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Behavior

Uma romance única Animal motricidade sistema usando simples, prontamente disponível Software de rastreamento

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/57917
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Advanced Platform Technology Center, Rehabilitation Research and Development, Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

O presente estudo visa automatizar a quantificação do déficit motor em ratos. O modelo de avaliação inicial avalia motor perda resultante de uma implantação de microeletrodos intracortical no córtex motor. Nós relatamos no desenvolvimento e utilização de um algoritmo de rastreamento usando facilmente adaptável, simples e facilmente disponível software de codificação.

Abstract

Recentemente demonstramos que implantar microeletrodos intracortical no corteces motor de ratos resulta em déficits motor imediatos e duradouros. Motor deficiências foram quantificadas manualmente através de um teste de rede de campo aberto para medir a função motora bruta e através de um teste de escada para medir a função motora fina. Aqui, vamos discutir uma técnica para a quantificação automatizada dos testes vídeo-gravado usando nosso Capadona personalizado o sistema comportamental de análise de vídeo: grade e teste de escada ou BVAS. Aproveitando a simples e facilmente disponível software de codificação (ver a Tabela de materiais), este programa permite o controle de um único animal em ambos a grade de campo aberto e os testes de escada. Em abrir a grade de campo de controle, os limiares de código o vídeo para intensidade, rastreia a posição do rato sobre a duração de 3 min de teste a grade e analisa o caminho. Em seguida, calcula e retorna as medições para a distância total percorrida, a velocidade máxima alcançada, o número de voltas de mão esquerda e direita e o número total de linhas de grade, atravessada pelo rato. Na escada novamente o código de rastreamento, limiares o vídeo da intensidade, controla o movimento do rato do outro lado da escada, e retornos calculados medições incluindo o tempo que levou o rato para atravessar a escada, o número de pata desliza ocorrendo abaixo do plano da degraus da escada e a incidência de falhas devido à estagnação ou reversões. Vislumbramos que o BVAS desenvolvido aqui pode ser empregado para a análise da função motora em uma variedade de aplicações, incluindo muitos modelos de lesão ou doença.

Introduction

Existem muitos métodos estabelecidos para avaliar motor funcional e comportamental e deficiências cognitivas1,2,3. Alguns dos métodos mais comumente empregados incluem o teste de função motora fina através de pata colocação, revisão e coordenação de membro em uma escada teste4, teste de função motora bruta e estresse comportamento através o teste de rede de campo aberto5 ,6e testes de medo, depressão e desespero através do nado forçado o teste7,8 ou rotor haste9. No entanto, muitos destes métodos dependem de pesquisadores humanos para "marcar" o animal ou julgar seu desempenho subjetivamente. A necessidade de uma avaliação subjetiva humana pode retardar a geração e análise dos dados, bem como apresentar a oportunidade para uma influência intencional ou não intencional do viés de investigação no estudo10. Além disso, subjetiva a avaliação dos dados também apresenta o risco de representação de dados imprecisos, seja através de esquecimento, pobre motivação, formação inadequada ou negligência11.

Nós recentemente relataram o uso de um teste de rede de campo aberto e um teste de escada em ratos implantados com microeletrodos intracortical12,13. Devido a novidade das descobertas nesses estudos, começamos imediatamente aqueles empregando e testes funcionais adicionais em muitos estudos em curso no laboratório. Em antecipação da variabilidade de humanos gerados não intencional resultantes de um aumento do número de avaliadores subjetivos e para melhorar o throughput de análise, partimos para criar um programa automatizado, assistida por computador para marcar testes comportamentais, e limitar consideravelmente o potencial de erro.

Aqui, podemos analisar a evolução do BVAS. O BVAS usa análise de computador para marcar um teste de rede de campo aberto e um teste de escada como métricas de motricidade grosseira e fina, respectivamente. Os resultados podem ser utilizados para elucidar os défices possível função motora causados por lesão ou doença, independentemente do modelo de lesão ou doença. Os códigos de análise podem ser adaptados a conta alterações no equipamento de teste comportamental ou marcar várias métricas de função motora. Portanto, o BVAS pode ser implementado em muitas aplicações, além de nosso uso pretendido ou a utilização desses atualmente empregado por outros laboratórios.

Note que os testes de grade e escada de campo aberto requerem a gravação de vídeo. Portanto, cada teste exigirá uma câmera de vídeo [1080p, mínimos 15 quadros por segundo (fps)], um laptop e um espaço para armazenar os dados de vídeo. Para ambos os testes, coloque a câmera em uma posição centrada, permitindo para o aparelho inteiro ser visto no quadro. Ancore a câmera em um tripé ou andaimes para que ela não se move durante o teste. Manter as bordas do quadro vídeo como perto de paralelo com as bordas do aparelho de teste possível. Certifique-se de que o mesmo pessoal completa todos os testes e o quarto é bem iluminado com um sistema de temperatura controlada. Use o mesmo quarto para todos os animais ao longo do curso dos testes, com mínimas alterações para o quarto. Cereais ou banana chips fazem boas recompensas para encorajar os animais para completar os testes de comportamento.

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Protocol

Todos os procedimentos e práticas de cuidados com animais foram aprovadas pela e efectuadas de acordo com o Comité de uso e Louis Stokes Cleveland departamento de veteranos dos Assuntos centro institucional Animal cuidados médicos. Protocolo do teste comportamental segue de perto trabalho anteriormente publicado12,13.

1. teste comportamentais: Filmando as tarefas

Nota: Aqui, os animais foram testados durante 8 semanas detectar quaisquer alterações comportamentais crônicas. A duração do estudo é dependente do modelo de aplicativo/lesão/doença utilizado para o estudo.

  1. Abrir campo grade testes
    Nota: O teste de rede tem uma área de 1 m2 com paredes de 40 cm e foi construído em casa. O fundo é dividido em nove quadrados através do colorido brilhantemente fita (Figura 1A). Para o uso da BVAS automatizado, é importante que a cor da linha e grade de contraste com o rato. Aqui, o brancos ratos Sprague Dawley foram utilizados; assim, o contexto de grade foi pintado de preto, e as linhas foram criadas com fita rosa brilhante.
    1. Teste os animais 2 x por semana, para todos os testes, incluindo a semana antes de iniciar o estudo a fim de criar uma contagem de linha de base para uso em cálculos posteriores.
    2. Limpe todo o equipamento de teste com um esterilizante baseado no dióxido de cloro no início de cada sessão de teste e entre cada animal.
    3. Trazer os animais para a sala para testes e lhes permitam adaptar-se à sala para 20 min antes de começar os ensaios.
    4. Começar a filmar e colocar o animal no centro da grade, costas para o pesquisador, para começar o teste de grade.
    5. Permitir que o animal correr livremente por 3 min, enquanto sendo vídeo gravado por cima.
    6. Pare de filmar quando o min 3 período terminou e devolver o animal para sua gaiola em casa. Limpe a grade com um esterilizante de baseado no dióxido de cloro, tendo o cuidado de secar totalmente as superfícies antes de testar. Teste cada animal 1 x por sessão.
  2. Teste de escada
    Nota: O teste da escada foi construído internamente e consiste de duas paredes de acrílico laterais, cada 1 m de comprimento, ligado por degraus de 3 mm de diâmetro espaçados a intervalos de 2 cm (Figura 2). Os animais necessitam de uma semana de treinamento de escada antes de iniciar o teste oficial. Não há nenhuma diferença entre a formação e o protocolo do teste. Observe que o treinamento não precisa ser filmado.
    1. Para o uso com o BVAS, cobrir a parede atrás da escada com uma cartolina preta e delinear o nível de degraus, start e linhas de acabamento com uma fita brilhante para criar um contraste com os ratos brancos.
    2. Teste os animais 2 x por semana, para todos os testes, incluindo a semana antes de iniciar o estudo para criar uma contagem de linha de base para uso em cálculos posteriores.
    3. Limpe todo o equipamento de teste com um esterilizante baseado no dióxido de cloro no início de cada sessão de teste e entre cada animal.
    4. Trazer os animais para a sala para testes e lhes permitam adaptar-se à sala para 20 min antes de começar os ensaios.
    5. Coloque o animal em uma gaiola limpa temporária antes de testar a escada.
      Nota: Uma gaiola temporária é uma gaiola de curto prazo para manter o animal enquanto casa gaiola do animal é usada no final da escada. Não há nenhuma idade viés como todos os animais utilizados no estudo são da mesma idade e testes completos durante o mesmo período. O controle usado aqui é um animal ingênuo, nunca tendo recebido cirurgia.
    6. Definir o aparelho de escada até extensão duas gaiolas; a gaiola de início é uma gaiola limpa, e a gaiola de fim é gaiola de vida do animal, um incentivo para completar a corrida.
    7. Coloque a câmera em um tripé, centrado sobre o comprimento da escada. Estenda o tripé para que a lente da câmera está na altura dos degraus da escada. Posicione a câmera de modo que os degraus estão exatamente alinhados com a lente, como isto é importante para o algoritmo de detecção de deslizamento no código BVAS.
    8. Iniciar a gravação de vídeo e permitir que o rato começar a correr, segurando suas patas dianteiras sobre o primeiro degrau da escada. Permitir que o animal avançar para a escada sem ajuda.
    9. Permitir que o animal mover a linha de partida para a linha de chegada em seu próprio ritmo durante as filmagens. Acabar com a gravação de vídeo e retire o animal da escada de uma vez o animal terminou a corrida.
    10. Considere a executar uma execução falha se o animal se vira ou permanece estagnada por 20 s. fim da gravação de vídeo e retire o animal a escada se o animal não o executar. Atribua uma pontuação de penalidade para funcionamentos de falhadas que é equivalente para o tempo mais lento, gravado durante o teste de pré-cirurgia base.
    11. Certifique-se de que cada animal completa 5 corridas por dia de teste e dar-lhes um período de descanso 1 min entre cada tentativa.
      Nota: Neste estudo, os animais foram testados 2 x por semana durante 8 semanas. No entanto, o prazo é até a critério do pesquisador.

2. arquivo de armazenamento e nomeação

Nota: O código BVAS usa especificamente designado arquivo de vídeo e pasta as convenções de nomenclatura para que os vídeos podem ser confiavelmente analisados e analisados corretamente. Convenções de nomenclatura diferentes não são suportadas atualmente. Após a conclusão de uma sessão de testes, o arquivo de vídeo é salvo no local padrão com um nome padrão.

  1. Nomeação de vídeo individual
    1. O nome de cada vídeo com designação do animal para grade todos os vídeos de teste.
    2. Colete 5 vídeos de escada por sessão para cada animal de teste. Selecione todos os cinco vídeos e renomear o primeiro vídeo, usando a designação do animal. Por exemplo, se o nome do animal é "C1NS", os arquivos são denominados "C1NS (1)", "C1NS (2)", "C1NS (3)", etc.
  2. Nome da pasta de armazenamento
    1. Os vídeos que agora nomeados após cada animal e colocar os arquivos em sua própria pasta de armazenamento. O nome desta pasta usando a seguinte convenção: "TestingWeek_TestMode_MM_DD_YY".
      Nota: por exemplo, se esta pasta contém a primeira semana de vídeos de grade e foi filmada em 1 de janeirost, 2018, a pasta segurando esses vídeos é chamado "Week1_GridTest_01_01_18".
    2. Coloque esta pasta especificamente nomeada em outra pasta que irá denotar o maior estudo que este conjunto de experimentos pertence.
      Nota: Existem sem requisitos de nomeação para o sistema de árvore de pasta para manter estudos e modos de teste organizado. A única pasta que o sistema seleciona é a pasta segurando vídeos chamados na etapa 2.2.1.
  3. Criação de arquivo de planilha
    1. Usando um programa de planilha externa (veja a Tabela de materiais), crie um novo arquivo de folha de cálculo vazia para armazenar os dados para cada estudo e a modalidade de teste.
      Nota: Existem sem requisitos de localização de nomeação ou de armazenamento para este arquivo. Cada estudo requer dois arquivos de planilha para uso com o sistema, um para o teste de rede e um para o teste de escada. Esses arquivos deixe vazio por enquanto.
    2. Verifique se que esses arquivos de planilha não são abertos em qualquer computador enquanto o BVAS é executado.
      Nota: Se o BVAS tenta abrir um arquivo de planilha que já está aberto, isso resultará em um erro.

3. sistema instalação

Nota: O BVAS foi construído e testado em sistemas operacionais para PC e aproveita o tempo de execução, componentes de simples e facilmente disponível software de codificação. Outras configurações de sistema não são suportadas atualmente.

  1. Instalando a versão mais recente de BVAS
    1. Execute o instalador clicando duas vezes no ícone do instalador rotulado 'BVASX. XXinstaller'. "X. XX" é o número da versão atual, atualmente 'BVAS3.30installer'.
      Nota: Este é o software de código aberto. Contate o autor correspondente para a versão mais recente.
    2. Siga-no ecrã instruções para instalar o BVAS.
      Nota: O instalador irá verificar o sistema para a versão correta do software (ex., MATLAB Runtime) e se não for encontrado, ele irá instalar o software da internet.
    3. Uma vez instalado, inicie o programa clicando o 'BVAS.exe' arquivo.

4. sistema de utilização

  1. Abrir o programa
    1. Clique duas vezes no ícone do programa BVAS para abrir o menu principal de BVAS que permite as seguintes opções: 'Análise de grade', 'Análise de escada', 'Revisão de escada' ou 'Quit'.
      Nota: Há também um menu drop-down localizado no canto superior esquerdo, rotulado 'Configurações de E-mail'(Figura 3).
  2. Configurações de e-mail
    1. Clique no menu suspenso 'Configurações de E-mail' e selecione primeiro 'destino de e-mail'.
    2. Digite um endereço de e-mail preferido para receber atualizações sobre a análise e selecione 'Okey'. Selecione 'Cancelar' para não mudar o e-mail atualmente salvo.
    3. Clique no botão 'Enviar E-mail de teste' para enviar um e-mail de teste para o e-mail salvo atualmente no sistema. Perto do 'E-mail enviado!' pop-up janela significando a conclusão do teste.
  3. Análise de teste de rede de campo aberto
    1. Selecione 'Análise de grade' na tela de menu superior.
    2. Certifique-se do botão de alternância rotulado 'Dados de sessão/terreno único vídeo/todo' está exibindo toda a sessão para concluir a análise em um conjunto de vídeos da sessão de teste.
    3. Utilize o botão de '...' ao lado da caixa de entrada superior para navegar no sistema de arquivo para localizar o arquivo de vídeos para analisar. Selecione a pasta rotulada no estilo discutido na etapa 2.2.1.
    4. Utilizar o... botão ao lado da caixa de entrada inferior para navegar no sistema de arquivo para selecionar o arquivo de planilha para armazenar os dados.
      Nota: Observe que, bem como saída os dados para um arquivo de planilha, os dados do caminho completo para cada vídeo são armazenados em um arquivo de dados (MAT) no mesmo diretório que contém os vídeos escolhidos na etapa 4.3.3.
    5. Certifique-se do botão de alternância, mencionado na etapa 4.3.2 é definido como 'Único vídeo' para concluir a análise em um único vídeo.
    6. Utilizar o... botão ao lado da caixa de entrada superior para navegar no sistema de arquivo para localizar o arquivo de vídeo para analisar.
    7. Utilizar o... botão ao lado da caixa de entrada inferior para navegar no sistema de arquivo para selecionar um diretório para salvar o arquivo de dados (MAT) que resulta da análise de vídeo único.
      Nota: O arquivo de dados será nomeado após o vídeo, que é nomeado após o animal.
    8. Selecione o toggle mencionado na etapa 4.3.2 'Data de saída'. para os dados de uma grade anteriormente analisado vídeo de saída. Exemplos desses dados plotados são mostrados nas Figuras 1B e 1C.
    9. Utilizar o... botão ao lado da caixa de entrada superior para navegar no sistema de arquivo para selecionar um arquivo de dados de vídeo de rede criado anteriormente. Selecione 'ir!' para criar a figura de enredo e dados.
      Nota: Esta função também cria um arquivo de texto chamado o mesmo e localizado no mesmo diretório como o arquivo de dados, que tem o animal executar dados nele.
    10. Uma vez que ambos os arquivos necessários foram localizados, selecione 'ir!' para começar a análise de vídeo. Observe que o botão 'voltar' vai reabrir o menu superior e o botão 'Quit' irá fechar o programa completamente. Escolha o 'Debug Display' alternar para mostrar uma representação visual do algoritmo de rastreamento (figuras 3 e 3D).
    11. Selecione 'ir!' para iniciar o processo de análise. Examine as imagens de cada vídeo na tela do revisor. Use os botões de página 'próximo' e 'anterior', se há mais de cinco vídeos.
    12. Para abrir um menu de seleção manual, selecione o botão 'Editar', se não existem verdes linhas ou a linha verde não parece ser no quadrado correto ao redor da área de teste. Para editar os cantos, selecione o botão 'Editar cantos'.
      Nota: O botão 'Próximo quadro' muda a imagem representativa para o próximo quadro do vídeo em questão. Selecione o botão 'Próximo quadro' se o quadro dado automaticamente está obstruído ou fora de foco.
    13. Siga as instruções para a direita da imagem representativa para selecionar a área de testes e tecle 'Enter' para concluir o processo de seleção.
      Nota: As linhas verdes selecionadas serão agora mostradas a imagem representativa.
    14. Selecione 'feito' para salvar a seleção e retornar para a tela do revisor.
    15. Selecione o botão central de 'feito' para iniciar o processo de análise completa, uma vez que a área da grade para cada vídeo é selecionada corretamente. Permitir que o programa seja executado e, após a conclusão, será exibido um aviso de sucesso.
      Nota: A análise completa de uma sessão de vídeos pode levar algum tempo, cerca de 10 min por animal.
  4. Análise de teste de escada
    Nota: O protocolo para a análise de teste inicial de escada é muito semelhante ao protocolo descrito em etapas 4.3.10–4.3.15. As diferenças notáveis antes esses passos são os seguintes:
    1. Selecione 'Análise de escada' do menu principal para abrir o menu de análise de escada.
    2. Visualizar as duas opções no toggle, 'Único vídeo' e 'Toda a sessão' (Figura 3B).
    3. Com 'Toda a sessão', selecione o superior entrada... botão para selecionar a pasta com vídeos de escada chamados em 2.2.1.Select passo o mais baixo... botão para selecionar um diretório para salvar uma pasta com dados a partir dos vídeos de escada para rever mais tarde.
    4. Se 'Único vídeo' estiver selecionada, selecione um único vídeo de arquivo com o superior... botão e uma localização a mesma etapa 4.4.3.
    5. Selecione 'ir!' para iniciar o processo de análise e trazer a tela de revisor de área de teste de escada.
    6. Siga as etapas 4.3.10–4.3.15 da mesma forma para a escada quanto a grade. Permitir que o programa seja executado e, após a conclusão, será exibido um aviso de sucesso.
      Nota: Se algo der errado durante a análise, um e-mail é enviado para o endereço de e-mail inserido na etapa 4.2.2. Após a conclusão de uma análise de qualquer tipo, um email de conclusão é emitido para o mesmo endereço de e-mail.
  5. Análise de imagens de escada
    Nota: O seguinte protocolo é rever anteriormente analisado vídeos de escada para confirmar quaisquer falhas e deslizamentos de pata. Note que arquivos de planilha para um cruzamento de escada não são gerados para exibir até 'Revisão de imagem de escada' (passos 4.5.1–4.5.5) seja concluída.
    1. No menu superior, selecione 'Escada de revisão de imagem'. Isto traz a tela Selecione arquivo de revisão de escada.
    2. Selecione o topo... botão para selecionar a pasta dos arquivos de dados.
      Nota: Os arquivos são salvos no local escolhido na etapa 4.4.2 e são nomeados no seguinte formato: "M1_D1_Y1 escada a sessão HH_MM M2_D2_YYYY". M1, D1 e Y1 são a data da sessão sendo analisada. "Sessão de vídeo da escada" lerá "Análise de vídeo único" se apenas um único vídeo foi analisado. HH_MM e M2_D2_YYYY são a hora e a data em que foi iniciada a sessão de revisão.
    3. Selecione o fundo... para selecionar o arquivo de planilha criado para o estudo.
    4. Selecione 'ir!' para iniciar o processo de revisão manual.
    5. Visualizar o menu de revisor de dados automaticamente aberta da escada. Se for detectado um deslize, usar o 'Próximo quadro' e 'Último quadro' botões para verificar qualquer consecutivamente gravou quadros, se disponível.
    6. Utilize o toggle de deslizamento para denotar o pé do rato escapou. Deixe o toggle sobre 'No Slip' se a detecção é um falso positivo. Clique em 'Save/continuar' para passar para a próxima deteção(Figura 2).
    7. Em caso de falha, use o toggle para indicar se a falha é devido à inversão (onde o rato virou durante a execução) ou estagnação (onde o rato não conseguiu completar a corrida em tempo hábil).
    8. Clique em 'Save/continuar' para passar para a próxima deteção. Na última detecção, clique em 'Save/continuar' para concluir a análise e salvar os dados no arquivo de planilha escolhido anteriormente. Dispense o aviso de conclusão.
      Nota: Após a revisão é concluída, a pasta que foi revisada é renomeada "Revista M1_D1_Y1 escada a sessão HH_MM M2_D2_YYYY".

5. análise de dados de saída

  1. Arquivo de planilha de grade
    1. Localize os dados criados no arquivo de planilha de cada grade vídeo.
      Nota: As colunas são esquerdas para direita como se segue: nome do animal, data da prova, semana de estudo número, distância total viajado, total tempo parado, velocidade máxima alcançada, bem gira, vira à esquerda e linha de grade cruza (Figura 1D).
    2. Use essas métricas para quantificar o desempenho motor bruto e criar gráficos de comparação entre animais e pontos de tempo.
  2. Arquivo de planilha de escada
    1. Localize os dados criados no arquivo de planilha de cada vídeo escada após o fracasso e pata revisão de deslizamento.
      Nota: As colunas são esquerdas para direita como se segue: nome do animal, execução número 1 – 5, semana de estudo número, data de teste, tipo de execução (sucesso ou falha), tempo de execução para sucessos, conclusão por cento, pata deslizamentos em cada pata e o modo de falha. A coluna de tempo está em branco para uma falha e a coluna do modo de falha irá ler ou reversão ou estagnação (Figura 2B).
    2. Use essas métricas para quantificar o desempenho motor fino e criar gráficos de comparação entre animais e pontos de tempo.

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Representative Results

Seguindo os métodos apresentados aqui, ratos completou a grade de campo aberto e escada testa 2x por semana. Os dados foram analisados usando BVAS e manualmente com um cronômetro por treinados e revisores de principiante. Os resultados apresentados são uma média dos escores brutos semanais de um animal único controle não implantados ao longo de um estudo de 8 semanas, onde semana "0" corresponde a teste de linha de base. Note que não havia nenhum teste durante a semana 1 como esta foi uma semana de descanso para os animais de cirurgia. Porque a grade de campo aberto é testado 1 x por dia, a escada é testado 5x por dia e há dois dias de testes por semana, há uma amostra de 16 ensaios para grade de campo aberto, Considerando que há 80 ensaios para o teste de escada na mesma semana 8 período de tempo.

BVAS vs. análise manual:
Para confirmar a consistência do sistema de BVAS e validá-lo contra a análise manual, os resultados para as linhas de grade cruzadas e escada cruzando tempo foram comparados com os resultados manuais de três revisores especializados (n = 3) como um "padrão ouro". Usuários novatos (n = 7) também revistos os dados tanto manualmente e usando o BVAS. Para a validação, cada revisor examinados no mesmo dia um dos experimentos para um animal (testes = um vídeo/trial; teste da escada = cinco ensaios independentes). Os resultados para o teste de rede de campo aberto mostraram que os revisores especializados eram mais consistentes do que novato críticos estavam (uma variação de 0 contra uma variação de 17,1, respectivamente), mas quando usando o BVAS, havia zero variância para ambos especialista e iniciante (os usuários Figura 4 A). da mesma forma, os resultados para o teste de escada mostraram que os revisores especializados eram mais consistentes do que novato críticos estavam (~3.5x maior: a variância de 0.120 contra uma variação de 0.414, respectivamente), mas quando usando o BVAS, havia outra vez zero variância para usuários especialistas e novatos (Figura 4B).

Portanto, onde possível, métricas de comportamento para a grade de campo aberto e a escada do teste foram quantificados manualmente pelo mesmo usuário perito e em comparação com os resultados gerados usando o BVAS. Aqui, os resultados de tudo incluídos animais durante toda a duração dos experimentos foram avaliados. Todo erro é relatado como um erro padrão da média (SEM) a menos que relatou o caso contrário. A diferença entre os dois métodos variou entre uma média de 0,64 ± 0,06 s para o teste de escada e 3,56 ± 0,53 linhas para o teste de grade. A diferença média entre os dois métodos para o teste de rede de campo aberto ao longo de 8 semanas foi 11.13 ± 3,03%. A diferença média entre os dois métodos para o teste da escada ao longo de 8 semanas foi 9.05 ± 1,07%. A diferença percentual entre os dois métodos foi calculada seguindo a equação 1.

Equação 1:Equation 1

Nota também para a escada teste sincronismo, a coleta de dados manual só é precisa de 1 s (que pode mudar com base no dispositivo utilizado para manter o tempo), enquanto o BVAS é preciso para o inverso da taxa de quadros do vídeo a ser revisto. Por exemplo, se o vídeo é filmado em 15 frames por segundo, os dados BVAS são precisos para nth 1/15 de segundo.

Teste da grade de campo aberto:
Seguindo anteriormente publicado protocolos12,13, animais foram autorizados a executar livremente em um teste de grade de campo aberto por 3 min medir sua função motora bruta e salientar o comportamento. O vídeo gravado durante o teste foi analisado usando o BVAS para quantificar os escores brutos para a velocidade máxima, distância total, o número de linhas de grade cruzadas e o percentual de voltas bem alcançado pelo animal (Figura 5). Enquanto este dados são apenas representante de um animal, as tendências foram vistos ao longo do estudo de aumento velocidade máxima alcançada, maior distância total percorrida, e cruzou um aumento do número de linhas de grade. Sem surpresa, quando comparado ao outro, a distância total percorrida, e as linhas de grade totais cruzadas tinham uma forte correlação positiva. Comparando a quantificação manual para a quantificação das linhas de grade BVAS revelou resultados comparáveis (Figura 5-C). Para este animal particular, o percentual de direito se transforma em grande parte pairou entre 40% e 50% (Figura 5-D). Digno de nota, as métricas para a distância total percorrida, velocidade máxima e gira o sentido não puderam ser quantificados manualmente e representam um outro recurso adicional do programa automatizado de BVAS.

Teste de escada:
Como relatado anteriormente4,14, a escada de testes foi concluído para medir o alcance coordenada e motricidade fina. O vídeo gravado durante o teste foi analisado usando o BVAS para quantificar os escores brutos para o tempo para atravessar e o número de deslizamentos de pata (Figura 6). Neste animal, havia uma tendência decrescente no tempo para cruzar a escada, seguida por um aumento no tempo, começando em torno de semana 4. Comparando a quantificação manual para o BVAS quantificação do tempo de travessia revelou resultados comparáveis (Figura 6A). Como o animal apresentado era um controle não-cirúrgico, pata deslizamentos foram pouco frequentes e comparáveis em número entre a pata esquerda e direita (Figura 6B).

Figure 1
Figura 1 : Exemplo de resultados de teste do campo aberto grade. (A), este painel mostra o comportamento teste 1 m2 abrir testes a área com um fundo preto e as linhas de grade-de-rosa. (B) este é um exemplo de uma trama de grade 3-min de um único animal executado. Este animal fez um circuito da grade e assim manteve-se na maior parte estacionário para o restante do tempo. O vermelho e o "x" denotar onde o algoritmo de detecção de vez detectado (O) à esquerda ou direita (X) virar. (C) este é um segundo exemplo de uma trama de grade 3-min de um único animal executado. Este animal era extremamente ativo para o período de teste 3-min inteiro. O vermelho e o "x" denotar onde o algoritmo de detecção de vez detectado (O) à esquerda ou direita (X) virar. (D) este é um exemplo da saída no arquivo de dados para as execuções de dois visto em painéis B e C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Exemplo de uma tela de revisor de dados escada. (A), este painel mostra a tela escada dados revisor, completa com uma captura de tela demonstrando a instalação escada. Esta tela é onde o usuário irá confirmar detectados deslizamentos e falhas. Este exemplo mostra um deslize de pata dianteira direita positivamente detectado. (B) este é um exemplo da saída no arquivo de dados para executar a escada que foi examinado no painel A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Exemplo de telas de análise BVAS. (A), este painel mostra o menu superior do BVAS. Observe os quatro botões ao longo da parte inferior e o menu drop-down de Configurações de E-mail no canto superior esquerdo. (B) este é um exemplo de uma tela de seleção de arquivo, neste caso, para a análise de vídeo de escada. (C) este é um exemplo de um visualizador de análise de depuração para um vídeo de teste de grade. Isto demonstra o algoritmo de detecção durante a análise de um teste de grade. (D), este painel mostra um exemplo de um visualizador de análise de depuração para um teste de escada vídeo. Isto demonstra o algoritmo de detecção durante a análise de um teste de escada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Exemplo de especialistas e novatos os resultados dos testes. Estes painéis mostram os resultados de um manual e um BVAS especialistas e novatos testando para (A) o número de linhas de grade cruzou o teste de rede de campo aberto e (B) o tempo para passar no teste de escada. Em ambos os ensaios, os resultados mostraram que usuários experientes tinham uma variação menor do que os usuários novatos para a análise manual, enquanto usar o BVAS resultou em zero variância, independentemente da experiência do usuário. O desvio padrão é relatado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Representante abrir resultados de teste de campo grade. Estes painéis mostram resultados de teste de grade representante de campo aberto para um animal de controle implantados não para (A) a velocidade máxima alcançada, (B) o total de distância percorrida, (C) o número total de linhas de grade cruzadas e (D) o percentagem de curvas bem feitas pelo animal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Resultados de teste de escada representativa. Estes painéis mostram resultados de teste escada representativo para um animal de controle implantados não para (A) o tempo para cruzar a escada e (B) o número de direito - e esquerda-frente-pata deslizamentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A parte mais crítica do protocolo para garantir uma análise forte é a filmagem consistente. Se os vídeos são bem iluminados e filmado na posição correta, conforme discutido na primeira seção do protocolo, o sistema será capaz de fazer uma análise precisa. Tal como acontece com qualquer problema de processamento de imagem, o trabalho realizado no pré-processamento fará o pós-processamento mais precisos e simples. Como tal, certificando-se que o aparelho e os animais são bem iluminados durante o teste e qualquer sombras ou outro movimento no quadro é mantido ao mínimo significará que o BVAS pode funcionar em um nível mais alto de precisão.

O protocolo apresentado aqui pode ser usado de forma eficiente e reproducibly analisar resultados de motricidade grosseira e fina testes em roedores através de uma abertura de campo grade e um teste de escada. Além disso, ele reduz a possibilidade de erro humano ou preconceito no processo de análise, como a análise de dados é concluída em grande parte pelo computador auto funcionamento sem qualquer entrada do usuário. Devido a esta característica, o sistema BVAS pode ser usado com o mesmo nível de precisão por usuários tanto especialistas e novatos. O programa BVAS é Self-checking, fácil de implementar e barata para usar. Além disso, o código pode ser adaptado para atender às necessidades individuais do pesquisador. Por exemplo, o código de rede de campo aberto pode ser usado para analisar uma variedade de métricas, incluindo a distância total percorrida, a velocidade máxima alcançada, e o número de esquerda e direita se transforma e provavelmente poderia ser facilmente modificado para o rastreamento em um labirinto de água ou forçado mergulho t Pergunte. Modificações adicionais podem ser feitas para o código para contabilizar a variação iluminação do quarto, diferenças na grade e cor da linha de escada e na cor do animal. Embora o aparelho de teste e o código BVAS aqui apresentados foram concebidos para a sua utilização em estudos de rato, esperamos que também poderia ser escalado acima ou para baixo para ser usado com vários animais de porte, embora isto não foi verificado até à data.

Como com todos os testes e dados de análise do comportamento, é importante manter a consistência tanto quanto possível durante todo o estudo e análises subsequentes. Embora o BVAS apresentado reduz qualquer confiança na entrada humana para a análise de dados, variação humana pode entram em jogo com o investigador a trabalhar com os animais e manipulação os procedimentos de15. Além disso, alterações no teste de localização de16 ou habitação e condições de maneio17 também podem influenciar os resultados. Enquanto o BVAS pode ser atualizado para conta para ângulo de câmera e iluminação, fatores como dieta, pessoal ou cheiros só podem ser contabilizados no momento do estudo. Portanto, pesquisadores devem tomar cuidado para não ficar tão consistente quanto possível na experimentação animal e as condições de alojamento, teste pessoal e métodos analíticos, entre outros.

O BVAS é novela por causa de seu sistema de deteção de composto. Cada quadro do vídeo é passado através de vários filtros de imagem para criar binárias máscaras todos calibradas para procurar o rato no quadro. Cada forma de rato possível então é avaliada pelo sistema em sua probabilidade de ser o rato. Esta avaliação fatores em tamanho, o número de filtros que a forma é detectada, e a última localização conhecida e o local previsto do animal com base na trajetória anterior. Isto faz para uma detecção de animal forte que pode superar a maioria dos problemas que possam surgir com base em sombras e alterações na iluminação. Ao contrário dos actuais sistemas de rastreamento de animais comercialmente disponíveis, este método não requer qualquer modificação ao animal para torná-lo mais visível e usa um padrão único-velocidade webcam para a gravação de vídeo. O sistema BVAS é também uma melhoria sobre comportamento manualmente quantificado convencional teste porque todas as métricas que são outputted são objectivamente medidas dos vídeos. Um estudo comportamental quantificado humano terá alguma subjectividade na natureza como o pesquisador decide o que constitui uma linha de deslizamento ou grade de pata Cruz.

O sistema requer uma configuração um pouco específica para trabalhar a sua capacidade máxima. Enquanto é possível adaptar o sistema às mudanças no aparelho, atualmente exigiria alguma fluência no computador para editar o código de codificação. Com uma fluência de codificação, solução de problemas é facilitada porque o erro Observe e-mails incluem uma leitura de informações de erro completo. Se os vídeos alimentados no sistema não estão na taxa ideal de resolução ou quadro (1080p, 15 fps), o usuário é alertou através de uma mensagem de aviso. Essa alteração afetará a precisão do sistema, mas ainda pode ser executado em vídeos de resolução mais baixos. Qualquer problema de sombra que causar um erro durante a análise ou iluminação conduzirá a uma mensagem de erro dinâmico enviada para o e-mail inserido pelo usuário. O usuário pode usar o Visualizador de depuração para assistir a análise quadro a quadro para entender o problema que surgiu. A mensagem de erro também inclui um erro relatar, então se é um problema de codificação, pode ser resolvido simplesmente.

No futuro, o sistema BVAS pode ser capaz de ser mais adaptado sem qualquer conhecimento da sintaxe de codificação de software. A adição de um controle de menu de opções pode permitir ao usuário selecionar a cor das linhas de grade e animais simples e conveniente. O teste de escada de rastreamento também aumentará em precisão com a possível adição de um detector de cascata objeto no código e um melhor equipamento de iluminação de escada para acompanhar o teste de escada e filmar o aparelho. Portanto, esperamos que o sistema BVAS descrito aqui pode ser implementado facilmente em uma matriz de tarefas comportamentais e motor função abrangendo uma grande variedade de modelos de doenças e lesões.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado pela revisão de mérito # B1495-R (para Jeffrey R. Capadona) e o prémio de carreira presidencial cedo para cientista e engenheiros (PECASE) (para Jeffrey R. Capadona) do departamento de Estados Unidos de veteranos assuntos reabilitação Pesquisa e desenvolvimento de serviço. Além disso, este trabalho foi financiado em parte pela estância de assistente de defesa para assuntos de saúde, através de Peer revisão médica programa de pesquisa sob n º prêmio W81XWH-15-1-0608. Os autores reconhecem a fonte para suas pesquisas de verão apoio financeiro. O conteúdo não representam a opinião do departamento dos Estados Unidos de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos. Os autores gostaria agradecer Hiroyuki Arakawa no núcleo de comportamento do roedor CWRU para sua orientação em projetar e testar protocolos comportamentais roedores. Os autores também gostaria de agradecer sua ajuda na concepção e fabrico no teste de roedores escada James Drake e Kevin Talbot do CWRU departamento de mecânica e engenharia aeroespacial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague Dawley rats, male, 201-225 g Charles River CD
Webcam HD Pro c920 Logitec 960-000764
Excel Microsoft N/A
Matalb 2017a, Computer Vision System Toolbox Mathworks N/A
Open field grid test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Ladder test Made in-house at Case Western Reserve University N/A

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References

  1. Beery, A. K., Kaufer, D. Stress, social behavior, and resilience: insights from rodents. Neurobiology of Stress. 1, 116-127 (2015).
  2. Crawley, J. N. Behavioral phenotyping of rodents. Comparative Medicine. 53, 140-146 (2003).
  3. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11, 0147733 (2016).
  4. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115, 169-179 (2002).
  5. Bailey, K. R., Crawley, J. N. Anxiety-Related Behaviors in Mice. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. chapter 5 (2009).
  6. Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. European Journal of Pharmacology. 463, 3-33 (2003).
  7. Porsolt, R. D., Bertin, A., Jalfre, M. Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants. Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Thérapie. 229, 327-336 (1977).
  8. Porsolt, R. D., Brossard, G., Hautbois, C., Roux, S. Rodent models of depression: forced swimming and tail suspension behavioral despair tests in rats and mice. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8, Unit 8 10 (2001).
  9. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46, 208-209 (1957).
  10. Forstmeier, W., Wagenmakers, E. J., Parker, T. H. Detecting and avoiding likely false-positive findings - a practical guide. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 92, 1941-1968 (2017).
  11. Reason, J. Human error: models and management. The Western Journal of Medicine. 172, 393-396 (2000).
  12. Goss-Varley, M. Rodent Behavioral Testing to Assess Functional Deficits Caused by Microelectrode Implantation in the Rat Motor Cortex. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  13. Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7, 15254 (2017).
  14. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visual Experiments. (28), e1204 (2009).
  15. Chesler, E. J., Wilson, S. G., Lariviere, W. R., Rodriguez-Zas, S. L., Mogil, J. S. Influences of laboratory environment on behavior. Nature Neuroscience. 5, 1101-1102 (2002).
  16. Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284, 1670-1672 (1999).
  17. Richter, S. H., Garner, J. P., Auer, C., Kunert, J., Wurbel, H. Systematic variation improves reproducibility of animal experiments. Nature Methods. 7, 167-168 (2010).

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Comportamento edição 138 comportamento rato escada grade de campo aberto segue o algoritmo análise comportamental análise de movimento
Uma romance única Animal motricidade sistema usando simples, prontamente disponível Software de rastreamento
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Dona, K. R., Goss-Varley, M., Shoffstall, A. J., Capadona, J. R. A Novel Single Animal Motor Function Tracking System Using Simple, Readily Available Software. J. Vis. Exp. (138), e57917, doi:10.3791/57917 (2018).

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