Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.

Abstract

micro-RNAs (miRNAs) são transcrições de single-stranded RNA que se ligam ao RNA mensageiro (mRNAs) e inibem a sua tradução ou promovem a sua degradação. Até à data, os miRNAs têm sido implicados em um grande número de processos biológicos e doença, que tem representado a necessidade para os métodos de detecção confiável de miRNA transcrições. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para Digoxigenina-rotulado (escavação) trancado ácido nucleico (LNA) baseada em investigação miRNA deteção, combinada com proteína immunostaining em seções de coração de rato. Primeiro, realizamos uma técnica hibridização em situ utilizando a sonda para identificar miRNA-182 expressão nas seções de coração de controle e os ratos de hipertrofia cardíaca. Em seguida, realizamos imunocoloração para proteína cardíaca de troponina T (miocardite), sobre as mesmas seções, co localizar miRNA-182 com as células de casos. Usando este protocolo, fomos capazes de detectar miRNA-182 através uma fosfatase alcalina baseado ensaio colorimetric e miocardite através de coloração fluorescente. Este protocolo pode ser usado para detectar a expressão de qualquer miRNA de interesse através das sondas LNA escavar-etiquetadas e expressão de proteínas relevantes em cortes de tecido de coração de rato.

Introduction

micro-RNAs (miRNAs) são curtas (18-25 nucleotides), RNAs single-stranded, não codificante que funcionam como reguladores negativos da expressão génica a nível pós-transcricional por inibição da tradução do RNA mensageiro (mRNA) e/ou promover a degradação do mRNA 1. os miRNAs são transcritas de intrões ou exões de codificação ou não-codificante genes e são clivadas no núcleo por DROSHA, que os miRNAs precursor (pre-miRNAs), que são estruturas de Hairpin loop curto de 70 nucleotídeos2. Seguindo citoplasmática de exportação, pré-miRNAs são subsequentemente transformados por DICER em miRNAs maduros que abrangem 18-25 nucleotides3,4. Posteriormente, o complexo silencioso induzido por RNA (RISC) incorpora estes miRNAs como single-stranded RNA, que permite a sua ligação à 3' untranslated região (3'-UTR) dos seus mRNAs alvo para suprimir sua expressão3,5 .

Dentro nas últimas três décadas, desde que eles foram primeiramente identificados, miRNAs surgiram para mestre reguladores da expressão do gene, cujos níveis de expressão são rigidamente controlada6. Funções para os miRNAs têm sido descritas em órgão desenvolvimento7,8,9,10,11,12, manutenção da homeostase13,14 , bem como os contextos de doença que incluem neurológico15,16,17,18,19, cardiovascular20, doenças auto-imunes21 ,22, cancros23,24e outros25. A crescente valorização para a relevância de padrões de expressão de miRNA apresentou a necessidade de métodos de deteção confiável de miRNA transcrições. Tais métodos incluem PCR em tempo Real, microarrays, mancha do Norte, hibridação in situ e outros, que variam de sensibilidade, especificidade e poder quantitativa, predominantemente, devido ao fato de que miRNA transcrições são compostas de curto e sequências homólogas altamente6.

Recentemente, informou um papel importante no desenvolvimento da hipertrofia miocárdica26, uma condição descrevendo a adaptação estrutural do coração em resposta às elevadas exigências hemodinâmica27,28de miRNA-182. Hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento da massa miocárdica, que, se associado com remodelação mal-adaptativos29, pode levar a aumento do risco de insuficiência cardíaca, uma condição de contabilização de 8,5% de todas as mortes atribuíveis a cardiovascular doença de30.

Aqui, descrevemos nosso protocolo que combina a hibridação in situ com uma sonda de ácido nucleico de bloqueado (escavação) (LNA) Digoxigenina-etiquetadas e imunocoloração para a detecção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato, em nosso modelo de hipertrofia cardíaca.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

As amostras de tecido do coração de rato para este estudo foram obtidas em conformidade com a legislação e as normas institucionais e foram aprovadas pelo Comitê de uso e Yale University institucional Cuidado Animal.

1. preparação da solução

  1. Preparar O RNase livre ddH2, tratando de 5 L de DDQ2O com 5 mL de diethylpyrocarbonate de 0,1% (DEPC) durante a noite (O/N), à temperatura ambiente (RT). Autoclave (121 ° C) para desactivar o DEPC. Uso tratada com DEPC ddH2O para a preparação de soluções a jusante como indicado.
    Cuidado: DEPC é um conhecido agente cancerígeno, lidar com na coifa.
  2. Prepare a solução de fosfato tamponado salino (PBS) 1 x dissolvendo-se 5 comprimidos de PBS em 1 L de DDQ tratada com DEPC2O. Autoclave (121 ° C).
  3. Prepare-se diluindo-se 1 mL de detergente não-iônico por 1 L de 1X PBS 0,1% detergente não-iônico/PBS (PBST).
  4. Prepare-se 90%, 70%, 50% e 30% de etanol em ddH tratada com DEPC2O.
  5. Preparar um 10 mg/mL solução de Proteinase K (ProK) em ddH tratada com DEPC2O. alíquota e armazenar a-20 ° C. Prepare uma solução de trabalho μg/mL 20 de ProK por diluição 100 μL da solução-mãe ProK em 50 mL de DDQ tratada com DEPC2O. Make fresco antes da utilização.
  6. Prepare paraformaldeído 4% (PFA), adicionar 2 g de PFA em 50 mL de 1X PBS. Aqueça a 65 ° C, agitando ocasionalmente, até dissolver. Alíquota e loja a-20 ° C.
    Cuidado: PFA é um conhecido agente cancerígeno, lidar com na coifa.
  7. Prepare uma solução de NaCl de 3M, acrescentando 87,8 g para 500 mL de DDQ2O. Autoclave (121 ° C).
  8. Prepare uma solução de2 1 M MgCl adicionando 20,3 g para 100 mL de DDQ2O. Autoclave (121 ° C).
  9. Preparar 1 M Tris pH 8.0 por dissolução g 121,1 em 800 mL de DDQ2O. ajustar o pH para 8,0 com algumas gotas de 1 N HCl, trazer o volume de 1 L e autoclave (121 ° C). Preparar uma solução de trabalho de 50 mM Tris pH 8.0 diluindo 2,5 mL de 1 M Tris pH 8.0 em 47,5 mL de DDQ2O.
  10. Preparar 1 M Tris pH 9,5 por dissolução 60,6 g em 400 mL de DDQ2O. ajustar o pH a 9,5 com algumas gotas de 1 N HCl, trazer o volume para 500 mL e autoclave (121 ° C).
  11. Prepare a 0,13 M 1-Methylimidazole pH 8.0 por diluição 1,6 mL de 1-Methylimidazole a 130 mL de DDQ tratada com DEPC2O. ajustar o pH para 8,0 com aproximadamente 450 µ l de 12 N HCl. Adicionar 16 mL de 3 M NaCl e traga o volume de 160 mL. Fazer fresco antes da utilização.
    Atenção: 1-Methylimidazole é prejudicial à pele, olhos e mucosas, lidar com na coifa.
  12. Prepare 0,16 M N cloridrato de-(3-Dimethylaminopropyl)-n-ethylcarbodiimide (EDC), diluindo µ l 176 de EDC a 10 mL de 0,13 M 1-Methylimidazole. Ajuste o pH para 8,0 com aproximadamente 100 µ l de 12 fresco N HCl. faça antes do uso.
    Atenção: EDC é prejudicial à pele, olhos e mucosas, lidar com na coifa.
  13. Prepare-se 1% H2O2 diluindo-se 1,5 mL de 30% H2O2 em 50 mL de 1X PBS. Fazer fresco antes da utilização.
  14. Preparar 20 x SSC pH 7.0 dissolvendo 175,3 g de NaCl e 88,2 g de citrato de sódio (Na3C6H5O7) em 800 mL de DDQ2O. ajustar o pH a 7,0 com algumas gotas de 1 N HCl, trazer o volume de 1 L e autoclave (121 ° C).
    1. Preparar uma solução de trabalho de 2 x SSC pH 7.0 diluindo 20ml de 20 x SSC pH 7.0 em 180 mL de DDQ2O.
    2. Preparar uma solução de trabalho de 1 x SSC pH 7.0 diluindo 2,5 mL de x SSC pH 7.0 em 47,5 20ml de DDQ2O.
    3. Preparar uma solução de trabalho de 0,2 x SSC pH 7.0 diluindo-se 5 mL de 2 x SSC pH 7.0 em 45 mL de DDQ2O.
  15. Prepare 1 x solução de hibridação diluindo-se 0,5 mL de tampão ISH x microRNA 2 em 0,5 mL de DDQ tratada com DEPC2O. Make fresco antes de usar.
  16. Preparar a solução stock de 200 mM de Levamisole adicionando 250mg 5ml de DDQ2O. alíquota e armazenar a-20 ° C.
  17. Prepare solução de bloqueio para a etapa 5 (10% ovelha serum/1% BSA/0.2 mM Levamisol) diluir 1 mL de soro de carneiro em 9 mL PBST, e adicionando 0,1 g de BSA. Adicione 10 μL de Levamisole antes de usar. Fazer fresco antes da utilização.
  18. Prepare solução de bloqueio para a etapa 6 (10% cabra serum/1% BSA) diluir 1 mL de soro de cabra em 9 mL de PBST, e adicionando 0,1 g de BSA. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana.
  19. Preparar prestaining solução diluindo 3,3 mL de 3 M NaCl, 5 mL de 1 M MgCl2, 10 mL de 1 M Tris pH 9,5, 100 µ l de Tween-20, 100 µ l de Levamisole em 81,5 mL de DDQ2O. Make fresco antes de usar.
  20. Use Tetrazolium tetrazólio (tabletes de fosfato (BCIP) NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly para preparar 20 mL de solução de substrato de fosfatase alcalina (AP) de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 20 μL de Levamisole. Fazer fresco antes de usar e proteger da luz.
  21. Prepare a solução KTBT adicionando 4G de Tris, 4,4 g de NaCl e 375 mg de KCl em 500 mL de DDQ2O. Autoclave (121 ° C).
  22. Opcional: Prepare uma solução de trabalho de DAPI (1 μg/mL) por diluição 50 μL de solução estoque DAPI (1 mg/mL) em 50 mL de 1X PBS.
    Nota: Soluções padrão como 3 M NaCl, 1m MgCl2, 1 M Tris-HCl, livre de nuclease ddH2O, 1X PBS e 20 x SSC pode ser comprado como alternativa. Para este protocolo, frascos de Coplin de vidro de 50 mL ou mailer de polipropileno slide 20 mL frascos têm sido utilizados.

2. preparação do tecido

Nota: As seções de coração de rato usadas aqui foram elaboradas pelos serviços de tecido de patologia Yale, do tecido Formalin-fixos/parafina, cortadas em 5 μm e posicionadas em slides carregados.

  1. Hidratação do tecido.
    1. Aquecer os slides a 60 ° C durante 10 minutos, no forno da hibridação até parafina visivelmente está derretendo.
    2. Incubar os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de despachante comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) por 10 min, duas vezes.
    3. Incube os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de etanol a 100% por 2 min, duas vezes, seguido por etanol 90% por 2 min, etanol a 70% por 2 min, duas vezes, etanol a 50% por 2 min e 30% de etanol por 2 min.
    4. Incube os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de DDQ tratada com DEPC2O por 5 min.
    5. Incube os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS por 5 min.
  2. Tecido de-proteinating.
    1. Incube em jarra de Coplin um vidro contendo 50 mL de solução de trabalho de ProK, a 37 ° C por 15 min no forno da hibridação de 20 μg/mL.
      Atenção: Sob digestão pode resultar em pobres ou sem desenvolvimento de sinal, enquanto a digestão excessiva pode resultar em degradação do tecido e o desenvolvimento de coloração de fundo. Otimização pode ser exigida para esta etapa (1-20 μg/mL ProK, incubação de 5 a 20 min, RT-37 ° C).
    2. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS durante 5 min, à RT, duas vezes.
  3. Fixação de tecidos.
    1. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo repelente de água ao redor do tecido em cada slide.
    2. Aplicar 500 µ l de solução PFA de 4% para o comprimento de cada slide e incubar-se horizontalmente para 10 min, a RT
    3. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS durante 5 min, à RT, duas vezes.
    4. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 0,13 M 1-methylimidazole por 10 min, em RT, duas vezes.
    5. Aplicar 500 µ l de solução EDC de 0,16 M para o comprimento de cada slide e incubar horizontalmente por 1h no RT, numa câmara umidificada.
    6. Lave os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de pH 8.0 do Tris 50mm no RT
    7. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT, duas vezes.
      Nota: Ambos os passos de fixação PFA e EDC são necessários para miRNA reticulação e não devem ser omitidos. 31
  4. Bloqueio da peroxidase endógena.
    1. Incubar em jarra de Coplin um vidro contendo 50 mL de 1% H2O2 por 30 min em RT
    2. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT, duas vezes.

3. hibridação

  1. Pré-aquecer a solução de hibridação (500 µ l por slide) a 50 ° C no forno da hibridação, até a temperatura-alvo, é atingido (10-15 min).
  2. Preparar a câmara de hibridação colocando 2 pedaços de filtro ou papel de tecido na parte inferior da câmara e molhar o papel com 50% formamida/1 x SSC.
    Cuidado: Formamida é prejudicial para as mucosas, olhos e pele, identificador único na coifa.
  3. Aplicam-se 200 µ l de solução de hibridização para o comprimento de cada slide. Incube-se horizontalmente para 1 – 3 h a 50 ° C, numa câmara umidificada.
  4. Prepare a solução de sonda misturando sonda estoque de 0.5 µ l (25 µM) em solução de ofhybridization 250 µ l (concentração final 50 nM), em um tubo de 1,5 mL.
    Nota: Os miRNAs diferentes são expressos em diferentes níveis, por otimização sobre a concentração de sonda pode ser exigida para esta etapa (1 – 50 nM) não evitar nenhum sinal ou desenvolvimento de fundo elevado.
  5. Aplicar 250 µ l de solução de sonda para o comprimento de cada slide e coloque uma lamela de RNase livre na parte superior. Evite a formação de bolhas.
  6. Cuidadosamente, selar a câmara de hibridação com parafilm e incubar O/N a 50 ° C.
    Nota: A temperatura de hibridização deve ser definida aproximadamente 30 ° C abaixo da temperatura de fusão de RNA (Tm) de cada teste. Otimização pode ser necessária. Aqui, 50 ° C é usado como a hibridação/lavagem temperatura miRNA-182, ajustar conformemente para diferentes sondas.

4. rigor lavagens

  1. Escaldar a 200 mL de 2 x SSC a 50 ° C no forno da hibridação, até atingir a temperatura de alvo (20 – 40 min).
  2. Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 2 x SSC a 50 ° C por 5 min, ou até soltar as lamelas.
  3. Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 2 x SSC em RT por 5 min, duas vezes.
  4. Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 0.2 x SSC em RT por 5 min.
  5. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de PBST em RT por 5 min.
  6. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min.
    Nota: Uso de condições RNase-livre não é necessário desde os híbridos de RNA-RNA são considerados estáveis.

5. CAVAR de anticorpos

  1. Use uma caneta hidrofóbica para re-desenhar um círculo repelente de água ao redor do tecido em cada slide, se necessário.
  2. Aplica 500 µ l de solução para o comprimento de cada slide de bloqueio. Incube-se horizontalmente por 30 min em RT, numa câmara umidificada.
  3. Prepare a solução de anticorpo de escavação (1:1, 000) por diluição 0,5 μL do anticorpo de escavação na solução de ofblocking 500 µ l em um tubo de 1,5 mL.
    Cuidado: Otimização pode ser necessária para esta etapa (1: 500 – 1:2, 000).
  4. Aplica 500 µ l de solução de anticorpo de escavação para o comprimento de cada slide. Incube-se horizontalmente por 1h no RT, numa câmara umidificada.
  5. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de PBST em RT por 5 min, três vezes.
  6. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de prestaining solução em RT por 5 min, duas vezes.
  7. Incube em uma jarra de mailer slide polipropileno contendo 20 mL solução de substrato ofAP a 37 ° C, por 6-24 h, protegido da luz.
    Atenção: Desenvolvimento de cor deve ser verificado que cada 2 h. otimização pode ser necessária para esta etapa.
  8. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de solução KTBT a RT por 5 min, duas vezes.
  9. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min.

6. miocardite de anticorpos

  1. Use uma caneta hidrofóbica para re-desenhar um círculo repelente de água ao redor do tecido em cada slide, se necessário.
  2. Aplica 500 µ l de solução para o comprimento de cada slide de bloqueio. Incube-se horizontalmente por 1h no RT, numa câmara umidificada.
  3. Prepare a solução de anticorpo de miocardite (1: 100) por diluição 2 μL do anticorpo de miocardite na solução de ofblocking 200 μL em um tubo de 1,5 mL.
  4. Aplicam-se 200 µ l de solução de anticorpo miocardite para o comprimento de cada slide. Incubar horizontalmente O/N a 4 ° C, numa câmara umidificada.
  5. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min, três vezes.
  6. Prepare a solução de anticorpo anti-rabbit-568 (1: 500) por diluição 0,5 μL do anticorpo anti-rabbit-568 na solução de ofblocking 250 μL em um tubo de 1,5 mL.
  7. Aplica 250 µ l de solução de anticorpo anti-rabbit-568 para o comprimento de cada slide. Incube-se horizontalmente por 1h no RT, numa câmara umidificada.
  8. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min, três vezes.
  9. Opcional: Aplicar 250 µ l de solução de trabalho de DAPI para o comprimento de cada slide e incubar horizontalmente por 1 min em RT, protegido da luz.
  10. Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min, duas vezes.

7. montagem e imagem

  1. Monte as lâminas com 2 a 3 gotas de meio de montagem e uma lamela de vidro. Permitir que os slides secar liso, O/N, a 4 ° C, protegido da luz.
  2. Continue a epifluorescente ou microscopia confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

hibridação de miRNA in situ foi otimizada em seções de coração de rato usando um scramble miRNA e U6-snRNA, que serviu como controles positivos e negativos, respectivamente. Coloração positiva é indicada em azul, enquanto a coloração negativa é indicada pela falta de desenvolvimento de cor (figura 1A-1B). Casos específico expressão de miRNA-182 foi avaliada em seções de coração de controle e PlGF superexpressão ratos. Os ratos carregando o transgene PlGF sob um promotor αMHC desenvolvem hipertrofia cardíaca, secundária à angiogênese aumentada, dentro de 6 semanas do transgene ativação26. Realizamos a hibridação in situ e encontrou expressão aumentada de miRNA-182 nos corações de ratos PlGF, comparados aos controles (Fig. 2A-2 H), indicada pela coloração azul. Para determinar quais tipos de células expressam miRNA-182, realizamos então imunocoloração para miocardite sobre as mesmas seções. Encontramos 182 miRNA co localizados com as células de casos de miocardite-positivo, bem como DAPI manchado núcleos, no controle e PlGF seções de coração de rato (Figura 2-2 H), indicado pelo vermelho e azul, respectivamente a coloração. Estas imagens foram com um objetivo X 20.

Figure 1
Figura 1: Negativo e positivo em situ da hibridação manchando. Hibridação In situ (A) para scramble miRNA (25 nM) em seções de controle do mouse de coração. (B) hibridação In situ por U6-snRNA (25 nM) em seções de controle do mouse de coração. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: casos específico expressão de miRNA-182 no controle e corações de rato PlGF. (A-B) Hibridação in situ por miRNA-182 nas seções de coração de rato PlGF e controle. (C-D) Immunostaining para miocardite em controle e seções de coração de rato PlGF que têm sido previamente coradas para miRNA-182. (E-F) DAPI counterstaining para localização nuclear no controle e PlGF seções de coração de rato que têm sido previamente coradas para miRNA-182. (G-H) Imagens mescladas de miRNA-182 (azul profundo), miocardite (vermelho) e DAPI (luz azul) mancha para o controle e PlGF seções de coração de rato. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

deteção de transcrição de miRNA pode ser conseguida através de técnicas diferentes que variam em sensibilidade, especificidade e poder quantitativa. Aqui, demonstramos o acoplamento de miRNA hibridação in situ com imunocoloração e descrever um protocolo que permite a avaliação simultânea dos níveis de expressão de moléculas miRNA e proteína, sobre as mesmas seções de coração. Nós primeiro mostrar como realizar a hibridação in situ de sondas de miRNA LNA escavar-etiquetadas em seções de coração de parafina incorporada. Em seguida, descrevemos como executar imunocoloração para miocardite sobre as mesmas seções. Finalmente, vamos demonstrar como mesclar a cor resultante e imagens fluorescentes. Este protocolo foi otimizado para fixo de formol (4 ° C, O/N) / parafina incorporado tecidos de coração de rato, com a utilização de sondas de miRNA LNA escavar-etiquetadas e miocardite. Otimização adicional pode ser necessário para diferentes tecidos, sonda ou tipos de anticorpos, conforme descrito abaixo.

Condições RNase-livre devem ser cuidadosamente implementadas em toda as etapas que conduzem a sonda de hibridização, como a contaminação de RNase pode comprometer gravemente o resultado do experimento. Todas as soluções devem ser feitas com o ddH tratada com DEPC2O, e todos os frascos de Coplin devem ser tratados com uma solução de descontaminação de RNase. Além disso, as seguintes considerações devem ter em conta quando se trabalha com diferentes sondas de miRNA LNA escavar-etiquetadas. A temperatura de hibridização depende da temperatura de fusão (Tm) de cada teste. Como regra geral, uma temperatura que é 30 ° C abaixo do determinado RNA Tm ou 20 ° C, abaixo o determinado Tm de DNA deve ser usada para hibridização da sonda. Além disso, a concentração ideal da sonda deve ser otimizada. Encontra-se geralmente entre 1 a 50 nM. Por último, a sonda contendo solução de hibridização pode ser aquecida para 95 ° C por 5 min desnaturar qualquer estruturas secundárias, se esta for uma preocupação. Um passo importante para testar a especificidade de uma sonda, especialmente quando usado pela primeira vez, é incluir uma negativa (ovos mexidos), bem como positivo (por exemplo U6) controle sonda, para garantir o sucesso experimental (Figura 2). Controles similares (por exemplo um anticorpo CD31 endotelial) devem ser usados durante a etapa de imunocoloração.

Um problema comum em situ as experiências de hibridação é o desenvolvimento de coloração sinal artefato/plano de fundo. Para evitar ou minimizar o artefato passos de coloração, o tecido deve ser protegido de secar durante todas as etapas, especificamente durante a incubação do longa. Recomendamos cobrir os slides com lamelas de RNase-livre durante a etapa de hibridação, particularmente quando são utilizadas a altas temperaturas e a utilização de câmaras de humedecimento. Também sugerimos a utilização de um fluoróforo 568 ou 594 para detectar miocardite ou a proteína de interesse durante a etapa de imunocoloração. Isto eliminará qualquer autofluorescência que muitas vezes surge com o uso de 488 fluorophores usado em formaldeído tecidos reparados.

Outra variável que é recomendável prestar atenção é a duração da AP manchando o desenvolvimento, que varia de acordo com os níveis da miRNA específica presente no tecido. Sugerimos verificar a progressão de coloração AP cada 2 h, para o primeiro experimento. Mais otimização pode incluir mudar a temperatura do parâmetro de incubação (RT-37 ° C). Por último, se fundo começa a desenvolver-se antes a verdade miRNA sonda coloração, ou se o AP coloração solução muda de cor para azul-brown, sugerimos lavar os slides em PBST duas vezes e substituir a solução de coloração por um feito recentemente.

Finalmente, embora este protocolo foi otimizado para tecidos de coração de rato formalina-fixo/parafina, pode ser adaptado para tecidos transformados em alternativa (PFA fixo/OCT incorporado) e/ou o uso dos diferentes tipos de sonda ou anticorpo. Uma limitação da combinação de hibridação in situ e imunocoloração que deve ser considerada é o fracasso de diversos anticorpos para ligar para seus respectivos resumos, devido a possível destruição dos últimos nas altas temperaturas usadas durante a hibridização e o rigor de etapas de lavagem. Mais limitações de hibridação in situ e de técnicas de imunocoloração mais frequentemente se referem ao poder dessas técnicas para detectar concentrações muito baixas de moléculas miRNA ou proteína, respectivamente. Kits de amplificação de sinal estão disponíveis para uso para a deteção de escavação ou anticorpo quando miRNA ou proteína de abundância é uma preocupação. Tais kits também fornecer uma alternativa de fluorescência para a detecção de miRNAs, que, quando acoplado com immunostaining fluorescente pode simplificar a aquisição de imagens. Métodos alternativos, tais como a PCR em tempo real e que têm maior sensibilidade, mancha ocidental também podem resolver problemas de baixa abundância. No entanto, ao contrário do protocolo de imunocoloração/hibridização em situ , estas técnicas não fornecem nenhuma informação sobre a localização de tecido-específica das moléculas de proteína/miRNA.

Para resumir, descrevemos um protocolo que fornece detecção simultânea de moléculas miRNA e proteína no mesmo tecido, que acreditamos que será uma ferramenta valiosa na investigação de miRNA em modelos do rato.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer Athanasios Papangelis, comentários críticos sobre o manuscrito. FM é apoiado pela biotecnologia e Conselho de pesquisa de ciências biológicas (BBSRC; BB/M009424/1). IP é suportado pela Associação coração americano cientista desenvolvimento Grant (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

Genética expressão de micro-RNA edição 139 perfilamento sonda LNA hibridação in situ immunostaining hipertrofia cardíaca
Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in <em>Situ</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter