Summary
El presente estudio pretende automatizar la cuantificación del déficit motor en ratas. El modelo de evaluación inicial evalúa motor pérdida resultante de una implantación de intracortical microelectrodos en la corteza de motor. Divulgamos sobre el desarrollo y uso de un algoritmo de seguimiento utilizando fácilmente adaptable, simple y disponible software de codificación.
Abstract
Recientemente hemos demostrado que implantar microelectrodos intracortical en los corteces motor de ratas produce déficit motor inmediato y duraderos. Deficiencias motoras manualmente se cuantificaron a través de una prueba de red de campo para medir la motricidad gruesa y de un examen de la escala para medir la motricidad fina. Aquí, discutimos una técnica para la cuantificación automatizada de las pruebas de vídeo grabado utilizando nuestro encargo Capadona comportamiento Video análisis sistema: red y prueba de la escalera o BVAS. Aprovechando sencillo y fácilmente disponible software de codificación (véase la Tabla de materiales), este programa permite el seguimiento de un solo animal en la red de campo abierto y las pruebas de la escalera. Abrir la grilla del campo de seguimiento, los umbrales de código el video de intensidad, rastrea la posición de la rata sobre la duración de 3 minutos de la prueba de rejilla y analiza el camino. Entonces calcula y devuelve las mediciones de la distancia total recorrida, la velocidad máxima alcanzada, el número de vueltas de la mano izquierda y derecha y el número total de líneas de la cuadrícula atravesada por la rata. En escala de seguimiento, el código otra vez los umbrales del video de intensidad, sigue el movimiento de la rata a través de la escalera, y devuelve mediciones calculado incluyendo el tiempo que tardó la rata a la escalera, el número de la pata desliza que ocurren por debajo del plano de la peldaños de escalera y la incidencia de fracasos debido a estancamiento o retrocesos. Imaginamos que el BVAS desarrollado aquí pueden emplearse para el análisis de la función motora en una variedad de aplicaciones, incluyendo muchos modelos de lesión o enfermedad.
Introduction
Hay muchos métodos establecidos para evaluar funcional y de comportamiento motor y debilitaciones cognoscitivas1,2,3. Algunos de los métodos más comúnmente empleados incluyen pruebas de motricidad fina a través de la pata la colocación paso a paso y coordinación de la extremidad en una escala de prueba4, prueba de función motora gruesa y comportamiento de estrés mediante la prueba de rejilla de campo abierto5 ,6y pruebas para el miedo, la depresión y desesperación por la natación forzada prueba7,8 o rotor de barra9. Sin embargo, muchos de estos métodos dependen de investigadores humanos para "marcar" el animal o juzgar su rendimiento subjetivo. La necesidad de una valoración subjetiva humana puede disminuir la generación y análisis de los datos, así como presentar la posibilidad de una influencia intencional o inintencional de sesgo de la investigación en el estudio10. Evaluación más subjetiva de los datos también presenta el riesgo de representación de los datos inexactos, ya sea por olvido, pobre motivación, entrenamiento inadecuado o negligencia11.
Recientemente hemos reportado el uso de una prueba de red de campo abierto y una prueba de escalera en ratas implantadas con microelectrodos intracortical12,13. Debido a la novedad de los resultados de esos estudios, inmediatamente empezamos a emplear aquellos y pruebas funcionales adicionales en muchos estudios en curso en el laboratorio. En previsión de variabilidad generada por humanos resultantes de un aumento en el número de evaluadores subjetivas y para mejorar el rendimiento del análisis, nos propusimos para crear un programa automatizado, asistido por computadora para pruebas de comportamiento, y limitan mucho la posibilidad de error.
Aquí, Divulgamos sobre el desarrollo de la BVAS. El BVAS utiliza el análisis de ordenador para conseguir una prueba de red de campo abierto y una prueba de escalera como indicadores de la función motora gruesa y fina, respectivamente. Los resultados pueden ser utilizados para aclarar déficits de motricidad posible causados por lesión o enfermedad, sin importar el modelo de lesión o enfermedad. Los códigos de análisis pueden ser adaptados para tener en cuenta cambios en el equipo de prueba de comportamiento o para marcar diferentes parámetros de la función motora. Por lo tanto, el BVAS pueden implementarse en muchas aplicaciones, más allá de nuestro uso o el uso previsto de los actualmente empleados por otros laboratorios.
Tenga en cuenta que las pruebas de red y escalera del campo abierto requieren grabación de vídeo. Por lo tanto, cada prueba requiere una cámara de vídeo [1080p, mínimos 15 cuadros por segundo (fps)], un portátil y un espacio para almacenar los datos de vídeo. Para ambas pruebas, coloque la cámara en una posición centrada, permitiendo el aparato entero ser visto en el marco. Fijar la cámara en un trípode o un andamio para que no se mueva durante la prueba. Mantener los bordes del fotograma de vídeo como cerca paralela a los bordes del aparato de prueba como sea posible. Asegúrese de completa todo prueba el mismo personal y la habitación está bien iluminada con un sistema de control de temperatura. Utilice la misma habitación para todos los animales en el transcurso de la prueba, con cambios mínimos a la sala. Cereales o chips de plátano que buenas recompensas a los animales para completar las pruebas de comportamiento.
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Protocol
Todos los procedimientos y prácticas de cuidado de los animales fueron aprobadas por y realizadas de acuerdo con la Comisión de uso y Louis Stokes Cleveland Departamento de veteranos asuntos centro institucional Animal atención médica. El protocolo de pruebas conductual sigue muy de cerca el trabajo previamente publicado12,13.
1. comportamiento de la prueba: Filmando las tareas
Nota: Aquí, los animales fueron probados por 8 semanas detectar cualquier cambio conductual crónica. La duración del estudio depende del modelo de enfermedad de lesiones de aplicación utilizado para el estudio.
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Abrir red pruebas
Nota: La prueba de la rejilla tiene un área de 1 m2 con paredes de 40 cm y fue construida en el local. El fondo se reparte en nueve cuadrados por medio de cinta (figura 1A) de colores brillantes. Para el uso de la BVAS automatizado, es importante que el color de la línea y la rejilla de contraste con la rata. Aquí, se utilizaron ratas Sprague Dawley blanco; así, el fondo de la red fue pintado de negro, y las líneas fueron creadas con cinta rosa brillante.- Prueba los animales 2 veces por semana para todas las pruebas incluyendo la semana antes de comenzar el estudio con el fin de crear una calificación de línea de base para el uso en cálculos posteriores.
- Limpie todo el equipo de prueba con un esterilizante basados en dióxido de cloro al inicio de cada sesión de evaluación y entre cada animal.
- Llevar los animales a la sala para la prueba y que puedan adaptarse a la habitación por 20 min antes de comenzar los ensayos.
- Comenzar a filmar y coloque el animal en el centro de la red, hacia el investigador, al comenzar el test de rejilla.
- Permitir que el animal funcionar libremente durante 3 minutos mientras que graban vídeo de arriba.
- Deje de filmar cuando el minuto 3 periodo de tiempo ha terminado y devolver el animal a su jaula casera. Limpie la rejilla con un esterilizante de basados en dióxido de cloro, teniendo cuidado de secar completamente la superficie antes de la prueba. Prueba cada animal 1 x por sesión.
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Pruebas de escala
Nota: La prueba de la escalera fue construida en la empresa y consiste en dos paredes de acrílico laterales, cada 1 m de longitud, conectado por peldaños de diámetro 3 mm espaciados a intervalos de 2 cm (figura 2). Los animales requieren una semana de entrenamiento de la escalera antes de comenzar la prueba oficial. No hay diferencia entre la formación y el protocolo de pruebas. Tenga en cuenta que el entrenamiento no necesita ser filmado.- Para el uso con el BVAS, cubrir la pared detrás de la escalera con una cartulina negra y delimitar el nivel de los peldaños, comienzo y final líneas con cinta brillante para crear un contraste con las ratas blancas.
- Prueba los animales 2 veces por semana para todas las pruebas incluyendo la semana antes de comenzar el estudio para crear una puntuación de línea de base para el uso en cálculos posteriores.
- Limpie todo el equipo de prueba con un esterilizante basados en dióxido de cloro al inicio de cada sesión de evaluación y entre cada animal.
- Llevar los animales a la sala para la prueba y que puedan adaptarse a la habitación por 20 min antes de comenzar los ensayos.
- Coloque el animal en una jaula limpia temporal antes de la prueba de la escalera.
Nota: Una jaula temporal es un a corto plazo para mantener el animal mientras jaula casera del animal se utiliza al final de la escalera. No hay ninguna edad sesgo como todos los animales utilizados en el estudio son la misma edad y la prueba completa en el mismo período de tiempo. El control utilizado aquí es un animal de ingenuo nunca haber recibido cirugía. - Ajustar el aparato de la escalera hasta palmo dos jaulas; la jaula de inicio es una jaula limpia, y la jaula del final es del animal vivo, un incentivo para completar la carrera.
- Coloque la cámara sobre un trípode, centrado en la longitud de la escalera. Extender el trípode para que el lente de la cámara está a la altura de los peldaños de escalera. Posición de la cámara para que los peldaños están alineados exactamente con la lente ya que es importante que el algoritmo de detección de deslizamiento en el código BVAS.
- Iniciar la grabación de vídeo y permite la rata empezar la carrera mediante la celebración de sus patas delanteras sobre el primer peldaño de la escalera. Permitir que el animal para moverse en la escalera sin ayuda.
- Permiten al animal pasar de la línea de salida a la línea de meta a su propio ritmo durante el rodaje. Terminar la grabación de vídeo y eliminar el animal de la escalera una vez que el animal ha completado la carrera.
- Considerar la carrera una carrera fallida si el animal se da la vuelta o permanece estancada por 20 s. final la grabación de vídeo y eliminar el animal de la escalera si el animal no la carrera. Asignar una puntuación de pena para funciona que es equivalente al tiempo más lento registrado durante la prueba de base antes de la cirugía.
- Asegurar que cada animal completa 5 carreras por día de la prueba y les dan un 1 min descanso entre cada ensayo.
Nota: En este estudio, los animales fueron probados 2 veces por semana durante 8 semanas. Sin embargo, el plazo es hasta la discreción del investigador.
2. almacenamiento y nombramiento de archivos
Nota: El código BVAS utiliza específicamente designado archivo y carpeta nombrando convenciones que videos pueden analizar confiablemente y analizados correctamente. Diferentes convenciones de nombres actualmente no son compatibles. Después de la terminación de una sesión de prueba, el archivo de vídeo se guarda en la ubicación predeterminada bajo un nombre por defecto.
3. el sistema instalación
Nota: El BVAS fue construido y había probado en sistemas operativos de PC y aprovecha el tiempo de ejecución componentes de simple y fácilmente disponible software de codificación. Otras configuraciones de sistema no son compatibles actualmente.
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Instalar la última versión BVAS
- Ejecute el instalador haciendo doble clic en el icono instalador 'BVASX. XXinstaller'. "X.XX" actualmente es el número de versión actual, 'BVAS3.30installer'.
Nota: Esto es software de código abierto. Contactar con el autor correspondiente para la versión más reciente. - Siga la pantalla instrucciones para instalar el BVAS.
Nota: El programa de instalación comprobará el sistema para la versión correcta del software (por ej., tiempo de ejecución de MATLAB) y si no se encuentra, se instale el software desde internet. - Una vez instalado, inicie el programa haciendo clic en el 'BVAS.exe' archivo.
- Ejecute el instalador haciendo doble clic en el icono instalador 'BVASX. XXinstaller'. "X.XX" actualmente es el número de versión actual, 'BVAS3.30installer'.
4. sistema de uso
- Abrir el programa
- Haga doble clic en el icono del programa BVAS para que aparezca el menú principal de BVAS que permite las siguientes opciones: 'Análisis de la red', 'Análisis de la escalera', 'Escala de' o 'Quit'.
Nota: También hay un menú desplegable situado en la esquina superior izquierda con la etiqueta 'Configuración de correo electrónico' (figura 3A).
- Haga doble clic en el icono del programa BVAS para que aparezca el menú principal de BVAS que permite las siguientes opciones: 'Análisis de la red', 'Análisis de la escalera', 'Escala de' o 'Quit'.
- Configuración de correo electrónico
- Haga clic en el menú 'Configuración de correo electrónico' y seleccione 'destino de correo electrónico de cambio'.
- Escriba una dirección de correo electrónico preferido para recibir actualizaciones sobre el análisis y seleccione 'OK'. Seleccione "Cancelar" para no cambiar el correo electrónico actualmente guardado.
- Haga clic en el botón 'Enviar mensaje de prueba' para enviar un correo electrónico de prueba al correo electrónico actualmente guardado en el sistema. Cerca el 'correo enviado!' pop-up de ventana que significa la terminación de la prueba.
- Campo abierto análisis de prueba de red
- Seleccione 'Rejilla de análisis' de la pantalla del menú superior.
- Asegúrese de que el botón con la etiqueta 'Video/toda sesión parcela datos' está mostrando toda la sesión para completar el análisis en un conjunto de pruebas de videos de la sesión.
- Utilizar el botón de '...' al lado de la caja de entrada superior para navegar por el sistema de archivos para buscar el archivo de videos para analizar. Seleccione la carpeta en el estilo en paso 2.2.1.
- Utilizar el... botón junto al cuadro de entrada inferior para navegar por el sistema de archivos para seleccionar el archivo de hoja de cálculo en la que almacenar los datos.
Nota: Tenga en cuenta que, como salida de datos a un archivo de hoja de cálculo, los datos de la ruta de acceso completa para cada vídeo se almacenaron en un archivo de datos (MAT) en el mismo directorio que contiene los videos elegidos en el paso 4.3.3. - Asegúrese de que el botón mencionado en el paso 4.3.2 se establece en 'Solo Video' para completar el análisis en un solo vídeo.
- Utilizar el... botón al lado de la caja de entrada superior para navegar por el sistema de archivos para buscar el archivo del video para analizar.
- Utilizar el... botón junto al cuadro de entrada inferior para navegar por el sistema de archivo para seleccionar un directorio para guardar el archivo de datos (MAT) que resulta del análisis de video solo.
Nota: El archivo de datos será nombrado después del video, que lleva el animal. - Seleccione "Datos de salida" de la palanca del mencionado en el paso 4.3.2. a la salida de los datos de un video de red previamente analizado. Se muestran ejemplos de estos datos trazados en figuras 1B y 1C.
- Utilizar el... botón al lado de la caja de entrada superior para navegar por el sistema de archivo para seleccionar un archivo de datos de vídeo de red creado anteriormente. Seleccione 'ir!' para crear la figura de la parcela y los datos.
Nota: Esta función también crea un archivo de texto, el nombre del mismo y situados en el mismo directorio que el archivo de datos, que tiene el animal de ejecutar datos en él. - Una vez ambos archivos necesarios han sido localizados, seleccionar 'ir!' para comenzar el análisis de vídeo. Observe que el botón de 'volver' se vuelva a abrir el menú principal y el botón 'salir' cierra el programa completamente. Elija el botón de 'Display Debug' para mostrar una representación visual del algoritmo de seguimiento (figuras 3 y 3D).
- Seleccione 'ir!' para iniciar el proceso de análisis. Examinar las imágenes de cada vídeo en la pantalla del revisor. Use los botones 'siguiente' y 'anterior' de la página si hay más de cinco videos.
- Para abrir un menú de selección manual, seleccione el botón 'Editar' si existen líneas verdes o la línea verde no parece estar en la Plaza correcta en el área de pruebas. Para editar las esquinas, seleccione el botón 'Editar las esquinas'.
Nota: El botón de 'Siguiente fotograma' cambia la imagen representativa para el siguiente fotograma del vídeo en cuestión. Seleccione el botón de 'Siguiente fotograma' si el marco dado automáticamente se obstruidos o fuera de foco. - Siga las instrucciones a la derecha de la imagen representativa para seleccionar el área de pruebas y pulsa 'Enter' para completar el proceso de selección.
Nota: Las líneas verdes seleccionadas ahora aparecerá en la imagen representativa. - Seleccione 'hecho' para guardar la selección y volver a la pantalla del revisor.
- Seleccione el botón 'hecho' del centro para iniciar el proceso de análisis completo una vez que el área de red para cada vídeo está seleccionado correctamente. Permite el ejecución del programa y, una vez terminado, aparecerá un mensaje de éxito.
Nota: El análisis completo de una sesión de videos puede tardar algún tiempo, aproximadamente 10 minutos por animal.
- Análisis de ensayo de la escalera
Nota: El protocolo para el análisis de la prueba de escala inicial es muy similar al protocolo descrito en pasos 4.3.10–4.3.15. Las notables diferencias antes esos pasos son los siguientes:- Seleccione 'Análisis de escala' en el menú superior para abrir el menú de análisis de la escala.
- Ver las dos opciones de la palanca, 'Solo vídeo' y 'Toda la sesión' (figura 3B).
- ConToda la sesión, seleccione la parte superior de entrada... botón para seleccionar la carpeta con vídeos escalera en 2.2.1.Select de paso inferior... el botón para seleccionar un directorio para guardar una carpeta con datos de los vídeos de la escalera para revisar más adelante.
- Si 'Solo Video' está seleccionado, seleccione un solo vídeo de archivo con la parte superior... botón y una ubicación al igual que en paso 4.4.3.
- Seleccione 'ir!' para iniciar el proceso de análisis y aparezca la pantalla de revisor de área de prueba de escalera.
- Siga pasos 4.3.10–4.3.15 la misma manera para la escalera en cuanto a la red. Permite el ejecución del programa y, una vez terminado, aparecerá un mensaje de éxito.
Nota: Si algo sale mal durante el análisis, se envía un correo electrónico a la dirección de correo electrónico en paso 4.2.2. Sobre la terminación de un análisis de cualquier tipo, un correo electrónico de terminación es enviado a la misma dirección de correo electrónico.
- Revisión de imagen de escalera
Nota: El siguiente protocolo es revisar previamente analizado videos de escalera para confirmar los fallos y la pata se desliza. Tenga en cuenta que no se generan archivos de hoja de cálculo para una travesía de la escalera para ver hasta que termine de 'Escalera imagen de' (medidas 4.5.1–4.5.5).- En el menú principal, seleccione 'Escalera imagen de'. Esto trae la escalera Informe archivo Seleccione pantalla.
- Seleccione la parte superior... botón para seleccionar la carpeta de los archivos de datos.
Nota: Los archivos se guardan en la ubicación elegida en el paso 4.4.2 y se nombran en el siguiente formato: "M1_D1_Y1 escalera Video sesión HH_MM M2_D2_YYYY". M1, D1 y Y1 son la fecha de la sesión de análisis. "Escalera Video sesión" leerá "Solo Video análisis" si sólo se analizó un solo vídeo. HH_MM y M2_D2_YYYY son la hora y fecha que se inició la sesión de revisión. - Seleccione la parte inferior... para seleccionar el archivo de hoja de cálculo creado para el estudio.
- Seleccione 'ir!' para iniciar el proceso de revisión manual.
- Ver el menú de revisor de datos escala automáticamente abierto. Si se detecta un deslizamiento, utilice el 'Próximo capítulo' y 'Último fotograma' botones para comprobar cualquier forma consecutiva registran marcos si está disponible.
- Utilizar el botón de deslizamiento para denotar qué pie de rata se ha deslizado. Dejar la palanca en 'No Slip' si la detección es un falso positivo. Haga clic en 'Guardar/continuar' para avanzar a la siguiente detección (figura 2A).
- En caso de falla, utilice el botón para indicar si la falla es debido a la revocación (donde la rata de vuelta durante la carrera) o estancamiento (donde la rata no pudo completar la carrera en tiempo y forma).
- Haga clic en 'Guardar/continuar' para avanzar a la siguiente detección. En la última detección, haga clic en 'Guardar/continuar' para completar el análisis y guardar los datos en el archivo de hoja de cálculo elegido anteriormente. Descartar el aviso de terminación.
Nota: Una vez finalizada la revisión, la carpeta que fue revisada se retitula "Revisado M1_D1_Y1 escalera Video sesión HH_MM M2_D2_YYYY".
5. Análisis de datos de salida
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Archivo de hoja de cálculo de la red
- Localizar los datos creados en el archivo de hoja de cálculo de cada red video.
Nota: Las columnas se izquierda a derecha como sigue: nombre del animal, fecha de la prueba, la semana de estudio número, distancia total recorrido, total tiempo parado, velocidad máxima alcanzada, derecha se convierte, vueltas izquierda y línea de la rejilla cruza (figura 1D). - Utilice estas métricas para cuantificar el rendimiento del motor bruto y crear parcelas de comparación entre los animales y puntos del tiempo.
- Localizar los datos creados en el archivo de hoja de cálculo de cada red video.
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Archivo de hoja de cálculo de escala
- Busque los datos creados en el archivo de hoja de cálculo de cada video de escalera tras el fracaso y revisión de deslizamiento de la pata.
Nota: Las columnas se izquierda a derecha como sigue: nombre de animales, ejecución número 1 – 5, semana de estudio número, fecha de prueba, tipo de funcionamiento (éxito o fracaso), tiempo de carrera de éxitos, porcentaje completado, la pata se desliza en cada pata y modo de falla. La columna de tiempo está en blanco para un fracaso y la columna de modo de falla leerá revocación o estancamiento (figura 2B). - Utilice estas métricas para cuantificar el rendimiento del motor fino y crear parcelas de comparación entre los animales y puntos del tiempo.
- Busque los datos creados en el archivo de hoja de cálculo de cada video de escalera tras el fracaso y revisión de deslizamiento de la pata.
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Representative Results
Siguiendo los métodos presentados aquí, ratas completó la red de campo abierto y pruebas de escala 2 x por semana. Los datos fueron analizados mediante el uso de BVAS y manualmente con un cronómetro por entrenados y revisores novatos. Los resultados presentados son un promedio de las puntuaciones semanales crudas de un animal de solo control no implantado sobre un estudio de 8 semanas, donde "0" de la semana corresponde a la prueba de referencia. Nota no había ninguna prueba durante la semana 1 como esto fue una semana de descanso para los animales de cirugía. Porque la red de campo abierto es probado 1 x al día, la escalera es probado 5 veces por día y hay dos días de exámenes por semana, hay una muestra de 16 ensayos para red de campo abierto, considerando que hay 80 ensayos para la prueba de escalera en la misma semana 8 período de tiempo.
BVAS vs. análisis de manual:
Para confirmar la consistencia del sistema BVAS y validar contra análisis manual, se compararon los resultados para líneas de red cruzadas y escalera cruzando el tiempo a los resultados de manual de tres revisores expertos (n = 3) como un "estándar de oro". Los usuarios (n = 7) también examinó los datos tanto de forma manual y usando el BVAS. Para la validación, cada revisor examinó el mismo día uno de los experimentos para un animal (red prueba = un video/ensayo; escala de prueba = 5 ensayos independientes). Los resultados de la prueba de campo abierto red demostraron que los revisores expertos eran más constantes que los revisores novatos eran (una variación de 0 y una varianza de 17.1, respectivamente), pero cuando se utiliza el BVAS, hubo cero varianza (los usuarios expertos y novatos Figura 4 A). de manera similar, los resultados de la prueba escala demostraron que los revisores expertos eran más constantes que los revisores novatos fueron (~3.5x más grande: una variación de 0.120 frente a una variación de 0.414, respectivamente), pero cuando se utiliza el BVAS, había otra vez cero varianza para usuarios expertos y novatos (figura 4B).
Por lo tanto, donde sea posible, métricas de comportamiento para la red de campo abierto y la escalera de prueba fueron cuantificadas manualmente por el mismo usuario experto y en comparación con los resultados generados usando el BVAS. Aquí, se evaluaron los resultados de animales todo incluidos durante toda la duración de los experimentos. Todo error se informa como un error estándar de la media (SEM) a menos que informó lo contrario. La diferencia entre los dos métodos oscilan entre un promedio de 0.64 ± 0.06 s para la prueba de la escalera y 3,56 ± 0,53 líneas para la prueba de la rejilla. La diferencia promedio para la prueba de rejilla de campo abierto en el transcurso de 8 semanas entre los dos métodos fue de ± 11,13 3,03%. La diferencia promedio para la prueba de escalera en el transcurso de 8 semanas entre los dos métodos fue de 9,05 ± 1,07%. La diferencia porcentual entre los dos métodos se calculó siguiendo la ecuación 1.
Ecuación 1:
Nota también para la escala prueba de sincronización, la recogida manual de datos sólo es precisa 1 s (que puede cambiar según el dispositivo utilizado para mantener el tiempo), mientras que el BVAS es preciso el inverso de la velocidad de fotogramas del vídeo revisando. Por ejemplo, si el video es filmado en 15 fotogramas por segundo, los datos BVAS están precisos 1/15th de un segundo.
Prueba de la red de campo abierto:
Tras previamente publicaron protocolos12,13, animales podían correr libremente en una prueba de campo abierto red durante 3 minutos medir su función motora gruesa y estrés comportamiento. El vídeo grabado durante la prueba se analizó utilizando la BVAS a cuantificar los resultados de raws de la velocidad máxima, la distancia total, el número de líneas de la cuadrícula cruzado y el porcentaje de vueltas derecho alcanzado por el animal (figura 5). Mientras que este dato es sólo representativa de un animal, las tendencias fueron vistos a lo largo del estudio de mayor velocidad máxima alcanzada, mayor distancia total recorrida, y un número creciente de líneas de la cuadrícula cruzado. Como era de esperar, comparados entre sí, la distancia total viajó, y las líneas de división total cruzado tuvieron correlación positiva fuerte. Comparación de la cuantificación manual para la cuantificación de la cuadrícula BVAS reveló resultados comparables (figura 5C). Para este animal en particular, el porcentaje de vueltas adecuados en gran parte rondaba entre 40% y 50%(figura 5). De nota, la métrica de la distancia total recorrida, velocidad máxima y girar a la dirección pudieron cuantificarse manualmente y representan otra característica adicional del programa BVAS automatizado.
Prueba de la escalera:
Previamente divulgados4,14, la prueba de la escalera se completó para medir el alcance coordinado y motricidad fina. El vídeo grabado durante la prueba se analizó utilizando la BVAS a cuantificar las puntuaciones crudas para el momento de cruzar y el número de hojas de pata (figura 6). En este animal, había una tendencia decreciente en el tiempo para cruzar la escalera, seguida por un aumento en el tiempo a partir alrededor de la semana 4. Comparación de la cuantificación manual a la BVAS cuantificación del tiempo de travesía reveló resultados comparables (figura 6A). Como el animal presentado un control no quirúrgico, la pata se desliza era infrecuentes y comparable en número entre la pata izquierda y derecha (figura 6B).
Figura 1 : Ejemplo de resultados de la prueba de campo abierto red. (A) este panel muestra el comportamiento prueba m 12 abrir prueba con un fondo negro y líneas de rejilla de color rosa. (B) este es un ejemplo de un diagrama de red de 3 min de un solo animal correr. Este animal hizo un circuito de la red y luego en su mayoría permaneció inmóvil para el resto del tiempo. La O roja y x denota donde el algoritmo de detección de giro a la izquierda (O) detecta o girar la derecha (X). (C) este es un segundo ejemplo de un diagrama de red de 3 min de un solo animal correr. Este animal era extremadamente activo durante todo el período prueba de 3-min. La O roja y x denota donde el algoritmo de detección de giro a la izquierda (O) detecta o girar la derecha (X). (D) este es un ejemplo de la salida en el archivo de datos para las dos carreras en los paneles B y C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ejemplo de una escala datos revisor pantalla. (A) este panel muestra la pantalla de revisor de datos escala, con una captura de pantalla mostrando la configuración de prueba de la escalera. Esta pantalla es donde el usuario confirmará detectados resbalones y fracasos. Este ejemplo muestra un positivo detectado resbalón de la pata delantera derecha. (B) este es un ejemplo de la salida en el archivo de datos para la escala de funcionamiento que fue examinado en el panel A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Ejemplo de pantallas de análisis BVAS. (A) este panel muestra el menú principal de la BVAS. Tenga en cuenta los cuatro botones a lo largo de la parte inferior y el menú desplegable de Configuración de correo electrónico en la esquina superior izquierda. (B) este es un ejemplo de una pantalla de selección de archivo, en este caso para el análisis del video de escalera. (C) este es un ejemplo de un visor de análisis de depuración para un video de prueba de red. Esto demuestra el algoritmo de detección durante el análisis de una prueba de la rejilla. (D) este panel muestra un ejemplo de un visor de análisis de depuración para una prueba de escalera video. Esto demuestra el algoritmo de detección durante el análisis de una prueba de escalera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Ejemplo de experto y principiante prueba resultados. Estos paneles muestran los resultados de un manual y un BVAS expertos y novatos para (A) el número de líneas de la cuadrícula cruzado en la prueba de rejilla de campo abierto y (B) el tiempo para cruzar en la prueba de la escalera. Para ambas pruebas, los resultados mostraron que los usuarios expertos tenían una menor varianza que los usuarios noveles para el análisis manual, mientras que usando el BVAS resultó en cero variación, independientemente de la experiencia de usuario. La desviación estándar se divulga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Representante abrir resultados de la prueba de campo red. Estos paneles muestran resultados de la prueba de campo abierto representante rejilla para un animal del control no implantado para (A) la velocidad máxima alcanzada (B) el total de distancia recorrida, (C) el número total de líneas de la cuadrícula cruzado y (D) la porcentaje de giros derecha por el animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Resultados de la prueba escala representante. Estos paneles muestran resultados de la prueba escala representativa para un animal del control no implantado para (A) el tiempo para cruzar la escalera, (B) el número de la derecha e izquierda-frente-paw, slips y tangas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La parte más crítica del protocolo para asegurar un análisis fuerte es la película constante. Si los videos son bien iluminado y filmada en la posición correcta como se explica en la primera sección del Protocolo, el sistema será capaz de hacer un análisis preciso. Como con cualquier problema de procesamiento de imágenes, el trabajo realizado en el proceso previo hará que el procesamiento posterior más precisa y simple. Como tal, asegurándose de que los aparatos y los animales están bien iluminados durante las pruebas y cualquier sombra u otro movimiento en el marco se mantiene al mínimo significa que el BVAS puede funcionar a un nivel superior de precisión.
El protocolo presentado aquí puede utilizar eficiente y reproducible analizar resultados de función motora gruesa y fina pruebas en roedores a través de un abierto campo de red y una prueba de escalera. Además, reduce la posibilidad de error humano o sesgo en el proceso de análisis como el análisis de datos se ha completado en gran medida por el equipo uno mismo-funcionamiento sin cualquier usuario. Debido a esta característica, el sistema BVAS puede utilizarse con el mismo nivel de precisión por usuarios expertos y novatos. El programa BVAS es autocontrol, fáciles de aplicar y barato usar. Además, el código puede ser adaptado a las necesidades individuales de los investigadores. Por ejemplo, puede utilizar el código de red de campo abierto a analizar una variedad de parámetros como la distancia total recorrida, la velocidad máxima alcanzada, y el número de la izquierda y la derecha da vuelta y probablemente podría modificarse fácilmente para el rastreo en un laberinto de agua o forzado baño t preguntar. Pueden hacer modificaciones adicionales al código para tener en cuenta para la iluminación de habitación diferentes, diferencias en parrilla y escalera línea color y diferencias en color de animales. Aunque el aparato de prueba y el código BVAS aquí presentados fueron diseñados para su uso en estudios de ratas, esperamos que bien podría ampliarse hacia arriba o hacia abajo para usarse con varios animales de tamaño, aunque esto no ha sido verificado hasta la fecha.
Como con todo comportamiento pruebas y análisis de datos, es importante mantener la mayor consistencia posible en todo el estudio y análisis posterior. Aunque el BVAS presentada reduce su confianza en la intervención humana para el análisis de datos, variación humana puede entrar en juego con el investigador trabaja con los animales y manejo de los procedimientos15. Además, cambios en la prueba de ubicación de16 o vivienda y de las condiciones de cría17 también pueden influir en los resultados. Mientras que el BVAS puede actualizarse para tener en cuenta iluminación y ángulo de la cámara, factores como olores, personal o dieta pueden sólo explicarse en el momento del estudio. Por lo tanto, los investigadores deben tomar precauciones para permanecer lo más consistente posible en los ensayos con animales y las condiciones de vivienda, la prueba personal y los métodos analíticos, entre otros.
El BVAS es novela debido a su sistema de detección compuesto. Cada fotograma del vídeo pasa por varios filtros de imagen para crear máscaras binarias todos calibrados para buscar la rata en el marco. Cada forma de rata posible entonces es clasificado por el sistema en su probabilidad de ser la rata. Esta clasificación de factores de tamaño, el número de filtros de que la forma se detecta, y la última ubicación conocida y la ubicación prevista del animal basado en la trayectoria anterior. Esto hace que para una detección animal fuerte que puede superar la mayoría de los problemas que se presenta basada en sombras y cambios en la iluminación. A diferencia de los sistemas de seguimiento de animales disponibles en el mercado actual, este método no requiere ninguna modificación a los animales para hacer más visible y utiliza una webcam estándar velocidad de la grabación de vídeo. El sistema BVAS es también una mejora sobre pruebas de comportamiento manualmente cuantificado convencional porque objetivamente se miden todas las métricas que se generan a través de los videos. Un estudio de comportamiento humano cuantificado tendrá cierta subjetividad en la naturaleza como el investigador decide lo que constituye una línea de cuadrícula o la guía de pata Cruz.
El sistema requiere una configuración algo específica para trabajar a su máxima capacidad. Mientras que es posible adaptar el sistema a los cambios en el aparato, en la actualidad requeriría cierta fluidez en computadora para editar el código de codificación. Con cierta fluidez de codificación, la resolución de problemas se hace fácil porque el error aviso correos electrónicos incluyen una lectura de la información de error completo. Si los videos en el sistema no están en la tasa ideal de estructura o resolución (1080p, 15 fps), el usuario es alertó a través de un mensaje de advertencia. Este cambio afectará la exactitud del sistema, pero todavía puede funcionar en vídeos baja resolución. Iluminación ni problemas de sombra que provocan un error durante el análisis dará lugar a un mensaje de error dinámico enviado al correo electrónico especificado por el usuario. El usuario entonces puede utilizar el visor de debug para ver el análisis de cuadro por cuadro para entender qué problema se presentó. El mensaje de error también incluye un error informe, por lo que si es un problema de codificación, puede abordarse simplemente.
En el futuro, el sistema BVAS puede además adaptar sin ningún conocimiento de la sintaxis del software de codificación. La adición de un seguimiento de las opciones podrían permitir al usuario seleccionar el color de las líneas de cuadrícula y animales simplemente y convenientemente. La prueba de escalera de seguimiento también aumentará en precisión con la posible adición de un detector de objeto de cascada en el código y una mejor plataforma de iluminación escalera para acompañar la prueba de la escalera y aparato de filmación. Por lo tanto, esperamos que el sistema BVAS descrito aquí puede implementarse fácilmente en una variedad de tareas de función del comportamiento y motor que abarca una amplia variedad de modelos de enfermedad y lesiones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el mérito de premio # B1495-R (para Jeffrey R. Capadona) y el Premio Presidencial de la carrera temprana de científico e ingenieros (PECASE) (a Jeffrey R. Capadona) de los Estados Unidos Departamento de los veteranos asuntos rehabilitación de Servicio investigación y desarrollo. Además, este trabajo fue financiado en parte por la oficina del Secretario de defensa asistente para asuntos de salud a través del Peer revisada médica investigación programa bajo Nº de premio W81XWH-15-1-0608. Los autores reconocen la fuente para su investigación de verano apoyo financiero. Los contenidos no representan las opiniones del Departamento de Asuntos Veteranos de Estados Unidos o el gobierno de Estados Unidos. Los autores desean agradecer a Hiroyuki Arakawa en la CWRU roedor comportamiento base para su orientación en el diseño y prueba de protocolos de comportamiento roedores. Los autores también desean agradecer a James Drake y Kevin Talbot de la CWRU Departamento de mecánica e ingeniería aeroespacial por su ayuda en el diseño y fabricación de la prueba escala roedores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rats, male, 201-225 g | Charles River | CD | |
| Webcam HD Pro c920 | Logitec | 960-000764 | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Matalb 2017a, Computer Vision System Toolbox | Mathworks | N/A | |
| Open field grid test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A | |
| Ladder test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A |
References
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