Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Produktion och visualisering av bakteriell Spheroplasts och Protoplasts för att karakterisera antimikrobiell peptid lokalisering

doi: 10.3791/57904 Published: August 11, 2018

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att producera gramnegativa Escherichia coli (E. coli) spheroplasts och grampositiva Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts att tydligt visualisera och snabbt karakterisera peptid-bakterier interaktioner. Detta ger en systematisk metod för att definiera membran lokalisering och translocating peptider.

Abstract

Användningen av konfokalmikroskopi som en metod för att bedöma peptid lokalisering mönster inom bakterier är ofta hämmas av resolution gränserna för konventionella ljus Mikroskop. Upplösningen för en given mikroskopet kan inte vara lätt förbättrade, presenterar vi protokoll för att omvandla små stavformad gramnegativ Escherichia coli (E. coli) och grampositiva Bacillus megaterium (B. megaterium) till större, enkelt avbildad sfäriska former kallas spheroplasts eller protoplasts. Denna omvandling tillåter observatörer att snabbt och tydligt avgöra om peptider inge sig i bakteriell membranet (dvs membran lokalisera) eller korsa membranet för att ange cellen (dvs. translocating). Med detta synsätt presenterar vi också en systematisk metod för att karaktärisera peptider som membran lokalisera eller translocating. Medan denna metod kan användas för en mängd olika membran-aktiva peptider och bakteriestammar, vi visar nyttan av detta protokoll genom att observera samspelet mellan Buforin II P11A (BF2 P11A), en antimikrobiell peptid (AMP), med E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antimikrobiella peptider (ampere) har fått uppmärksamhet på grund av deras potentiella användning som alternativ till konventionell antibiotika1,2,3,4,5. Ampere döda bakterier genom antingen translocating över cellmembranet och interagera med intracellulära komponenter såsom nukleinsyror eller av permeabilizing membranet orsakar läckage av cell innehållet6. Förutom deras användning som antibiotika, kan translocating ampere anpassas för drug delivery program eftersom de kan icke-disruptively korsar den ogenomträngliga cellmembran7,8. Vi söker därför att förstå grundläggande AMP verkningsmekanismer att lägga grunden för deras användning i läkemedelsdesign.

Konfokalmikroskopi erbjuder ett sätt att bedöma lokalisering mönster fluorescently märkt ampere i bakterieceller som ger insikter i deras mekanism för åtgärd9,10,11,12, 13 , 14. genom märkning membranet i bakterier, kan man bestämma om en fluorescently märkt peptid lokaliserar till membranet eller det intracellulära utrymmet i en bakteriecell. Denna teknik är dock begränsad av liten storlek och rod formen av bakterier, vilket kan göra imaging utmanande på grund av upplösning gränserna för konventionella ljus Mikroskop och varierande orienteringen av bakterier på bild15.

Målet med denna metod är att möjliggöra bättre visualisering av de fluorescently märkt peptid lokalisering mönster med konfokalmikroskopi. Visualisering förstärks genom att vrida de små, tunna, stavformad gramnegativ Escherichia coli (E. coli) och grampositiva Bacillus megaterium (B. megaterium) bakterier till utvidgade, sfäriska former kallas spheroplasts (för gramnegativa stammar) och protoplasts (för grampositiva stammar)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts och protoplasts är lättare att bilden på grund av både sin ökad storlek och sin symmetriska form, vilket gör orienteringen av en bakterie på ett objektsglas irrelevant för dess avbildning. Dessutom presenterar vi en systematisk metod att kvantitativt analysera konfokalmikroskopi data för att karaktärisera ampere som antingen membran lokalisera eller translocating. Tillämpa dessa metoder gör det lättare att skilja fluorescently märkt peptid lokalisering mönster. De protokoll som presenteras här kan användas för att bedöma lokaliseringen av en mängd olika membran-aktiva agenter än ampere, inklusive cell-penetrerande peptider.

En klar fördel av denna teknik är att det ger insikter om verkningsmekanismen ampere på en enda cell-nivå, vilket kan avslöja cell till cell heterogenitet15, i motsats till andra fluorescens-analyser som vanligen används för att identifiera den verkningsmekanismer för ampere, som endast ger bulk uppskattningar9,22,23,24,25. Användning av spheroplasts och protoplasts för att bedöma AMP cellinmatning är särskilt användbar26 eftersom de är mer fysiologiskt relevanta15 än andra modeller som används för att bedöma cellinmatning, såsom lipid blåsor24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. lösningen förberedelse

Obs: Förbereda lösningar som beskrivs i steg 1,1 – 1,9 och 1,8 – 1.11 för att producera E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts, respektive.

  1. Förbereda 1 M Tris-Cl, pH 7,8 genom upplösning 10,34 g Tris HCl och 4,17 g Tris Oh i 50 mL dH2O i en 125 mL mätkolv. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran och förvara i ett koniskt rör vid rumstemperatur.
  2. Bered A 20 mM MgCl2, 0,7 M sackaros, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 genom upplösning 0.10 g MgCl2 (95,2 g/mol) och 11.98 g sackaros (342,3 g/mol) i 25 mL dH2O i en 125 mL-mätkolv. Tillsätt 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) och justera volymen till 50 mL. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran och förvara i ett koniskt rör vid rumstemperatur.
  3. Förbereda lösning B (10 mM MgCl2, 0,8 M sackaros, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) genom upplösning 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) och 13.69 g sackaros (342,3 g/mol) i 25 mL dH2O i en 125 mL-mätkolv. Tillsätt 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) och justera volymen till 50 mL. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran och förvara i ett koniskt rör vid rumstemperatur.
  4. Förbereda 0,8 M sackaros genom upplösning 13.69 g sackaros (342,3 g/mol) i 50 mL dH2O i en 125 mL-mätkolv. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran och förvara i ett koniskt rör vid rumstemperatur.
  5. Förbereda 5 mg/mL deoxyribonuclease jag (DNAS jag) genom upplösning 0,015 g DNAS jag 3 ml dH2O i en 50 mL mätkolv. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran. Alikvotens lösningen i microfuge rör och förvaras vid-20 ° C.
  6. Förbereda 0,125 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA), pH 8,0 genom upplösning 0.698 g EDTA dinatrium torkar (372.2 g/mol) till 15 mL dH2O i en 125 mL mätkolv. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran och förvara i ett koniskt rör vid rumstemperatur.
  7. Förbereda 600 µg/mL cefalexin genom upplösning 0,03 g av cefalexin hydrat (365.404 g/mol) i 50 mL dH2O i en 125 mL mätkolv. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran och förvara i ett koniskt rör vid 4 ° C.
  8. Förbereda 5 mg/mL lysozym genom upplösning 0,015 g lysozym 3 ml dH2O i en 50 mL mätkolv. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran. Alikvotens lösningen i microfuge rör och förvaras vid-20 ° C.
  9. Förbered 3% w/v Trypticase Soy buljong (TSB) genom att lösa upp 30 g av TSB i 1 L dH2O i en 2 L kolv. Alikvot lösningen i flaskor som innehåller 25 mL eller 100 mL TSB skall användas vid beredning av E. coli spheroplasts eller B. megaterium protoplasts, respektive. Autoklav kolvar att sterilisera det flytande mediet. Sterila TSB kan förvaras vid rumstemperatur eller 4 ° C.
  10. Bered C (1 M sackaros, 0,04 M timololmaleat, 0,04 M MgCl2, pH 6,5) genom upplösning 34.23 g sackaros (342,3 g/mol), 0,46 g maleinsyra (116.07 g/mol) och 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) i 100 mL dH2O i en 250 mL mätkolv. Justera pH till 6,5. Sterilisera genom filtrering genom ett 25 mm spruta filter med ett 0,2 µm-membran och förvara i ett koniskt rör vid rumstemperatur.
  11. Förbereda 200 mL protoplast medium genom att blanda 100 mL 3% w/v TSB och 100 mL lösning C i en 1 L glasflaska. Autoklav att sterilisera lösningen och förvara i rumstemperatur.

2. beredning av övernattning kultur

Obs: Utföra avsnitten 2-4 med lämplig steril teknik. Om så önskas, kan en bakteriestam innehålla en plasmid för antibiotikaresistens att minska potentiella föroreningen. Om du använder en stam med antibiotikaresistens, lägga till nödvändiga antibiotika i steg 2.1, 3.1, 3.2 och 4.1 – 4.4.

  1. Förbereda en övernattning kultur genom att plocka en enda koloni av bakterier med hjälp av en steril pipettspetsen och placera det i en 14 mL kultur tub innehållande 2 – 3 mL 3% w/v TSB. Inkubera vid 37 ° C, under omskakning för 16 – 21 h.

3. beredning av gramnegativa E. coli Spheroplasts

  1. I en 250 mL mätkolv, späd den natten kultur 1: 100 i 25 mL volym av 3% w/v TSB och inkubera bakteriell lösningen vid 37 ° C, under omskakning för ca 2,5 h tills lösningen har nått en optisk densitet av 0,5 – 0,8 på 600 nm. Mät den optiska densiteten med en spektrofotometer.
  2. I en 250 mL mätkolv, späd denna kultur 1:10 i 30 mL 3% w/v TSB och inkubera vid 37 ° C, under omskakning för 2,5 h i närvaro av 60 µg/mL cefalexin (347.4 g/mol) att producera enstaka cell filament på cirka 50 – 150 µm i längd , som kan observeras under 1000 X förstoring med ett ljusmikroskop (figur 1B).
  3. Skörda glödtrådarna genom centrifugering bakteriell lösningen vid 1500 x g, 4 ° C i 4 min. Dekantera och kasta bort supernatanten, reservera pelleten.
  4. Tvätta glödtrådarna genom att försiktigt tillsätta 1 mL 0,8 M sackaros, vara noga med att inte störa pelleten. Inkubera i 1 min och sedan kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten.
  5. Tillsätt 150 µL av 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL av 5 mg/mL lysozym, 30 µL av 5 mg/mL DNAS jag och 120 µL av 0,125 M EDTA i deras respektive för att pelleten och inkubera lösningen i rumstemperatur i 10 min.
  6. Tillsätt 1 mL av lösning A successivt under 1 min till en lösning beredd enligt 3.5 med hjälp av en mikropipett medan försiktigt virvlande lösningen för hand. Inkubera lösningen för 4 min i rumstemperatur.
  7. In två 15 mL koniska rör 7 mL 4 ° C lösning B. Lägg till lika mängder en lösning beredd enligt 3.6 till var och en av dessa två rör. Centrifugera lösningen vid 1 500 x g, 4 ° C under 4 minuter.
  8. Med serologisk pipett noggrant bort alla utom 12 mL av supernatanten utan att störa pelleten. Återsuspendera pelleten genom pipettering försiktigt upp och ner med en P1000 mikropipett. Visuellt kontrollera spheroplasts bildas genom att observera provet vid 1000 X förstoring med ett ljusmikroskop (figur 1 c).
  9. Lagra spheroplasts vid-20 ° C i upp till en vecka eller tills de har gått igenom 3 frysning-tining cykler.

4. beredning av grampositiva B. megaterium Protoplasts

  1. I en 250 mL mätkolv, späd den natten kultur-1:1,000 i 100 mL 3% w/v TSB och inkubera bakteriell lösningen vid 37 ° C, under omskakning ungefärligt 4.5 h tills lösningen har nått en optisk densitet 0,91.0 på 600 nm. Mät den optiska densiteten med en spektrofotometer.
  2. Häll flytande kulturen i två 50 mL koniska rör och centrifugera vid 2000 x g, 4 ° C i 10 min.
  3. Med serologisk pipett Kassera supernatanten från både koniska rör. Återsuspendera varje pellet i 2,5 mL protoplast medium och kombinera de återsuspenderade lösningarna i en enda koniska rör. Pipettera den kombinerade återsuspenderade lösningen i en 125 mL mätkolv.
  4. Tillsätt 1 mL av 5 mg/mL lysozym och inkubera i 1 timme vid 37 ° C, under omskakning.
  5. Övervaka tillväxten av protoplasts under 1000 x förstoring med ett ljusmikroskop, konstaterar några oegentligheter, såsom bakterier som visas som svullna stavar i stället för sfärer (figur 2). Med serologisk pipett överför lösningen till en 15 mL koniska rör och centrifugera vid 2000 x g, 4 ° C i 10 min.
  6. Dekantera supernatanten och resuspendera pelleten i 5 mL protoplast media. Lagra protoplasts vid-20 ° C i upp till en vecka eller tills de har gått igenom 3 frysning-tining cykler.

5. beredning av peptid lösning och membran färgämne för avbildning

  1. Peptid lösning
    1. Lös 2 mg FITC märkt BF2 P11A i 800 µL dH2O. användning en peptid som innehåller minst en tryptofan rester för att genomföra protein koncentration mätningar i ett mikrofugrör insvept i aluminiumfolie.
    2. Spektrofotometriskt, Mät absorbansen hos peptid lösningen vid 280 nm i tre exemplar. Beräkna peptid koncentrationen med den molära extinktionskoefficient för tryptofan (5,700/Mcm).
    3. Späd peptid koncentrationen i dH2O till en slutlig koncentration på 100-200 µM. butik i ett mikrofugrör vid-20 ° C insvept i aluminiumfolie ljuskänsligt.
  2. Membranet färgämne
    1. I ett mikrofugrör, förbereda ett 10 mM lager av di-8-ANEPPS (592,9 g/mol) genom upplösning 5 mg av di-8-ANEPPS i 843.3 µL av DMSO. Förvaras vid 4 ° C insvept i aluminiumfolie ljuskänsligt.
    2. I ett mikrofugrör, förbereda 1 mL 0,03 mM di-8-ANEPPS genom att lägga till 3 µL av 10 mM di-8-ANEPPS 997 µL DMSO. Lagra i ett mikrofugrör vid 4 ° C insvept i aluminiumfolie ljuskänsligt.

6. visualisering av E. coli Spheroplasts och B. megaterium Protoplasts med konfokalmikroskopi

  1. Pipettera 5 µL av spheroplasts eller protoplasts i en poly-L-lysin belagt glas bild. Tillsätt 2 µL av FITC märkt AMP (100-200 µM) till bild och inkubera i 3 min skyddas från ljus.
  2. Tillsätt 1 µL av den membran dye di-8-ANEPPS (0,03 mM) till bild och inkubera i 3 min skyddas från ljus. Täck med ett täckglas och försegla med nagellacket.
  3. Slå på confocal mikroskopet och argon laser. Justera argon laser uteffekt 20% och 20% transmission.
  4. Ställa in utsläpp våglängdsområden 499 – 532 nm och 670 – 745 nm för FITC-märkt peptid utsläpp kanal och di-8-ANEPPS-märkt membran dye utsläpp kanal, respektive.
  5. Bild protoplasts eller spheroplasts (figur 1 och figur 2) med ett 63 X-objektiv. Använd avbildningsprogrammet för att få 8-bitars, 512 x 512 sammansatta z-stack bilder består av 0,5 µm skivor av helheten av den spheroplast eller protoplast.
    Obs: Ta noggrant övervägande att minska utsläppen genomlysningseffekten medan imaging spheroplasts och protoplasts. Se diskussion för detaljer.

7. karakterisering av AMP lokalisering

  1. Öppna den sammansatta z-stack bilden i bildprogram. Leta upp det center-mest segmentet av spheroplast eller protoplast och placera en cirkulär Region av intresse (ROI) (0,3 µm i diameter) på membranet (ROI 1), en i mitten av den spheroplast eller protoplast (ROI 2) och en från spheroplast eller protoplast att mäta den bakgrunden fluorescensen (ROI 3) (figur 5). Undvika införandet av mättade pixlar. Fluorescensintensiteten i varje ROI kan beräknas genom bildprogram.
    Obs: I fall när peptid inte lokalisera till helheten av membranet, rita ROI 1 på ett område av membranet där peptiden är lokaliserad.
  2. Använd följande ekvation för att fastställa förhållandet av intracellulära peptid fluorescensintensiteten till membran peptid fluorescensintensiteten:
    Equation
    Obs: Fluorescensintensiteten i ROI 3 subtraheras från fluorescens stödnivåer i ROI 2 och ROI 1 för att redogöra för bakgrunden fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genom att förstora bakterier och gör dem sfäriska, kan vi lätt skilja peptider lokalisera till bakteriell membranet eller lätt translocate över bakteriell membranet. Upplösning gränserna för konventionella ljus Mikroskop göra det utmanande för att skilja om peptid signaler uppstår från membran eller intracellulära utrymmet i normala bakterier eftersom signaler lokaliserad till membranet visas överlappar den intracellulära utrymmet (figur 3A). Däremot resulterar spheroplasts (2 – 5 µm) och protoplasts (2 – 3 µm) jämfört med normala bakterier, som vanligtvis endast är 1 µm i diameter, förstorad storlek i tydlig upplösning mellan membran markören och intracellulära utrymmet gör det lättare att skilja peptid lokalisering (figur 3B).

Här, används spheroplasts och protoplasts för att Visa mönstret lokalisering av den N-terminala FITC märkt AMP BF2 P11A. Vi observerar FITC märkt BF2 P11A att lokalisera till membranet och translocate över cellmembranet av E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts (figur 4). Medan vildtyp BF2 har observerats för att translocate över E. coli och lipid vesikler membran, är P11A mutationen kända för att minska denna translokation13,27,28. Vi utnyttjade en icke-antibiotikaresistenta B. megaterium och ampicillin resistenta Top 10 E. coli (pET45B) i data som presenteras. Den ampicillin resistenta E. coli var odlas i närvaro av ampicillin (349.4 g/mol) med en slutlig koncentration i lösningen på 25 µg/mL. För imaging, drogs efter den systematiska tillvägagångssätt som beskrivs i avsnitt 7, ROIs på membranet, intracellulära utrymmet och bakgrunden (figur 5B). Förhållandet mellan intracellulära peptid fluorescensintensiteten till peptid fluorescensintensiteten på membranet beräknades för varje spheroplast eller protoplast interagerar med BF2 P11A med hjälp av ekvation som beskrivs i avsnitt 7.2. Figur 5A visar fördelningen av detta förhållande för alla spheroplasts och protoplast gjorde. Den spheroplasts och protoplasts gjorde i stort sett föll i två grupper, med majoriteten av spheroplasts eller protoplasts att ha ett förhållande på mindre än 0,3 eller större än 1.

Med tanke på de distinkta grupper som nyckeltalen faller, definierat vi peptid lokalisering som translocating när förhållandet beräknas i avsnitt 7.2 var större än eller lika med 1. Omvänt, peptid lokalisering definierades som membran lokalisera när förhållandet beskrivs i avsnitt 7.2 var mindre än 1. Enligt denna metod av scoring vi observerade ett liknande lokalisering mönster för BF2 P11A i E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts med BF2 P11A lokalisera till membranet i 71% och 70% av fallen för E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts, respektive (tabell 1).

Figure 1
Figur 1: Representativa bilder av E. coli. (A) E. coli bakterier (B) E. coli orm och (C) E. coli spheroplast. Bilder togs på 100 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa bilder av B. megaterium. (A) B. megaterium bakterier och (B) B. megaterium protoplast. Bilder togs på 100 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa bilder av B. megaterium. (A) B. megaterium bakteriecell och (B) B. megaterium protoplast märkt med den membran markör di-8-ANEPPS. Bilder från mellersta z-stacken visas på 100 X (A) och 63 X (B) förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativ E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts interagerar med FITC märkt BF2 P11A. (A) E. coli spheroplast visar BF2 P11A lokalisera till membranet. (B) E. coli spheroplast visar BF2 P11A translocating över membranet. (C) B. megaterium protoplast visar BF2 P11A lokalisera till membranet. (D) B. megaterium protoplast visar BF2 P11A translocating över membranet. E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts märks med den membran markör di-8-ANEPPS (röd) och FITC märkt BF2 P11A (grön). Bilder från mellersta z-stacken visas på 63 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: analys av peptid lokalisering mönster. (A) fördelningen av förhållandet av intracellulära fluorescensintensiteten (ROI 2) till membran fluorescensintensiteten (ROI 1) efter bakgrunden subtraktion ((ROI 2-ROI 3) / (ROI 1-ROI 3)) för E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts märkt med BF2 P11A (B) E. coli spheroplast interagerar med FITC märkt BF2 P11A. Cirkulära områden av intresse (ROI) 0,3 µm i diameter dras på membran (ROI 1) intracellulära utrymmet (ROI 2) och bakgrunden (ROI 3). Fluorescensintensiteten hos peptid kvantifierades i varje ROI och bakgrunden fluorescensen redovisades genom att subtrahera fluorescensintensiteten i ROI 3 från fluorescensintensiteten i ROI 1 och ROI 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bakteriestam Lol spheroplast eller protoplast % Membran lokalisera % Translocating
E. coli 84 71 29
B. megaterium 70 70 30

Tabell 1: lokalisering mönstret av BF2 P11A interagerar med E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De protokoll som presenteras här gör det möjligt för forskare att snabbare erhålla större stickprovsstorlekar bakteriell bilder eftersom de utvidgade, sfäriska bakterierna är mycket lättare att hitta, orientera och bild. Denna förbättrade förmåga att samla in data är värdefullt i flera avseenden. Först, det gör en mer systematisk kvantitativ analys av peptid lokalisering mönster. Medan kvalitativa trender kan påvisas från mindre uppsättningar av bilder, endast en stort urval uppsättning högkvalitativa bilder avslöjar mer nyanserad trender i lokalisering mönster, såsom andelen celler där en peptid translocates kontra lokaliserar till den membran. Dessutom förmågan att bättre lösa interna fluorescensen från membran lokaliseringen gör det lättare att utföra tid kursen studier för att bedöma hur snabbt peptider interagera med bakterieceller samt hur lokalisering mönster förändras över tid. Förbättrad upplösning också tillåter forskare att överväga trender i peptid lokalisering som inte är möjliga med mindre bakterier. Till exempel i några av våra observerade spheroplasts och protoplasts verkar peptider lokalisera till specifika delar av membranet, dvs peptid signalerna inte bilda en komplett, sammanhållande ring runt bakterierna och istället visa några punktuell märkning. I andra fall peptider kan inte distribueras helt jämnt inuti bakteriell membranet, dvs peptiden signaler inte Fyll helt det inre utrymmet av bakterier. Medan vi inte har följt dessa trender i vår nuvarande analys, blir med tanke på sådan lokalisering trender genomförbart när imaging spheroplasts och protoplasts i stället för standard bakterieceller. Dessa fördelar skulle också gälla att bestämma localizationen av peptider än ampere, såsom cell-penetrerande peptider. Spheroplasts och protoplasts produceras med dessa metoder kan också användas för icke-imaging experiment som gynnas av ökad cellulär storlek, till exempel patch-clamp elektrofysiologi mätningar18,19.

En laser skanning confocal Mikroskop var utnyttjas i utvecklingen av våra protokoll för avbildning, men det är avgörande att optimera parametrar för varje specifik imaging system. Detta inkluderar att välja en uppsättning parametrar som maximerar detektion av peptid och membran dye fluorescens, samtidigt minimera genomlysningseffekten från membran färgämnet i peptidens utsläpp kanal och FITC-märkt peptiden till membranets utsläpp kanal. Genomlysningseffekten från peptiden in membranets utsläpp kanal undveks genom att välja ett våglängdsområde för membranets utsläpp kanal som inte innehöll någon del av FITCS emissionsspektrum. Genomlysningseffekten från membran färgämnet, di-8-ANEPPS, in peptidens utsläpp kanal var svårare att undvika eftersom di-8-ANEPPS' emissionsspektrum överlappar med majoriteten av FITCS emissionsspektrum. Specifika för detta protokoll, genomlysningseffekten från membran färgen in peptidens utsläpp kanal kan resultera i falska karakterisering av ampere som membran lokaliserade. Kan man bestämma om genomlysningseffekten av detta slag sker genom imaging spheroplasts eller protoplasts som uteslutande är märkta med membran färgämne och kontrollera för att se om fluorescensen är synlig i peptidens utsläpp kanal. Olika imaging parametrar, inklusive våglängdsområdet används för att definiera peptidens utsläpp kanal och gain och offset värden, kan testas systematiskt för att fastställa en uppsättning parametrar som minimerar genomlysningseffekten. När en uppsättning parametrar är etablerad, är det viktigt att utvärdera om imaging ger stark identifiering av fluorescens signal när spheroplasts eller protoplasts märkt med både peptid och membran färgämne utnyttjas. Genom detta tillvägagångssätt, har vi framgångsrikt etablerat imaging parametrar som minimeras effekten av genomlysningseffekten samtidigt maximera fluorescens upptäckt av både FITC-märkt AMP och membranet färga di-8-ANEPPS. Specifikt, Vi hittade att de utsläpp genomlysningseffekten från membran färgämnet i peptid kanalen var minimeras med hjälp av utsläpp våglängdsområden 499 – 532 nm (peptid) och 670 – 745 nm (membran), och när vinsten justerades till vara ≤800 volt (V) (peptid) och ≤900 V (membran) och offset justerades till ≤ -10,0% (peptid, membran).

Även om vi fokuserade på E. coli och B. megaterium, kunde presenterade protokollen anpassas till producera spheroplasts eller protoplasts från många olika bakteriestammar. Exempelvis har vi framgångsrikt producera Bacillus subtilis protoplasts som var 1 – 2 µm i diameter med hjälp av protokollet som beskrivs i avsnitt 4 och anpassningar av protokollet kunde göras för att ytterligare optimera storlek. Förmåga att iaktta peptid lokalisering mönster i både gramnegativa och grampositiva bakterier är särskilt användbar för studier av AMPs eftersom skillnaderna i cellväggen strukturen mellan dessa två klasser av bakterier kan påverka hur ampere interagerar med cellulära membran. Dock många bildtagningsstudier ampere hittills har enbart fokuserat på modell E. coli -stammar och, således, återspeglar inte beteendet för peptider med grampositiva bakteriestammar.

Spheroplasts och protoplasts skiljer sig från normala bakterier, framför allt i deras brist på en yttre cellväggen, och följaktligen kan inte vara bra modeller för alla experimentella frågor. Till exempel har yttermembranet hos gramnegativa bakterier visat sig fungera som en molekylsikt för större molekyler29. Större peptider, kan därför kunna translocate i spheroplasts när de inte skulle göra det i normala bakterier. Dessutom inte kan detaljerade studier av växelverkan av AMP med bakterier cellväggen, yttre membran och cytoplasmic membranet utföras med spheroplasts och protoplasts. Till exempel har nyligen arbete från Weisshaar Lab utnyttjat imaging att observera peptiden mer exakta positioner i åtgärd30,31CM15 och melittin mekanismer. Dock vår metod, kräver som beskrivs här, inte genomförandet av mikrofluidik i mikroskopi instrumentering för att uppnå krävs resolution31. Även om tidigare arbete har visat att spheroplasts är livskraftig21,32, har de ändå sannolikt vissa metabola och fysiologiska skillnader från ”normala” bakterier som kan potentiellt förändra membran interaktioner i vissa fall. Dessutom, eftersom vi inte har bedömt livskraften hos spheroplast populationer, man kan inte skilja mellan en peptid som lätt kan translocate över cellmembranet av en levande cell kontra en peptid som kan bara translocate över en död eller dör cellen. Trots dessa skillnader har vi sett lokalisering mönster i E. coli spheroplasts för många ampere som överensstämmer med kända mekanismer av åtgärd15, och våra resultat för BF2 P11A med B. megaterium protoplasts presenteras här verka konsekvent med andra observationer för att peptid13,27,28. Membranet kompositioner av spheroplasts och protoplasts är också definitivt mer fysiologiskt relevanta än de typiska blandningar som används i andra modellsystem, såsom lipid blåsor. Sammanfattningsvis, med tanke på förbättrad upplösning och användarvänlighet imaging ges av spheroplasts och protoplasts, tror vi att de är användbara modeller för att visualisera membran aktiva ämnen, såsom ampere, i en rad olika bakteriestammar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Forskning stöds av nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIH-NIAID) award R15AI079685.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl) Sigma T3253
Trizma base (Tris OH) Sigma T1503
Magnesium chloride Sigma M8266
Sucrose Sigma S7903
Lysozyme Sigma L6876
Deoxyribonuclease I Sigma D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma 106361 Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate Sigma C4895
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
BBL Trypticase soy broth Fisher Scientific B11768
BF2 P11A FITC NeoScientific Custom ordered
di-8-ANEPPS Biotium 61012
DMSO Sigma 34869 Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid Sigma M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane Pall Corporation 4192
Laser scanning confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 II For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Leica Microsystems For image processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20, (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24, (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19, (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80, (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8, (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4, (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40, (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838, (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29, (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9, (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818, (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39, (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4, (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107, (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43, (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25, (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111, (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32, (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39, (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128, (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114, (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819, (1), (1985).
Produktion och visualisering av bakteriell Spheroplasts och Protoplasts för att karakterisera antimikrobiell peptid lokalisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).More

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter