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Genetics

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind kurz und stark homologe RNA-Sequenzen, dienen als Posttranskriptionale Regulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs). Aktuelle MiRNA Nachweismethoden unterscheiden sich in der Sensitivität und Spezifität. Wir beschreiben eine Protokoll, die in Situ Hybridisierung und Immunostaining für die gleichzeitige Erkennung von MiRNA und Protein-Moleküle auf Maus Herz Gewebeschnitte verbindet.

Abstract

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind einsträngige RNA-Transkripte, die an Messenger-RNAs (mRNAs) binden und deren Übersetzung hemmen oder fördern ihren Abbau. Bisher waren MiRNAs in eine große Anzahl von biologischen und Krankheit Verfahren verwickelt, die die Notwendigkeit für die zuverlässige Nachweismethoden MiRNA Transkripte bezeichnet hat. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Digoxigenin-markierten (DIG) gesperrt Nukleinsäure (LNA) testbasierte MiRNA-Erkennung, kombiniert mit Protein Immunostaining auf Maus Herz Abschnitte. Zunächst führten wir eine in Situ Hybridisierung-Technik mit der Sonde, um MiRNA-182 Ausdruck im Herzen Abschnitte von Kontrolle und Herzhypertrophie Mäuse zu identifizieren. Als nächstes führten wir Immunostaining für kardiale Troponin T (cTnT) Protein, auf die gleichen Abschnitte, MiRNA-182 mit den Cardiomyocyte Zellen Co zu lokalisieren. Unter Verwendung dieses Protokolls, konnten wir erkennen, dass MiRNA-182 durch eine alkalische Phosphatase farbmetrischen Assay und cTnT durch fluoreszierende Färbung basiert. Dieses Protokoll kann verwendet werden, den Ausdruck der jede MiRNA des Interesses durch LNA DIG-markierten Sonden und entsprechende Protein-Expression auf Maus Herz Gewebeschnitte erkennen.

Introduction

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind kurz (18-25 Nukleotide), einzelsträngig, Forensisches RNAs, die als negativer Regulator der Genexpression auf Posttranskriptionale Ebene funktionieren durch Hemmung der Boten-RNA (mRNA) Übersetzung und/oder Förderung der mRNA Abbau 1. MiRNAs sind transkribiert von Introns und Exons der Codierung oder Forensisches Gene und sind im Zellkern durch DROSHA, zum Vorläufer MiRNAs (Pre-MiRNAs), die kurzen Stiel-Loop-Strukturen von 70 Nukleotide2sind gespalten. Export nach zytoplasmatischen, Pre-MiRNAs weiterverarbeitet werden von DICER in Reife MiRNAs, die 18-25 Nukleotide3,4umfassen. Anschließend enthält der RNA-induced silencing-Komplex (RISC) diese MiRNAs als einsträngige RNA, die ihre Bindung an die 3' untranslatierten Region (3'-UTR) ihre Ziel-mRNAs ermöglicht, ihren Ausdruck3,5 zu unterdrücken .

In den letzten drei Jahrzehnten da sie zuerst identifiziert wurden, entstanden MiRNAs zum master Regler der Genexpression, deren eigenen Ausdruck streng kontrollierten6sind. Rollen für MiRNAs wurden im Orgel Entwicklung7,8,9,10,11,12, Aufrechterhaltung der Homöostase13,14 beschrieben. , sowie Krankheit zusammenhängen, die neurologische15,16,17,18,19, Herz-Kreislauf-20, enthalten Autoimmunerkrankung21 ,22und Krebserkrankungen23,2425. Die zunehmende Wertschätzung für die Relevanz der MiRNA Expressionsmuster hat die Notwendigkeit einer zuverlässigen Nachweisverfahren MiRNA Transkripte vorverlegt. Solche Methoden sind Real-Time PCR, Microarrays, Nordbeflecken, in Situ Hybridisierung und andere, die in die Sensitivität, Spezifität und quantitative macht überwiegend variieren die MiRNA Transkripte von kurzen bestehen und hochgradig homologe Sequenzen6.

Wir berichteten vor kurzem eine wichtige Rolle für die MiRNA-182 in der Entwicklung der myokardialen Hypertrophie26, eine Bedingung, die Beschreibung der strukturellen Anpassungdes des Herzens als Reaktion auf erhöhten hämodynamischen Anforderungen27,28. Herzhypertrophie zeichnet sich durch die Zunahme der myokardialen Masse führen, wenn im Zusammenhang mit maladaptive umgestaltet29, erhöhtes Risiko für Herzinsuffizienz, einem Anteil von 8,5 % aller Todesfälle auf Herz-Kreislauf-Zustand kann Krankheit-30.

Hier beschreiben wir unsere Protokoll, das in Situ Hybridisierung mit Digoxigenin-markierten Sonde (DIG) gesperrt Nukleinsäure (LNA) und Immunostaining für die gleichzeitige Detektion von MiRNA und Protein-Moleküle auf Maus Herz Gewebeschnitte, verbindet unsere Modell der Herzhypertrophie.

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Protocol

Maus Herz Gewebeproben für diese Studie wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und Richtlinien und wurden von Yale Universität institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösung

  1. RNase frei DdH2O vorbereiten, indem man 5 L DdH2O mit 5 mL 0,1 % Diethylpyrocarbonate (DEPC) über Nacht (O/N), bei Raumtemperatur (RT). Autoklaven (121 ° C), die DEPC zu deaktivieren. Verwendung DEPC-behandeltem DdH2O für die Vorbereitung der nachgelagerte Lösungen als angegeben.
    Achtung: DEPC ist ein bekanntes Karzinogen, nur in der Dunstabzugshaube zu behandeln.
  2. Bereiten Sie 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung durch 5 PBS-Tabletten in 1 L DEPC-behandeltem DdH2O. Autoklaven (121 ° C) auflösen.
  3. Bereiten Sie 0,1 % nicht-ionische Waschmittel/PBS (PBST vor) durch Verdünnen von 1 mL der nichtionischen Waschmittel pro 1 L 1 X PBS.
  4. Bereiten Sie 90 %, 70 %, 50 % und 30 % Ethanol in DEPC-behandeltem DdH2O.
  5. Bereiten Sie eine 10 mg/mL Stammlösung von Proteinase K (ProK) in DEPC-behandeltem DdH2O. Aliquot und Lagerung bei-20 ° C. Bereiten Sie eine 20 μg/mL funktionierende Lösung von ProK durch Verdünnung 100 μL der ProK Stammlösung in 50 mL DEPC-behandeltem DdH2O. machen vor Gebrauch frisch.
  6. Bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA vor) durch Zugabe von 2 g PFA in 50 mL 1 X PBS. Erwärmen Sie auf 65 ° C mit gelegentlichen schütteln, bis aufgelöst. Aliquoten und Store bei-20 ° C.
    Achtung: PFA ist ein bekanntes Karzinogen, nur in der Dunstabzugshaube zu behandeln.
  7. Bereiten Sie eine 3 M NaCl-Lösung durch Zugabe von 87,8 g bis 500 mL DdH2O. Autoklaven (121 ° C).
  8. Bereiten Sie eine 1 M MgCl2 Lösung durch Zugabe von 20,3 g auf 100 mL DdH2O. Autoklaven (121 ° C).
  9. Bereiten Sie 1 M Tris pH 8.0 durch auflösende 121,1 g in 800 mL DdH2O. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.0 mit ein paar Tropfen von 1 N HCl, bringen Sie das Volumen 1 L und Autoklaven (121 ° C). Bereiten Sie eine funktionierende Lösung 50 mM Tris pH 8.0 durch Verdünnung 2,5 mL 1 M Tris pH 8.0 in 47,5 mL DdH2O.
  10. Bereiten Sie 1 M Tris pH 9.5 durch auflösende 60,6 g in 400 mL DdH2O. Einstellen des pH-Werts auf 9,5 mit ein paar Tropfen von 1 N HCl, bringen Sie die Lautstärke für 500 mL und Autoklaven (121 ° C).
  11. 0,13 M 1-Methylimidazol pH 8.0 von 1,6 mL 1-Methylimidazol bis 130 mL DEPC-behandeltem DdH2O. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.0 mit rund 450 µL 12 N HCl. Hinzufügen 16 mL verdünnen von 3 M NaCl vorzubereiten und das Volumen zu 160 mL bringen. Machen Sie vor Gebrauch frisch.
    Achtung: 1-Methylimidazol ist schädlich für die Schleimhäute, Augen und Haut, nur in der Dunstabzugshaube zu behandeln.
  12. 0,16 M N--(3-Dimethylaminopropyl)-N′-Ethylcarbodiimide-Hydrochlorid (EDC) durch Verdünnung 176 µL EDC, 10 mL von 0,13 M 1-Methylimidazol vorbereiten. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.0 mit ca. 100 µL 12 N HCl. machen frische vor Gebrauch.
    Achtung: EDC ist schädlich für die Schleimhäute, Augen und Haut, nur in der Dunstabzugshaube zu behandeln.
  13. Bereiten Sie 1 % H2O2 1,5 mL 30 % H2O2 in 50 mL 1 X PBS verdünnen. Machen Sie vor Gebrauch frisch.
  14. Bereiten Sie 20 X SSC pH 7,0 durch Auflösen von 175,3 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat (Na3C6H5O7) in 800 mL DdH2O. anpassen den pH-Wert 7,0 mit ein paar Tropfen von 1 N HCl, bringen die Lautstärke auf 1 L und Autoklaven (121 ° C).
    1. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung 2 X SSC pH 7.0 durch Verdünnung 20 mL 20 X SSC pH 7.0 in 180 mL DdH2O.
    2. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung 1 X SSC pH 7.0 durch Verdünnung 2,5 mL 20 X SSC pH 7.0 in 47,5 mL DdH2O.
    3. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von 0,2 X SSC pH 7.0 durch Verdünnung 5 mL 2 X SSC pH 7.0 in 45 mL DdH2O.
  15. Bereiten Sie 1 x Hybridisierung Lösung durch Verdünnung 0,5 mL 2 X microRNA ISH Puffer in 0,5 mL DEPC-behandeltem DdH2O. machen vor Gebrauch frisch zu.
  16. 200 mM Stammlösung von Levamisol durch Zugabe von 250 mg bis 5 mL DdH2O. Aliquot Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.
  17. Schritt 5 (10 % Schafe serum/1% BSA/0,2 mM Levamisol) bereiten Sie blockiert Lösung durch Verdünnen von 1 mL der Schafe Serum in 9 mL PBST und Zugabe von 0,1 g BSA vor. Fügen Sie 10 μL Levamisol vor der Verwendung. Machen Sie vor Gebrauch frisch.
  18. Schritt 6 (10 % Ziege serum/1% BSA) bereiten Sie blockiert Lösung durch Verdünnen von 1 mL ziegenserum in 9 mL PBST und Zugabe von 0,1 g BSA vor. Bei 4 ° C lagern Sie und verwenden Sie innerhalb einer Woche.
  19. Bereiten Sie prestaining Lösung durch Verdünnung 3,3 mL 3 M NaCl, 5 mL 1 M MgCl2, 10 mL von 1 M Tris pH 9.5, 100 µL der Tween-20, 100 µL Levamisol in 81,5 mL DdH2O. machen frisch vor dem Gebrauch.
  20. Verwenden Sie Nitroblue tetrazoliumsalz (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly Phosphat (BCIP) Tabletten 20 mL Substratlösung alkalische Phosphatase (AP) nach den Anweisungen des Herstellers vorbereiten. Fügen Sie 20 μL Levamisole. Vor Gebrauch frisch machen und vor Licht schützen.
  21. Bereiten Sie KTBT Lösung durch Zugabe von 4 g Tris, 4,4 g NaCl und KCl 375 mg in 500 mL DdH2O. Autoklaven (121 ° C).
  22. Optional: Bereiten Sie eine DAPI Funktionslösung (1 μg/mL) durch Verdünnung 50 μL des DAPI-Stammlösung (1 mg/mL) in 50 mL 1 X PBS.
    Hinweis: Standard-Lösungen wie z. B. 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, Nuklease-freie DdH2O, 1 X PBS und 20 X SSC Alternativ erworben werden können. Für dieses Protokoll, Coplin Gläsern 50 mL oder 20 mL Polypropylen Folie Mailer wurden Gläser verwendet.

(2) Gewebe-Vorbereitung

Hinweis: Die Maus Herz Abschnitte hier verwendet wurden von Yale Pathologie Gewebe Services von Formalin fixiert/Paraffin-eingebetteten Gewebe vorbereitet, an 5 μm geschnitten und auf aufgeladenen Folien positioniert.

  1. Gewebe Rehydratation.
    1. Wärmen Sie die Folien bei 60 ° C für 10 min im Ofen Hybridisierung bis Paraffin sichtbar schmilzt.
    2. Inkubieren Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL handelsübliche Clearing Agent (siehe Tabelle der Materialien) für 10 min, zweimal.
    3. Inkubieren Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 100 % Ethanol für 2 min, zweimal, gefolgt von 90 % Ethanol, 2 min, 70 % Ethanol für 2 min, zweimal 50 % Ethanol für 2 min und 30 % Ethanol für 2 min.
    4. Inkubieren Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL DEPC-behandeltem DdH2O 5 min.
    5. Inkubieren Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS für 5 min.
  2. Gewebe-de-Proteinating.
    1. Inkubieren Sie Folien in einem Glas Coplin enthaltend 50 mL von 20 μg/mL ProK funktionierende Lösung, bei 37 ° C für 15 min im Ofen Hybridisierung.
      Achtung: Unzureichende Verdauung möglicherweise in schlechter oder kein Signal-Entwicklung, während übermäßige Verdauung Gewebe Abbau und Entwicklung von Hintergrundfärbung führen kann. Optimierung sein für diesen Schritt (μg 1 – 20/ProK, 5-20 min Inkubation, mL RT-37 ° C) erforderlich.
    2. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS für 5 min bei RT, zweimal.
  3. Gewebe-Fixierung.
    1. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift wasserabweisenden Kreis um das Gewebe auf jeder Folie zu zeichnen.
    2. Gelten Sie 500 µL 4 % PFA-Lösung für die Länge der einzelnen Folien und inkubieren Folien horizontal für 10 min bei RT
    3. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS für 5 min bei RT, zweimal.
    4. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 0,13 M 1-Methylimidazol für 10 min bei RT, zweimal.
    5. Gelten Sie 500 µL 0,16 M EDC-Lösung für die Länge der einzelnen Folien und inkubieren Sie Folien horizontal für 1 h bei RT in eine Feuchte Kammer.
    6. Spülen Sie die Folien in einem Glas Coplin enthaltend 50 mL 50 mM Tris pH 8.0 bei RT
    7. Spülen Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS bei RT, zweimal.
      Hinweis: Beide PFA und EDC Fixierung Schritte sind erforderlich für MiRNA Vernetzung und sollte nicht weggelassen werden. 31
  4. Endogene Peroxidase Block.
    1. Inkubieren Sie Folien in einem Glas Coplin enthaltend 50 mL von 1 % H2O2 für 30 min bei RT
    2. Spülen Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS bei RT, zweimal.

3. Hybridisierung

  1. Hybridisierung Lösung (500 µL pro Folie) bei 50 ° C in den Ofen Hybridisierung Vorheizen, bis die Zieltemperatur, (10-15 min) erreicht ist.
  2. Vorbereiten die Hybridisierung Kammer indem man 2 Stück Filter oder Seidenpapier in den Boden der Kammer und Benetzung des Papiers mit 50 % Formamid/1 X SSC.
    Achtung: Formamid ist schädlich für die Schleimhäute, Augen und Haut, nur Griff in der Dunstabzugshaube.
  3. 200 µL der Hybridisierung Lösung auf die Länge der einzelnen Folien anwenden. Inkubieren Sie Dias horizontal für 1 – 3 h bei 50 ° C, in eine Feuchte Kammer.
  4. Bereiten Sie die Sonde Lösung durch Mischen von 0,5 µL Lager Sonde (25 µM) in 250 µL Ofhybridization Lösung (Endkonzentration 50 nM) in einer 1,5 mL Tube.
    Hinweis: Verschiedene MiRNAs werden auf verschiedenen Ebenen ausgedrückt, so dass Optimierung hinsichtlich der Sonde Konzentration für diesen Schritt (1-50 nM), zu vermeiden, kein Signal oder hoher Hintergrund Entwicklung erforderlich sind.
  5. 250 µL Sonde Lösung auf die Länge der einzelnen Folien anwenden und eine RNase frei Deckglas darauf legen. Vermeidung von Blasenbildung.
  6. Sorgfältig die Hybridisierung Kammer mit Parafilm Dichtung und O/N bei 50 ° c inkubieren
    Hinweis: Die Hybridisierung Temperatur sollte ca. 30 ° C unterhalb der Schmelztemperatur RNA (Tm) von jeder Probe festgelegt werden. Optimierung kann erforderlich sein. Hier, 50 ° C dient als Hybridisierung/Waschtemperatur für MiRNA-182, entsprechend anpassen für unterschiedliche Sonden.

4. strenge wäscht

  1. Prewarm 200 mL 2 X SSC bei 50 ° C im Ofen Hybridisierung, bis die Zieltemperatur (20 – 40 min) erreicht ist.
  2. Waschen Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 2 X SSC bei 50 ° C für 5 min, oder bis die Deckgläsern lösen.
  3. Waschen Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 2 X SSC bei RT 5 min, zweimal.
  4. Waschen Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 0,2 X SSC bei RT 5 min.
  5. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL der PBST bei RT 5 min.
  6. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS bei RT 5 min.
    Hinweis: Verwendung der RNase-freie ist nicht mehr notwendig, da die RNA-RNA-Hybriden als stabil angesehen werden.

(5) Graben Sie Antikörpernachweis

  1. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift wasserabweisend Zeichnen eines Kreises um das Gewebe auf jeder Folie bei Bedarf neu.
  2. Gelten Sie 500 µL Lösung auf die Länge der einzelnen Folien zu blockieren. Inkubieren Sie Dias horizontal für 30 min bei RT in eine Feuchte Kammer.
  3. Bereiten Sie die DIG-Antikörper-Lösung (1:1 000) durch Verdünnung 0,5 μL der DIG-Antikörper in 500 µL Ofblocking Lösung in einem 1,5 mL-Tube.
    Vorsicht: Optimierung kann für diesen Schritt erforderlich sein (1: 500 – 1:2, 000).
  4. Die Länge der einzelnen Folien 500 µL DIG Antikörperlösung zuweisen. Inkubieren Sie Dias horizontal für 1 h bei RT in eine Feuchte Kammer.
  5. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL der PBST bei RT 5 min dreimal.
  6. Waschen Sie die Folien in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL der Lösung bei RT 5 min, zweimal prestaining.
  7. Inkubieren Sie Folien in einem Polypropylen Folie Mailer JAR-Datei mit 20 mL OfAP Substrat-Lösung bei 37 ° C für 6 – 24 h, vor Licht geschützt werden.
    Achtung: Farbentwicklung sollte überprüft werden, dass jeder 2 h. Optimierung für diesen Schritt erforderlich sind.
  8. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL KTBT Lösung bei RT 5 min, zweimal.
  9. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS bei RT 5 min.

(6) cTnT Antikörpernachweis

  1. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift wasserabweisend Zeichnen eines Kreises um das Gewebe auf jeder Folie bei Bedarf neu.
  2. Gelten Sie 500 µL Lösung auf die Länge der einzelnen Folien zu blockieren. Inkubieren Sie Dias horizontal für 1 h bei RT in eine Feuchte Kammer.
  3. Bereiten Sie die cTnT Antikörperlösung (1: 100) durch Verdünnung 2 μL cTnT Antikörper in 200 μL Ofblocking Lösung in einem 1,5 mL-Tube.
  4. Die Länge der einzelnen Folien 200 µL cTnT Antikörperlösung zuweisen. Inkubieren Sie Folien horizontal O/N bei 4 ° C in eine Feuchte Kammer.
  5. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS bei RT 5 min dreimal.
  6. Bereiten Sie die rabbit-568 Antikörperlösung (1: 500) durch Verdünnung 0,5 μL der rabbit-568-Antikörper in 250 μL Ofblocking Lösung in einem 1,5 mL-Tube.
  7. Die Länge der einzelnen Folien 250 µL rabbit-568 Antikörperlösung zuweisen. Inkubieren Sie Dias horizontal für 1 h bei RT in eine Feuchte Kammer.
  8. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS bei RT 5 min dreimal.
  9. Optional: Wenden Sie 250 µL Arbeitslösung DAPI auf die Länge der einzelnen Folien an und inkubieren Sie Folien horizontal für 1 min bei RT, vor Licht geschützt werden.
  10. Waschen Sie der Objektträger in einem Glas, Coplin, enthält 50 mL 1 X PBS bei RT 5 min, zweimal.

7. Montage und Imaging

  1. Montieren Sie die Folien mit 2 – 3 Tropfen Eindeckmittel und einem Glas Deckglas. Lassen Sie die Folien flach, O/N, bei 4 ° C, vor Licht geschützt trocknen.
  2. Fahren Sie mit Epifluorescent oder der konfokalen Mikroskopie.

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Representative Results

MiRNA in Situ Hybridisierung wurde auf Maus Herz Abschnitte mit einem Gerangel MiRNA und U6-SnRNA, diente als negativ-und Positivkontrollen bzw. optimiert. Positive Färbung wird angegeben in blau, während die negative Färbung durch die fehlende Farbentwicklung angezeigt wird (Abbildung 1A-1 b). Cardiomyocyte Konkretisierung der MiRNA-182 wurde abschnittsweise Herz von Kontrolle und PlGF überexprimierenden Mäusen bewertet. Die Mäuse tragen PlGF Transgens unter αMHC Förderer entwickeln Herzhypertrophie, sekundär zu mehr Angiogenese, innerhalb von 6 Wochen des Transgens Aktivierung26. Wir in Situ Hybridisierung durchgeführt und fanden erhöhte Expression von MiRNA-182 in den Herzen der PlGF Mäuse, im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 2A2 H), wird durch die blaue Färbung. Um festzustellen, welche Zelltypen MiRNA-182 auszudrücken, haben wir dann Immunostaining für cTnT auf den gleichen Abschnitten durchgeführt. Wir fanden gemeinsam mit den Cardiomyocyte cTnT-positiven Zellen lokalisiert MiRNA-182 sowie DAPI gefärbt Kerne, Kontrolle und PlGF Maus Herz Abschnitte (Abbildung 22 H), von den roten und blauen Färbung bzw. angegeben. Diese Bilder wurden mit einem 20 X Objektiv.

Figure 1
Abbildung 1: Negative und Positive in Situ Hybridisierung Beflecken. (A) In Situ Hybridisierung für Gerangel MiRNA (25 nM) Herz abschnittsweise Kontrolle Maus. (B) In Situ Hybridisierung für U6-SnRNA (25 nM) Herz abschnittsweise Kontrolle Maus. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Cardiomyocyte Konkretisierung der MiRNA-182 in Kontrolle und PlGF Mäuseherzen. (A-B) In Situ Hybridisierung für MiRNA-182 in Kontrolle und PlGF Maus Herz Abschnitte. (C-D) Immunostaining für cTnT in Kontrolle und PlGF Maus Herz Abschnitte, die zuvor für MiRNA-182 befleckt worden. (E-F) DAPI gegenfärbung für die nukleare Lokalisierung in Kontrolle und PlGF Maus Herz Abschnitte, die zuvor für MiRNA-182 befleckt worden. (G-H) Zusammengeführte Bilder von MiRNA-182 (tiefblau), cTnT (rot) und DAPI (hellblau) für die Steuerung und PlGF Maus Herz Abschnitte Färbung. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

MiRNA-Transkript-Erkennung kann durch verschiedene Techniken erreicht werden, die in Sensitivität, Spezifität und quantitative Leistung variieren. Hier zeigen wir die Kopplung von MiRNA in Situ Hybridisierung mit Immunostaining und ein Protokoll, das ermöglicht eine gleichzeitige Beurteilung der Ausdruck Niveaus von MiRNA und Protein-Moleküle, auf die gleichen Herzen Abschnitte beschreiben. Wir zeigen zunächst wie in Situ Hybridisierung von DIG-Label LNA MiRNA Sonden auf Paraffin eingebettet Herz Abschnitten durchgeführt. Anschließend beschreiben wir wie Immunostaining für cTnT auf den gleichen Abschnitten durchgeführt. Schließlich führen wir die resultierende Farbe und Fluoreszenz Bilder verschmelzen. Dieses Protokoll wurde optimiert für feste Formalin (4 ° C, O/N) / Paraffin eingebetteten Maus Herz Gewebe, mit dem Einsatz von DIG-Label LNA MiRNA Sonden und cTnT. Eine weitere Optimierung für verschiedene Gewebe erforderlich sein kann, Sonde oder Antikörper-Typen, wie unten beschrieben.

RNase-freie Bedingungen sollten sorgfältig in die Schritte umgesetzt werden, die Sie bringen, Hybridisierung, Sonde wie RNase Kontamination das Ergebnis des Experiments erheblich beeinträchtigen kann. Alle Lösungen mit DEPC-behandeltem DdH2O erfolgen sollte, und alle Coplin Gläser mit einer RNase Dekontaminationslösung behandelt werden sollte. Darüber hinaus sollten folgende Aspekte berücksichtigt werden, bei der Arbeit mit verschiedenen DIG-Label LNA MiRNA Sonden. Die Hybridisierung Temperatur richtet sich nach der Schmelztemperatur (Tm) von jeder Probe. Als allgemeine Regel sollte eine Temperatur 30 ° C unter der gegebenen RNA Tm oder 20 ° C unter der gegebenen DNA Tm für die Sonde Hybridisierung verwendet werden. Darüber hinaus sollte die ideale Sonde Konzentration optimiert werden. Es liegt in der Regel zwischen 1 – 50 nM. Zu guter Letzt kann die Sonde mit Hybridisierung Lösung auf 95 ° C für 5 min um alle Sekundärstrukturen denaturieren geheizt werden, wenn dies nicht gewünscht ist. Ein wichtiger Schritt um die Besonderheit einer Sonde zu testen ist vor allem, wenn zum ersten Mal verwendet eine negative (Rührei) sowie als positive (z. B. U6) Kontrolle Sonde, für experimentelle Erfolg (Abbildung 2) enthalten. Ähnliche Steuerelemente (z. B. ein CD31 endotheliale Antikörper) sollte während der Immunostaining Schritt verwendet werden.

Ein häufiges Problem in Situ Hybridisierung Experimente ist die Entwicklung der Färbung Artefakt/Hintergrundsignal. Zu vermeiden oder zu minimieren Artefakt Färbung Schritte, sollte das Gewebe vor dem Austrocknen während aller Schritte, insbesondere bei langen Inkubationen geschützt werden. Es wird empfohlen, auf die Folien mit RNase-freie Deckgläsern während der Hybridisierung Schritt, besonders bei hohe Temperaturen eingesetzt werden, und die Verwendung der Befeuchtung Kammern. Wir empfehlen außerdem die Verwendung von 568 oder 594 Fluorophor cTnT zu erkennen oder das Protein des Interesses während der Immunostaining Schritt. Dies verhindert jede Autofluoreszenz, die oft mit dem Einsatz von 488 Fluorophore auf Formaldehyd festen Geweben verwendet entsteht.

Eine weitere Variable empfehlen wir Aufmerksamkeit auf ist die Dauer der AP Färbung Entwicklung, die abhängig von den Ebenen der spezifischen MiRNA im Gewebe vorhanden. Wir vorschlagen, Check-AP Färbung Fortschreiten alle 2 h für das erste Experiment. Eine weitere Optimierung umfassen Änderung der Temperatur der Inkubation (RT-37 ° C) Parameter. Zu guter Letzt empfehlen Hintergrund beginnt, bevor die wahre MiRNA Sonde Färbung zu entwickeln, ob die AP Färbelösung zu blau-braun verfärbt, wir die Folien in PBST zweimal waschen und ersetzen die Färbelösung mit einem frisch zubereiteten.

Schließlich, obwohl dieses Protokoll für Formalin fixiert/Paraffin-eingebetteten Maus Herz Gewebe optimiert wurde, kann es alternativ verarbeitete Gewebe (PFA behoben/OCT eingebettet) und/oder die Nutzung der verschiedenen Sonde oder Antikörper angepasst. Eine Einschränkung der Kombination von in Situ Hybridisierung und Immunostaining, die berücksichtigt werden sollten ist das Versagen der mehrere Antikörper binden an ihre jeweiligen Epitope, aufgrund der möglichen Zerstörung der letztere bei den hohen Temperaturen während die Hybridisierung und Stringenz Waschschritte. Weitere Einschränkungen der in Situ Hybridisierung und Immunostaining Techniken beziehen sich meist auf die Kraft dieser Techniken, bzw. sehr niedrigen Konzentrationen von MiRNA oder Protein-Moleküle zu erkennen. Signal-Verstärkung-Kits sind erhältlich für DIG oder Antikörper-Erkennung verwenden, wenn MiRNA oder Protein Fülle ein Anliegen ist. Solche Sets sind auch eine Fluoreszenz-Alternative für die Erkennung von MiRNAs, die, gekoppelt mit fluoreszierenden Immunostaining Bildaufnahme vereinfachen können. Alternative Methoden, wie Real-Time PCR und Western Blotting, die größere Empfindlichkeit können auch niedrige Fülle Probleme anzugehen. Jedoch im Gegensatz zu in Situ Hybridisierung/Immunostaining Protokoll geben diese Techniken keine Auskunft auf die gewebespezifischen Lokalisierung der MiRNA-Eiweiß-Moleküle.

Zusammenfassend lässt sich sagen, beschreiben wir eine Protokoll, das simultane Detektion von MiRNA und Protein-Moleküle auf der gleichen Gewebe bietet die unserer Meinung nach wird ein wertvolles Instrument in der MiRNA Forschung auf Maus-Modellen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir möchten Danke Athanasios Papangelis für kritische Anmerkungen zum Manuskript. FM wird unterstützt von der Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP wird von der American Heart Association Wissenschaftler Development Grant (17SDG33060002) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

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References

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Genetik Ausgabe 139 Mikro-RNA Expressions-profiling LNA-Sonde in Situ Hybridisierung Immunostaining Herzhypertrophie
Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte <em>In Situ</em> Hybridisierung
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Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

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