Summary
De huidige studie is gericht op het automatiseren van de kwantificatie van motorische tekorten bij ratten. De eerste evaluatiemodel beoordeelt motor schade als gevolg van de implantatie van een intracortical micro-elektrode in de motorschors. Wij rapporteren over de ontwikkeling en het gebruik van een algoritme van de bijhouden met behulp van gemakkelijk aan te passen, eenvoudig en gemakkelijk beschikbaar codering software.
Abstract
We hebben onlangs aangetoond dat het inplanteren van intracortical microelectrodes in de motor corteces van ratten tot onmiddellijke en duurzame motor tekorten leidt. Motor afwaarderingen waren handmatig gekwantificeerd door middel van een open veld raster test voor het meten van de bruto motor functie en een ladder test voor het meten van de fijne motorische functie. Hier bespreken we een techniek voor geautomatiseerde kwantificering van de video-opgenomen tests met behulp van onze aangepaste Capadona gedrags Video analysesysteem: raster en Ladder Test of BVAS. Leveraging eenvoudig en gemakkelijk beschikbaar codering software (Zie de Tabel van materialen), dit programma biedt voor het volgen van een enkel dier op het open veldraster zowel de ladder-tests. In open veldraster bijhouden, de drempels van de code van de video voor intensiteit, tracks van de positie van de rat gedurende de looptijd van de 3 min van detest raster en analyseert het pad. Vervolgens berekent en retourneert de metingen voor de totale afgelegde afstand, de maximale snelheid bereikt, het aantal links - en rechtshandig bochten en het totale aantal rasterlijnen doorkruist door de rat. In ladder tracking, de code opnieuw drempels de video voor de intensiteit, de beweging van de rat tracks in de ladder en rendement berekende metingen inclusief de tijd die het duurde de rat te steken van de ladder, het aantal paw glijdt die zich voordoen onder het vlak van de sporten van de ladder, en de incidentie van storingen als gevolg van de stagnatie of terugboekingen. Wij voorzien dat de BVAS hier ontwikkeld kunnen worden ingezet voor de analyse van motor functie in een verscheidenheid van toepassingen, waaronder vele modellen van letsel of ziekte.
Introduction
Er zijn vele gevestigde methoden zowel motor van functionele en gedragsmatige en cognitieve waardeverminderingen1,2,3te beoordelen. Enkele van de meer algemeen werkzame methoden omvatten testen fijn motorische functie via de plaatsing van de poot, intensivering en coördinatie van de ledematen op een ladder test4, testen bruto motor functie en stress gedrag via het open veld raster test5 ,6, en testen voor angst, depressie en wanhoop via het gedwongen zwemmen test7,8 of rotor staaf9. Echter, veel van deze methoden rekenen op menselijke onderzoekers gaan "scoren" van het dier of te subjectief zijn prestaties beoordelen. De noodzaak van een subjectieve menselijke beoordeling kan vertragen de productie en de analyse van de gegevens, evenals presenteren de gelegenheid voor een opzettelijke of onopzettelijke invloed van onderzoek bias in de studie10. Verdere, subjectieve beoordeling van de gegevens presenteert ook het risico van onjuiste gegevens representatie, zij het door middel van vergeetachtigheid, slechte motivatie, onjuiste training of nalatigheid11.
We hebben onlangs gemeld dat het gebruik van zowel een open veld raster en een ladder test bij ratten geïmplanteerd met intracortical microelectrodes12,13. Als gevolg van de nieuwheid van de bevindingen van die studies, we onmiddellijk begonnen die in dienst en extra functionele testen in vele lopende studies in het laboratorium. In afwachting van onbedoelde mens-gegenereerde variabiliteit ten gevolge van een toename van het aantal subjectieve beoordelaars, en ter verbetering van de analyse-doorvoer, uiteengezet we om een geautomatiseerde, computerondersteunde programma te scoren gedrags testen, en het potentieel voor fout sterk te beperken.
Wij rapporteren hier, over de ontwikkeling van de BVAS. De BVAS gebruikt computer analyse om te scoren een open veld raster en een ladder test statistieken van bruto en fijne motor functie, respectievelijk. De resultaten kunnen worden gebruikt voor verhelderen van mogelijke motor functie tekorten, veroorzaakt door letsel of ziekte, ongeacht het model letsel of ziekte. De code analyse kunnen worden aangepast aan wijzigingen in behavioral testapparatuur of te scoren verschillende statistieken van motor functie voor hun rekening. Daarom kunnen de BVAS in vele toepassingen, buiten onze beoogde gebruik of het beoogde gebruik van die momenteel werkzaam bij andere laboratoria worden geïmplementeerd.
Merk op dat de open veldtesten raster en ladder video-opname vereisen. Elke test vergt daarom een video camera [1080 p, minimum 15 frames per seconde (fps)], een laptop en een opslagruimte voor de videogegevens. Voor beide tests, plaatst u de camera in een gecentreerde positie, waardoor voor het hele apparaat op het frame te zien. De camera op een statief of steigers te verankeren zodat het niet tijdens het testen verschuift. De randen van het videoframe zo dicht mogelijk bij parallel met de randen van het testen apparaat mogelijk houden. Zorg ervoor dat het dezelfde personeel voltooien alle testen en de kamer is goed verlicht met een temperatuurgevoelig systeem. Gebruik de zelfde ruimte voor alle dieren in de loop van het testen, met minimale wijzigingen naar de kamer. Granen of bananenchips maken goede beloningen ter bevordering van het voltooien van de tests van het gedrag van de dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures en praktijken van de verzorging van de dieren werden goedgekeurd door en uitgevoerd overeenkomstig het Louis Stokes Cleveland afdeling veteranen zaken Medical Center institutionele Animal Care en gebruik Comité. Het gedrags test protocol volgt eerder gepubliceerde werk12,13.
