Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

микро РНК (интерферирующим) являются короткие и очень гомологичных последовательности РНК, выступающей в качестве post-transcriptional регуляторы messenger РНК (мРНК). Текущие методы обнаружения Мирна различаются по чувствительности и специфичности. Мы описываем протокол, который сочетает в себе в situ Гибридизация и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши.

Abstract

микро РНК (интерферирующим) являются одноцепочечной РНК стенограмм, которые привязку к messenger РНК (мРНК) и препятствовать их перевода или содействовать их деградации. На сегодняшний день, адаптивной были причастны большое количество болезней и биологических процессов, который означало необходимость надежного обнаружения методов Мирна стенограмм. Здесь мы описываем подробный протокол для digoxigenin меченых (DIG) Locked нуклеиновой кислоты (LNA) на основе выборки Мирна обнаружения, в сочетании с иммуноокрашивания белка на мыши сердце секций. Во-первых мы провели в situ гибридизация технику с помощью зонда для определения Мирна-182 выражение в разделах сердца от управления и гипертрофии сердца мышей. Далее мы провели иммуноокрашивания для сердца тропонина T (cTnT) белка, на те же разделы, совместно локализовать Мирна-182 с клетки cardiomyocyte. Используя этот протокол, мы смогли обнаружить основанный Мирна-182 через щелочной фосфатазы колориметрические пробирного и cTnT через флуоресцентной окраски. Этот протокол может использоваться для обнаружения выражение любого Мирна интерес через DIG-меченых LNA зонды и соответствующих белков на разделах ткани сердца мыши.

Introduction

микро РНК (интерферирующим) являются короткие (18-25 нуклеотидов), одноцепочечной, некодирующей РНК, которые функционируют как негативные регуляторы экспрессии генов на post-transcriptional уровне путем ингибирования матричная РНК (мРНК) перевод и/или содействия деградации мРНК 1. интерферирующим расшифрованный от интронов или экзонов кодирования или некодирующей генов и являются расщепляется в ядре, DROSHA, чтобы прекурсоров интерферирующим (pre адаптивной), которые являются короткий стебель циклические структуры 70 нуклеотидов2. После цитоплазматических экспорта, pre адаптивной Далее перерабатывается DICER в зрелых адаптивной, которые охватывают 18-25 нуклеотидов3,4. Впоследствии РНК-комплекс (RISC) включает в себя эти интерферирующим как одноцепочечной РНК, которая позволяет для их привязки к 3' непереведенные региона (3'-УТР) их целевых мРНК подавить их выражение3,5 .

В течение последних трех десятилетий так как они впервые были определены, адаптивной появились мастер регуляторы экспрессии генов, чьи собственные уровни выражения являются жестко контролируемой6. Роли для адаптивной были описаны в орган развития7,8,9,10,11,12, поддержание гомеостаза13,14 , а также болезни контексты, которые включают неврологические15,16,,1718,19, сердечно-20, аутоиммунных условия21 ,22, рака23,24и другие25. Увеличение признательность за актуальность структур Мирна выражение выдвинули необходимость надежного обнаружения методов Мирна стенограмм. Такие методы включают реальном масштабе времени PCR, microarrays, Северный Blotting, в situ Гибридизация и другие, которые различаются в чувствительность, специфичность и количественные власти, преимущественно с тем, что Мирна стенограммы состоят из коротких и 6высоко гомологичных последовательности.

Недавно мы сообщили важную роль для Мирна-182 в развитие гипертрофии миокарда26, условие, описывая структурной адаптации сердца в ответ на повышенный гемодинамики требования27,28. Гипертрофии сердца характерно увеличение массы миокарда, который, если связанные с неадаптивные ремоделирования29, может привести к повышенному риску развития сердечной недостаточности, условие, приходится 8,5% всех смертей объясняется сердечно-сосудистой системы болезни30.

Здесь мы описываем наш протокол, который сочетает в себе в situ гибридизация с надписью digoxigenin (DIG) Locked нуклеиновой кислоты (LNA) зонд и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши, в нашем модель гипертрофии сердца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Образцы тканей сердца мыши для этого исследования были получены согласно соответствующим законам и институциональных руководящих принципов и были одобрены Йельского университета институциональных животное уход и использование Комитета.

