Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.

Abstract

מיקרו-RNAs (miRNAs) הן תעתיקים RNA חד-גדילי לאגד RNAs שליח (mRNAs) ו לעכב את התרגום שלהם או לקדם את שפלותם. עד כה, miRNAs היו מעורבים מספר רב של תהליכים ביולוגיים ומחלות, אשר יש למסומן את הצורך בשיטות זיהוי אמין של תעתיקים miRNA. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לגילוי התווית על-ידי digoxigenin (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם) המבוסס על בדיקה miRNA, בשילוב עם חלבון immunostaining על העכבר לב חלקים. ראשית, אנו לבצע בחיי עיר הכלאה טכניקה באמצעות המכשיר לזיהוי miRNA-182 ביטוי בסעיפים הלב של שליטה ועכברים היפרטרופיה. הבא, נוכל לבצע immunostaining לב החלבונים טרופונין T (cTnT), על הסעיפים זהה, כדי להתאים לשפה משותפת miRNA-182 עם תאי cardiomyocyte. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לזהות miRNA-182 דרך phosphatase אלקליין המבוסס על ערכי צבע מוחלטים assay, cTnT דרך מכתים פלורסנט. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות את הביטוי של כל miRNA עניין באמצעות מגבר קדם התווית על-ידי החפירה הגששים, וביטוי חלבון הרלוונטיים במקטעי רקמת הלב העכבר.

Introduction

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם קצרים (18 – 25 נוקלאוטידים), RNAs חד-גדילי, noncoding המתפקדים הרגולטורים שלילי של ביטוי גנים ברמת post-transcriptional על ידי עיכוב תרגום RNA שליח (mRNA) ו/או קידום mRNA השפלה 1. miRNAs הם עיבד אינטרונים או exons של קידוד או noncoding גנים והם ביקע בגרעין על-ידי DROSHA, כדי קודמן miRNAs (pre-miRNAs), אשר הם גזע-לולאת מבנים של נוקלאוטידים 702. בעקבות cytoplasmic לייצא, pre-miRNAs מעובדים נוספים על ידי לטעמים לתוך miRNAs בוגרת המתפרסים על פני 18 – 25 נוקלאוטידים3,4. לאחר מכן, המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) משלבת miRNAs האלה כמו RNAs חד-גדילי, המאפשר את הכריכה שלהם לאזור 3' לא מתורגם (3'-UTR) של mRNAs היעד שלהם כדי לדכא את הביטוי3,5 .

בתוך שלושה עשורים, מאז שהם זוהו קודם, miRNAs הופיעו על הרגולטורים מאסטר של ביטוי גנים, רמות הביטוי האישי שלו הם מגבילים6. תפקידים miRNAs תוארו אורגן פיתוח7,8,9,10,11,12, תחזוקה של הומאוסטזיס13,14 , כמו גם מחלות בהקשרים הכוללים נוירולוגיות15,16,17,18,19,20לב וכלי דם, מחלות אוטואימוניות21 ,22,23,סרטן24ועוד25. הערכה הגוברת על הרלוונטיות של דפוסי ביטוי miRNA הביא קדימה את הצורך בשיטות זיהוי אמין של הפרוטוקולים miRNA. שיטות כאלה כוללות PCR בזמן אמת, מיקרו-מערכים, סופג בצפון, הכלאה בחיי עיר ועוד, אשר להשתנות רגישות, ירידה לפרטים, ובכוחו כמותית, בעיקר בשל העובדה כי miRNA תעתיקים המורכב מעובדים קצר ו רצפים הומולוגיים מאוד6.

לאחרונה דווח כאן תפקיד חשוב עבור miRNA-182 בפיתוח של שריר הלב היפרטרופיה26, מצב המתארת הסתגלות מבנית של הלב בתגובה לדרישות מוגברות בגרימת27,28. היפרטרופיה מאופיין על-ידי הגדלת מסת שריר הלב, אשר, אם המשויך שיפוץ maladaptive29, יכול להוביל לסיכון מוגבר לאי ספיקת לב, תנאי החשבונאי 8.5% ממקרי המוות כל המיוחס לב וכלי דם מחלת30.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו המשלבת בחיי עיר הכלאה עם התווית על-ידי digoxigenin בדיקה (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם), immunostaining איתור בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר, ב שלנו דגם של היפרטרופיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

העכבר דגימות רקמות הלב במחקר זה התקבלו בדרישות הרלוונטיות חוקים והנחיות מוסדיים ואושרו על-ידי ייל אוניברסיטת אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. פתרון הכנה

  1. הכנת RNase ddH חינם2O, על ידי טיפול 5 L של ddH2O עם 5 מ של 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) בין לילה (O/N), בטמפרטורת החדר (RT). אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס) כדי לבטל את DEPC. שימוש ddH שטופלו DEPC2O עבור ההכנה של פתרונות במורד הזרם כמו מצוינת.
    התראה: DEPC הוא חומר מסרטן ידוע, לטפל רק בשכונה fume.
  2. להכין 1 x פוספט Buffered מלוחים (PBS) פתרון על ידי המסת טבליות PBS 5 ב- 1 ליטר של ddH שטופלו DEPC2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).
  3. הכן 0.1% דטרגנט ללא יונית/PBS (PBST) על ידי דילול 1 מ"ל של דטרגנט ללא יונית לכל 1 ליטר ל- 1 x PBS.
  4. להכין אתנול 90%, 70%, 50% ו- 30% שטופלו DEPC ddH2O.
  5. הכינו 10 מ"ג/מ"ל פתרון מניות של K Proteinase (ProK) ב- ddH שטופלו DEPC2O. Aliquot ולאחסן ב-20 ° C. להכין 20 μg/mL הפתרון עובד של ProK על ידי המדללת 100 μL של פתרון מניות ProK 50 מ של ddH שטופלו DEPC2O. להפוך טריים לפני השימוש.
  6. להכין 4% paraformaldehyde (PFA) על-ידי הוספת 2 גר' PFA 50 מ של 1 x PBS. חום-65 ° C עם טלטולים מפעם לפעם, עד התפרקה. Aliquot וחנות ב-20 ° C.
    התראה: PFA הוא חומר מסרטן ידוע, לטפל רק בשכונה fume.
  7. להכין פתרון NaCl 3 מ' על-ידי הוספת 87.8 g עד 500 מ"ל של ddH2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).
  8. להכין פתרון2 MgCl 1 מ' על-ידי הוספת 20.3 g 100 מ של ddH2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).
  9. הכנת 1 מ' טריס pH 8.0 על ידי המסת 121.1 g ב 800 מיליליטר ddH2O. התאם ה-pH ל 8.0 עם כמה טיפות של 1 N HCl, להביא את אמצעי האחסון 1 L והחיטוי (121 מעלות צלזיוס). הכן הפתרון עובד של 50 מ מ טריס pH 8.0 על ידי דילול 2.5 מ של 1 מ' טריס pH 8.0 ב- 47.5 מ של ddH2O.
  10. הכנת 1 מ' טריס pH 9.5 על ידי המסת 60.6 g ב- 400 מ של ddH2O. התאם ה-pH ל 9.5 עם כמה טיפות של 1 N HCl, להביא את אמצעי האחסון 500 מ"ל ו autoclave (121 מעלות צלזיוס).
  11. להכין 0.13 ז 1-Methylimidazole pH 8.0 על ידי המדללת 1.6 מ ל 1-Methylimidazole 130 מ של ddH שטופלו DEPC2O. התאם ה-pH ל 8.0 עם בערך 450 µL של 12 N HCl. להוסיף 16 מ"ל של 3 M NaCl ולהביא את אמצעי האחסון עד 160 מ"ל. להפוך טריים לפני השימוש.
    התראה: 1-Methylimidazole הוא מזיק הקרומים הריריים, עיניים, עור, לטפל רק בשכונה fume.
  12. הכן מ' 0.16 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide הידרוכלוריד (EDC) על ידי µL 176 המדללת של EDC 10 מ של 1 מ' 0.13-Methylimidazole. להתאים את ה-pH ל 8.0 עם µL כ-100 12 טריים N HCl. לעשות לפני השימוש.
    התראה: EDC מזיק הקרומים הריריים, עיניים, עור, לטפל רק בשכונה fume.
  13. הכן 1% H2O2 על ידי דילול 1.5 מיליליטר 30% H2O2 ב- 50 מ של 1 x PBS. להפוך טריים לפני השימוש.
  14. להכין x SSC 20 pH 7.0 על ידי המסת 175.3 g של NaCl ו- g 88.2 של ציטראט נתרן (Na3ג'6H5או7) ב- 800 מיליליטר ddH2O. התאם את ה-pH אל 7.0 עם כמה טיפות 1 N HCl, להביא את אמצעי האחסון 1 ליטר, תא לחץ (121 מעלות צלזיוס).
    1. הכן הפתרון עובד של x SSC 2 pH 7.0 באמצעות דילול 20 מ של 20 x SSC, pH 7.0 ל- 180 מ"ל של ddH2O.
    2. הכן הפתרון עובד של x SSC 1 pH 7.0 באמצעות דילול 2.5 מ של 20 x SSC pH 7.0 ב- 47.5 מ של ddH2O.
    3. הכן הפתרון עובד של x SSC 0.2 pH 7.0 באמצעות דילול 5 מיליליטר 2 x SSC, pH 7.0 ב 45 מ"ל של ddH2O.
  15. הכן 1 x הכלאה פתרון על ידי דילול 0.5 מ של מאגר איש x microRNA 2 ב- 0.5 מ של ddH שטופלו DEPC2O. להפוך טריים לפני השימוש.
  16. להכין תמיסת מניות 200 מ"מ Levamisole על-ידי הוספת 250 מ"ג עד 5 מ"ל של ddH2O. Aliquot ולאחסן ב-20 ° C.
  17. היכונו חסימה פתרון שלב 5 (10% כבשים serum/1% BSA/0.2 מ מ Levamisol) על-ידי דילול 1 מ"ל של כבשים נסיוב ב 9 מ ל PBST, והוספת 0.1 גר' BSA. להוסיף 10 μL של Levamisole לפני השימוש. להפוך טריים לפני השימוש.
  18. היכונו חסימה פתרון שלב 6 (10% עז serum/1% BSA) על-ידי דילול 1 מ"ל של נסיוב עז ב 9 מ של PBST, והוספת 0.1 גר' BSA. לאחסן ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבוע.
  19. להכין פתרון prestaining על ידי דילול 3.3 מ של 3 M NaCl, 5 מ של MgCl 1 מ'2, 10 מ של 1 מ' טריס pH 9.5, 100 µL של יצירת רצף-20, µL 100 של Levamisole ב mL 81.5 ddH2O. להפוך טריים לפני השימוש.
  20. השתמש nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly פוספט (BCIP) טבליות להכין 20 מ של פתרון המצע אלקליין פוספטאז (AP) על פי הוראות היצרן. הוסף 20 μL של Levamisole. להפוך טריים לפני השימוש, להגן מפני אור.
  21. הכן KTBT פתרון על ידי הוספת 4g של טריס, 4.4 g של NaCl, 375 מ"ג אשלגן כלורי ב 500 מ"ל של ddH2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).
  22. אופציונלי: הכן הפתרון עובד דאפי (1 μg/mL) על ידי המדללת 50 μL של פתרון מניות דאפי (1 מ"ג/מ"ל) 50 מ של 1 x PBS.
    הערה: פתרונות סטנדרטיים כגון 3 M NaCl, MgCl 1 מ'2, 1 מ' טריס-HCl, נטולת נוקלאז ddH2O, 1 x PBS ו 20 x SSC ניתן לרכוש לחלופין. עבור פרוטוקול, צנצנות Coplin זכוכית 50 מ ל או מ"ל 20 שקופית פוליפרופילן מיילר שימשו צנצנות.

2. רקמת הכנה

הערה: הסעיפים הלב עכבר להשתמש כאן היו שהוכנו על ידי שירותי רקמה ייל פתולוגיה, מרקמות פורמלין-קבוע/פרפין-מוטבע, חותכים 5 μm וממוקמים בשקופיות טעונה.

  1. רקמות התייבשות.
    1. חממו את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, בתנור הכלאה עד פרפין נמס בעליל.
    2. דגירה השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של הסוכן סליקה זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים) למשך 10 דקות, פעמיים.
    3. דגירה של השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכילים 50 מ של אתנול 100% למשך 2 דקות, פעמיים, ולאחריו 90% אתנול למשך 2 דקות, אתנול 70% למשך 2 דקות, פעמיים, 50% אתנול למשך 2 דקות ו- 30% אתנול למשך 2 דקות.
    4. דגירה השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של ddH שטופלו DEPC2O למשך 5 דקות.
    5. דגירה השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS במשך 5 דקות.
  2. רקמות דה-proteinating.
    1. דגירה שקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 20 μg/mL הפתרון עובד ProK, ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנור הכלאה.
      התראה: תת מערכת העיכול עלול לגרום לעניים או אין התפתחות האות, בזמן העיכול יתר עלולה לגרום השפלה רקמות ופיתוח של צביעת הרקע. אופטימיזציה עשוי להידרש בשלב זה (μg 1 – 20/ProK, דגירה 5 – 20 דקות, mL RT-37 ° C).
    2. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS במשך 5 דקות, ב- RT, פעמיים.
  3. קיבוע הרקמה.
    1. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר מעגל דוחה מים סביב הרקמה בכל שקופית.
    2. להחיל 500 µL של 4% PFA פתרון האורך של כל שקופית, דגירה שקופיות אופקית במשך 10 דקות, בשעה RT.
    3. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS במשך 5 דקות, ב- RT, פעמיים.
    4. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 מ' 0.13-methylimidazole 10 דקות, ב- RT, פעמיים.
    5. החל µL 500 מ' 0.16 EDC פתרון האורך של כל שקופית, דגירה שקופיות אופקית h 1-RT, בתוך תא humidified.
    6. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 50 מ מ טריס pH 8.0-RT.
    7. יש לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT, פעמיים.
      הערה: שני צעדים קיבוע כדורגלן ו- EDC נדרשים עבור miRNA crosslinking, לא צריך להיות מושמט. 31
  4. בלוק peroxidase אנדוגני.
    1. דגירה שקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1% H2O2 למשך 30 דקות ב- RT.
    2. יש לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT, פעמיים.

3. הכלאה

  1. מחממים הכלאה פתרון (500 µL לכל שקופית) ב 50 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה, עד טמפרטורת היעד, נגיש (10-15 דקות).
  2. להכין את התא הכלאה על-ידי הצבת 2 חתיכות של מסנן או ממחטת נייר בתחתית התא ומרטיב את הנייר עם 50% formamide/1 x SSC.
    התראה: Formamide מזיק הקרומים הריריים, עיניים, עור, ידית היחידה בשכונה fume.
  3. µL 200 של הכלאה פתרון חלות על האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית 1 – 3 h ב 50 מעלות צלזיוס, בתוך תא humidified.
  4. להכין את הפתרון בדיקה על ידי ערבוב µL 0.5 מלאי רגש (25 מיקרומטר) בתמיסה 250 µL ofhybridization (ריכוז סופי 50 ננומטר) צינור 1.5 מ.
    הערה: miRNAs שונים באים לידי ביטוי ברמות שונות, כך אופטימיזציה לגבי ריכוז בדיקה העשויים להידרש בשלב זה (1 – 50 ננומטר) להימנע אין אות או רקע פיתוח.
  5. החל µL 250 בפתרון בדיקה האורך של כל שקופית, למקם coverslip חינם RNase למעלה. למנוע את היווצרות בועות.
  6. לאטום את התא הכלאה עם מצלמות-מיקרוסקופים ובזהירות דגירה O/N ב- 50 מעלות צלזיוס.
    הערה: הטמפרטורה הכלאה צריך להיות מוגדר כ 30 מעלות צלזיוס מתחת הטמפרטורה ההיתוך RNA (Tm) של כל בדיקה. אופטימיזציה עשוי להידרש. . הנה, 50 ° C משמש הטמפרטורה הכלאה/שטיפת miRNA בלינק 182, משתנות בהתאם עבור הגששים שונים.

4. לכתחילה שוטף

  1. Prewarm 200 מיליליטר 2 x SSC ב 50 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה, עד טמפרטורת היעד (20-40 דקות).
  2. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 2 x SSC ב 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, או עד coverslips לשחרר.
  3. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 2 x SSC ב RT למשך 5 דקות, פעמיים.
  4. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 0.2 x SSC ב RT במשך 5 דקות.
  5. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של PBST ב RT במשך 5 דקות.
  6. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות.
    הערה: השימוש RNase ללא תנאים כבר לא נחוץ מאז כלאיים RNA-RNA נחשבים יציבים.

5. זיהוי נוגדנים לחפור

  1. השתמש בעט הידרופובי לצייר מחדש מעגל דוחה מים סביב הרקמה בכל שקופית, במידת הצורך.
  2. החל µL 500 של חסימת פתרון האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית למשך 30 דקות ב- RT, בתוך תא humidified.
  3. הכן את הפתרון נוגדן החפירה (1:1, 000) על ידי המדללת 0.5 μL של החפירה נוגדן בתמיסה ofblocking µL 500 צינור 1.5 מ.
    התראה: אופטימיזציה העשויים להידרש בשלב זה (שבערך – 1:2, 000).
  4. µL 500 של החפירה נוגדן פתרון חלות על האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית h 1-RT, בתוך תא humidified.
  5. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של PBST ב RT במשך 5 דקות, שלוש פעמים.
  6. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של prestaining פתרון RT במשך 5 דקות, פעמיים.
  7. דגירה שקופיות בתוך צנצנת מיילר שקופית פוליפרופילן המכיל 20 מ"ל ofAP המצע פתרון ב 37 מעלות צלזיוס, במשך 6-24 h, מוגן מפני אור.
    התראה: פיתוח צבע צריך להיבדק שכל ה 2 אופטימיזציה העשויים להידרש בשלב זה.
  8. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של פתרון KTBT RT במשך 5 דקות, פעמיים.
  9. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות.

6. cTnT זיהוי נוגדנים

  1. השתמש בעט הידרופובי לצייר מחדש מעגל דוחה מים סביב הרקמה בכל שקופית, במידת הצורך.
  2. החל µL 500 של חסימת פתרון האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית h 1-RT, בתוך תא humidified.
  3. הכן את הפתרון נוגדן cTnT (1: 100) על ידי המדללת 2 μL של cTnT נוגדן בתמיסה ofblocking μL 200 צינור 1.5 מ.
  4. µL 200 בפתרון נוגדן cTnT חלות על האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית O/N ב 4 ° C, בתוך תא humidified.
  5. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות, שלוש פעמים.
  6. הכן את הפתרון נוגדן אנטי-rabbit-568 (שבערך) על ידי המדללת 0.5 μL של נוגדן אנטי-rabbit-568 בפתרון ofblocking μL 250 צינור 1.5 מ.
  7. µL 250 של נוגדן אנטי-rabbit-568 פתרון חלות על האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית h 1-RT, בתוך תא humidified.
  8. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות, שלוש פעמים.
  9. אופציונלי: החל µL 250 של הפתרון עובד דאפי האורך של כל שקופית ולאחר דגירה שקופיות אופקית 1 דקות ב- RT, מוגן מפני אור.
  10. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות, פעמיים.

7. הרכבה והדמיה

  1. הר של השקופיות עם 2-3 טיפות של הרכבה בינונית, תגית כיסוי זכוכית. לאפשר את השקופיות להתייבש שטוחים, O/N, ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
  2. המשך פלורסנטי או מיקרוסקופיה קונפוקלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

miRNA בחיי עיר הכלאה אופטימלי במקטעי הלב העכבר באמצעות לטרוף miRNA U6-snRNA, אשר שימש ואתאיזם הפקדים בהתאמה. צביעת חיובי מסומן בכחול, בעוד ההכתמה שלילי הוא הצביע על ידי חוסר צבע פיתוח (איור 1A-1B). Cardiomyocyte ביטוי מסוים של miRNA-182 הוערכה בסעיפים הלב של שליטה ועכברים overexpressing PlGF. העכברים נושאת את transgene PlGF תחת מקדם αMHC מפתחים היפרטרופיה, משני אנגיוגנזה מוגברת, בתוך 6 שבועות של הפעלת transgene26. לבצע הכלאה בחיי עיר ואנו מוצאים ביטוי מוגבר של miRNA-182 בליבם של עכברים PlGF, לעומת שולט (איור 2 א-2 H), המצוין על-ידי ההכתמה כחול. כדי לקבוע אילו סוגי תאים אקספרס miRNA בלינק 182, אנחנו מכן ביצע immunostaining עבור cTnT על הסעיפים זהה. מצאנו miRNA-182 שותף מקומי עם תאי cardiomyocyte cTnT-חיובית, וכן דאפי צבעונית גרעינים, שליטה והן PlGF העכבר לב מקטעים (איור 2C-2 H), המצוין על-ידי מכתימה בהתאמה הכחול והאדום. התמונות האלה היו עם יעד X 20.

Figure 1
איור 1: השליליות בחיי עיר הכלאה מכתים. (א) בחיי עיר הכלאה עבור לטרוף miRNA (25 ננומטר) בסעיפים הלב של שליטה בעכבר. (B) בחיי עיר הכלאה עבור U6-snRNA (25 ננומטר) בסעיפים הלב של שליטה בעכבר. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ביטוי ספציפי Cardiomyocyte miRNA 182 שליטה ולבבות העכבר PlGF. (A-B) בחיי עיר הכלאה עבור miRNA 182 PlGF העכבר לב סעיפים ובקרה. (C-D) Immunostaining עבור cTnT ב PlGF העכבר לב קטעי יש כבר בעבר מוכתם miRNA-182 ובקרה. (E-F) דאפי counterstaining בלוקאליזציה גרעיני שליטה, PlGF הנגרמים ללב העכבר יש כבר בעבר מוכתם miRNA-182. (G-H) תמונות הממוזג של miRNA-182 (כחול עמוק), cTnT (אדום) ודאפי (תכלת) צביעת עבור פקד ומקטעי הלב PlGF העכבר. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהוי תעתיק miRNA יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקות שונות המשתנות רגישות, ירידה לפרטים, כוח כמותית. . הנה, נדגים את צימוד miRNA בחיי עיר הכלאה עם immunostaining. ומתארות פרוטוקול המאפשר להערכת בו-זמניות של רמות הביטוי של מולקולות miRNA, חלבון, על הלב הנוכשה. אנו הראשונים מראים כיצד לבצע בחיי עיר הכלאה של התווית על-ידי החפירה מגבר קדם miRNA הגששים במקטעי הלב פרפין מוטבע. בשלב הבא, אנו נתאר כיצד לבצע immunostaining עבור cTnT על הסעיפים זהה. לבסוף, נדגים כיצד למזג את צבע שנוצר ואת התמונות פלורסנט. פרוטוקול זה הותאם עבור קבוע פורמלין (4 ° C, O/N) / פרפין מוטבע העכבר רקמות הלב, עם השימוש של התווית על-ידי החפירה מגבר קדם miRNA המחקרים וכל cTnT. אופטימיזציה נוספת עשויה להידרש ברקמות שונות, בדיקה או סוגי נוגדנים, כמתואר להלן.

תנאים נטול RNase לישם בקפידה לאורך המדרגות המוביל אל בדיקה הכלאה, כפי RNase זיהום קשות יכול לסכן את תוצאת הניסוי. כל הפתרונות צריכה להיעשות עם ddH שטופלו DEPC2O, כל הצנצנות Coplin צריכים להיות מטופלים עם פתרון טיהור RNase. בנוסף, השיקולים הבאים צריך להילקח בחשבון בעת עבודה עם הגששים miRNA מגבר קדם התווית על-ידי חפירה שונים. הטמפרטורה הכלאה תלוי טמפרטורת ההיתוך (Tm) של כל בדיקה. ככלל, חום זה 30 מעלות צלזיוס מתחת ה-RNA Tm נתון או 20 ° C מתחת ה-DNA Tm נתון צריך לשמש עבור בדיקה הכלאה. יתר על כן, ריכוז בדיקה אידיאלי צריך להיות מוטבת. בדרך כלל נמצא בין 1 – 50 ננומטר. לבסוף, החללית המכיל פתרון הכלאה עשויה להיות מחומם עד 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי denature כל מבנה משני, אם זוהי דאגה. צעד חשוב לבחון את ייחודה של החללית, במיוחד בעת שימוש בפעם הראשונה, היא לכלול שלילי (מעורבל) כמו גם חיובי (לדוגמה U6) בקרת החללית, כדי להבטיח הצלחה ניסיוני (איור 2). פקדים דומים (לדוגמה CD31 אנדותל נוגדנים) אמור לשמש במהלך השלב immunostaining.

בעיה נפוצה בניסויים הכלאה ' ב באתרו הוא הפיתוח של צביעת החפץ/רקע אות. כדי למנוע או למזער את החפץ צביעת מדרגות, הרקמה צריך להיות מוגן מפני מתייבשת לאורך כל השלבים, במיוחד במהלך incubations ארוך. אנו ממליצים על המכסה את השקופיות עם נטול RNase coverslips במהלך השלב הכלאה, במיוחד כאשר משתמשים בטמפרטורות גבוהות, שימוש humidifying צ'יימברס. אנו מציעים גם את השימוש fluorophore 568 או 594 לאתר cTnT או החלבון עניין במהלך השלב immunostaining. זה יבטל את כל autofluorescence שעולה לעתים קרובות עם השימוש של 488 fluorophores בשימוש על פורמלדהיד קבוע רקמות.

משתנה נוסף שאנו ממליצים לשים לב הוא משך הזמן של AP מכתים פיתוח, אשר תלויה רמות miRNA ספציפית נוכח הרקמה. אנו ממליצים לבדוק התקדמות מכתימים AP כל 2 h, עבור הניסוי הראשון. מיטוב נוספות עשויים לכלול שינוי הטמפרטורה של פרמטר דגירה (RT-37 ° C). לבסוף, אם הרקע מתחיל לפתח לפני ההכתמה בדיקה miRNA נכון, או אם נקודת הגישה מכתים פתרון משתנה צבע כחול-חום, אנו ממליצים לשטוף את השקופיות ב PBST פעמיים ולאחר החלפת הפתרון מכתימים במשאב טריים.

בסופו של דבר, למרות פרוטוקול זה הותאם מבחינת רקמות הלב פורמלין-קבוע/פרפין-מוטבע העכבר, זה עשוי להיות מותאם רקמות לחלופין מעובד (PFA קבוע/אוקטובר מוטבע) ו/או השימוש של בדיקה או נוגדנים הסוגים. מגבלה של שילוב בחיי עיר הכלאה immunostaining הנחשבות הוא הכישלון של מספר נוגדנים כדי לאגד שלהם epitopes בהתאמה, בשל חורבן אפשרי האחרונים שבהם בטמפרטורות גבוהות במהלך הכלאה, לכתחילה לשטוף מדרגות. מגבלות נוספות של הכלאה בחיי עיר והטכניקות immunostaining מתייחסים לרוב הכוח של טכניקות אלה כדי לזהות ריכוזים נמוכים מאוד של מולקולות חלבון או miRNA בהתאמה. האות הגברה ערכות זמינים לשימוש לצורך זיהוי או לחפור או נוגדן בעת השפע miRNA או חלבון היא דאגה. ערכות כאלה גם לספק חלופה פלורסצנטיות איתור miRNAs, אשר, בשילוב עם immunostaining פלורסנט יכולים לפשט את ייבוא תמונות. שיטות אלטרנטיביות, כגון בזמן אמת PCR ומערבי סופג בעלי רגישות רבה יותר, יכול גם בבעיות שפע נמוכה. עם זאת, בניגוד בחיי עיר פרוטוקול הכלאה/immunostaining, שיטות אלה מספקים מידע אין לוקליזציה רקמות ספציפיות של מולקולות miRNA/חלבון.

לסיכום, אנו מתארים את פרוטוקול המספק זיהוי סימולטני של מולקולות miRNA, חלבון על הרקמה זהה, אשר אנו מאמינים יהיה כלי יקר ערך במחקר miRNA על העכבר מודלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות אנטאנאסיוס Papangelis, על תגובות ביקורתיות על כתב היד. FM נתמך על-ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC; BB/M009424/1). IP נתמך על ידי האמריקאי הלב האגודה מדען פיתוח המענק (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

גנטיקה גיליון 139 מיקרו-RNA ביטוי פרופיל בדיקה מגבר קדם בחיי עיר הכלאה immunostaining היפרטרופיה
MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים <em>באתרו של</em> הכלאה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter