En roman enkelt dyr motoriske funksjoner sporingssystem ved hjelp av enkle, lett tilgjengelig programvare

Summary

Denne studien rettet til å automatisere kvantifisering av motor underskudd i rotter. Initial bedømmelse modellen vurderer motor resultat en intracortical microelectrode implantasjon i motorisk cortex. Vi rapporterer om utvikling og bruk av en sporing algoritme lett tilpasses, enkel og lett tilgjengelig koding programvare.

Abstract

Vi har nylig vist at implanting intracortical microelectrodes i den motor corteces rotter fører til umiddelbar og varig motor underskudd. Motor impairments kvantifisert manuelt via en åpen rutenettet test for å måle den grov motoriske funksjonen og en stige-test for å måle den fin funksjonen. Her diskuterer vi en teknikk for automatisert kvantifiseringen video-innspilte tester med våre tilpassede Capadona atferdsdata analyse videosystem: rutenett og stigen Test, eller BVAS. Utnytte enkel og lett tilgjengelig koding programvare (se Tabell for materiale), dette programmet tillater sporing av en enkelt dyr både åpne feltrutenettet og stigen testene. I åpne feltrutenettet sporing koden tersklene video for intensitet, spor plasseringen av rotta over 3 min varigheten av rutenettet testen og analyserer banen. Deretter beregner og returnerer mål for den totale avstanden reist, den høyeste hastigheten oppnås, antall venstre - og høyrehendte snur og antall rutenettlinjer krysses rotta. I stigen sporing, koden igjen terskler videoen for intensitet, sporer bevegelse av rottene over stigen, og returnerer beregnede målinger inkludert tiden det tok rotta å krysse stigen, antall pote glir oppstår under flyet av de stigen trinnene og forekomsten av feil på grunn av stagnasjon eller reversering. Vi ser at BVAS utviklet her kan brukes til analyse av funksjon i en rekke programmer, inkludert mange skade eller sykdom modeller.

Introduction

Det er mange etablerte metoder å vurdere både funksjonelt og atferdsmessige motor og andre^1,2,3. Noen av metodene mer vanlig ansatt inkludere testing fin funksjon via pote plassering, stepping og lem koordinering på stigen test⁴, testing grov motoriske funksjoner og stress atferd via åpen rutenettet testen^{5 ,6}, og testing for frykt, depresjon og fortvilelse via tvunget svømme teste^7,8 eller rotoren rod⁹. Men stole mange av disse metodene på menneskelig forskere "score" dyret eller vurdere resultatene subjektivt. Behovet for en subjektiv menneskelig vurdering kan langsom generasjon og analyse av data, samt presentere muligheten for en tilsiktet eller utilsiktet innflytelse forskning skjevhet i studien¹⁰. Videre, subjektive vurderingen av dataene presenterer også risikoen for unøyaktige datarepresentasjon, enten det er gjennom glemsel, dårlig motivasjon, uriktig trening eller uaktsomhet¹¹.

Vi har nylig rapportert bruk av både en åpen rutenettet test og en stige test i rotter implantert med intracortical microelectrodes^12,13. På grunn av nyheten av funnene i disse studiene, vi umiddelbart begynte å ansette de og mer funksjonell testing i mange pågående studier i laboratoriet. I påvente av utilsiktet menneskeskapte variasjonen skyldes en økning i antall subjektive evalueringer, og å forbedre analyse gjennomstrømningen, satt vi ut for å opprette en automatisert, computer-assistert program å score atferdsmessige testing, og sterkt begrense muligheten for feil.

Her rapporterer vi på utviklingen av BVAS. BVAS bruker datamaskinen analyse for å score et åpent felt rutenettet test og en stige test som beregninger av brutto- og motorikk, henholdsvis. Resultatene kan brukes til å belyse mulig funksjon underskudd skyldes skade eller sykdom, uansett skade eller sykdom modellen. Analyse kodene kan tilpasses for endringer i atferdsdata testutstyr eller scorer ulike beregninger av motorikk. Derfor kan BVAS bli implementert i mange programmer, utover våre bruksområde eller den tiltenkte bruken av de for tiden ansatt av andre laboratorier.

Merk at åpne rutenett og stigen feltforsøk krever videoopptak. Hver test vil derfor kreve et videokamera [1080 p, minimum 15 bilder per sekund (fps)], en bærbar PC og et rom for å lagre videoen data. For begge tester, plassere kameraet i en sentrert posisjon, slik at hele apparatet å bli sett på rammen. Anchor kameraet på et stativ eller stillas slik at det ikke flytte under testing. Holde kantene på videorammen så nær parallelle kantene på testing apparater som mulig. Husk den samme personellet fullført alle tester og rom er lyse med en temperatur-kontrollert system. Bruk samme rom for alle dyr i løpet av testing, med minimale endringer i rommet. Korn eller banan chips gjør gode gevinster å oppmuntre dyrene fullføre atferd testene.

Protocol

Alle prosedyrer og dyr omsorg praksis ble godkjent av og utført i henhold til Louis Stokes Cleveland Institutt for Veteraner saker Center institusjonelle dyr helsetjenester og bruk komiteen. Atferdsmessige testing protokollen følger tett tidligere utgitte verk^12,13.

1. atferdsmessige Testing: Filming aktivitetene

Merk: Her dyrene ble testet i 8 uker å oppdage endringer i kronisk virkemåten. Studien varigheten er avhengig av program/skade/sykdom modellen brukes for studier.

1. Åpne feltet rutenettet testing
   Merk: Rutenett testen har et 1 m² med 40 cm vegger og ble bygget i huset. Bunnen er delt i ni firkantene via fargerike bånd (figur 1A). For bruk av den automatiske BVAS er det viktig at fargen på linjen og rutenettet kontrast med rotten. Her, ble hvit Sprague Dawley rotter brukt; dermed rutenettet bakgrunnen var malt svart, og linjene ble opprettet med lys rosa bånd.
   1. Teste dyrene 2 x per uke for alle tester inkludert uken før begynner studien for å skape en baseline score for bruk i senere beregninger.
   2. Rengjør alle tester utstyret med klor dioxide-baserte sterilisering i begynnelsen av hver testing økt og mellom hvert dyr.
   3. Ta dyrene til rommet for testing og tillate dem å justere til rommet for 20 min før du starter prøvelser.
   4. Begynner filming og plassere dyret i midten av rutenettet vendt fra forskeren, begynne rutenettet testen.
   5. Tillate dyr å løpe fritt for 3 min mens videoen spilles ovenfra.
   6. Stoppe filme 3 min perioden har passert og tilbake dyret til buret sitt hjem. Rengjør rutenettet med klor dioxide-baserte sterilisering, ta vare å fullstendig tørke overflater før testing. Test hvert dyr 1 x per økt.
2. Stigen testing
   Merk: Stigen testen ble bygget huset og består av to akryl sideveggene, hver 1 m lengde, forbundet med 3 mm diameter trinnene linjeavstand med 2 cm mellomrom (figur 2). Dyr krever en ukes stigen trening før du begynner offisielle testing. Det er ingen forskjell mellom trening og testing protokollen. Merk at treningen ikke trenger å bli filmet.
   1. For bruk med BVAS, dekker veggen bak stigen med en svart plakatkartong og avgrense nivået av trinnene, start og slutt linjer med lyse bånd å skape en kontrast med hvit rotter.
   2. Teste dyrene 2 x per uke for alle tester inkludert uken før begynner studien for å opprette en planlagt score for bruk i senere beregninger.
   3. Rengjør alle tester utstyret med klor dioxide-baserte sterilisering i begynnelsen av hver testing økt og mellom hvert dyr.
   4. Ta dyrene til rommet for testing og tillate dem å justere til rommet for 20 min før du starter prøvelser.
   5. Plass dyret i ren midlertidig bur før stigen testing.
      Merk: En midlertidig bur er en kortsiktig bur å holde dyret mens dyr hjem bur brukes på slutten av stigen. Det er ingen alder bias som alle dyr brukt i studien er på samme alder og fullstendig testing i den samme tidsperioden. Kontrollen brukes her er en naiv dyr har aldri mottatt kirurgi.
   6. Konfigurere stigen apparatet til span to merder; start buret er en ren bur slutten buret er dyrets levende bur, et insentiv til å fullføre kjøre.
   7. Plassere kameraet på et stativ, sentrert på lengden på stigen. Utvide stativ slik at linsen av kameraet er på høyden av stigen trinnene. Plasser kameraet slik at trinnene er nøyaktig justert med objektivet som dette er viktig for slip algoritme i BVAS koden.
   8. Starter videoinnspillingen og lar rotta å begynne kjøre ved å holde sin front paws over den første rung av stigen. Tillate dyr å flytte på stigen unassisted.
   9. Tillate dyr å flytte fra start linjen til mållinjen i eget tempo under innspillingen. Avslutte videoinnspillingen og fjerne dyret fra stigen når dyret har fullført kjøringen.
   10. Vurdere kjøre en mislykket kjørt hvis dyret snur seg eller forblir stillestående for 20 s. slutten videoinnspillingen og fjerne dyret fra stigen hvis dyret ikke kjøre. Tilordne en straff poeng for mislykkede kjører som tilsvarer den tregeste tiden registrert under pre-kirurgi planlagte testing.
   11. Kontroller at hvert dyr fullfører 5 kjøringer testing dag og gi dem en 1 min hvileperiode mellom hvert forsøk.
       Merk: I denne studien dyrene var testet 2 x per uke i 8 uker. Derimot er tidsrammen skjønn av forskeren.

2. filen lagring og navngivning

Merk: BVAS koden bruker spesielt utpekte video arkiv og mappe navnekonvensjoner slik at videoer kan bli pålitelig analysert og analyseres riktig. Forskjellige navnekonvensjoner støttes ikke for øyeblikket. Etter fullføringen av en testing session lagres videofilen på standardplasseringen under et standardnavn.

1. Personlige video navngiving
   1. Navngi hver video med dyr betegnelse for alle rutenettet testing videoer.
   2. Samle 5 stigen videoer per testing økt for hvert dyr. Velg alle fem videoer, og gi den første videoen, bruker dyrets betegnelse. For eksempel hvis dyrets navn er "C1NS", filene er navnet "C1NS (1)", "C1NS (2)", "C1NS (3)", osv.
2. Lagringsplass mappe navn
   1. Ta videoer nå oppkalt etter hvert dyr og plassere filene i egne lagringsmappe. Navn denne mappen bruker følgende konvensjon: "TestingWeek_TestMode_MM_DD_YY".
      Merk: For eksempel denne mappen inneholder den første uken i rutenettet videoer og ble filmet på januar 1^st, 2018, mappen holder disse videoene er kalt "Week1_GridTest_01_01_18".
   2. Sett dette spesielt mappen i en annen mappe som skal betegne den større studien som dette settet av eksperimenter tilhører.
      Merk: Det er ingen navngiving krav for mappen treet systemet å holde studier og tester moduser organisert. Den eneste velger systemet er mappen holder videoer i trinn 2.2.1.
3. Regneark filopprettelse
   1. Bruker et utenfor regnearket (se Tabell for materiale), opprette en ny tom regnearkfil å lagre data for hver studie og test-modus.
      Merk: Det er ingen navngiving eller lagring Plasseringskrav for denne filen. Hver studie krever to regnearkfiler til systemet, en for rutenettet testing og en for stigen testing. La disse filene være tom for nå.
   2. Kontroller disse regnearkfiler ikke er åpne på alle datamaskiner mens BVAS kjører.
      Merk: Hvis BVAS prøver å åpne en regnearkfil som allerede er åpen, vil dette resultere i en feil.

3. system installasjon

Merk: BVAS ble bygget og testet på PC systemer og utnytter Runtime komponentene fra enkel og lett tilgjengelig koding programvare. Andre systemkonfigurasjoner støttes ikke for øyeblikket.

1. Installere nyeste BVAS versjon
   1. Kjøre installasjonsprogrammet ved å dobbeltklikke på installasjonsikonet merket 'BVASX. XXinstaller'. "X.XX" er gjeldende versjonsnummeret, 'BVAS3.30installer'.
      Merk: Dette er åpen kildekode. Kontakt tilsvarende forfatteren for den nyeste versjonen.
   2. Følg den på skjermen å installere BVAS.
      Merk: Installasjonsprogrammet vil kontrollere systemet for den riktige versjonen av programvaren (f.eks., MATLAB Runtime) og hvis det ikke blir funnet, vil den installere programvaren fra Internett.
   3. En gang installert, kan du starte programmet ved å klikke på 'BVAS.exe' filen.

4. system bruk

1. Åpne programmet
   1. Dobbeltklikk på ikonet BVAS programmet å oppdra BVAS hovedmenyen som gir følgende alternativer: "Rutenett analyse", "Stigen analyse", "Ladder gjennomgang" eller "Avslutt".
      Merk: Det er også en rullegardinmenyen i øvre venstre hjørne "Email Settings' (Figur 3A).
2. E-innstillinger
   1. Klikk på rullegardinmenyen "E-innstillinger" og merk "endre e-destinasjon".
   2. Angi en foretrukket e-postadresse for å motta oppdateringer på analyse og velg "OK". Velg 'Avbryt' du kan ikke endre e-posten er lagret.
   3. Klikk 'Send Test epost' for å sende en test e-post til e-posten er lagret i systemet. Lukk den 'Email sendt!' vindu popup betegner testens ferdigstillelse.
3. Åpen rutenettet testanalyse
   1. Velg 'Rutenett analyse' fra menyskjermen.
   2. Sikre veksleknappen merket 'Enkelt Video/hele økten/inntegnede Data' viser hele økten for å fullføre analysen på et helt sett av testing samling videoer.
   3. Bruke knappen '...' ved øvre inndataboksen bla gjennom filsystemet for å finne filen videoer å analysere. Velg mappen merket i stil i trinn 2.2.1.
   4. Utnytte det... knappen ved siden av nedre inndataboksen bla gjennom filsystemet for å velge regnearkfilen som dataene skal lagres i.
      Merk: Legg merke til at, samt sender dataene til en regnearkfil, hele banen dataene for hver video er lagret i en datafil (.mat) i den samme mappen som inneholder videoer valgt i trinn 4.3.3.
   5. Kontroller veksleknappen nevnt i trinn 4.3.2 er satt til "Enkelt Video" å fullføre analysen på en enkelt video.
   6. Utnytte det... knappen ved siden av øvre inndataboksen bla gjennom filsystemet for å finne filen på videoen for å analysere.
   7. Utnytte det... knappen ved siden av nedre inndataboksen bla gjennom filsystemet for å velge en mappe å lagre datafilen (.mat) som enkelt video analysen.
      Merk: Datafilen navnet etter videoen, som er oppkalt etter dyret.
   8. Velg "Utdata" fra den veksle nevnt i trinn 4.3.2. utdata fra en tidligere analysert rutenettet video. Eksempler på denne plottede dataene vises i tallene 1B og 1 C.
   9. Utnytte det... knappen ved siden av øvre inndataboksen bla gjennom filsystemet Velg en tidligere opprettet rutenettet videodata fil. Velg 'gå!' å opprette figuren plot og data.
      Merk: Denne funksjonen oppretter også en tekstfil, kalt det samme og ligger i samme mappe som datafilen som har dyret er kjørt data i den.
   10. Når begge nødvendige filer er plassert, velger 'gå!' å begynne er video analysen. Merk at "tilbake" knappen vil åpne menyen øverst og knappen 'Avslutt' lukkes programmet helt. Velg den 'Feilsøke visning' veksle til å vise en visuell representasjon av sporing algoritmen (tall 3 c og 3D).
   11. Velg 'gå! " å starte analyseprosessen. Se bilder av hver video på skjermbildet korrekturleser. Bruk knappene "neste" og "forrige" side hvis det er mer enn fem videoer.
   12. For å bringe en manuelt valg meny, velger du knappen "Rediger" Hvis det finnes ingen grønne linjer eller den grønne linjen vises ikke i riktig plassen rundt testing området. Klikk "Rediger hjørner" for å redigere hjørnene.
       Merk: 'Neste ramme' knappen endres representant bildet til den neste rammen av video i spørsmålet. Velg 'Neste ramme' Hvis rammen gitt automatisk er hindret eller ute av fokus.
   13. Følg instruksjonene til høyre for representant bildet å merker testing og trykke "Enter" for å fullføre utvelgelsesprosessen.
       Merk: De valgte grønne linjene vises nå på representant bildet.
   14. Velg "ferdig" lagre valget og gå tilbake til skjermbildet korrekturleser.
   15. Velg Senter "gjort"-knappen for å starte fullstendig analyseprosessen når rutenettområdet for hver video er valgt riktig. Tillate at programmet kjører, og ved ferdigstillelse, en suksess melding vil vises.
       Merk: Full analyse av en samling av videoer kan ta litt tid, ca 10 min per dyr.
4. Stigen testanalyse
   Merk: Protokollen for første stigen testanalyse er svært lik protokollen som beskrevet i trinn 4.3.10–4.3.15. Bemerkelsesverdig forskjellene før disse trinnene er som følger:
   1. Velg "Stigen analyse" fra toppmenyen for å åpne stigen analyse-menyen.
   2. Vis de to alternativene i veksle, 'Enkelt Video' og 'Hele økten' (Figur 3B).
   3. Med 'Hele økten', Velg øvre input... for å velge mappen med stigen videoer kalt i trinn 2.2.1.Select lavere...-knappen for å velge en mappe å lagre en mappe med data fra stigen videoer å se senere.
   4. Hvis "Enkelt Video" er valgt, Velg en enkelt video fil med øvre... knappen og en beliggenhet som trinn 4.4.3.
   5. Velg 'gå!' starte analyseprosessen og ta opp stigen testskjermbilde området korrekturleser.
   6. Følg trinn 4.3.10–4.3.15 samme måte for stigen for rutenettet. Tillate at programmet kjører, og ved ferdigstillelse, en suksess melding vil vises.
      Merk: Hvis noe går galt under analysen, en email er sendt til epostadressen skrev inn i trinn 4.2.2. Ved ferdigstillelse av en analyse av noe slag, er en ferdigstillelse email sendt til den samme e-postadressen.
5. Ladder bilde gjennomgang
   Merk: Følgende protokollen er å gjennomgå tidligere analysert stigen videoer for å bekrefte eventuelle feil og pote følgesedler. Merk regnearkfiler for stigen krysse ikke genereres for å vise til "Ladder bilde gjennomgang" (trinn 4.5.1–4.5.5) er fullført.
   1. Velg "Ladder bilde gjennomgang" på toppmenyen. Dette bringer opp Ladder gjennomgang filen velge skjermen.
   2. Velg topp... for å velge mappen til datafilene.
      Merk: Filene lagres i stedet valgt i trinn 4.4.2 og er navngitt i følgende format: "M1_D1_Y1 stigen Video økt HH_MM M2_D2_YYYY". M1, D1 og Y1 er datoen for økten blir analysert. "Stigen Video Session" lese "Enkelt videoanalyse" Hvis bare en enkelt video ble analysert. HH_MM og M2_D2_YYYY er klokkeslettet og datoen da anmeldelse økten ble startet.
   3. Velg bunnen... velge en regnearkfil som er opprettet for å studere.
   4. Velg 'gå! " å starte manuell vurderingsprosessen.
   5. Vis automatisk åpnet stigen data kontrolløren-menyen. Hvis det oppdages en slip, bruker 'Neste bilde' og 'Siste ramme'-knappene for å sjekke noen fortløpende registrert rammer hvis tilgjengelig.
   6. Bruk slip-pinnen for å betegne hva foten av rotte har glidd. La veksle på "No Slip" Hvis oppdagelsen er en false positiv. Klikk "Lagre/Fortsett" å gå videre til neste påvisning (figur 2A).
   7. I tilfelle av svikt, kan du bruke veksle til å angi om feilen skyldes tilbakeføring (der rotta slått under kjøre) eller stagnasjon (der rotta mislyktes å fullføre kjøre i tide).
   8. Klikk "Lagre/Fortsett" å gå videre til neste gjenkjenning. På den siste oppdagelsen, klikk "Lagre/Fortsett" for å fullføre analyse og lagre dataene i regnearkfilen valgt tidligere. Avvise ferdigstillelse varsel.
      Merk: Etter at gjennomgangen er fullført, mappen som ble vurdert er omdøpt "GJENNOMGÅTT M1_D1_Y1 stigen Video økt HH_MM M2_D2_YYYY".

5. produksjonen dataanalyse

1. Rutenettet regnearkfil
   1. Finne opprettet dataene i regnearkfilen fra hver rutenettet video.
      Merk: Kolonnene er venstre til høyre som følger: dyrets navn, dato av test, uke studere antallet, total distanse reist, total tid stoppet, maksimal hastighet oppnås, høyre svinger, venstre svinger og rutenett krysser (figur 1D).
   2. Bruke disse beregninger for å kvantifisere brutto motor ytelsen og opprette sammenligning tomter mellom dyr og tidspunkt.
2. Stigen regnearkfil
   1. Finn opprettet dataene i regnearkfilen fra hver stigen video etter feil og pote slip gjennomgang.
      Merk: Kolonnene er venstre til høyre som følger: dyrets navn, kjøre nummer 1-5, uke av studien, datoen for test, løpe type (enten vellykket eller mislykket), tid av løpe for suksesser, prosent fullført, pote glipper på hver labben, og feilmodus. Kolonnen tid er tomt for en feil og feil modus kolonnen vil lese tilbakeføring eller stagnasjon (figur 2B).
   2. Bruke disse beregninger for å kvantifisere fine motor ytelsen og opprette sammenligning tomter mellom dyr og tidspunkt.

Representative Results

Etter metoder presenteres her, rotter fullført åpne feltrutenettet og stigen tester 2 x per uke. Dataene ble analysert både ved hjelp av BVAS, og manuelt med stop-se av trent og nybegynner anmeldere. Resultatene som presenteres er et gjennomsnitt av de rå ukentlige scorene fra en enkelt ikke implantert kontroll dyr over en 8 ukers studie, der uke "0" tilsvarer planlagt testing. Merk det var ingen testing i uke 1 da dette var resten uken for kirurgi dyrene. Fordi åpne feltrutenettet er testet 1 x per dag, stigen er testet 5 x per dag, og det er to testing dager per uke, det er en prøve av 16 prøvelser for åpne feltrutenettet mens det er 80 prøvelser for stigen testen i den samme 8 uken periode.

BVAS vs manuelle analyser:
For å bekrefte konsistensen av BVAS systemet og validere den mot manuelle analyser, resultatene for rutenett krysset og stigen krysset tiden ble sammenlignet med manuell fra tre ekspert lesere (n = 3) som en "gull standard." Nybegynnere (n = 7) også gjennomgått dataene både manuelt og bruker BVAS. For å validere, hver korrekturleser undersøkt samme én dag eksperimenter for en dyr (rutenett testing = en video/trial; stigen testing = fem uavhengige forsøk). Resultatene for åpne-feltet rutenettet test viste at ekspert anmeldere var mer konsekvent enn nybegynner anmeldere var (en variansen av 0 mot en variansen til 17,1, henholdsvis), men når du bruker BVAS, det var null varians for både ekspert og begynner brukernes ( Figur 4 A)., resultatene for stigen test viste at ekspert anmeldere var mer konsekvent enn nybegynner anmeldere var (~3.5x større: en variansen av 0.120 versus et avvik i 0.414, henholdsvis), men når du bruker BVAS, det var igjen null variansen for både ekspert og begynner brukernes (Figur 4B).

Derfor der mulig, atferdsberegninger for både åpne feltrutenettet og stigen test ble kvantifisert manuelt ved samme ekspertbrukeren og sammenlignet resultatene som genereres ved hjelp av BVAS. Her, ble alt inkludert dyr gjennom hele resultatene av eksperimenter evaluert. Alle feil rapporteres som en standard feil av gjsnitt (SEM) med mindre rapporteres ellers. Forskjellen mellom de to metodene varierte gjennomsnittlig 0,64 ± 0,06 s stigen testen og 3.56 ± 0.53 linjer for rutenettet testen. Gjennomsnittlig forskjellen for åpne-feltet rutenettet testen i løpet av 8 uker mellom de to metodene var 11.13 ± 3.03%. Gjennomsnittlig forskjellen på stigen testen i løpet av 8 uker mellom de to metodene var 9.05 ± 1.07%. Prosent forskjellen mellom de to metodene ble beregnet etter Formel 1.

Formel 1:

Merk også for stigen test timing, manuell datainnsamlingen er bare nøyaktig 1 s (som kan endres basert på enheten brukes til å holde tid), mens BVAS er nøyaktig til inverse av bildefrekvensen for videoen er vurdert. For eksempel hvis videoen er filmet på 15 bilder per sekund, er BVAS dataene nøyaktig til 1/15^th av et sekund.

Åpen rutenettet test:
Etter tidligere publiserte protokoller^12,13, dyr ble tillatt å løpe fritt i en åpen rutenettet test for 3 min til å måle deres grov motoriske funksjoner og stress atferd. Videoen registrert under testing ble analysert ved hjelp av BVAS for å kvantifisere de rå scorene for maksimal hastighet, den totale avstanden, antall støttelinjer krysset og andelen høyresvinger av dyret (figur 5). Disse dataene er bare representant for en dyr, ble trender sett i løpet av studiet av økt maksimal hastighet oppnås, økt total distanse reist, og et økt antall støttelinjer krysset. Ikke overraskende, i forhold til hverandre, den totale avstanden reist, og totalt rutenettet krysset hadde en sterk positiv korrelasjon. Sammenligne manuell kvantifiseringen til BVAS støttelinje kvantifiseringen avslørte sammenlignbare resultater (figur 5C). For denne spesielle dyr svevde prosentandelen av høyresvinger hovedsakelig mellom 40% og 50% (figur 5D). Av notatet var beregningene for total distanse, maksimal hastighet og turn retning ikke kan kvantifiseres manuelt, og representerer en ekstra funksjon av automatiserte BVAS programmet.

Stigen test:
Som tidligere rapportert^4,14, ble stigen testing fullført for å måle koordinert forståelse og fin funksjon. Videoen registrert under testing ble analysert ved hjelp av BVAS for å kvantifisere de rå scorene for tiden å krysse og antall pote slips (figur 6). I dette dyret var det en fallende trend i tiden å krysse stigen, etterfulgt av en økning i tid starter rundt uke 4. Sammenligne manuell kvantifiseringen til BVAS avslørte krysset tid kvantifisering sammenlignbare resultater (figur 6en). Dyret presentert var en ikke-kirurgisk kontroll, var pote slips sjeldne, og tilsvarende i tall mellom venstre og høyre paw (figur 6B).

Figur 1 : Eksempel på åpen rutenettet testresultater. (A) dette panelet viser de atferdsmessige testing 1 m² åpne testing med svart bakgrunn og rosa rutenettlinjer. (B) Dette er et eksempel på en tomt på en enkelt dyrets 3-minutter rutenettet kjøre. Dette dyret gjort én krets i rutenettet og deretter forble stort sett ro for resten av tiden. Rød O's and x betegne hvor algoritme slå oppdaget venstre (O) eller en (X) høyresving. (C) Dette er et annet eksempel av en tomt på en enkelt dyrets 3-minutter rutenettet kjøre. Dette dyret var svært aktive i hele 3-minutter tester periode. Rød O's and x betegne hvor algoritme slå oppdaget venstre (O) eller en (X) høyresving. (D) Dette er et eksempel på utdata i datafilen i to går i paneler B og C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Eksempel på en stige data anmelder skjermen. (A) dette panelet viser stigen data anmelder skjermen, komplett med et skjermbilde viser stigen test oppsettet. Denne skjermen er der brukeren vil bekrefte oppdaget følgesedler og feil. Dette eksemplet viser en positivt oppdaget rett foran labben slip. (B) Dette er et eksempel på utdata i datafilen for stigen kjøre som ble undersøkt i A-panelet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Eksempel på BVAS analyse skjermer. (A) dette panelet viser menyen øverst på BVAS. Merk de fire knappene langs bunnen og rullegardinmenyen E-postinnstillinger i øvre venstre hjørne. (B) Dette er et eksempel på en filen utvalgsskjermen, i dette tilfellet for stigen video analyse. (C) Dette er et eksempel på et debug analyse visningsprogram for rutenettet test video. Dette demonstrerer algoritmen under analysen av en rutenett. (D) dette panelet viser et eksempel på en debug analyse seer for en stige test video. Dette demonstrerer algoritmen under analysen av en stige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Eksempel på ekspert og begynner testing resultater. Disse skjermbildene viser resultatene av en håndbok og en BVAS ekspert og nybegynner testing for (A) antall støttelinjer krysset på åpen rutenettet test og (B) tid til å krysse på stigen test. For begge tester viste resultatene at ekspertbrukere hadde en lavere varians enn nybegynnere for manuell analyse, mens bruker BVAS resulterte i null avvik, uansett bruker kompetanse. Standardavviket er rapportert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 : Representant åpne feltet rutenettet testresultater. Disse skjermbildene viser representant åpne feltet rutenettet testresultater for en ikke-implantert kontroll dyr for (A) maksimal hastighet oppnås, (B) total distanse, (C) antall støttelinjer krysset og (D) det andelen høyresvinger laget av dyret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6 : Representant stigen testresultater. Disse skjermbildene viser representant stigen testresultater for en ikke-implantert kontroll dyr for (A) tid til å stige, og (B) nummeret av høyre - og venstre-foran-pote følgesedler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den mest kritiske delen av protokollen for å sikre en sterk analyse er konsekvent filmingen. Hvis videoene er godt opplyst og filmet på riktig sted som beskrevet i den første delen av protokollen, vil systemet kunne gjøre en nøyaktig analyse. Som med alle bildebehandling problem, vil arbeidet i forbehandling gjøre etter behandlingen mer nøyaktig og enkelt. Slik betyr gjør at apparatet og dyr er godt opplyst under testing og eventuelle skygger eller andre bevegelse i rammen holdes til et minimum at BVAS kan fungere på et høyere nivå av nøyaktighet.

Protokollen presenteres her kan brukes til å effektivt og reproduserbar analyserer resultatene fra både grov og fin funksjon testing i gnagere via en åpen rutenett og en stige test. I tillegg reduserer det muligheten for menneskelige feil eller skjevhet i analyseprosessen dataanalyse er hovedsakelig fullført av selv fungerende datamaskinen uten noen brukerinndata. Denne nye funksjonen kan BVAS systemet brukes med samme nivå av nøyaktighet av både ekspert og begynner brukernes. BVAS programmet er selv kontrollere, enkel å implementere og rimelig å bruke. Videre kan koden tilpasses etter forskerens individuelle behov. For eksempel åpen grid code kan brukes til å analysere en rekke beregninger inkludert den totale avstanden reist, maksimal hastighet oppnås, og venstre og høyre svinger, og sannsynligvis lett kunne modifiseres sporing i en vann-labyrint eller tvunget svømme t spør. Ytterligere endringer kan gjøres til koden å gjøre rede for ulike rom lys, forskjeller i rutenettet og stigen linjefarge og forskjeller i dyr fargen. Selv om testing apparatet og BVAS koden presenteres her er utformet for bruk i rotte studier forventer vi at enten kan skaleres opp eller ned for å brukes med forskjellige størrelser dyr, selv om dette ikke er bekreftet ennå.

Som med alle opptreden testing og data analyse, er det viktig å opprettholde konsistens så mye som mulig gjennom studiet og påfølgende analyser. Selv om de presenterte BVAS reduserer tillit menneskelig input for dataanalyse, kan menneskelige avvik tiltre lek med forskeren med dyr og håndtering prosedyrer¹⁵. Videre kan endringer i testing sted¹⁶ eller boliger og røkting forhold¹⁷ også påvirke resultatene. Mens BVAS kan oppdateres til kontoen for belysning og kameravinkel, regnskapsføres faktorer som lukter, personell eller kosthold bare ved studien. Forskere bør derfor ta forsiktig å være så konsekvent som mulig i dyreforsøk og bolig vilkårene, personell og analytiske metoder, blant andre.

BVAS er romanen sin sammensatte detection system. Hver ramme av videoen sendes gjennom flere bilde filtre å opprette binære masker alle kalibrert for å se etter rotta inne rammen. Hver mulig rotte figur er deretter vurdert av systemet på dens sannsynlighet for er rotta. Denne rangeringen faktorer i størrelse, antall filtre figuren oppdages, og den siste kjente posisjon og anslåtte plasseringen av dyret basert på forrige banen. Dette gir en sterk dyr oppdagelsen som kan overvinne problemene som oppstår basert på skygger og endringer i belysningen. I motsetning til gjeldende kommersielt tilgjengelig dyr sporingssystemer, denne metoden krever ikke noen endringer til dyret til å gjøre den mer synlig og bruker en enkelt standard hastighet webcam for video-opptaket. BVAS systemet er også en forbedring over konvensjonelle manuelt kvantifisert atferd testing fordi alle beregninger som er outputted måles objektivt fra videoer. Et menneske kvantifisert atferdsmessige studie vil ha noen subjektivitet i naturen som forskeren bestemmer hva utgjør en labb slip eller rutenett krysser.

Systemet krever en noe bestemt oppsett for å fungere til sin fulle evner. Mens det er mulig å tilpasse systemet til endringer i apparatet, vil det nå kreve noen flyt i datamaskin koding for å redigere koden. Med noen koding flyt gjøres feilsøking enkelt fordi feilen merke e-post som inkluderer en full feil informasjon avlesning. Hvis videoene matet inn i systemet ikke på ideelle oppløsning eller rammen rate (1080 p, 15 fps), er brukeren varslet via en advarsel. Denne endringen vil påvirke nøyaktigheten av systemet, men det fortsatt kan kjøre på lavere oppløsning videoer. Noen belysning eller skyggen problemer som forårsaker en feil under analysen vil føre til en dynamisk melding sendt til angitt av brukeren. Brukeren kan deretter bruke debug betrakteren for å se bilde for bilde-analyse for å forstå hva problemet oppsto. Feilmeldingen inneholder også en feil rapport, så hvis det er en koding problem, det kan tas bare.

I fremtiden kan BVAS systemet kunne tilpasses ytterligere uten kunnskap om syntaksen fra koding programvare. Tillegg av en sporing alternativmenyen kan tillate brukeren å velge fargen på dyr og rutenettet linjene enkelt og bekvemt. Stigen testen sporing vil også øke i nøyaktighet med mulig tillegg av en gjennomgripende objektet detektor i koden og en bedre stige lysrigg med stigen testen og filming apparater. Derfor forventer vi at BVAS systemet beskrevet her lett kan implementeres i en oppstille av atferdsmessige og motor oppgaver som spenner over et bredt utvalg av sykdom og skader modeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rats, male, 201-225 g	Charles River	CD
Webcam HD Pro c920	Logitec	960-000764
Excel	Microsoft	N/A
Matalb 2017a, Computer Vision System Toolbox	Mathworks	N/A
Open field grid test	Made in-house at Case Western Reserve University	N/A
Ladder test	Made in-house at Case Western Reserve University	N/A