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Genetics

MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.

Abstract

micro-RNAs (miRNAs) son transcritos de RNA monocatenario que se unen a mensajero RNAs (mRNAs) e inhiben su traducción o promoción su degradación. Hasta la fecha, miRNAs se han implicado en un gran número de procesos biológicos y enfermedad, que ha significado la necesidad de los métodos de detección fiable de las transcripciones de miRNA. Aquí, describimos un protocolo detallado para marcado con digoxigenina ácido nucleico bloqueado (DIG) (LNA) basada en sondeos miRNA detección, combinada con la proteína immunostaining en secciones de corazón de ratón. En primer lugar, realizamos una técnica de hibridación en situ utilizando la sonda para identificar la expresión del miRNA-182 en las secciones de centro de control y los ratones de la hipertrofia cardiaca. A continuación, realizamos immunostaining para la proteína troponina T (cTnT) cardiaca, en las mismas secciones, localizar Co miRNA-182 con las células de cardiomiocitos. Mediante este protocolo, hemos podido detectar miRNA-182 por una fosfatasa alcalina a base de ensayo colorimétrico y reposo mediante tinción fluorescente. Este protocolo se puede utilizar para detectar la expresión de cualquier miRNA de interés mediante sondas LNA marcada con DIG y expresión de la proteína correspondiente en secciones de tejido de corazón de ratón.

Introduction

son micro-RNAs (miRNAs) corto (18 – 25 nucleótidos), ARN monocatenario, los que funcionan como reguladores negativos de la expresión génica a nivel post-transcripcional por inhibición de la traducción del ARN mensajero (ARNm) o promover la degradación del mRNA 1. miRNAs se transcriben intrones o exones de codificación o los genes y son troceados en el núcleo por DROSHA, miRNAs del precursor (pre-miRNAs), que son estructuras de corto lazo del vástago de 70 nucleótidos2. Después citoplásmica de la exportación, pre-miRNAs más son procesados por DICER en miRNAs maduros que abarcan 18 – 25 nucleótidos3,4. Posteriormente, el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) incorpora estos miRNAs como ARN monocatenario, que permite su unión a la región 3' no traducida (3'-UTR) de sus mRNAs de destino para reprimir su expresión3,5 .

En las últimas tres décadas, puesto que primero fueron identificados, miRNAs han surgido para principales reguladores de la expresión génica, cuyos niveles de expresión están estrechamente controlados6. Papeles de miRNAs se han descrito en órgano desarrollo7,8,9,10,11,12, mantenimiento de la homeostasis13,14 , así como de contextos de enfermedad que incluyen neurológica15,16,17,18,19, cardiovascular20, condiciones autoinmunes21 ,22,23,de cáncer24y otros25. La apreciación creciente de la importancia de los patrones de expresión de miRNA ha presentado la necesidad de métodos de detección fiable de las transcripciones de miRNA. Tales métodos incluyen PCR de tiempo Real, microarrays, norte Blot, hibridación en situ y otros, que varían en sensibilidad, especificidad y potencia cuantitativa, predominante debido a que miRNA transcripciones se componen de corto y secuencias altamente homólogo6.

Nos informó recientemente un papel importante de miRNA-182 en el desarrollo de la hipertrofia del miocardio26, una condición que describe la adaptación estructural del corazón en respuesta a elevadas exigencias hemodinámicas27,28. Hipertrofia cardiaca se caracteriza por el aumento de la masa miocárdica, que, si asociado con remodelación desadaptativas29, puede llevar a un mayor riesgo para la insuficiencia cardíaca, una condición representan 8.5% de todas las muertes atribuibles a cardiovascular enfermedad30.

Aquí, describimos nuestro protocolo que combina en situ el hibridación con una sonda de ácido nucleico bloqueado (DIG) (LNA) y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón, marcados con digoxigenina en nuestro modelo de la hipertrofia cardiaca.

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Protocol

Muestras de tejido de corazón de ratón para este estudio fueron obtenidas en conformidad con las leyes pertinentes y las directrices y fueron aprobadas por Yale Universidad institucional Animal cuidado y uso.

1. preparación de la solución

  1. Preparar Rnasa ddH gratis2O, por el tratamiento de 5 L de ddH2O con 5 mL de 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) durante la noche (O/N), a temperatura ambiente (RT). Autoclave (121 ° C) para desactivar la DEPC. Uso tratada con DEPC ddH2O para la preparación de soluciones downstream como indicado.
    PRECAUCIÓN: Con DEPC es un conocido carcinógeno, manejar sólo en la capilla del humo.
  2. Preparar solución de fosfato tampón salino (PBS) 1 x 5 tabletas de PBS en 1 L de ddH tratada con DEPC2O. Autoclave (121 ° C) de disolución.
  3. Diluir 1 mL de detergente no iónico por 1 L de 1 x PBS para preparar 0,1% detergente no-iónico/PBS (SAFT).
  4. Preparar etanol 90%, 70%, 50% y 30% en el ddH tratada con DEPC2O.
  5. Prepare un 10 mg/mL solución de proteinasa K (ProK) tratada con DEPC ddH2O. alícuota y almacenar a-20 ° C. Preparar una solución de trabajo μg/mL 20 de ProK por dilución 100 μL de solución stock ProK en 50 mL de ddH tratada con DEPC2o haga fresco antes de usarlo.
  6. Preparar 4% paraformaldehido (PFA) añadiendo 2 g de PFA en 50 mL de PBS 1 x. Calentar a 65 ° C con agitación ocasional, hasta que se disuelva. Alícuota y almacenar a-20 ° C.
    PRECAUCIÓN: PFA es un cancerígeno conocido, sólo la manija en la campana.
  7. Preparar una solución de NaCl de 3 M añadiendo g 87,8 a 500 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  8. Preparar una solución de 1 M MgCl2 agregando 20,3 g a 100 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  9. Preparar 1 M Tris pH 8.0 g 121,1 disolver en 800 mL de ddH2O. ajustar el pH a 8.0 con unas gotas de 1 N HCl, llevar el volumen a 1 L y autoclave (121 ° C). Preparar una solución de trabajo de 50 mM de Tris pH 8.0 diluyendo 2,5 mL de 1 M Tris pH 8.0 en 47.5 mL de ddH2O.
  10. Preparar 1 M Tris pH 9.5 por disolver 60,6 g en 400 mL de ddH2O. ajustar el pH a 9.5 con unas gotas de 1 N HCl, llevar el volumen a 500 mL y autoclave (121 ° C).
  11. Preparar 1-Metilimidazol 0,13 M pH 8.0 por dilución 1.6 mL de 1-Metilimidazol a 130 mL de ddH tratada con DEPC2O. ajustar el pH a 8.0 con aproximadamente 450 μl de 12 N HCl. agregar 16 mL de 3 M NaCl y llevar el volumen a 160 mL. Hacer fresco antes de usarlo.
    PRECAUCIÓN: 1-Metilimidazol es perjudicial para las membranas mucosas, ojos y piel, manejar sólo en la capilla del humo.
  12. Preparar diluyendo 176 μl de EDC a 10 mL de 0,13 M 1-Metilimidazol 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-etilcarbodiimida clorhidrato (EDC). Ajustar el pH a 8.0 con aproximadamente 100 μl de 12 N HCl. hacer fresco antes de usarlo.
    PRECAUCIÓN: EDC es perjudicial para las membranas mucosas, ojos y piel, manejar sólo en la capilla del humo.
  13. Preparar 1% H2O2 diluir 1,5 mL de 30% H2O2 en 50 mL de 1 x PBS. Hacer fresco antes de usarlo.
  14. Preparar 20 x SSC pH 7.0 por disolver 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio (Na3C6H5O7) en 800 mL de ddH2O. ajustar el pH a 7.0 con unas gotas de 1 N de ácido clorhídrico, llevar el volumen a 1 L y autoclave (121 ° C).
    1. Preparar una solución de trabajo de 2 x SSC pH 7.0 diluyendo 20 mL de 20 x SSC pH 7.0 en 180 mL de ddH2O.
    2. Preparar una solución de trabajo de 1 x SSC pH 7.0 diluyendo 2,5 mL de 20 x SSC pH 7.0 en 47.5 Dec2O.
    3. Preparar una solución de trabajo de 0,2 x SSC pH 7.0 diluyendo 5 mL de 2 x SSC pH 7.0 en 45 mL de ddH2O.
  15. Diluir 0,5 mL de tampón ISH x microRNA 2 en 0,5 mL de ddH tratada con DEPC2o haga fresco antes de su uso para preparar solución de hibridación 1 x.
  16. Preparar solución stock de 200 mM de levamisol añadiendo 250 mg en 5 mL de ddH2O. alícuota y almacenar a-20 ° C.
  17. Preparar solución de bloqueo para el paso 5 (10% oveja serum/1% BSA/0.2 mM Levamisol) diluir 1 mL de suero de oveja en 9 mL de Saft y añadiendo 0,1 g de BSA. Añada 10 μL de levamisol antes de usar. Hacer fresco antes de usarlo.
  18. Preparar solución de bloqueo para el paso 6 (10% cabra serum/1% BSA) diluir 1 mL de suero de cabra en 9 mL de Saft y añadiendo 0,1 g de BSA. Almacenar a 4 ° C y usar dentro de una semana.
  19. Preparar la solución prestaining diluyendo 3,3 mL de 3 M NaCl, 5 mL de 1 M MgCl2, 10 mL de 1 M Tris pH 9.5, 100 μl de Tween-20, 100 μl de levamisol en 81,5 mL de ddH2o haga fresco antes de usar.
  20. Uso de nitroazul de tetrazolio (en tabletas de fosfato (BCIP) NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly para preparar 20 mL de solución de sustrato de la fosfatasa alcalina (AP) según las instrucciones del fabricante. Añadir 20 μL de levamisol. Hacer fresco antes de su uso y proteger de la luz.
  21. Preparar la solución KTBT al agregar 4 g de Tris, 4,4 g de NaCl y 375 mg de KCl en 500 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  22. Opcional: Prepare una solución de trabajo de DAPI (1 μg/mL) diluyendo 50 μL de solución stock de DAPI (1 mg/mL) en 50 mL de PBS 1 x.
    Nota: Soluciones estándar como 3 M NaCl, 1 M de MgCl2, 1 M Tris-HCl, libre de nucleasas ddH2O 1 x PBS y 20 x SSC pueden adquirirse como alternativa. Para este protocolo, frascos de 50 mL vidrio Coplin o mailer de polipropileno diapositiva 20 mL frascos han sido utilizados.

2. preparación de tejido

Nota: Las secciones de corazón de ratón aquí fueron preparadas por Yale patología servicios de tejido, de tejido formalina-fijo/parafina-encajado, corte a 5 μm y colocadas en diapositivas cargadas.

  1. Rehidratación del tejido.
    1. Calentar los portaobjetos a 60 ° C durante 10 min, en el horno de hibridación hasta que la parafina se derrite visiblemente.
    2. Incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de agente de limpieza disponibles en el mercado (véase Tabla de materiales) durante 10 minutos, dos veces.
    3. Incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de etanol al 100% por 2 min, dos veces, seguido de etanol al 90% por 2 min, etanol al 70% por 2 min, dos veces, etanol al 50% por 2 min y etanol al 30% por 2 min.
    4. Incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de ddH tratada con DEPC2O 5 minutos.
    5. Incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x durante 5 minutos.
  2. Tejido de-proteinating.
    1. Incube los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de solución de trabajo ProK, a 37 ° C durante 15 min en el horno de hibridación de 20 μg/mL.
      PRECAUCIÓN: Digestión insuficiente puede resultar en pobre o ningún desarrollo de señal, mientras que la digestión excesiva puede resultar en la degradación del tejido y el desarrollo de la tinción de fondo. Optimización puede ser necesaria para este paso (1-20 μg/mL ProK, incubación de 5 a 20 min, RT-37 ° C).
    2. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x durante 5 minutos, a temperatura ambiente, dos veces.
  3. Fijación del tejido.
    1. Utilice un lápiz hidrofóbico para dibujar un círculo repelente al agua alrededor del tejido en cada diapositiva.
    2. 500 μl de solución PFA 4% se aplica a la duración de cada diapositiva e Incube los portaobjetos horizontal durante 10 min, a TA.
    3. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x durante 5 minutos, a temperatura ambiente, dos veces.
    4. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 0,13 M 1-Metilimidazol para 10 min, a temperatura ambiente, dos veces.
    5. Aplicar 500 μl de solución EDC de 0.16 M a la longitud de cada diapositiva e Incube los portaobjetos horizontal por 1 h a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
    6. Enjuague los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 50 mM Tris, pH 8.0 a TA.
    7. Enjuague los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x a RT, dos veces.
      Nota: Los pasos de fijación PFA y EDC son necesarios para la reticulación de miRNA y no deben ser omitidos. 31
  4. Bloqueo de la peroxidasa endógena.
    1. Incube los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1% H2O2 por 30 min a TA.
    2. Enjuague los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x a RT, dos veces.

3. hibridación

  1. Precalentar la solución de hibridación (500 μl) a 50 ° C en el horno de hibridación, hasta la temperatura deseada, se alcanza (10 – 15 min).
  2. Preparar la cámara de hibridación por colocar 2 piezas de filtro o papel de tejido en la parte inferior de la cámara y mojando el papel con 50% formamida/1 x SSC.
    PRECAUCIÓN: Formamida es perjudicial para las membranas mucosas, ojos y piel, mango sólo en la capilla del humo.
  3. Aplique 200 μL de solución de hibridación para la duración de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal para 1-3 h a 50 ° C, en una cámara humidificada.
  4. Preparar la solución de sonda mezclando 0,5 μl stock punta de prueba (25 μm) en la solución de ofhybridization 250 μl (concentración final 50 nM) en un tubo de 1,5 mL.
    Nota: Diversos miRNAs se expresan en diferentes niveles, para que optimización con respecto a la concentración de la sonda puede ser necesario para este paso (1-50 nM) no evitar que ninguna señal o fondo alto desarrollo.
  5. 250 μl de solución de la punta de prueba se aplica a la duración de cada diapositiva y coloque encima un cubreobjetos libre de Rnasa. Evitar la formación de burbujas.
  6. Sellar la cámara de hibridación con parafilm e incubar O/N a 50 ° C.
    Nota: La temperatura de hibridación debe establecerse aproximadamente 30 ° C por debajo de la temperatura de fusión del RNA (Tm) de cada sonda. Optimización puede ser necesaria. Aquí, 50 ° C se utiliza como la temperatura de hibridación/lavado de miRNA-182, Ayuste de diversas puntas de prueba.

4. rigor lavados

  1. Precaliente 200 mL de 2 x SSC a 50 ° C en el horno de hibridación, hasta alcanzar la temperatura deseada (20 – 40 min).
  2. Lavar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 2 x SSC a 50 ° C por 5 min, o hasta que afloje el cubreobjetos.
  3. Lavar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 2 x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos, dos veces.
  4. Lavar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 0.2 x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  5. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de SAFT a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  6. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    Nota: El uso de condiciones libres de Rnasa ya no es necesario puesto que los híbridos de RNA-RNA se consideran estables.

5. Empuje la detección del anticuerpo

  1. Usar una pluma hidrofóbica para volver a dibujar un círculo repelente al agua alrededor del tejido en cada diapositiva, si es necesario.
  2. Aplicar 500 μl de bloquear la solución a la longitud de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal por 30 min a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
  3. Preparar la solución de anticuerpo de empuje (1:1, 000) por dilución 0,5 μL de anticuerpo DIG en la solución de ofblocking de 500 μL en un tubo de 1,5 mL.
    PRECAUCIÓN: Optimización puede ser necesaria para este paso (1: 500, 1:2, 000).
  4. Aplicar 500 μl de solución de anticuerpo DIG a la duración de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal por 1 h a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
  5. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de SAFT a temperatura ambiente durante 5 minutos, tres veces.
  6. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de prestaining solución a temperatura ambiente durante 5 minutos, dos veces.
  7. Incube los portaobjetos en un tarro de mailer polipropileno diapositiva que contiene la solución de substrato ofAP de 20 mL a 37 ° C, durante 6-24 h, protegido de la luz.
    PRECAUCIÓN: Desarrollo de Color debe controlarse que cada 2 h. optimización puede ser necesario para este paso.
  8. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de solución KTBT a temperatura ambiente durante 5 minutos, dos veces.
  9. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos.

6. reposo detección del anticuerpo

  1. Usar una pluma hidrofóbica para volver a dibujar un círculo repelente al agua alrededor del tejido en cada diapositiva, si es necesario.
  2. Aplicar 500 μl de bloquear la solución a la longitud de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal por 1 h a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
  3. Preparar la solución de anticuerpo de cTnT (1: 100) diluyendo 2 μL del anticuerpo de la cTnT en la solución de ofblocking de 200 μL en un tubo de 1,5 mL.
  4. Aplique 200 μL de solución de anticuerpo de reposo a la duración de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal O/N a 4 ° C, en una cámara humidificada.
  5. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, tres veces.
  6. Preparar la solución de anticuerpo anti-anti-conejo-568 (1: 500) por dilución 0,5 μL de anticuerpo anti-anti-conejo-568 en la solución de ofblocking de 250 μL en un tubo de 1,5 mL.
  7. 250 μl de solución de anticuerpo anti-anti-conejo-568 se aplica a la duración de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal por 1 h a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
  8. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, tres veces.
  9. Opcional: 250 μl de solución de trabajo de DAPI se aplica a la duración de cada diapositiva e Incube los portaobjetos horizontal durante 1 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
  10. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, dos veces.

7. montaje y proyección de imagen

  1. Montar el portaobjetos con 2 – 3 gotas de medio de montaje y un cubreobjetos de vidrio. Deje que los portaobjetos se seque completamente, O/N, a 4 ° C, protegido de la luz.
  2. Proceder a epifluorescente o microscopía confocal.

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Representative Results

miRNA en situ el hibridación se ha optimizado en las secciones de corazón de ratón utilizando un scramble miRNA y U6-snRNA, que sirvieron como controles positivos y negativos respectivamente. Coloración positiva está indicada en azul, mientras que la tinción negativa es indicada por la falta de desarrollo de color (figura 1A-1B). Evaluaron la expresión específica de cardiomiocitos de miRNA-182 en secciones de centro de control y los ratones expresando PlGF. Los ratones con el transgén de PlGF bajo un promotor αMHC desarrollan hipertrofia cardíaca, secundaria a la angiogenesis creciente, dentro de 6 semanas de transgen activación26. Se realizó hibridación en situ y se encontró aumento de expresión de miRNA-182 en los corazones de los ratones de PlGF, comparados a los controles (figura 2A-2 H), indicada por la coloración azul. Para determinar que tipos de celulares expresan miRNA-182, luego realizamos la inmunotinción para cTnT en las mismas secciones. Nos encontramos localizados conjuntamente con las células de cTnT positivos cardiomiocitos miRNA-182, así como DAPI manchado núcleos en secciones de corazón de ratón de PlGF y control (figura 2-2 H), indicado por el rojo y el azul manchas respectivamente. Estas imágenes fueron con objetivo 20 X.

Figure 1
Figura 1: Negativo y positivo en situ hibridación tinción. (A) In situ hibridación para miRNA scramble (25 nM) en secciones de centro de control del ratón. (B) In situ hibridación de snRNA U6 (25 nM) en secciones de centro de control del ratón. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: expresión concreta de cardiomiocitos de miRNA-182 en control y PlGF ratón corazones. (A-B) Hibridación in situ de miRNA-182 en control y PlGF ratón corazón. (C-D) Immunostaining para la cTnT en el control y PlGF ratón corazón las secciones que han sido previamente teñidas de miRNA-182. (E-F) DAPI contratinción de localización nuclear en el control y PlGF secciones de corazón de ratón que han sido previamente teñidas de miRNA-182. (G-H) Imágenes combinadas de miRNA-182 (azul profundo), reposo (rojo) y DAPI (azul claro) para las secciones de corazón de ratón de PlGF y control. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

detección de transcripción miRNA puede lograrse a través de diferentes técnicas que varían en sensibilidad, especificidad y potencia cuantitativa. Aquí, demostramos el acoplamiento de miRNA en situ hibridación con inmunotinción y describe un protocolo que permite la evaluación simultánea de los niveles de expresión de moléculas de proteína y miRNA, en las mismas secciones de corazón. Primero mostramos cómo realizar en situ hibridación de sondas de miRNA LNA marcada con DIG en las secciones de corazón embebido de parafina. A continuación, describimos cómo realizar el immunostaining para cTnT en las mismas secciones. Finalmente, demostramos cómo combinar el color resultante y las imágenes fluorescentes. Este protocolo ha sido optimizado para formol fija (4 ° C, O/N) / parafina empotrado tejidos de corazón de ratón, con el uso de sondas de miRNA LNA marcada con DIG y reposo. Otra optimización puede ser requerido para los diferentes tejidos, sonda o tipos de anticuerpos, como se indica a continuación.

Condiciones libres de Rnasa deben implementarse cuidadosamente a lo largo de los pasos que conducen a la hibridación, la sonda como contaminación de Rnasa puede comprometer seriamente el resultado del experimento. Todas las soluciones deben hacerse con ddH tratada con DEPC2O, y todos los frascos Coplin deben tratarse con una solución de descontaminación de Rnasa. Además, las siguientes consideraciones deben tenerse en cuenta cuando se trabaja con diferentes sondas de miRNA LNA marcada con DIG. La temperatura de hibridación depende de la temperatura de fusión (Tm) de cada sonda. Como regla general, se recomienda una temperatura 30 ° C por debajo de la Tm RNA determinado o a 20 ° C debajo de la Tm de ADN determinada por hibridación de la sonda. Además, debe optimizarse la concentración ideal de la sonda. Miente generalmente entre 1 – 50 nM. Por último, la sonda que contiene solución de hibridación puede calentarse a 95 ° C por 5 min desnaturalizar las estructuras secundarias, si se trata de una preocupación. Un paso importante para probar la especificidad de una sonda, especialmente cuando se utiliza por primera vez, es incluir una negativa (revueltos), así como positiva (por ejemplo U6) sonda de control, para asegurar el éxito experimental (figura 2). Controles similares (por ejemplo un CD31 endotelial anticuerpos) deben utilizarse durante el paso de inmunotinción.

Un problema común en los experimentos de hibridación en situ es el desarrollo de la coloración de la señal del artefacto y fondo. Para evitar o minimizar el artefacto pasos de la coloración, el tejido debe protegerse sequía a lo largo de todas las medidas, especialmente durante largas incubaciones. Se recomienda cubrir el portaobjetos con cubreobjetos libre de Rnasa durante el paso de hibridación, especialmente cuando se utilizan altas temperaturas y el uso de cámaras de humectación. También sugerimos el uso de un fluoróforo 568 o 594 para detectar la cTnT o la proteína de interés durante el paso de inmunotinción. Esto eliminará cualquier autofluorescencia que a menudo se presenta con el uso de 488 fluoróforos en formaldehído tejidos fijados.

Otra variable a que se recomienda prestar atención es la duración del AP tinción de desarrollo, que depende de los niveles de la miRNA específico presente en el tejido. Sugerimos comprobar progresión tinción AP cada 2 h, para el primer experimento. Otra optimización puede incluir cambiar la temperatura del parámetro de incubación (RT-37 ° C). Por último, si fondo comienza a desarrollarse antes de la tinción de la sonda de miRNA verdadero, o si la AP tinción solución cambia de color a azul-marrón, sugerimos lavar los portaobjetos en SAFT dos veces y reemplazar la solución de tinción con uno recién hecho.

Por último, aunque este protocolo ha sido optimizado para los tejidos de corazón de ratón formalina-fijo/parafina-encajado, puede ser adaptado para tejidos o bien procesados (PFA fijo/OCT incrustado) o la utilización de los diferentes tipos de sonda o anticuerpos. Una limitación de combinar en situ el hibridación y el immunostaining que debe considerar es la falta de varios anticuerpos se unen a sus respectivos epítopos, debido a la posible destrucción de los últimos en las altas temperaturas utilizadas durante la hibridación y lavado pasos de rigor. Más limitaciones de hibridación en situ y técnicas de inmunotinción más a menudo se refieren a la potencia de estas técnicas para detectar concentraciones muy bajas de moléculas de proteína o miRNA respectivamente. Kits de amplificación de señal están disponibles para usar para cavar o anticuerpo de detección cuando miRNA o proteína de la abundancia es una preocupación. Estos equipos también ofrecen una alternativa de fluorescencia para la detección de miRNAs, que, cuando está juntado con inmunotinción fluorescente puede simplificar la adquisición de la imagen. Métodos alternativos, tales como PCR en tiempo real y Western Blotting que tienen una mayor sensibilidad, también pueden abordar cuestiones de baja abundancia. Sin embargo, al contrario en situ el protocolo de hibridación/immunostaining, estas técnicas no proporcionan ninguna información sobre la localización de tejidos específicos de las moléculas de proteína/miRNA.

En Resumen, se describe un protocolo que proporciona detección simultánea de miRNA y proteína moléculas en el mismo tejido, lo que creemos que será una valiosa herramienta en la investigación de miRNA en modelos de ratón.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Athanasios Papangelis, por comentarios críticos sobre el manuscrito. FM es apoyado por la biotecnología y el Consejo de investigación de ciencias biológicas (BBSRC; BB/M009424/1). IP se apoya en el corazón Americano Asociación científico desarrollo Grant (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

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References

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Genética expresión de micro-RNA número 139 perfiles sonda LNA hibridación en situ immunostaining hipertrofia cardiaca
MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación <em>In Situ</em>
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Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

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