Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

الصغير-الكشف (ميرناس) تسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة وعالية مثلى، بوصفه بوستترانسكريبشونال المنظمين للكشف رسول (مرناس). وتختلف طرق الكشف عن ميرنا الحالية في حساسية وخصوصية. ونحن تصف بروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع وإيمونوستينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على أبواب أنسجة القلب الماوس المتزامنة.

Abstract

الصغير-الكشف (ميرناس) هي النصوص الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي ربط الكشف رسول (مرناس) وتحول دون ترجمتها أو الترويج عن التدهور. وحتى الآن، قد تورط ميرناس في عدد كبير من العمليات البيولوجية والمرض، والتي قد تدل على الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين ميرنا المستندة إلى المسبار الكشف، جنبا إلى جنب مع البروتين إيمونوستاينينج على أبواب القلب الماوس. أولاً، أجرينا في الموقع تهجين أسلوب استخدام التحقيق لتحديد التعبير ميرنا-182 في أقسام القلب من التحكم وتضخم القلب الفئران. بعد ذلك، أجرينا إيمونوستينينج للقلب بروتين "تروبونين تي" (كتنت)، على نفس المقاطع، شارك تعريب ميرنا-182 مع الخلايا كارديوميوسيتي. باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على اكتشاف ميرنا-182 من خلال الفوسفاتيز قلوية على أساس مقايسة اللونية، وكتنت من خلال تلطيخ الفلورسنت. يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن التعبير عن أي ميرنا من الفائدة من خلال تحقيقات LNA المسمى حفر، وتعبير البروتينات ذات الصلة على أبواب أنسجة القلب الماوس.

Introduction

الصغير-الكشف (ميرناس) قصيرة (18 – 25 النيوكليوتيدات)، واحد-الذين تقطعت بهم السبل، وفضله الكشف التي تؤدي وظيفة المنظمين السلبية للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال بتثبيط الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) ترجمة و/أو تعزيز تدهور مرناً 1-يتم نسخها ميرناس من إينترونس أو exons من الترميز أو المشقوق فضله، والجينات في النواة من دروشا، للسلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس)، وهياكل الجذعية-حلقة قصيرة من النيوكليوتيدات 702. عقب هيولى الصادرات، وكذلك معالجة قبل ميرناس بواسطة ديسير في ميرناس الناضجة التي تمتد 18 – 25 النيوكليوتيدات3،4. وفي وقت لاحق، المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC) يتضمن هذه ميرناس كالكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل، الذي يسمح تجليدها إلى 3 'غير مترجمة منطقة (3'-UTR) بهم مرناس الهدف لقمع ما التعبير3،5 .

خلال العقود الثلاثة الماضية، حيث أنها قد حددت أولاً، ظهرت ميرناس للمنظمين سيد التعبير الجيني، ومستويات التعبير الخاصة التي هي أحكام الرقابة6. وقد وصف أدوار ميرناس في جهاز التنمية7،،من89،10،11،12، الحفاظ على التوازن13،14 ، فضلا عن سياقات المرض التي تشمل العصبية15،16،17،،من1819،20من القلب والأوعية الدموية، شروط المناعة الذاتية21 ،22،23،السرطان24وغيرها25. جلبت إلى الأمام الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا التقدير المتزايد للأهمية أنماط التعبير ميرنا. وتشمل هذه الأساليب PCR الوقت الحقيقي، [ميكروارس]، النشاف الشمالية، والتهجين في الموقع وغيرها، التي تختلف في حساسية وخصوصية، وكمية الطاقة، معظمها يرجع ذلك إلى حقيقة أن النصوص ميرنا تتألف من قصيرة و 6من متواليات عالية مثلى.

ونحن أفادت مؤخرا دوراً هاما لميرنا-182 في التنمية لتضخم عضلة القلب26، شرط وصف التكيف الهيكلي للقلب في الاستجابة لمطالب الفسيولوجية مرتفعة27،28. تضخم القلب تتميز بالزيادة في كتلة عضلة القلب، التي، إذا ترافق مع مهايئ يعيد29، يمكن أن يؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بقصور القلب، شرط المحاسبة 8.5 في المائة من جميع الوفيات المنسوبة إلى القلب والأوعية الدموية 30من المرض.

هنا، يمكننا وصف لنا البروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع مع مسبار الحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين وإيمونوستاينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على الماوس المقاطع أنسجة القلب، المتزامنة في موقعنا نموذج لتضخم القلب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ماوس القلب عينات الأنسجة لهذه الدراسة تم الحصول عليها وفقا للقوانين ذات الصلة والمبادئ التوجيهية للمؤسسات ووافقت عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية جامعة ييل.

1-حل إعداد

  1. إعداد رناسي ddH الحرة2س، بعلاج ل 5 من ddH2س مع 5 مل من 0.1% ديثيلبيروكاربوناتي (ديبك) بين عشية وضحاها (O/N)، في درجة حرارة الغرفة (RT). اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية) لإلغاء تنشيط في ديبك. وأشار إلى استخدام المعالجة ديبك ddH2س للإعداد الحلول النهائية ك.
    تنبيه: ديبك مسرطن معروف، معالجة فقط في غطاء الدخان.
  2. إعداد x 1 فوسفات مخزنة المالحة (PBS) الحل بتذويب 5 أقراص برنامج تلفزيوني في 1 لتر من تعامل ديبك ddH2اﻷوتوكﻻف سين (121 درجة مئوية).
  3. إعداد 0.1% غير الأيونية المنظفات الصناعية/برنامج تلفزيوني (ببست) بتمييع 1 مل منظفات غير الأيونية كل 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
  4. تحضير الإيثانول 90%، 70%، 50% و 30% في تعامل ديبك ddH2o.
  5. إعداد 10 ملغ/مل الحل الأسهم بروتيناز ك (ProK) في تعامل ديبك ddH2قاسمة سين وتخزينها في-20 درجة مئوية. تعد حلاً عامل ميكروغرام/مل 20 من ProK بتمييع ميكروليتر 100 حل ProK الأسهم في 50 مل من تعامل ديبك ddH2O. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  6. إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) عن طريق إضافة ز 2 من منهاج عمل بيجين في 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. الحرارة عند 65 درجة مئوية مع الهز أحياناً، حتى يذوب. قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية.
    تنبيه: منهاج عمل بيجين مادة مسرطنة معروفة، ومعالجة فقط في غطاء الدخان.
  7. إعداد حل م 3 كلوريد الصوديوم بإضافة ز 87.8 إلى 500 مل ddH2اﻷوتوكﻻف سين (121 درجة مئوية).
  8. تعد حلاً2 مجكل م 1 بإضافة ز 20.3 إلى 100 مل من ddH2اﻷوتوكﻻف سين (121 درجة مئوية).
  9. تحضير 1 "م تريس" pH 8.0 بحل ز 121.1 في 800 مل ddH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع بضع قطرات من 1 N HCl، إحضار وحدة التخزين إلى 1 لتر والاوتوكلاف (121 درجة مئوية). يعد إيجاد حل عملي من 50 مم تريس pH 8.0 بتمييع 2.5 مل م 1 تريس pH 8.0 في 47.5 مل ddH2o.
  10. تحضير 1 "م تريس" pH 9.5 بحل ز 60.6 في 400 مل ddH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 9.5 مع بضع قطرات من 1 N HCl، جلب الحجم 500 مل والاوتوكلاف (121 درجة مئوية).
  11. إعداد 0.13 م 1-ميثيليميدازولي pH 8.0 بتمييع مل 1.6 من 1-ميثيليميدازولي لمل 130 من تعامل ديبك ddH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع ميليلتر حوالي 450 من 12 N HCl. إضافة 16 مل من كلوريد الصوديوم م 3 والحجم 160 مل. جعل الطازجة قبل استخدامها.
    تنبيه: 1-ميثيليميدازولي الضارة بالأغشية المخاطية والعينين والجلد، ومعالجة فقط في غطاء الدخان.
  12. إعداد 0.16 م ن هيدروكلوريد-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-اثيلكاربودييميدي (EDC) بتمييع ميليلتر 176 لتنمية الصادرات إلى 10 مل من 0.13 م 1-ميثيليميدازولي. قم بضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع حوالي 100 ميليلتر من جديد N HCl. جعل 12 قبل الاستخدام.
    تنبيه: تنمية الصادرات الضارة للأغشية المخاطية والعيون، والجلد، ومعالجة فقط في غطاء الدخان.
  13. إعداد 1% ح2س2 بإذابة 1.5 مل من 30 ٪ ح2س2 في 50 مل من 1 x PBS. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  14. إعداد 20 x SSC pH 7.0 بتذويب 175.3 ز من كلوريد الصوديوم وز 88.2 سترات الصوديوم (Na3ج6ح5س7) في 800 مل من ضبط O. ddH2درجة الحموضة 7.0 مع بضع قطرات من 1 N HCl، إحضار وحدة التخزين إلى 1 لتر والاوتوكلاف (121 درجة مئوية).
    1. إعداد حلاً عامل من 2 x SSC pH 7.0 بتمييع 20 مل x SSC 20 درجة الحموضة 7.0 في 180 مل من ddH2o.
    2. يعد إيجاد حل عملي من 1 x SSC pH 7.0 بتمييع 2.5 مل من x SSC 20 درجة الحموضة 7.0 في 47.5 مل ddH2o.
    3. تعد حلاً عامل من 0.2 x SSC pH 7.0 بتمييع مل 5 x SSC 2 درجة الحموضة 7.0 في 45 مل من ddH2o.
  15. تحضير 1 × الحل التهجين بإذابة 0.5 مل من x microRNA 2 ايش العازلة في 0.5 مل من تعامل ديبك ddH2O. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  16. إعداد حل Levamisole الأسهم 200 ملم بإضافة 250 ملغ إلى 5 مل من قاسمة O. ddH2وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  17. إعداد حل حظر للخطوة 5 (10% الأغنام serum/1% جيش صرب البوسنة/0.2 مم ليفاميسول) بتمييع 1 مل مصل الأغنام في 9 مل ببست، وإضافة 0.1 غرام من جيش صرب البوسنة. إضافة 10 ميكروليتر من Levamisole قبل استخدام. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  18. إعداد حل حظر للخطوة 6 (الماعز 10% serum/1% جيش صرب البوسنة) بتمييع 1 مل مصل الماعز في 9 مل ببست، وإضافة 0.1 غرام من جيش صرب البوسنة. تخزين في 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون أسبوع.
  19. إعداد حل بريستينينج بتمييع 3.3 مل 3 "م كلوريد الصوديوم"، 5 مل من م 1 MgCl2، 10 مل من 1 م تريس pH 9.5، 100 ميليلتر توين-20، 100 ميليلتر من Levamisole 81.5 مل ddH2O. جعل الطازجة قبل استخدامها.
  20. استخدام نيتروبلوي تيترازوليوم (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly أقراص الفوسفات (بسب) بإعداد 20 من مل من محلول الركازة الفوسفاتيز القلوي (AP) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إضافة 20 ميكروليتر من Levamisole. جعل الطازجة قبل الاستخدام، وحماية من الضوء.
  21. إعداد الحل كتبت بإضافة 4 غرام تريس، ز 4.4 من كلوريد الصوديوم و 375 ملغ من بوكل في 500 مل من ddH2اﻷوتوكﻻف سين (121 درجة مئوية).
  22. اختياري: تحضير حلاً عامل DAPI (1 ميكروغرام/مل) بتمييع ميكروليتر 50 DAPI حل الأسهم (1 ملغ/مل) في 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الحلول القياسية مثل 3 كلوريد م الصوديوم، مجكل م 12, 1 م تريس-HCl، خالية من نوكلاس ddH2س، 1 x PBS و 20 x SSC يمكن شراؤها بدلاً من ذلك. وقد استخدمت لهذا البروتوكول أو الجرار كوبلين زجاج 50 مل أو الإرسال الشريحة البوليبروبيلين 20 مل الجرار.

2-الأنسجة إعداد

ملاحظة: المقاطع قلب الماوس المستخدمة هنا كانت أعدتها "جامعة ييل باثولوجيا الأنسجة الخدمات"، من الفورمالين-الثابتة/البارافين-جزءا لا يتجزأ من النسيج وقطع في 5 ميكرومترات والمتمركزة في الشرائح مشحونة.

  1. الإماهة الأنسجة.
    1. الحارة الشرائح عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، في الفرن التهجين حتى يذوب البرافين واضح.
    2. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل وكيل التخليص متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد) لمدة 10 دقائق، مرتين.
    3. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل إيثانول 100% لمدة 2 دقيقة، مرتين، وتليها الإيثانول 90% لمدة 2 دقيقة، الإيثانول 70% لمدة 2 دقيقة، مرتين، الإيثانول 50% لمدة 2 دقيقة والايثانول 30% لمدة 2 دقيقة.
    4. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من تعامل ديبك ddH2س لمدة 5 دقائق.
    5. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  2. الأنسجة دي-بروتيناتينج.
    1. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل 20 ميكروغرام/مل ProK العامل الحل، في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
      تنبيه: قد يؤدي الهضم الناقص في الفقراء أو لا وضع الإشارات، بينما الهضم الإفراط قد تؤدي إلى تدهور النسيج والتنمية لتلوين الخلفية. الأمثل قد تكون مطلوبة من أجل هذه الخطوة (1 – 20 ميكروغرام/مل ProK، حضانة 5 – 20 دقيقة، الرايت-37 درجة مئوية).
    2. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، في الرايت، مرتين.
  3. تثبيت الأنسجة.
    1. استخدام قلم مسعور لرسم دائرة طارد مياه حول الأنسجة على كل شريحة.
    2. تطبيق 500 ميليلتر من حل منهاج العمل 4% على طول كل شريحة، واحتضان الشرائح أفقياً لمدة 10 دقيقة، في الرايت
    3. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، في الرايت، مرتين.
    4. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من 0.13 م 1-ميثيليميدازولي لمدة 10 دقيقة، في الرايت، مرتين.
    5. تطبيق 500 ميليلتر من 0.16 م الصادرات الحل على طول كل شريحة، واحتضان الشرائح أفقياً ح 1 في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
    6. شطف الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من 50 مم تريس pH 8.0 في الرايت
    7. شطف الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت، مرتين.
      ملاحظة: كل خطوات التثبيت منهاج العمل وتنمية الصادرات مطلوبة من أجل ميرنا crosslinking وينبغي إلا تحذف. 31
  4. كتلة البيروكسيديز الذاتية.
    1. احتضان الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من 1 ٪ ح2س2 لمدة 30 دقيقة في الرايت
    2. شطف الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت، مرتين.

3-التهجين

  1. يسخن حل التهجين (500 ميليلتر كل شريحة) عند 50 درجة مئوية في الفرن التهجين، حتى درجة الحرارة المستهدفة، ويتم التوصل إلى (10 – 15 دقيقة).
  2. إعداد قاعة التهجين بوضع قطعتين من التصفية أو المناديل الورقية في الجزء السفلي من الدائرة وترطيب الورقة مع 50% ميثلامين/1 x SSC.
    تنبيه: ميثلامين مضر للأغشية المخاطية والعينين والجلد ومقبض فقط في غطاء الدخان.
  3. تطبيق 200 ميليلتر من التهجين الحل على طول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً ح 1 – 3 في 50 درجة مئوية، في دائرة هوميديفيد.
  4. إعداد الحل المسبار بمزج 0.5 ميليلتر الأسهم مسبار (25 ميكرومتر) في 250 ميليلتر أوفهيبريديزيشن الحل (التركيز النهائي 50 نانومتر) في أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: يتم أعرب ميرناس مختلفة على مختلف المستويات، حتى الأمثل فيما يتعلق بتركيز التحقيق قد تكون مطلوبة من أجل هذه الخطوة (1 – 50 nM)، لتجنب لا إشارة أو وضع خلفية عالية.
  5. تطبيق 250 ميليلتر من مسبار الحل على طول كل شريحة وساترة رناسي مجاناً على أعلى. تجنب تشكيل الفقاعات.
  6. ختم الدائرة التهجين مع بارافيلم بعناية واحتضان O/N في 50 درجة مئوية.
    ملاحظة: درجة حرارة التهجين يجب تعيين حوالي 30 درجة مئوية تحت درجة حرارة ذوبان الحمض النووي الريبي (Tm) لكل التحقيقات. قد يكون التحسين المطلوبة. هنا، 50 درجة مئوية كدرجة حرارة التهجين/الغسيل لميرنا-182، وضبط وفقا لتحقيقات مختلفة.

4-التشدد يغسل

  1. بريوارم 200 مل 2 x SSC عند 50 درجة مئوية في الفرن التهجين، حتى يتم التوصل إلى درجة حرارة الهدف (20 – 40 دقيقة).
  2. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل 2 x SSC عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أو حتى تخفف كوفيرسليبس.
  3. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل 2 x SSC على RT لمدة 5 دقائق، مرتين.
  4. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل 0.2 x SSC على RT لمدة 5 دقائق.
  5. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل ببست في RT لمدة 5 دقائق.
  6. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: استخدام ظروف خالية من رناسي لم يعد ضروريا منذ الهجينة رنا رنا تعتبر مستقرة.

5-حفر الكشف عن الأجسام المضادة

  1. استخدام قلم مسعور لإعادة رسم دائرة طارد مياه حول الأنسجة على كل شريحة إذا لزم الأمر.
  2. تطبيق 500 ميليلتر لعرقلة حل لطول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً مدة 30 دقيقة في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
  3. تحضير حل جسم حفر (1:1، 000) بتمييع ميكروليتر 0.5 من جسم حفر في 500 ميليلتر أوفبلوكينج الحل في أنبوب 1.5 مل.
    تنبيه: قد تكون مطلوبة من أجل هذه الخطوة الأمثل (1: 500-000 1:2).
  4. تطبيق 500 ميليلتر من حفر جسم الحل على طول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً ح 1 في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
  5. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل ببست في RT لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات.
  6. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من بريستينينج الحل في RT لمدة 5 دقائق، مرتين.
  7. احتضان الشرائح في جرة الإرسال البوليبروبيلين شريحة التي تحتوي على 20 مل أوفاب الركازة الحل عند 37 درجة مئوية، ح 6 – 24، محمية من الضوء.
    تنبيه: يجب فحص وضع لون كل حاء 2 الأمثل قد تكون مطلوبة من أجل هذه الخطوة.
  8. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من محلول كتبت على RT لمدة 5 دقائق، مرتين.
  9. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق.

6-كتنت الكشف عن الأجسام المضادة

  1. استخدام قلم مسعور لإعادة رسم دائرة طارد مياه حول الأنسجة على كل شريحة إذا لزم الأمر.
  2. تطبيق 500 ميليلتر لعرقلة حل لطول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً ح 1 في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
  3. تحضير حل جسم كتنت (1: 100) بتمييع ميكروليتر 2 من جسم كتنت في 200 ميكروليتر أوفبلوكينج الحل في أنبوب 1.5 مل.
  4. تطبيق 200 ميليلتر كتنت جسم الحل على طول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً س/ن في 4 درجات مئوية، في دائرة هوميديفيد.
  5. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات.
  6. إعداد الحل الأجسام المضادة بعد 568 رابيت (1: 500) بتمييع ميكروليتر 0.5 من الأجسام المضادة رابيت-568 في 250 ميكروليتر أوفبلوكينج الحل في أنبوب 1.5 مل.
  7. تطبيق 250 ميليلتر من الأجسام المضادة بعد 568 رابيت الحل على طول كل شريحة. احتضان الشرائح أفقياً ح 1 في الرايت، في دائرة هوميديفيد.
  8. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات.
  9. اختياري: تطبيق 250 ميليلتر لحل عملي DAPI على طول كل شريحة، واحتضان الشرائح أفقياً لمدة 1 دقيقة على RT، محمية من الضوء.
  10. يغسل الشرائح في جرة كوبلين زجاجية التي تحتوي على 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 5 دقائق، مرتين.

7-تركيب والتصوير

  1. تحميل الشرائح مع 2 – 3 قطرات من زلة تغطية زجاج وتصاعد المتوسطة. السماح للشرائح لتجف O/N، شقة، عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء.
  2. انتقل إلى ابيفلوريسسينت أو مجهرية [كنفوكل].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ميرنا التهجين في الموقع الأمثل على أبواب القلب الماوس باستخدام ميرنا التدافع و U6-سنرنا، كانت بمثابة عناصر سلبية وإيجابية على التوالي. يرد تلطيخ إيجابية باللون الأزرق، بينما تلطيخ سلبي يرد بعدم وضع اللون (الشكل 1A-1B). تم تقييم التعبير كارديوميوسيتي محددة لميرنا-182 في أقسام القلب من التحكم والفئران overexpressing بلجف. وضع الفئران تحمل التحوير بلجف تحت مروج αMHC تضخم القلب، ثانوية بالنسبة للأوعية زيادة، في غضون 6 أسابيع من التحوير التنشيط26. علينا إجراء التهجين في الموقع ووجدت زيادة التعبير عن ميرنا-182 في قلوب الفئران بلجف، مقارنة بعناصر التحكم (الشكل 2 أح-2)، والمشار إليه بواسطة تلطيخ الأزرق. لتحديد أنواع الخلايا التي أعرب ميرنا-182، ثم أجرينا إيمونوستينينج كتنت في نفس المقاطع. وجدنا ميرنا-182 مترجمة شارك مع الخلايا كارديوميوسيتي كتنت-إيجابية، فضلا عن DAPI الملون الأنوية، في مراقبة وأقسام القلب الماوس بلجف (الشكل 2-2 ح)، المشار إليه بالأحمر والأزرق تلطيخ على التوالي. وكانت هذه الصور مع هدف X 20.

Figure 1
الشكل 1: إيجابية وسلبية في الموقع التهجين تلطيخ. (أ) في الموقع التهجين للتدافع ميرنا (25 نانومتر) في عنصر تحكم الماوس أقسام القلب. (ب) في الموقع التهجين ل U6-سنرنا (25 نانومتر) في عنصر تحكم الماوس أقسام القلب. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: كارديوميوسيتي تعبيراً محدداً لميرنا-182 في السيطرة وقلوب الماوس بلجف. (أ-ب) في الوضع الطبيعي التهجين لميرنا-182 في التحكم وأقسام القلب الماوس بلجف. (ج-د) Immunostaining كتنت في التحكم والماوس بلجف قلب المقاطع التي قد تم سابقا الملون لميرنا-182. (ه-و) DAPI كونتيرستينينج للتعريب النووية في التحكم وبلجف الماوس قلب المقاطع التي قد تم سابقا الملون لميرنا-182. (ز-ح) الصور المدمجة ميرنا-182 (العميقة الزرقاء)، كتنت (أحمر) و DAPI (أزرق فاتح) تلطيخ للتحكم وأقسام القلب الماوس بلجف. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن تحقيق ميرنا نسخة الكشف من خلال التقنيات المختلفة التي تختلف في حساسية وخصوصية وكمية الطاقة. هنا، علينا أن نبدي اقتران ميرنا في الموقع التهجين مع إيمونوستاينينج ووصف بروتوكول يسمح لتقييم مستويات التعبير من جزيئات البروتين وميرنا، على نفس المقاطع القلب المتزامنة. نحن أولاً إظهار كيفية إجراء التهجين في الموقع من المسابر ميرنا LNA المسمى حفر على أبواب القلب البارافين المضمنة. المقبل، ونحن تصف كيفية تنفيذ إيمونوستاينينج كتنت في نفس المقاطع. أخيرا، نحن لشرح كيفية دمج الألوان الناتجة والصور الفلورية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول "ثابت الفورمالين" (4 درجة مئوية، O/N)/البارافين جزءا لا يتجزأ من أنسجة القلب الماوس، مع استخدام المسابير ميرنا LNA المسمى حفر وكتنت. مزيد من التحسين قد تكون مطلوبة لانسجة مختلفة، والتحقيق أو أنواع الأجسام المضادة، كما هو مبين أدناه.

ينبغي أن تنفذ شروط خالية من رناسي بعناية في جميع أنحاء الخطوات التي تؤدي إلى التحقيق التهجين، كما يمكن شدة التلوث رناسي لتسوية نتائج التجربة. ينبغي بذل جميع الحلول مع معاملة ديبك ddH2س، وينبغي أن تعامل جميع كوبلين الجرار مع حلاً تطهير رناسي. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي اتخاذ الاعتبارات التالية في الاعتبار عند العمل مع تحقيقات ميرنا LNA المسمى حفر مختلفة. درجة حرارة التهجين يعتمد على درجة حرارة ذوبان (Tm) كل التحقيق. وكقاعدة عامة، ينبغي استخدام درجة حرارة 30 درجة مئوية أدناه Tm الحمض النووي الريبي معين أو 20 درجة مئوية أدناه Tm الحمض النووي معين لمسبار التهجين. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل تركيز التحقيق المثالي. وعادة ما يقع بين 1-50 نانومتر. أخيرا، قد تكون ساخنة المسبار الذي يتضمن الحل التهجين إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تجريدها من أي هياكل الثانوي، إذا كان هذا مصدر قلق. خطوة هامة لاختبار الطابع الخاص للتحقيق، خاصة عند استخدامها للمرة الأولى، أن تدرج سلبية (مجمعة)، فضلا عن أنها إيجابية (على سبيل المثال U6) مراقبة تحقيق، لضمان نجاح التجريبية (الشكل 2). ينبغي أن تستخدم ضوابط مماثلة (على سبيل المثال CD31 بطانية جسم) أثناء الخطوة إيمونوستاينينج.

مشكلة شائعة في تجارب التهجين في الموقع هو تطوير لتلطيخ إشارة أثرية/الخلفية. لتجنب أو تقليل قطعة أثرية تلطيخ الخطوات، ينبغي حماية الأنسجة من الجفاف طوال جميع الخطوات، على وجه التحديد أثناء إينكوباتيونس الطويلة. ونحن نوصي تغطي الشرائح مع كوفيرسليبس رناسي خالية أثناء الخطوة التهجين، خاصة عندما يتم استخدام درجات حرارة عالية، واستعمال التبول السيارات الدوائر. كما نقترح استخدام fluorophore 568 أو 594 للكشف عن كتنت أو البروتين من الاهتمام خلال الخطوة إيمونوستينينج. هذا سيزيل أي أوتوفلوريسسينسي التي كثيرا ما تنشأ باستخدام fluorophores 488 المستخدمة على فورمالدهايد إصلاح الأنسجة.

نوصي بالالتفات إلى متغير آخر هو مدة AP تلطيخ التنمية، الذي يعتمد على مستويات ميرنا محددة موجودة في الأنسجة. ونحن نقترح التحقق من التقدم المصبوغة وكالة اسوشييتد برس كل ح 2، للتجربة الأولى. وقد تشمل مزيدا من التحسين تغيير درجة الحرارة لمعلمة الحضانة (RT-37 درجة مئوية). وأخيراً، إذا كانت الخلفية يبدأ وضع قبل تلطيخ مسبار ميرنا صحيحاً، أو إذا AP تلطيخ الحل تغيير اللون إلى اللون الأزرق والبنى، فإننا نقترح الغسيل الشرائح في ببست مرتين، والاستعاضة عن حل المصبوغة مع واحدة تقدم طازجة.

وأخيراً، على الرغم من أن هذا البروتوكول قد الأمثل لانسجة القلب الفورمالين-الثابتة/البارافين-جزءا لا يتجزأ من الماوس، قد يكون تكييفها للأنسجة المصنعة بدلاً من ذلك (منهاج العمل الثابتة/أكتوبر مضمن) و/أو استخدام مختلف أنواع التحقيق أو الأجسام المضادة. حد الجمع بين التهجين في الموقع و immunostaining ينبغي النظر فيه هو فشل العديد من الأجسام المضادة لربط بهم [ابيتوبس] كل منها، نظراً لإمكانية تدمير تلك الأخيرة عند درجات الحرارة العالية المستخدمة أثناء التهجين وصرامة الغسيل الخطوات. قيود إضافية من التهجين في الموقع والتقنيات إيمونوستينينج في أغلب الأحيان تشير إلى السلطة من هذه التقنيات للكشف عن تركيزات منخفضة جداً من جزيئات ميرنا أو البروتين على التوالي. تتوفر مجموعات تضخيم الإشارات المستخدمة للكشف عن حفر أو الأجسام المضادة عند وفرة ميرنا أو البروتين مصدر قلق. هذه المجموعات أيضا توفير بديل الأسفار للكشف عن ميرناس، الذي، عندما يقترن مع immunostaining الفلورسنت يمكن تبسيط الحصول على الصور. أساليب بديلة، مثل PCR الوقت الحقيقي والغربية النشاف التي لها قدر أكبر من الحساسية، يمكن أيضا معالجة قضايا وفرة منخفضة. ومع ذلك، خلافا للبروتوكول في الموقع التهجين/إيمونوستينينج، هذه التقنيات لا توفر معلومات حول التعريب الخاصة بالانسجة من جزيئات البروتين ميرنا/.

وباختصار، يمكننا وصف بروتوكول يوفر الكشف المتزامن لجزيئات البروتين وميرنا في الأنسجة نفسها، التي نعتقد أنها ستكون أداة لا تقدر بثمن في البحوث ميرنا على نماذج الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نود أن نشكر أثاناسيوس بابانجيليس، للتعليقات الانتقادية على المخطوطة. FM معتمد بواسطة التكنولوجيا الأحيائية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BBSRC؛ BB/M009424/1). IP تدعمها "أمريكية قلب جمعية العلماء التنمية المنحة" (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

علم الوراثة، والتعبير الجزئي-الجيش الملكي النيبالي، العدد 139، التنميط، ومسبار LNA، التهجين في الموقع ، إيمونوستينينج، وتضخم القلب
ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين <em>في الموقع</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter