Summary
Lo studio corrente ha mirato per automatizzare la quantificazione dei deficit motori in ratti. Il modello di valutazione iniziale valuta motore perdite derivanti da un impianto di microelettrodo intracorticali nella corteccia motoria. Segnaliamo sullo sviluppo e l'uso di un algoritmo di rilevamento utilizzando facilmente adattabile, semplice e prontamente disponibili software di codifica.
Abstract
Recentemente abbiamo dimostrato che impiantando intracorticali microelettrodi nel motore corteces di ratti provoca deficit motori immediato e duraturo. Motorie manualmente sono stati quantificati attraverso una prova di griglia del campo aperto per misurare la funzione di motore lorda e attraverso un test di scala per misurare la funzione motoria fine. Discutiamo qui, una tecnica per la quantificazione automatizzata delle prove video-registrato utilizzando il nostro personalizzato Capadona comportamentale dei Video analisi sistema: griglia e scaletta Test o BVAS. Sfruttando semplici e facilmente accessibili software di codifica (Vedi la Tabella materiali), questo programma permette il tracciamento di un singolo animale sia la griglia di campo aperto e le prove di scaletta. In aprire la griglia del campo di rilevamento, le soglie di codice il video per intensità, tiene traccia della posizione del ratto nel corso della durata di 3 min della prova griglia e analizza il percorso. Quindi calcola e restituisce le misurazioni per la distanza totale percorsa, la velocità massima raggiunta, il numero di giri a sinistra e mano destra e il numero totale di linee di griglia attraversata da ratto. In scaletta, il codice nuovo di monitoraggio soglie il video per intensità, segue il movimento del ratto attraverso la scala, e restituisce misure calcolate compreso il tempo impiegato il ratto di attraversare la scala, il numero di zampa scivola che si verificano sotto il piano dei pioli e l'incidenza di danni dovuti a ristagno o inversioni. Immaginiamo che il BVAS sviluppato qui può essere impiegato per l'analisi della funzione motoria in una varietà di applicazioni, tra cui molti modelli di infortunio o malattia.
Introduction
Ci sono molti metodi consolidati per valutare entrambi motore funzionale e comportamento e cognitivi1,2,3. Alcuni dei metodi più comunemente impiegati includono test funzione motoria fine via zampa placement, rafforzamento e coordinamento degli arti su una scaletta prova4, test lorda funzione motoria e lo stress comportamento tramite il test di griglia campo aperto5 ,6e test per paura, depressione e disperazione attraverso il nuoto forzato test7,8 o rotore asta9. Tuttavia, molti di questi metodi si basano su ricercatori umani a "segnare" l'animale o per giudicare le prestazioni soggettivamente. La necessità di una valutazione soggettiva umana può rallentare la generazione e l'analisi dei dati, nonché a presentare l'opportunità per un'influenza intenzionale o non intenzionale della polarizzazione di ricerca in Studio10. Ulteriore valutazione soggettiva dei dati presenta anche il rischio di rappresentazione di dati inesatti, sia attraverso la dimenticanza, scarsa motivazione, formazione improprio o negligenza11.
Recentemente abbiamo segnalato l'uso di sia un test di griglia di campo aperto e uno scaletta in ratti impiantati con microelettrodi intracortical12,13. A causa della novità dei risultati in quegli studi, abbiamo subito iniziato a coloro che impiegano e ulteriori test funzionale in molti studi in corso nel laboratorio. In attesa della variabilità di generati non intenzionali derivanti da un aumento del numero di valutatori soggettive e per migliorare il throughput di analisi, abbiamo deciso di creare un programma automatizzato, computer-assistita di segnare test comportamentali, e limitare notevolmente il potenziale di errore.
Qui, segnaliamo sullo sviluppo del BVAS. Il BVAS utilizza analisi computerizzata per segnare un test di griglia di campo aperto e un test di scala metrica della funzione motoria lorda e fine, rispettivamente. I risultati possono essere usati per delucidare i deficit di funzione motoria possibile causati da infortunio o malattia, indipendentemente dal modello di infortunio o malattia. I codici di analisi possono essere adattati per tenere conto delle modifiche comportamento apparecchiatura di collaudo o di segnare diverse metriche della funzione motoria. Pertanto, il BVAS può essere implementato in molte applicazioni, oltre la nostra destinazione d'uso o l'uso previsto di quelli attualmente impiegati da altri laboratori.
Si noti che i test di griglia e la scaletta di campo aperto richiedono registrazione video. Di conseguenza, ogni test richiederà una videocamera [1080p, minimi 15 fotogrammi al secondo (fps)], un computer portatile e una camera per memorizzare i dati video. Per entrambi i test, è possibile posizionare la fotocamera in posizione centrata, consentendo l'intero apparato deve essere visto sul telaio. Ancorare la fotocamera su un treppiede o un ponteggio affinché non si sposti durante il test. Mantenere i bordi del fotogramma video più vicino al parallelo con i bordi dell'apparato di test possibili. Assicurarsi che lo stesso personale completano tutti i test e la camera è ben illuminata con un sistema di controllo della temperatura. Utilizzare la stessa camera per tutti gli animali nel corso della sperimentazione, con modifiche minime alla camera. Cereali o chips di banana fanno buone ricompense per incoraggiare gli animali per completare i test di comportamento.
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Protocol
Tutte le procedure e le prassi di cura degli animali sono state approvate da e in accordo con il Comitato di uso e Louis Stokes Cleveland dipartimento del Veterans Affairs Center istituzionale animale cure mediche. Il protocollo di test comportamento segue da vicino il lavoro precedentemente pubblicato12,13.
1. test comportamentale: Le riprese le attività
Nota: Qui, gli animali sono stati testati per 8 settimane rilevare le modifiche comportamentali che croniche. La durata dello studio è dipenda il modello di applicazione/infortunio/malattia utilizzato per lo studio.
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Aprire il test sul campo griglia
Nota: Il test di griglia ha una superficie di 1 m2 con pareti di 40 cm e fu costruito in-House. Il fondo è suddiviso in nove quadrati via brillantemente colorato nastro (Figura 1A). Per l'uso della BVAS automatizzata, è importante che il colore della linea e la griglia in contrasto con il topo. Qui, sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley bianchi; così, sullo sfondo di griglia era dipinto di nero, e le linee sono state create con nastro rosa brillante.- Testare gli animali 2 volte a settimana per tutte le prove compresa la settimana prima di iniziare lo studio al fine di creare un punteggio di riferimento per l'uso nei calcoli successivi.
- Pulire tutte le apparecchiature di prova con un sterilizzante di basato sul biossido di cloro all'inizio di ogni sessione di test e tra ogni animale.
- Portare gli animali in camera per test e consentire loro di regolare alla camera per 20 min prima di iniziare le prove.
- Iniziare le riprese e posizionare l'animale al centro della griglia, il ricercatore, per iniziare il test di griglia dalla parte opposta.
- Permettere all'animale di correre liberamente per 3 min mentre video registrate dall'alto.
- Interrompere le riprese quando il min 3 periodo di tempo è terminato e tornare l'animale alla sua gabbia a casa. Pulire la griglia con un sterilizzante di basato sul biossido di cloro, avendo cura di asciugare completamente le superfici prima del test. Testare ogni animale 1 x per ogni sessione.
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Test di scaletta
Nota: Il test di scala è stato costruito in-House e si compone di due pareti laterali acrilico, ogni 1 m di lunghezza, collegato da gradini di diametro 3 mm spaziati ad intervalli di 2 cm (Figura 2). Gli animali richiedono una settimana di formazione scaletta prima di iniziare le prove ufficiali. Non c'è alcuna differenza tra la formazione e il protocollo di prova. Si noti che la formazione non ha bisogno di essere girato.- Per l'uso con il BVAS, coprire il muro dietro la scala con un cartellone nero e delineare il livello di pioli, start e linee di finitura con nastro brillante per creare un contrasto con i ratti di bianco.
- Testare gli animali 2 volte a settimana per tutte le prove compresa la settimana prima di iniziare lo studio per creare un punteggio di riferimento per l'uso nei calcoli successivi.
- Pulire tutte le apparecchiature di prova con un sterilizzante di basato sul biossido di cloro all'inizio di ogni sessione di test e tra ogni animale.
- Portare gli animali in camera per test e consentire loro di regolare alla camera per 20 min prima di iniziare le prove.
- Metti l'animale in una gabbia pulita temporanea prima della prova di scaletta.
Nota: Una gabbia temporanea è una gabbia a breve termine per tenere l'animale mentre gabbia dell'animale viene utilizzato alla fine della scala. Non c'è nessuna età bias come tutti gli animali utilizzati nello studio sono della stessa età e completare i test rispetto allo stesso periodo di tempo. Il controllo utilizzato qui è un ingenuo animale dopo aver mai ricevuto la chirurgia. - Impostare l'apparecchio di scala fino a span due gabbie; la gabbia di inizio è una gabbia pulita, e la gabbia di fine è gabbia dell'animale vivente, un incentivo per completare l'esecuzione.
- Posizionare la fotocamera su un treppiede, centrato sulla lunghezza della scala. Estendere il treppiede così l'obiettivo della fotocamera è all'altezza dei gradini scaletta. Posizionare la fotocamera in modo che i gradini sono esattamente allineati con la lente come questo è importante per l'algoritmo di rilevamento di slittamento nel codice BVAS.
- Avviare la registrazione video e consentire il topo a inizio della corsa tenendo le loro zampe anteriori sopra il primo gradino della scala. Permettere all'animale di passare la scala senza assistenza.
- Permettere all'animale di muoversi dalla linea di partenza al traguardo a loro piacimento durante le riprese. Terminare la registrazione dei video e rimuovere l'animale dalla scaletta, una volta che l'animale ha completato l'esecuzione.
- Si consideri il termine un'esecuzione non riuscita se l'animale si gira o rimane stagnante per 20 s. fine la registrazione video e rimuovere l'animale dalla scaletta, se l'animale non riesce la corsa. Assegnare un punteggio di penalità per le esecuzioni dei falliti che equivale al tempo più lento registrato durante la prova basale pre-intervento.
- Garantire che ciascun animale completa 5 cicli al giorno di test e dare loro un periodo di riposo min 1 tra ogni prova.
Nota: In questo studio, gli animali sono stati testati 2 volte a settimana per 8 settimane. Tuttavia, l'intervallo di tempo è a discrezione del ricercatore.
2. deposito e denominazione del file
Nota: Il codice BVAS utilizza specificamente designato dei video file e cartella convenzioni di denominazione in modo che il video può essere analizzato in modo affidabile e analizzato correttamente. Diverse convenzioni di denominazione non sono supportate. Dopo il completamento di una sessione di test, il file video viene salvato nel percorso predefinito con un nome predefinito.
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Denominazione dei video individuali
- Nome ogni video con indicazione dell'animale per griglia tutte le prove video.
- Raccogliere 5 video di scaletta per sessione per ogni animale di test. Selezionare tutti i cinque video e rinominare il primo video, utilizzando la denominazione dell'animale. Ad esempio, se il nome dell'animale è "C1NS", i file sono denominati "C1NS (1)", "C1NS (2)", "C1NS (3)", ecc.
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Cartella di archiviazione denominazione
- Prendere il video ora chiamato dopo di ogni animale e inserire i file nella propria cartella di archiviazione. Nome di questa cartella utilizzando la seguente convenzione: "TestingWeek_TestMode_MM_DD_YY".
Nota: per esempio, se questa cartella contiene la prima settimana di video di griglia ed è stata girata il 1 ° gennaiost, 2018, la cartella che tiene questi video è denominato "Week1_GridTest_01_01_18". - Posto questa cartella denominata specificamente in un'altra cartella che sarà denotano il più grande studio che questo set di esperimenti appartiene.
Nota: Non sono previsti requisiti di denominazione per il sistema di albero di cartelle mantenere gli studi e test modalità organizzato. L'unica cartella che il sistema seleziona è la cartella holding video denominato al punto 2.2.1.
- Prendere il video ora chiamato dopo di ogni animale e inserire i file nella propria cartella di archiviazione. Nome di questa cartella utilizzando la seguente convenzione: "TestingWeek_TestMode_MM_DD_YY".
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Creazione di file foglio di calcolo
- Utilizzando un programma di foglio di calcolo esterno (Vedi la Tabella materiali), creare un nuovo file di foglio di calcolo vuoto per memorizzare i dati per ogni studio e il modo di prova.
Nota: Non esistono requisiti di denominazione o deposito posizione per questo file. Ogni studio richiede due file di foglio di calcolo per l'utilizzo con il sistema, uno per il test della griglia e uno per il test di scaletta. Lasciare questi file vuoto per ora. - Verificare che questi file di foglio di calcolo non sono aperti su tutti i computer mentre è in esecuzione il BVAS.
Nota: Se il BVAS tenta di aprire un file di foglio di calcolo che è già aperto, questo verrà generato un errore.
- Utilizzando un programma di foglio di calcolo esterno (Vedi la Tabella materiali), creare un nuovo file di foglio di calcolo vuoto per memorizzare i dati per ogni studio e il modo di prova.
3. sistema installazione
Nota: Il BVAS è stato costruito e testato su sistemi operativi per PC e sfrutta Runtime componenti da semplice e prontamente disponibili software di codifica. Altre configurazioni di sistema non sono attualmente supportati.
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Installazione versione BVAS
- Eseguire il programma di installazione facendo doppio clic sull'icona installer etichettato 'BVASX. XXinstaller'. "XX" è il numero di versione corrente, attualmente 'BVAS3.30installer'.
Nota: Si tratta di software open source. Contattare l'autore corrispondente per la versione più recente. - Seguire sullo schermo istruzioni per installare il BVAS.
Nota: Il programma di installazione verificherà il sistema per la versione corretta del software (ad es., MATLAB Runtime) e se non viene trovato, verrà installato il software da internet. - Una volta installato, lanciare il programma cliccando il 'BVAS.exe' file.
- Eseguire il programma di installazione facendo doppio clic sull'icona installer etichettato 'BVASX. XXinstaller'. "XX" è il numero di versione corrente, attualmente 'BVAS3.30installer'.
4. sistema uso
- Apertura del programma
- Fare doppio clic sull'icona del programma BVAS per far apparire il menu principale di BVAS che consente le seguenti opzioni: 'Grid Analysis', 'Analisi di scala', 'Scaletta recensione' o 'Quit'.
Nota: Esiste anche un menu a discesa situato in alto a sinistra con l'etichetta 'Impostazioni Email' (Figura 3A).
- Fare doppio clic sull'icona del programma BVAS per far apparire il menu principale di BVAS che consente le seguenti opzioni: 'Grid Analysis', 'Analisi di scala', 'Scaletta recensione' o 'Quit'.
- Impostazioni email
- Fare clic sul menu a discesa "Impostazioni Email" e selezionare prima 'Cambia destinazione e-mail'.
- Immettere un indirizzo di posta elettronica preferito per ricevere aggiornamenti sull'analisi e selezionare 'OK'. Selezionare 'Annulla' per non cambiare l'indirizzo email attualmente salvato.
- Fare clic sul pulsante 'Invia Email di prova' per inviare una email di prova all'indirizzo email attualmente salvato nel sistema. Vicino il 'Email inviata!' pop-up finestra indicante il completamento del test.
- Analisi del Test di campo aperto griglia
- Selezionare 'Griglia analisi' dalla schermata del menu superiore.
- Garantirvi la pulsante toggle etichettato 'Singolo Video/intera sessione/traccia dati' è visualizzazione intera sessione per completare l'analisi su tutta una serie di prove sessione video.
- Utilizzare il pulsante di '...' accanto alla casella di input superiore a sfogliare il file system per trovare il file di video da analizzare. Selezionare la cartella denominata nello stile discusso al punto 2.2.1.
- Utilizzare il... pulsante accanto alla casella di ingresso inferiore a sfogliare il file system per selezionare il file di foglio di calcolo in cui memorizzare i dati.
Nota: Si noti che, come pure l'output dei dati in un file di foglio di calcolo, i dati di percorso completo per ogni video sono memorizzati in un file di dati (Mat) nella stessa directory che contiene il video scelto al punto 4.3.3. - Assicurarsi che il pulsante di commutazione indicato al punto 4.3.2 è impostato su 'Singolo Video' per completare l'analisi su un singolo video.
- Utilizzare il... pulsante accanto alla casella di input superiore a sfogliare il file system per trovare il file del video per analizzare.
- Utilizzare il... pulsante accanto alla casella di ingresso inferiore a sfogliare il file system per selezionare una directory in cui salvare il file di dati (Mat) che risulta dall'analisi dei video singolo.
Nota: Il file di dati si chiamerà dopo il video, che prende il nome l'animale. - Selezionare 'Output dati' da toggle menzionato al punto 4.3.2. per estrarre i dati da una griglia precedentemente analizzato dei video. Esempi di questo dati tracciati sono riportati nelle figure 1B e 1C.
- Utilizzare il... pulsante accanto alla casella di input superiore a sfogliare il file system per selezionare un file di dati video griglia creata in precedenza. Selezionare 'Go!' per creare la figura di trama e dati.
Nota: Questa funzione crea anche un file di testo, denominato la stessa e si trova nella stessa directory del file di dati, che ha l'animale di eseguire dati al suo interno. - Una volta che entrambi i file necessari sono stati localizzati, selezionare 'Go!' per iniziare l'analisi dei video. Si noti che il pulsante di 'restituire' riaprirà il menu in alto e il pulsante 'Esci' si chiude il programma completamente. Scegliere il commutatore 'Display Debug' per mostrare una rappresentazione visiva dell'algoritmo di rilevamento (figure 3 e 3D).
- Selezionare 'Go!' per avviare il processo di analisi. Esaminare le immagini di ciascun video sullo schermo del revisore. Utilizzare i pulsanti della pagina 'Next' e 'precedente' se ci sono più di cinque video.
- Per visualizzare un menu di selezione manuale, selezionare il pulsante 'modifica' se non esistono righe verde o la linea verde non sembra essere in Piazza corretta intorno l'area di test. Per modificare gli angoli, selezionare il pulsante 'Modifica angoli'.
Nota: Il pulsante 'Fotogramma successivo' Cambia immagine rappresentativa al frame successivo del video in questione. Selezionare il pulsante 'Fotogramma successivo' se il telaio dato automaticamente è ostruito o fuori fuoco. - Seguire le istruzioni a destra dell'immagine rappresentativa a selezionare l'area di test e premi 'invio' per completare il processo di selezione.
Nota: Le linee verdi selezionate ora apparirà l'immagine rappresentativa. - Selezionare 'fatto' per salvare la selezione e tornare alla schermata di revisore.
- Selezionare il pulsante di 'fatto' di centrale per avviare il processo di analisi completa una volta nell'area della griglia per ogni video è selezionato correttamente. Consentire al programma di eseguire e, al termine, verrà visualizzato un messaggio di successo.
Nota: L'analisi completa di una sessione di video può richiedere qualche tempo, circa 10 min per animale.
- Analisi del test di scaletta
Nota: Il protocollo per l'analisi di prova scaletta iniziale è molto simile al protocollo descritto nella procedura 4.3.10–4.3.15. Le notevoli differenze prima quei passi sono i seguenti:- Selezionare 'Scaletta analisi' dal menu in alto per aprire il menu di analisi di scala.
- Visualizza le due opzioni di toggle, 'Singolo Video' e 'Tutta la sessione' (Figura 3B).
- Con 'Intera sessione', selezionare la tomaia ingresso... pulsante per selezionare la cartella con i video di scaletta denominato nel passaggio 2.2.1.Select minore... pulsante per selezionare una directory per salvare una cartella con i dati dei video di scaletta per il ripasso.
- Se 'Singolo Video' è selezionata, selezionare un singolo video file con la tomaia... pulsante e una posizione lo stesso come descritto al punto 4.4.3.
- Selezionare 'Go!' per avviare il processo di analisi e far apparire la schermata di revisore scaletta zona di prova.
- Seguire i passaggi 4.3.10–4.3.15 allo stesso modo per la scala per quanto riguarda la griglia. Consentire al programma di eseguire e, al termine, verrà visualizzato un messaggio di successo.
Nota: Se qualcosa va storto durante l'analisi, un'e-mail viene inviata all'indirizzo e-mail inserito al punto 4.2.2. Al termine di un'analisi di qualsiasi tipo, un completamento e-mail allo stesso indirizzo e-mail.
- Rivedere le immagini scala
Nota: Il seguente protocollo è di rivedere in precedenza analizzato video scaletta per confermare eventuali guasti e zampa scivola. Si noti che non vengono generati file di foglio di calcolo per una traversata di scaletta per visualizzare fino al completamento della 'Scala immagine recensione' (passi 4.5.1–4.5.5).- Dal menu in alto, selezionare 'Scala immagine Review'. Verrà visualizzata la schermata di selezione del file di scaletta recensione.
- Seleziona il top... pulsante per selezionare la cartella dei file di dati.
Nota: I file vengono salvati nella posizione scelta nel passaggio 4.4.2 e sono denominati nel seguente formato: "M1_D1_Y1 scaletta Video sessione HH_MM M2_D2_YYYY". M1, D1 e Y1 sono la data della sessione analizzata. "Scaletta sessione Video" leggerà "Analisi Video singolo" se solo un singolo video è stato analizzato. HH_MM e M2_D2_YYYY sono il tempo e la data in cui è stata avviata la sessione di revisione. - Selezionare la parte inferiore... per selezionare il file di foglio di calcolo creato per lo studio.
- Selezionare 'Go!' per avviare il processo di revisione manuale.
- Visualizzare il menu di revisore di dati aperti automaticamente scaletta. Se viene rilevato un lapsus, utilizzare il 'Frame successivo' e 'Ultimo fotogramma' pulsanti per controllare qualsiasi consecutivamente registrata cornici se disponibile.
- Utilizzare il commutatore di slittamento per indicare quale piede del ratto è scivolato. Lasciare l'interruttore su 'No Slip' se il rilevamento è un falso positivo. Fare clic su 'Salva/continua' per passare alla successiva rilevazione (Figura 2A).
- In caso di errore, utilizzare l'interruttore per indicare se il guasto è dovuto inversione (dove il ratto girato intorno durante l'esecuzione) o stagnazione (dove il ratto Impossibile completare l'esecuzione in modo tempestivo).
- Fare clic su 'Salva/continua' per passare al successivo rilevamento. L'ultimo rilevamento, fare clic su 'Salva/continua' per completare l'analisi e salvare i dati nel file di foglio di calcolo scelto in precedenza. Allontanare la notifica di completamento.
Nota: Una volta completata la revisione, viene rinominata la cartella che è stata controllata "Recensione M1_D1_Y1 scaletta Video sessione HH_MM M2_D2_YYYY".
5. uscita dati analisi
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File di foglio di calcolo di griglia
- Individuare i dati creati nel file foglio di calcolo da ogni griglia dei video.
Nota: Le colonne sono da sinistra a destra come indicato di seguito: nome degli animali, data del test, settimana di studio numero e distanza totale percorsa, totale tempo fermato, velocità massima raggiunta, sinistra curve, curve in linea griglia attraversa (Figura 1D). - Utilizzare questi parametri per quantificare le prestazioni di motore lorda e creare grafici di confronto tra animali e intervalli di tempo.
- Individuare i dati creati nel file foglio di calcolo da ogni griglia dei video.
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File di foglio di calcolo di scaletta
- Individuare i dati creati nel file di foglio di calcolo da ogni video scaletta dopo il fallimento e zampa recensione di slittamento.
Nota: Le colonne sono da sinistra a destra come indicato di seguito: nome degli animali, numero 1 – 5, settimana di studio numero, data di prova, esecuzione tipo (successo o fallimento), tempo di esecuzione per i successi, percentuale completamento, zampa scivola su ogni zampa e modalità di guasto. La colonna è vuota per un guasto e la colonna di modalità di guasto leggerà o inversione o stagnazione (Figura 2B). - Utilizzare questi parametri per quantificare le prestazioni di motore bene e creare grafici di confronto tra animali e punti di tempo.
- Individuare i dati creati nel file di foglio di calcolo da ogni video scaletta dopo il fallimento e zampa recensione di slittamento.
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Representative Results
In seguito i metodi presentati qui, ratti completato la griglia di campo aperto e scaletta prove 2 volte a settimana. I dati sono stati analizzati utilizzando BVAS sia manualmente, sia con un cronometro di addestrato e utenti alle prime armi. I risultati presentati sono una media dei punteggi settimanali crudi da un animale singolo controllo non impiantati nel corso di uno studio di 8 settimane, dove la settimana "0" corrisponde al collaudo della linea di base. Nota non c'era nessun test durante la settimana 1 come questa è stata una settimana di riposo per gli animali di chirurgia. Perché la griglia di campo aperto è testata 1 x al giorno, la scaletta è testato 5 volte al giorno e ci sono due giorni di test a settimana, c'è un campione di 16 prove per griglia aperta campo considerando che ci sono 80 prove per il test di scala nella stessa settimana 8 periodo di tempo.
BVAS vs. analisi manuale:
Per verificare la coerenza del sistema BVAS e convalidarlo contro analisi manuale, i risultati per linee di griglia attraversate e scala tempo crossing sono stati confrontati ai risultati manuali da tre utenti esperti (n = 3) come "gold standard". Gli utenti inesperti (n = 7) hanno esaminato i dati sia manualmente e utilizzando il BVAS. Per la convalida, ciascun revisore ha esaminato lo stesso giorno uno degli esperimenti per un animale (griglia test = uno dei video/trial; scala test = cinque prove indipendenti). I risultati del test di griglia aperta del campo ha mostrato che utenti esperti erano più coerenti di utenti alle prime armi erano (una varianza di 0 contro una varianza di 17,1, rispettivamente), ma quando si utilizza il BVAS, c'era zero varianza per utenti (sia esperti che alle prime armi Figura 4 A). allo stesso modo, i risultati per il test di scala hanno mostrato che utenti esperti erano più coerenti di utenti alle prime armi erano (~3.5x più grande: una varianza di 0,120 contro una varianza di 0.414, rispettivamente), ma quando si utilizza il BVAS, c'era ancora zero varianza per gli utenti sia esperti che alle prime armi (Figura 4B).
Pertanto, dove possibile, metriche di comportamento per la griglia di campo aperto e la scala di prova erano quantificati manualmente dallo stesso utente esperto e rispetto ai risultati generati utilizzando il BVAS. Qui, sono stati valutati i risultati dagli animali tutto incluso per tutta la durata degli esperimenti. Ogni errore viene segnalato come un errore standard della media (SEM) a meno che non diversamente segnalato. La differenza tra i due metodi hanno variato da una media di 0,64 ± 0.06 s per il test di scaletta e 3,56 ± 0,53 linee per il test della griglia. La differenza media per il test della griglia di campo aperto nel corso di 8 settimane tra i due metodi è stata 11.13 ± 3,03%. La differenza media per il test di scala nel corso di 8 settimane tra i due metodi è stata 9,05 ± 1,07%. La differenza percentuale tra i due metodi è stata calcolata seguendo equazione 1.
Equazione 1:
Nota anche per la scala test tempismo, la raccolta manuale dei dati è solo precisa a 1 s (che possono cambiare in base al dispositivo utilizzato per tenere il tempo), mentre il BVAS è preciso all'inverso della frequenza fotogrammi del video rivedendo. Ad esempio, se il video è stato girato a 15 fotogrammi al secondo, i dati BVAS sono precisi a 1/15th di secondo.
Prova in loco aperta griglia:
Seguito in precedenza pubblicato protocolli12,13, animali sono stati ammessi a correre liberamente in un test di griglia del campo aperto per 3 min misurare la loro funzione di motore lordo e lo stress di comportamento. Il video registrato durante la prova è stato analizzato utilizzando il BVAS per quantificare i punteggi grezzi per la massima velocità, la distanza totale, il numero della griglia ha attraversato e la percentuale di giri a destra raggiunto dall'animale (Figura 5). Mentre questo dati sono solo rappresentativi di un animale, tendenze sono stati veduti nel corso dello studio di una maggiore velocità massima raggiunta, aumento della distanza totale percorsa, e attraversato un aumento del numero di linee della griglia. Non sorprende che, rispetto ad ogni altro, la distanza totale percorsa, e le linee della griglia totale attraversato aveva una forte correlazione positiva. Confrontando la quantificazione manuale alla quantificazione della griglia BVAS ha rivelato risultati comparabili (Figura 5C). Per questo particolare animale, la percentuale di giri a destra in gran parte aleggiava tra 40% e 50%(Figura 5). Di nota, le metriche per la distanza totale percorsa, velocità massima e svoltare in direzione potevano essere quantificato manualmente e rappresentano un'altra caratteristica aggiunta del programma BVAS automatizzato.
Prova di scaletta:
Come precedentemente segnalato4,14, la scala di test è stato completato per misurare la comprensione coordinata e funzione motoria fine. Il video registrato durante la prova è stato analizzato utilizzando il BVAS per quantificare i punteggi grezzi per il tempo di attraversare e il numero di zampa scivola (Figura 6). In questo animale, c'era una tendenza alla diminuzione nel tempo di attraversare la scala, seguita da un aumento nel tempo a partire intorno alla settimana 4. Confrontando la quantificazione manuale per il BVAS quantificazione del tempo di attraversamento ha rivelato risultati comparabili (Figura 6A). Come l'animale presentato era un controllo non-chirurgico, zampa scivola era rari e paragonabile in numero compreso tra la zampa destra e sinistra (Figura 6B).
Figura 1 : Esempio di risultati di test di campo aperto griglia. (A), questo pannello mostra il test comportamentali 1 m2 aprire test area con sfondo nero e linee griglia rosa. (B) questo è un esempio di un appezzamento di griglia 3-min di un singolo animale eseguire. Questo animale fatto un circuito della griglia e quindi per la maggior parte sono rimaste stazionario per il resto del tempo. Il rosso O e x indicare dove rilevato l'algoritmo di rilevamento di girare a sinistra (O) o girate a destra (X). (C) questo è un secondo esempio di un appezzamento di griglia 3-min di un singolo animale eseguire. Questo animale è stato estremamente attivo per l'intero periodo di prova di 3 minuti. Il rosso O e x indicare dove rilevato l'algoritmo di rilevamento di girare a sinistra (O) o girate a destra (X). (D) questo è un esempio dell'output nel file di dati per le due esecuzioni visto nei pannelli B e C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Esempio di una schermata di revisore dati scaletta. (A), questo pannello mostra la schermata di recensore di dati di scaletta completa con uno screenshot che illustrano la configurazione della prova scaletta. Questa schermata è dove l'utente confermerà rilevati scivola e fallimenti. Questo esempio mostra una distinta positivamente rilevato di zampa anteriore destra. (B) questo è un esempio dell'output nel file di dati per eseguire la scala che è stata esaminata in pannello A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Esempio di schermate di analisi BVAS. (A), questo pannello mostra il menu in alto della BVAS. Nota i quattro pulsanti lungo la parte inferiore e il menu a discesa Impostazioni Email in alto a sinistra. (B) questo è un esempio di una schermata di selezione del file, in questo caso per l'analisi di video di scaletta. (C) questo è un esempio di un visualizzatore di analisi di debug per un video di prova della griglia. Questo dimostra l'algoritmo di rilevamento durante l'analisi di un test di griglia. (D), questo pannello mostra un esempio di un visualizzatore di analisi di debug per un test di scaletta dei video. Questo dimostra l'algoritmo di rilevamento durante l'analisi di un test di scaletta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Esempio di esperti e principianti, risultati di test. Questi pannelli mostrano i risultati di un manuale e un BVAS esperti e inesperti test per (A) il numero di linee della griglia attraversato sulla prova in loco aperta griglia e (B) il tempo di attraversare la prova di scaletta. Per entrambi i test, i risultati hanno mostrato che gli utenti esperti avevano una varianza inferiore rispetto gli utenti alle prime armi per l'analisi manuale, mentre usando il BVAS provocato zero varianza, indipendentemente dal fatto l'esperienza utente. La deviazione standard è segnalata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Rappresentante aprire risultati dei test di campo griglia. Questi pannelli mostrano risultati di test di griglia rappresentativo del campo aperto per un animale di controllo non-impiantati per (A) la velocità massima raggiunta, (B) il totale distanza percorsa, (C) il numero totale di linee della griglia ha attraversato e (D) la percentuale di giri a destra fatta dall'animale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Risultati dei test rappresentativo scaletta. Questi pannelli mostrano risultati test rappresentativo scaletta per un animale di controllo non-impiantati per (A) il tempo di attraversare la scaletta e (B) il numero di destra e sinistra-anteriore-zampa scivola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La parte più critica del protocollo per garantire un'analisi forte è la contaminazione coerente. Se i video sono ben illuminate e girato nella posizione corretta, come discusso nella prima sezione del protocollo, è possibile che il sistema sarà in grado di fare un'analisi precisa. Come con qualsiasi problema di elaborazione delle immagini, il lavoro svolto nella pre-elaborazione renderà il post-processing più preciso e semplice. Come tale, assicurandosi che l'apparecchio e gli animali sono ben illuminati durante il test ed eventuali ombre o altri movimento nel telaio è ridotto al minimo significherà che il BVAS può funzionare a un livello superiore di precisione.
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato in modo efficiente e riproducibile analizzare risultati dalla funzione motoria sia al lordo sia bene test in roditori tramite un open campo griglia e un test di scaletta. Inoltre, riduce la possibilità di errore umano o pregiudizi nel processo di analisi come l'analisi dei dati è in gran parte completato dal computer auto-funzionamento senza alcun input dell'utente. Grazie a questa caratteristica, il sistema BVAS può essere utilizzato con lo stesso livello di precisione dagli utenti sia esperti che inesperti. Il programma BVAS è autocontrollo, facile da implementare e poco costoso da utilizzare. Inoltre, il codice può essere adattato alle esigenze individuali di un ricercatore. Ad esempio, il codice di griglia campo aperto può essere utilizzato per analizzare una varietà di parametri tra cui la distanza totale percorsa, la velocità massima raggiunta, e il numero di sinistra e di destra si trasforma e probabilmente può essere facilmente modificato per il tracciamento in un labirinto di acqua o costretti nuotata t chiedere. Modifiche aggiuntive possono essere apportate al codice per rappresentare varie illuminazione della stanza, differenze in griglia e scala colore e le differenze di colore animale. Sebbene l'apparato di test e il codice BVAS qui presentati sono stati progettati per il loro uso negli studi del ratto, ci aspettiamo che sia potrebbe essere scalata verso l'alto o verso il basso per essere utilizzato con vari animali di dimensioni, anche se questo non è stato verificato fino ad oggi.
Come con tutti i comportamento test e analisi dei dati, è importante mantenere coerenza quanto più possibile in tutto lo studio e l'analisi successive. Sebbene il BVAS presentato riduca notevolmente qualsiasi affidamento su input umano per l'analisi dei dati, varianza umano può entrare in gioco con il ricercatore lavora con gli animali e gestisce le procedure15. Inoltre, le modifiche della prova posizione16 o la custodia e l'allevamento condizioni17 possono anche influenzare i risultati. Mentre il BVAS può essere aggiornato per tenere conto di illuminazione e di angolazione della telecamera, fattori quali odori, personale o dieta possono solo essere contabilizzate al momento dello studio. Di conseguenza, i ricercatori dovrebbero fare attenzione a rimanere più costanti possibile in sperimentazione animale e le condizioni di stabulazione, test di personale e metodi analitici, tra gli altri.
Il BVAS è romanzo a causa del suo sistema di rilevamento composto. Ogni fotogramma del video è passato attraverso più filtri di immagine per creare maschere binarie tutti calibrate per cercare il ratto nel telaio. Ogni forma di possibile ratto è quindi valutato dal sistema sulla sua probabilità di essere il ratto. Questa valutazione fattori nella dimensione, il numero di filtri, che la forma viene rilevata, e l'ultima posizione nota e la posizione prevista dell'animale basato sulla traiettoria precedente. Questo rende per un rilevamento animale forte che può superare la maggior parte dei problemi che sorgono basato su ombre e cambia nell'illuminazione. A differenza dei sistemi di tracciabilità degli animali commercialmente disponibile corrente, questo metodo non richiede alcuna modifica all'animale per renderlo più visibile e utilizza una webcam standard di singolo-velocità per la registrazione video. Il sistema BVAS è anche un miglioramento sopra comportamento manualmente quantificato convenzionale prova perché tutte le metriche restituite sono oggettivamente misurate dai video. Uno studio comportamentale quantificato umano avrà certa soggettività nella natura come il ricercatore decide che cosa costituisce una linea di slittamento o griglia di zampa croce.
Il sistema richiede una configurazione specifica un po ' a lavorare alla sua massima capacità. Mentre è possibile adattare il sistema alle modifiche nell'apparato, attualmente sarebbe necessario qualche scioltezza in codifica per modificare il codice del computer. Con qualche codifica scioltezza, risoluzione dei problemi è reso facile perché l'errore avviso email includono una lettura di informazioni di errore completo. Se il video inserito nel sistema non sono presso il tasso ideale di risoluzione o telaio (1080p, 15 fps), l'utente è allertato tramite un messaggio di avviso. Questa modifica interesserà la precisione del sistema, ma ancora può essere eseguito su video a risoluzione inferiori. Qualsiasi illuminazione o problemi di ombra che causano un errore durante l'analisi porterà un messaggio di errore dinamico inviato all'indirizzo email immesso dall'utente. L'utente può quindi utilizzare il Visualizzatore di debug per guardare l'analisi fotogramma per fotogramma per capire quale problema sorto. Il messaggio di errore include anche un errore relazione, perciò se è un problema di codifica, può essere risolto semplicemente.
In futuro, il sistema BVAS può essere in grado di essere ulteriormente adattato senza alcuna conoscenza della sintassi da software di codifica. L'aggiunta di un rilevamento menu opzioni potrebbe consentire all'utente di selezionare il colore delle linee della griglia e dell'animale semplicemente e comodamente. Il test di scaletta monitoraggio aumenterà anche in precisione con l'eventuale aggiunta di un rivelatore di oggetto cascata nel codice e un impianto di illuminazione scaletta migliore per accompagnare il test di scaletta e le riprese di apparato. Pertanto, ci aspettiamo che il sistema BVAS descritto qui può essere implementato facilmente in una matrice di attività di funzione di motore e comportamentale che abbracciano una vasta gamma di modelli di malattia e infortunio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Merit Award Review # B1495-R (per Jeffrey R. Capadona) e il premio alla carriera precoce presidenziale per scienziato e ingegneri (PECASE) (di Jeffrey R. Capadona) da Dipartimento di Stati Uniti di Veterans Affairs riabilitazione Servizio ricerca e sviluppo. Inoltre, questo lavoro è stato supportato in parte dall'ufficio di assistente segretario della difesa per gli affari di salute attraverso il Peer recensione di programma di medica ricerca sotto Premio Nr. W81XWH-15-1-0608. Gli autori riconoscono la fonte per la ricerca di estate sostegno finanziario. I contenuti non rappresentano le opinioni della United States Department of Veterans Affairs o di governo degli Stati Uniti. Gli autori vorrei ringraziare Hiroyuki Arakawa nel nucleo di comportamento del roditore CWRU per la sua guida nella progettazione e test del roditore protocolli comportamentali. Gli autori inoltre ringraziare James Drake e Kevin Talbot dalla CWRU dipartimento di meccanica e ingegneria aerospaziale per il loro aiuto nella progettazione e produzione la prova scaletta del roditore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rats, male, 201-225 g | Charles River | CD | |
| Webcam HD Pro c920 | Logitec | 960-000764 | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Matalb 2017a, Computer Vision System Toolbox | Mathworks | N/A | |
| Open field grid test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A | |
| Ladder test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A |
References
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