1. gedrags testen: Filmen de taken
Opmerking: Hier, de dieren werden getest op 8 weken te detecteren elke chronische gedragsveranderingen. De werkstudenten is afhankelijk van het model van de toepassing/blessure/ziekte gebruikt voor de studie.
-
Open rooster veldproeven
Opmerking: De raster-test heeft een 1 m2 oppervlakte met 40 cm muren en huis werd gebouwd. De onderkant is gepartitioneerd in negen vierkanten via helder gekleurd tape(Figuur 1). Voor het gebruik van de geautomatiseerde BVAS is het belangrijk dat de kleur van de lijn en het raster met de rat contrast. Hier, werden witte Sprague-Dawley ratten gebruikt; Dus, de grid achtergrond zwart was geschilderd, en de regels werden gemaakt met helder roze tape.- De proefdieren 2 x per week voor alle tests met inbegrip van de week voor het begin van de studie te maken van een basislijn-score voor gebruik in latere berekeningen.
- Reinig alle de testapparatuur die met een chloor kooldioxide gebaseerde sterilant aan het begin van elke test sessie en tussen elk dier.
- Breng de dieren naar de kamer voor het testen en laat hen aan te passen aan de ruimte voor 20 min voor het begin van de proeven.
- Beginnen met filmen en plaats het dier in het midden van het raster, geconfronteerd weg van de onderzoeker, om te beginnen met de test van het raster.
- Laat het dier te lopen vrij voor 3 min terwijl de video wordt opgenomen van bovenaf.
- Stoppen met filmen wanneer de 3 min periode is afgelopen en het dier terug naar haar kooi. Reinig het raster met een chloor kooldioxide gebaseerde sterilant, verzorgen volledig drogen de oppervlakken voor testen. Testen van elk dier 1 x per sessie.
-
Ladder testen
Opmerking: De ladder test in eigen huis werd gebouwd en bestaat uit twee acryl zijwanden, elke 1 m in lengte, verbonden door 3 mm diameter sporten regelafstand 2 cm tussenpozen (Figuur 2). De dieren moeten een week van de ladder opleiding voordat u begint met de officiële controle. Er is geen verschil tussen de opleiding en het test protocol. Merk op dat de opleiding niet hoeft te worden opgenomen.- Voor het gebruik met de BVAS, betrekking hebben op de muur achter de ladder met een zwarte Aanplakbord en het niveau van de sporten, start en finish lijnen met helder tape maken een contrast met het witte ratten af te bakenen.
- De proefdieren 2 x per week voor alle tests met inbegrip van de week voor het begin van de studie een score van de basislijn voor gebruik in latere berekeningen maken.
- Reinig alle de testapparatuur die met een chloor kooldioxide gebaseerde sterilant aan het begin van elke test sessie en tussen elk dier.
- Breng de dieren naar de kamer voor het testen en laat hen aan te passen aan de ruimte voor 20 min voor het begin van de proeven.
- Plaats het dier in een schoon tijdelijke kooi voor het testen van de ladder.
Opmerking: Een tijdelijke kooi is een korte kooi te houden van het dier, terwijl de kooi van het dier wordt gebruikt aan het eind van de ladder. Er is geen leeftijd bias als alle dieren die worden gebruikt in de studie zijn dezelfde leeftijd en volledige testen over dezelfde periode. Het besturingselement wordt hier gebruikt is een naïef dier nooit chirurgie hebben ontvangen. - Instellen van het apparaat van de ladder tot span twee kooien; de start-kooi is een schone kooi en de kooi van het einde is van het dier levende kooi, een stimulans voor het voltooien van de run.
- Plaats de camera op een statief, gecentreerd op de lengte van de ladder. Breiden het statief, zodat de lens van de camera op het hoogtepunt van de sporten van de ladder is. Plaats de camera zodanig dat de sporten zijn precies afgestemd op de lens zoals dit belangrijk voor de slip detectie algoritme in de BVAS code is.
- Start de video-opname en laat de rat om te beginnen met het punt door te houden hun voorste poten over de eerste sport van de ladder. Laat het dier te gaan naar de ladder zonder hulp.
- Laat het dier tijdens het filmen van de startlijn overstappen naar de finish in hun eigen tempo. Einde van de video-opname en verwijder het dier van de ladder zodra het dier de run is voltooid.
- Overwegen de run een mislukte run als het dier zich omdraait of blijft stagnerende voor 20 s. einde de video-opname en het dier uit de ladder te verwijderen indien het dier niet het punt. Het toewijzen van een straf score voor mislukte loopt dat gelijkwaardig aan de langzaamste tijd opgenomen is tijdens het pre chirurgie basislijn testen.
- Zorgen dat elk dier 5 punten voltooit per dag testen en geef ze een rustperiode van 1 min tussen elk afzonderlijk experiment.
Opmerking: In deze studie, de dieren waren getest 2 x per week gedurende 8 weken. Het tijdschema is echter aan de discretie van de onderzoeker.
2. bestand opslag en naamgeving
Opmerking: De BVAS code gebruikt specifiek aangewezen video bestanden en mappen naamgevingsconventies zodat video's op betrouwbare wijze kunnen worden geparseerd en goed geanalyseerd. Verschillende Naamgevingsconventies worden momenteel niet ondersteund. Na de voltooiing van een test sessie, wordt de video-bestand opgeslagen in de standaardlocatie onder een standaardnaam.
-
Individuele video naamgeving
- De naam van elke video met het dier aanwijzing voor alle raster testen van video's.
- Verzamel 5 ladder video's per sessie voor elk dier te testen. Selecteer alle vijf video's en de naam van de eerste video, met behulp van de aanwijzing van het dier. Bijvoorbeeld, als de naam van het dier is "C1NS", de bestanden zijn met de naam "C1NS (1)", "C1NS (2)", "C1NS (3)", enz.
-
Opslag map naamgeving
- Neem de video's nu vernoemd naar elk dier en plaatst u de bestanden in hun eigen opslagmap. Naam van deze map met behulp van de volgende Conventie: "TestingWeek_TestMode_MM_DD_YY".
Opmerking: als bijvoorbeeld deze map bevat de eerste week van raster video's en werd gefilmd op 1 januarist, 2018, de map houden deze video's heet "Week1_GridTest_01_01_18". - Plaats deze specifiek benoemde geplaatst in een andere map die zal duiden de grotere studie die dit van experimenten instellen behoort tot.
Opmerking: Er zijn geen naamgeving vereisten voor het mappensysteem van de boom om te houden van de studies en testen modi georganiseerd. De enige map die het systeem selecteert is de map Video's genoemd in stap 2.2.1 te houden.
- Neem de video's nu vernoemd naar elk dier en plaatst u de bestanden in hun eigen opslagmap. Naam van deze map met behulp van de volgende Conventie: "TestingWeek_TestMode_MM_DD_YY".
-
Aanmaak van spreadsheet-bestanden
- Met behulp van een extern spreadsheetprogramma (Zie de Tabel van materialen), maak een nieuwe lege spreadsheet-bestand voor het opslaan van de gegevens voor elke studie en testen modus.
Opmerking: Er zijn geen naamgeving of opslag Locatievereisten voor dit bestand. Elke studie vereist twee spreadsheet-bestanden voor gebruik met het systeem, één voor het testen van het raster en één voor het testen van de ladder. Laat deze bestanden leeg voor nu. - Controleer of dat deze spreadsheet-bestanden zijn niet open op alle computers, terwijl de BVAS wordt uitgevoerd.
Opmerking: Als de BVAS probeert te openen van een spreadsheet-bestand dat al is geopend, zal dit resulteren in een fout.
- Met behulp van een extern spreadsheetprogramma (Zie de Tabel van materialen), maak een nieuwe lege spreadsheet-bestand voor het opslaan van de gegevens voor elke studie en testen modus.
3. de systeeminstallatie
Opmerking: De BVAS is gebouwd en getest op PC-besturingssystemen en hefbomen Runtime componenten van eenvoudige en gemakkelijk beschikbaar codering software. Andere systeemconfiguraties worden momenteel niet ondersteund.
-
Installeren van de nieuwste versie van de BVAS
- Voer het installatieprogramma door te dubbelklikken op het pictogram van de installateur met het label 'BVASX. XXinstaller'. "X.XX" is het huidige versienummer, op dit moment 'BVAS3.30installer'.
Nota: Dit is een open source-software. Neem contact op met de overeenkomstige auteur voor de meest recente versie. - Volg de aanwijzingen op het scherm instructies voor het installeren van de BVAS.
Opmerking: Het installatieprogramma zal het controleren van het systeem voor de juiste versie van de software (bijv., MATLAB Runtime) en als het niet wordt gevonden, zal het de software installeren vanaf het internet. - Zodra geïnstalleerde, lanceer het programma door te klikken op de 'BVAS.exe' bestand.
- Voer het installatieprogramma door te dubbelklikken op het pictogram van de installateur met het label 'BVASX. XXinstaller'. "X.XX" is het huidige versienummer, op dit moment 'BVAS3.30installer'.
4. systeem gebruik
- Het programma openen
- Dubbelklik op het pictogram voor een programma van de BVAS om de BVAS hoofdmenu waarmee de volgende opties: 'Grid analyse', 'Ladder analyse', 'Ladder Review' of 'Stop'.
Opmerking: Er is ook een drop-down menu, gelegen in de linker bovenhoek met het label 'Email Settings' (Figuur 3A).
- Dubbelklik op het pictogram voor een programma van de BVAS om de BVAS hoofdmenu waarmee de volgende opties: 'Grid analyse', 'Ladder analyse', 'Ladder Review' of 'Stop'.
- E-mailinstellingen
- Klik op de 'E-mailinstellingen' drop-down menu en selecteert u eerst 'verandering e-mail bestemming'.
- Voer een gewenste e-mailadres voor het ontvangen van updates op de analyse en selecteer 'OK'. Selecteer 'Annuleer' als u wilt wijzigen niet de e-mail die op dit moment opgeslagen.
- Klik op de knop 'Test E-mail verzenden' een test om e-mail te verzenden aan de e-mail momenteel opgeslagen in het systeem. Dichtbij de 'E-mail verzonden!' venster pop-up betekenende voltooiing van de test.
- Open veld raster Test analyse
- Selecteer 'Grid analyse' in het bovenste menuscherm.
- Zorg ervoor de toggle knop 'Interne Video/hele sessie/Plot gegevens' hele sessie om te voltooien van de analyse van een hele reeks testen sessie video's wordt weergegeven.
- Gebruik maken van de "..."-knop naast het bovenste invoervak bladeren het bestandssysteem om te zoeken naar het bestand van video's om te analyseren. Selecteer de map met de naam in de stijl die in stap 2.2.1 besproken.
- Gebruik de... knop naast het lagere invoervak bladeren het bestandssysteem Schakel de spreadsheet-bestand waarin de gegevens op te slaan.
Opmerking: Merk op dat, evenals het uitvoeren van de gegevens naar een werkbladbestand, de volledige pad gegevens voor elke video wordt opgeslagen in een gegevensbestand (.mat) in dezelfde map die in het bezit van de video's gekozen in stap 4.3.3. - Controleer de wisselknop vermeld in stap 4.3.2 is ingesteld op 'Één Video' om te voltooien van de analyse op een enkele video.
- Gebruik de... knop naast het bovenste invoervak bladeren het bestandssysteem om te zoeken naar het bestand van de video te analyseren.
- Gebruik de... knop naast het lagere invoervak bladeren het bestandssysteem om te selecteren van een map op te slaan van het gegevensbestand (.mat) die uit de interne video-analyse voortvloeit.
Opmerking: Het gegevensbestand zal worden vernoemd naar de video, die is vernoemd naar het dier. - Selecteer 'Uitvoergegevens' in de knevel vermeld in stap 4.3.2. voor de uitvoer van de gegevens uit een eerder geanalyseerde raster video. Voorbeelden van deze uitgezette gegevens staan in cijfers 1B en 1 C.
- Gebruik de... knop naast het bovenste invoervak bladeren het bestandssysteem om een eerder gemaakte raster videogegevens bestand te selecteren. Selecteer 'gaan!' te creëren van de plot en gegevens figuur.
Opmerking: Deze functie maakt ook een tekstbestand met de naam dezelfde en gelegen in dezelfde map als het gegevensbestand, die het dier heeft run gegevens daarin. - Zodra beide vereiste bestanden gelegen zijn, selecteer 'gaan!' om te beginnen met de video-analyse. Merk op dat de "terug" knop zal het heropenen van het bovenste menu en de 'Quit'-knop zal het programma volledig sluit. Kies de knevel van de 'Debug scherm' om te laten zien van een visuele weergave van de tracking-algoritme (cijfers 3 c en 3D).
- Selecteer 'gaan!' om te beginnen het analyseproces. Bekijk de beelden van elke video op het scherm van de revisor. Gebruik de pagina van de knoppen 'volgende' en 'vorige' als er meer dan vijf video's.
- Om een handmatige selectie menu, selecteer de knop 'bewerken' als geen groene regels of de groene lijn niet lijkt te worden in het juiste vierkant rond het gebied van testen. Als u wilt de hoeken bewerken, klik op de knop 'Hoeken bewerken'.
Opmerking: De knop 'Volgende Frame' verandert de representatieve afbeelding naar het volgende frame van de video in kwestie. Selecteer de knop 'Volgende Frame' als het frame automatisch gegeven wordt belemmerd of onscherp. - Volg de instructies rechts van de representatieve afbeelding Selecteer het testen gebied en druk op 'Enter' om de selectieproces te voltooien.
Opmerking: De geselecteerde groene regels wordt nu getoond op de representatieve afbeelding. - Selecteer 'gedaan' de selectie opslaan en terugkeren naar het scherm van de revisor.
- Selecteer 'gedaan' knop in het midden om de volledige analyse te starten zodra het raster gebied voor elke video correct is geselecteerd. Het programma laat werken en, na voltooiing, verschijnt de melding van een succes.
Opmerking: De volledige analyse van een sessie van video's kan enige tijd duren, ongeveer 10 min per dier.
- Ladder test analyse
Opmerking: Het protocol voor de analyse van de eerste ladder test is zeer vergelijkbaar met het protocol beschreven in stappen 4.3.10–4.3.15. De opmerkelijke verschillen voordat die stappen zijn als volgt:- Selecteer 'Ladder analyse' uit het bovenste menu om de ladder analyse menu te openen.
- De twee opties in de knevel, 'Enkele Video' en 'Hele sessie' (Figuur 3B) bekijken.
- Met 'Hele sessie', selecteer de bovenste ingang... knop selecteert u de map met ladder video's met de naam in stap 2.2.1.Select de onderste... knop om te selecteren van een map naar een map met de gegevens worden opgeslagen vanaf de ladder video's later bekijken.
- Als 'Één Video' is geselecteerd, selecteert u een enkele video bestand met de bovenste... knop en een locatie gelijk aan stap 4.4.3.
- Selecteer 'gaan!' om te beginnen met het analyseproces en opvoeden van de ladder test gebied revisor scherm.
- Volg de stappen 4.3.10–4.3.15 voor de ladder voor het raster op dezelfde wijze. Het programma laat werken en, na voltooiing, verschijnt de melding van een succes.
Opmerking: Als er iets misgaat tijdens de analyse, is een e-mail verzonden naar het e-mailadres hebt opgegeven in stap 4.2.2. Na voltooiing van een analyse van welke aard, wordt een voltooiing e-mail verstuurd naar hetzelfde e-mailadres.
- Ladder beeld beoordeling
Opmerking: Het volgende protocol is te herzien eerder geanalyseerd ladder video's om te bevestigen eventuele storingen en paw enten. Opmerking, spreadsheet-bestanden voor een ladder kruising worden niet gegenereerd om te bekijken totdat 'Ladder Image Review' (stappen 4.5.1–4.5.5) is voltooid.- Van het hoogste menu, selecteer 'Ladder Image Review'. Dit brengt omhoog de Ladder Review Selecteer bestandscontrole.
- Selecteer de... boven knop selecteert u de map van de gegevensbestanden.
Opmerking: De bestanden zijn opgeslagen op de locatie gekozen in stap 4.4.2 en heten in de volgende notatie: "M1_D1_Y1 Ladder Video sessie HH_MM M2_D2_YYYY". M1, D1 en Y1 zijn de datum van de zitting wordt geanalyseerd. "Ladder videosessie" lezen "Enkele Video-analyse" als slechts een enkele video werd geanalyseerd. HH_MM en M2_D2_YYYY zijn de datum en tijd waarop de evaluatie-sessie is gestart. - Select de onderkant... en selecteer het werkbladbestand gemaakt voor de studie.
- Selecteer 'gaan!' het handoverzicht-proces te starten.
- Bekijk het menu automatisch geopende ladder data revisor. Als een slip wordt gedetecteerd, gebruik van de 'Volgend Frame' en 'Laatste Frame' knoppen om te controleren elke opeenvolgende frames opgenomen, indien beschikbaar.
- Gebruik maken van de slip knevel u wilt aanduiden welke voet van de rat heeft gleed. Laat de knevel op 'No-Slip' als de detectie een valse is positieve. Klik op 'Save/doorgaan' om verder te gaan naar de volgende detectie(Figuur 2).
- In het geval van mislukking, gebruikt de knevel om aan te duiden of het falen te wijten aan omkering (waar de rat draaide zich om tijdens de run) of stagnatie is (waar de rat is niet voltooid de run op een tijdige manier).
- Klik op 'Save/doorgaan' om verder te gaan naar de volgende detectie. Op de laatste detectie, klikt u op 'Opslaan/doorgaan' ter voltooiing van de analyse en de gegevens opslaan in het werkbladbestand eerder gekozen. Ontslaan van de aankondiging van de voltooiing.
Opmerking: Nadat de test is voltooid, de map, die werd herzien is omgedoopt tot "Herzien M1_D1_Y1 Ladder Video sessie HH_MM M2_D2_YYYY".
5. output Data-analyse
-
Raster-werkbladbestand
- Zoek de gecreëerde gegevens in de spreadsheet-bestand uit elke video raster.
Opmerking: De kolommen zijn links naar rechts als volgt: dierlijke naam, datum van de test, week van de studie aantal, totale afstand reisde, totale tijd gestopt, maximale snelheid bereikt, rechts draait, draait links en rasterlijn kruist (Figuur 1D). - Gebruiken deze statistieken om te kwantificeren van de bruto motor prestaties en maken vergelijking percelen tussen dieren en tijd punten.
- Zoek de gecreëerde gegevens in de spreadsheet-bestand uit elke video raster.
-
Ladder-werkbladbestand
- Zoek de gecreëerde gegevens in de spreadsheet-bestand uit elke ladder video na het mislukken en paw slip beoordeling.
Opmerking: De kolommen zijn links naar rechts als volgt: dierlijke naam, uitvoeren nummer 1 – 5, week van de studie nummer, datum van de test, uitvoeren type (succes of falen), tijd van run voor successen, procent zal zijn voltooid, paw enten op elke poot en storingsconditie. De tijd-kolom is leeg voor een mislukking en de mislukking modus kolom zal lezen omkering of stagnatie (Figuur 2B). - Gebruiken deze statistieken om te kwantificeren van de goede prestatie van de motor en maken vergelijking percelen tussen dieren en tijd punten.
- Zoek de gecreëerde gegevens in de spreadsheet-bestand uit elke ladder video na het mislukken en paw slip beoordeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naar aanleiding van de methoden die hier gepresenteerd, ratten voltooid het open veldraster en ladder test 2 x per week. De gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de BVAS zowel handmatig met een stop-watch door getraind en beginnende recensenten. De resultaten zijn een gemiddelde van de ruwe wekelijkse scores van een dier één niet-geïmplanteerde besturingselement over een 8 week studie, waar week "0" komt overeen met het testen van de basislijn. Opmerking Er was geen testen tijdens week 1, want dit een week rust voor de dieren van de chirurgie was. Omdat het open veldraster geteste 1 x per dag, de ladder is getest 5 x per dag, en er zijn twee testen dagen per week, er is een steekproef van de 16 proeven voor open veldraster terwijl er 80 proeven voor de test van de ladder in de 8 week in dezelfde periode zijn.
BVAS VS. Handmatige analyse:
Om te bevestigen de consistentie van de BVAS-systeem en het valideren van handmatige analyse, de resultaten voor de rasterlijnen die gekruiste en ladder overschrijding van de tijd werden vergeleken met de handmatige resultaten van drie deskundige revisoren (n = 3) als een "gouden standaard". Beginnende gebruikers (n = 7) ook handmatig de gegevens van beide herzien en het gebruik van de BVAS. Voor de validatie, elke revisor onderzocht dezelfde één dag van experimenten voor een dier (raster testen = één video/proef; ladder testen = vijf onafhankelijke experimenten). De resultaten voor het open veld raster test toonde aan dat de deskundige reviewers consistenter dan beginnende reviewers waren waren (een afwijking van 0 versus een variantie van 17,1, respectievelijk), maar bij het gebruik van de BVAS, er was nul variantie voor zowel de beginner als de expert gebruikers ( Figuur 4 A). ook de resultaten voor de ladder test toonden dat deskundige reviewers consistenter dan beginnende reviewers waren (~3.5x groter: een variantie van 0.120 versus een variantie van 0.414, respectievelijk), maar bij het gebruik van de BVAS, er weer was nul variantie voor zowel de beginner als de expert gebruikers (Figuur 4B).
Dus, waar mogelijk, gedrag metrics voor zowel de open veldraster en de ladder test werden gekwantificeerd handmatig door dezelfde deskundige gebruiker en vergeleken met de resultaten gegenereerd met behulp van de BVAS. Hier werden de resultaten van alle opgenomen dieren tijdens de gehele duur van de experimenten geëvalueerd. Alle fout wordt gemeld als een standaardfout van het gemiddelde (SEM), tenzij anders vermeld. Het verschil tussen de twee methoden varieerde gemiddeld 0.64 ± 0.06 s voor de test van de ladder en 3,56 ± 0,53 lijnen voor de test van het raster. Het gemiddelde verschil voor het open veld raster test in de loop van 8 weken tussen de twee methoden was 11.13 ± 3,03%. Het gemiddelde verschil voor de test van de ladder in de loop van 8 weken tussen de twee methoden was 9.05 ± 1,07 procent. Het percentage verschil tussen de twee methoden werd berekend na vergelijking 1.
Vergelijking 1:
Opmerking ook voor de ladder test timing, de handmatige gegevensverzameling is alleen nauwkeurig zijn, 1 s (die kan veranderen afhankelijk van het apparaat gebruikt om te houden van de tijd), terwijl de BVAS is nauwkeurig is om de inverse van de frame rate van de video wordt herzien. Bijvoorbeeld, als de video is gefilmd op 15 frames per seconde, is de gegevens van de BVAS 1/15th van een seconde nauwkeurig.
Open veld raster test:
Na eerder gepubliceerde protocollen12,13, dieren mochten lopen vrij in een open veld raster test voor 3 min voor het meten van hun bruto motor functie en gedrag benadrukken. De video opgenomen tijdens het testen was geanalyseerd met behulp van de BVAS te kwantificeren van de ruwe scores voor de maximale snelheid, de totale afstand, het aantal rasterlijnen die gekruiste en het percentage van de rechtse bochten bereikt door het behandelde dier (Figuur 5). Hoewel deze gegevens is alleen vertegenwoordiger van één dier, werden trends gezien in de loop van de studie van hogere maximale snelheid bereikt, verhoogde totale afstand reisde, en een toenemend aantal rasterlijnen gekruist. Is niet verwonderlijk dat in vergelijking met elkaar, de totale afstand reisde, en de totale rasterlijnen die gekruiste had een sterke positieve correlatie. Vergelijken van de handmatige kwantificering aan de kwantificering van de BVAS rasterlijn geopenbaard vergelijkbare resultaten (Figuur 5C). Voor dit bijzondere dier zweefde het percentage van de rechtse bochten grotendeels tussen 40% en 50% (Figuur 5D). Van de nota konden de statistieken voor de totale afgelegde afstand, maximale snelheid en turn richting handmatig worden gekwantificeerd en vertegenwoordigen een andere toegevoegde eigenschap van de geautomatiseerde BVAS programma.
Ladder test:
Als eerder gemeld4,14, is het testen van de ladder voltooid om de gecoördineerde greep en fijne motorische functie te meten. De video opgenomen tijdens het testen was geanalyseerd met behulp van de BVAS te kwantificeren van de ruwe scores voor de tijd om over te steken en het aantal paw slips (Figuur 6). In dit dier was er een dalende trend in de tijd om over te steken van de ladder, gevolgd door een toename van de tijd beginnend rond week 4. Vergelijken van de handmatige kwantificering aan de BVAS kruising tijd kwantificering geopenbaard vergelijkbare resultaten (Figuur 6A). Als de aangeboden dier een niet-chirurgische besturingselement was, waren paw slips zeldzaam, en vergelijkbare in getal tussen de linker en rechter poot (Figuur 6B).
Figuur 1 : Voorbeeld van open veld raster testresultaten. (A) dit paneel toont de gedrags test 1 m2 open ruimte met een zwarte achtergrond en roze rasterlijnen testen. (B) Dit is een voorbeeld van een complot van een enkel dier 3-min raster uitvoeren. Dit dier maakte een circuit van het raster en vervolgens gebleven meestal stationaire voor de rest van de tijd. De rode O en x aanduiden waar de beurt detectie algoritme ontdekt een links (O) of een recht (X) schakelen. (C) Dit is een tweede voorbeeld van een complot van een enkel dier 3-min raster uitvoeren. Dit dier was zeer actief voor de gehele testperiode van 3-min. De rode O en x aanduiden waar de beurt detectie algoritme ontdekt een links (O) of een recht (X) schakelen. (D) Dit is een voorbeeld van de output in het gegevensbestand voor de twee runs gezien in panelen B en C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Voorbeeld van een ladder gegevensscherm revisor. (A) dit paneel toont de ladder revisor gegevensscherm, compleet met een screenshot demonstreren de ladder testschema. Dit scherm is waar de gebruiker zal bevestigen gedetecteerde slips en mislukkingen. Dit voorbeeld toont een positief gedetecteerde rechter voorpand paw slip. (B) Dit is een voorbeeld van de output in het gegevensbestand voor de ladder lopen die werd onderzocht in deelvenster A. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Voorbeeld van de BVAS analyse schermen. (A) dit paneel toont het bovenste menu van de BVAS. Opmerking de vier knoppen langs de onderkant en de E-mailinstellingen drop-down menu in de linker bovenhoek. (B) Dit is een voorbeeld van een bestandscontrole voor de selectie, in dit geval voor de video-analyse van de ladder. (C) Dit is een voorbeeld van een debug analyse viewer voor een raster test video. Hieruit blijkt de detectie algoritme tijdens de analyse van de test van een raster. (D) dit paneel toont een voorbeeld van een debug analyse viewer voor een ladder test video. Hieruit blijkt de detectie algoritme tijdens de analyse van de test van een ladder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Voorbeeld van deskundige en beginnende testresultaten. Deze panelen tonen de resultaten van een handleiding en een BVAS expert en beginnende testen voor (A) het aantal rasterlijnen stak op het open veld raster test en (B) de tijd om over te steken op de ladder-test. Voor beide tests toonden de resultaten aan dat ervaren gebruikers had een lagere variantie dan de beginnende gebruikers voor de handmatige analyse, terwijl met behulp van de BVAS in nul variantie, onafhankelijk van de expertise van de gebruiker resulteerde. De standaarddeviatie wordt gemeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Representatief open veld raster testresultaten. Deze panelen Showresultaten representatieve open veld raster test voor een dier van de niet-geïmplanteerde controle voor (A) de maximale snelheid bereikt, (B) de totaal afgelegde afstand, (C) het totale aantal rasterlijnen gekruist en (D) de percentage van de rechtse bochten gemaakt door het behandelde dier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Vertegenwoordiger ladder testresultaten. Deze panelen Showresultaten representatieve ladder test voor een niet-geïmplanteerde controle dier voor (A) de tijd om over te steken van de ladder, en (B) het getal van rechts - en links-voorzijde-paw enten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het meest kritische deel van het protocol bij het zorgen voor een sterke analyse is het consistent filmen. Wanneer de video's zijn goed verlicht en gefilmd op de juiste positie zoals besproken in de eerste sectie van het protocol, naar de systematiek zal zitten kundig voor verrichten een nauwkeurige analyse. Zoals met elk beeld-verwerkende probleem, zal het werk in het voorbewerken de post-processing maken meer nauwkeurige en eenvoudig. Als zodanig, betekent ervoor te zorgen dat de apparatuur en de dieren goed verlichte tijdens het testen en schaduwen of andere beweging in het frame wordt gehouden tot een minimum dat de BVAS kan functioneren op een hoger niveau van nauwkeurigheid.
De hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt efficiënter en reproducibly om resultaten te analyseren van zowel bruto en fijne motor functie testen in knaagdieren via een open veld raster en een test van de ladder. Het vermindert bovendien de mogelijkheid van menselijke fouten of bias in het analyseproces als de data-analyse is grotendeels voltooid door de zelfstandig functionerende computer zonder input van de gebruiker. Vanwege deze functie, kan de BVAS systeem worden gebruikt met dezelfde mate van nauwkeurigheid door zowel de beginner als de expert gebruikers. De BVAS programma is zelf controleren, eenvoudig te implementeren en goedkoop te gebruiken. De code kan verder worden aangepast aan de individuele behoeften van een onderzoeker. Bijvoorbeeld, de netcode open veld kan worden gebruikt voor het analyseren van een scala aan statistieken, met inbegrip van de totale afstand reisde, de maximale snelheid bereikt, en het aantal links en rechts draait, en waarschijnlijk moeiteloos kan worden gewijzigd voor het bijhouden van de wijzigingen in een doolhof van water of gedwongen zwemmen t vragen. Extra wijzigingen kunnen worden aangebracht in de code voor verschillende ruimtelicht, verschillen in grid en de kleur van de lijn van de ladder, en in dierlijke kleur. Hoewel de test apparatuur en de code van de BVAS hier gepresenteerd zijn ontworpen voor gebruik in rat studies, verwachten we dat ofwel kan worden geschaald omhoog of omlaag om te worden gebruikt met verschillende grootte dieren, hoewel dit tot dusver niet is geverifieerd.
Zoals met alle testen en gegevens gedragsanalyse, is het belangrijk om zo veel mogelijk gedurende de studie en de daaropvolgende analyses in overeenstemming zou houden. Hoewel de gepresenteerde BVAS sterk vertrouwen op menselijke input voor de data-analyse vermindert, kan menselijke afwijking meespelen met de onderzoeker werken met de dieren en de behandeling van de procedures15. Wijzigingen in de test locatie16 of huisvesting en veehouderij voorwaarden17 kunnen bovendien ook invloed op de resultaten. Terwijl de BVAS kan worden bijgewerkt naar account voor verlichting en camerahoek, kunnen factoren zoals geuren, personeel of dieet alleen worden verklaard ten tijde van de studie. Daarom moeten onderzoekers nemen voorzichtigheid te blijven zo consistent mogelijk in dierproeven en huisvestingsomstandigheden, testen van personeel, en de analysemethoden, onder anderen.
De BVAS is roman vanwege haar samengestelde detectiesysteem. Elk frame van de video wordt doorgegeven via meerdere beeldfilters maken binaire maskers alle gekalibreerd om te zoeken naar de rat in het frame. Elke mogelijke rat-shape wordt vervolgens beoordeeld door het systeem op de waarschijnlijkheid dat de rat. Deze beoordeling factoren in grootte, het aantal filters die de vorm zit speurder voort, en de laatste bekende locatie en de voorspelde locatie van het dier op basis van het voorgaande traject. Dit zorgt voor een sterke dierlijke opsporen die de meeste problemen die zich voordoen op basis van schaduwen kunt overwinnen en veranderingen in de belichting. In tegenstelling tot de huidige verkrijgbare dierlijke tracking-systemen, deze methode vereist geen wijzigingen aan het dier deze meer zichtbaar te maken en maakt gebruik van een uniforme standaard-snelheid-webcam voor de video-opname. De BVAS systeem is ook een verbetering ten opzichte conventionele handmatig gekwantificeerde gedrag testen omdat alle de statistieken die zijn output objectief vanaf de video's gemeten worden. Een menselijke gekwantificeerde gedrags studie zal hebben sommige subjectiviteit in de natuur als de onderzoeker besloten wat een poot slip of raster lijn kruis.
Het systeem vereist een enigszins specifieke setup om te werken op haar volle capaciteit. Hoewel het mogelijk is te passen het systeem aan wijzigingen in de apparatuur, zou het momenteel vereisen sommige spreekvaardigheid in computer codering om te bewerken van de code. Met sommige codering spreekvaardigheid, is probleemoplossing gemakkelijk gemaakt omdat de fout merken e-mails bevatten een volledige fout informatie uitlezing. Als de video's gevoed in het systeem niet op de ideale resolutie of frame rate (1080 p, 15 fps), wordt de gebruiker gewaarschuwd via een waarschuwingsbericht is. Deze verandering zal van invloed zijn op de nauwkeurigheid van het systeem, maar het nog steeds kan draaien op lagere resolutie video's. Verlichting en de eventuele problemen van de schaduw die een fout tijdens de analyse veroorzaken zal leiden tot een dynamische foutbericht aan de gebruiker ingevoerde e-mail. De gebruiker kan vervolgens de debug-viewer gebruiken om naar te kijken de frame voor frame analyse om te begrijpen welke probleem ontstond. Het foutbericht bevat ook een fout verslag, dus als het een codering probleem, het gewoon kan worden aangepakt.
In de toekomst mogelijk de BVAS systeem kunnen verder worden aangepast zonder enige kennis van de syntaxis van codering software. De toevoeging van een tracking optiemenu kan de gebruiker selecteren van de kleur van het dier en raster lijnen, eenvoudig en gemakkelijk. De test van de ladder bijhouden zal ook toename van de nauwkeurigheid met de mogelijke toevoeging van een trapsgewijze object detector in de code en een betere ladder verlichting tuig het begeleiden van de ladder-test en filmen apparaat. Daarom verwachten wij dat het systeem van de BVAS beschreven hier gemakkelijk kan worden uitgevoerd in een array van gedrags- en motorische functie taken verspreid over een breed scala aan modellen voor ziekte en verwonding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de verdienste Review Award # B1495-R (om Jeffrey R. Capadona) en de presidentiële Early Career Award voor wetenschappers en ingenieurs (PECASE) (naar Jeffrey R. Capadona) van het Amerikaanse departement van veteranen zaken revalidatie Onderzoek en ontwikkeling Service. Bovendien, werd dit werk gedeeltelijk ondersteund door het Bureau van de Assistant Secretary of Defense for gezondheid zaken via het Peer Reviewed medisch onderzoeksprogramma onder Award nr. W81XWH-15-1-0608. De auteurs erkennen bron voor de zomer onderzoek financiering van de steun. De inhoud geven niet de standpunten van de United States Department of Veterans Affairs of de regering van de Verenigde Staten. De auteurs bedank Hiroyuki Arakawa in de CWRU knaagdier gedrag kern voor zijn leiding in het ontwerpen en testen van knaagdier gedrags protocollen. De auteurs wil ook James Drake en Kevin Talbot van het CWRU departement van mechanische en luchtvaart-en Ruimtevaarttechniek bedanken voor hun hulp bij het ontwerpen en produceren van detest knaagdier ladder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rats, male, 201-225 g | Charles River | CD | |
| Webcam HD Pro c920 | Logitec | 960-000764 | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Matalb 2017a, Computer Vision System Toolbox | Mathworks | N/A | |
| Open field grid test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A | |
| Ladder test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A |
References
- Beery, A. K., Kaufer, D. Stress, social behavior, and resilience: insights from rodents. Neurobiology of Stress. 1, 116-127 (2015).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping of rodents. Comparative Medicine. 53, 140-146 (2003).
- Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11, 0147733 (2016).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115, 169-179 (2002).
- Bailey, K. R., Crawley, J. N. Anxiety-Related Behaviors in Mice. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. chapter 5 (2009).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. European Journal of Pharmacology. 463, 3-33 (2003).
- Porsolt, R. D., Bertin, A., Jalfre, M. Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants. Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Thérapie. 229, 327-336 (1977).
- Porsolt, R. D., Brossard, G., Hautbois, C., Roux, S. Rodent models of depression: forced swimming and tail suspension behavioral despair tests in rats and mice. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8, Unit 8 10 (2001).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46, 208-209 (1957).
- Forstmeier, W., Wagenmakers, E. J., Parker, T. H. Detecting and avoiding likely false-positive findings - a practical guide. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 92, 1941-1968 (2017).
- Reason, J. Human error: models and management. The Western Journal of Medicine. 172, 393-396 (2000).
- Goss-Varley, M. Rodent Behavioral Testing to Assess Functional Deficits Caused by Microelectrode Implantation in the Rat Motor Cortex. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7, 15254 (2017).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visual Experiments. (28), e1204 (2009).
- Chesler, E. J., Wilson, S. G., Lariviere, W. R., Rodriguez-Zas, S. L., Mogil, J. S. Influences of laboratory environment on behavior. Nature Neuroscience. 5, 1101-1102 (2002).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284, 1670-1672 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Auer, C., Kunert, J., Wurbel, H. Systematic variation improves reproducibility of animal experiments. Nature Methods. 7, 167-168 (2010).