1. решение подготовка

  1. Подготовить РНКазы бесплатно ddH2O, рассматривая ddH2O 5 Л с 5 мл 0,1% Диэтилпирокарбонат (DEPC) ночь (O/N), при комнатной температуре (RT). Автоклав (121 ° C) для отключения DEPC. Использование DEPC-лечение ddH2O для подготовки течению решений, как указано.
    Предупреждение: DEPC является известный канцероген, обрабатывать только в зонта.
  2. Подготовка 1 x фосфат буфер солевой (PBS) раствора растворяют 5 таблеток PBS в 1 Л DEPC-лечение ddH2O. автоклав (121 ° C).
  3. Подготовьте 0,1% неионные моющего средства/PBS (PBST) путем разбавления 1 мл неионных стирального порошка на 1 Л ПБС.
  4. Подготовить 90%, 70%, 50% и 30% этанола в DEPC-лечение ddH2O.
  5. Подготовка 10 мг/мл Стоковый раствор протеиназы K (прок) в DEPC-лечение ddH2O. Алиготе и хранить при температуре от-20 ° C. Подготовьте 20 мкг/мл рабочего раствора прок путем разбавления 100 мкл прок Стоковый раствор в 50 мл DEPC-лечение ddH2O. Make свежий перед использованием.
  6. Подготовьте параформальдегида 4% (PFA), добавив 2 g ПФА в 50 мл ПБС. Тепло при 65 ° C с периодически встряхивая, пока растворится. Алиготе и хранить при температуре от-20 ° C.
    Предупреждение: PFA является известный канцероген, обрабатывать только в зонта.
  7. Приготовляют раствор NaCl 3 M, добавив 87,8 g 500 мл ddH2O. автоклав (121 ° C).
  8. Приготовляют раствор2 MgCl 1 М, добавив 20.3 g 100 мл ddH2O. автоклав (121 ° C).
  9. Подготовка 1 М трис рН 8.0 путем растворения 121.1 g в 800 мл ddH2O. Adjust pH 8.0 с несколько капель 1 N HCl, доводят объем до 1 Л и автоклав (121 ° C). Подготовить рабочий раствор 50 мм трис рН 8.0 путем разбавления 2,5 мл 1 М трис рН 8,0 в 47,5 мл ddH2O.
  10. Подготовка 1 М трис рН 9,5 путем растворения 60,6 g в 400 мл ddH2O. Регулировка рН 9,5 с несколько капель 1 N HCl, доводят объем до 500 мл и автоклав (121 ° C).
  11. Подготовка 1-метил 0.13 М рН 8.0 путем разбавления 1,6 мл 1-метил до 130 мл DEPC-лечение ddH2O. Adjust pH 8.0 с приблизительно 450 мкл 12 N HCl. Добавить 16 мл 3 М NaCl и доводят объем до 160 мл. Сделайте свежий перед использованием.
    Предупреждение: 1-метил вредно слизистых оболочек, глаз и кожи, обрабатывать только в зонта.
  12. Подготовьте 0,16 М N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide гидрохлорид (EDC) путем разбавления 176 мкл EDC до 10 мл 0.13 М 1-метил. Отрегулируйте пэ-аш до 8.0 с приблизительно 100 мкл 12 N HCl. сделать свежий перед использованием.
    Предупреждение: EDC вредно слизистых оболочек, глаз и кожи, обрабатывать только в зонта.
  13. Подготовка 1% H2O2 путем разбавления 1,5 мл 30% H2O2 в 50 мл ПБС. Сделайте свежий перед использованием.
  14. Подготовить 20 x SSC pH 7.0 путем растворения 175.3 г NaCl и 88.2 g цитрата натрия (Na3C6H5O7) в 800 мл ddH2O. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с несколько капель 1 N HCl, доводят объем до 1 Л и автоклав (121 ° C).
    1. Приготовить рабочий раствор 2 x SSC рН 7.0 путем разбавления 20 мл 20 x SSC pH 7.0 в 180 мл ddH2O.
    2. Приготовить рабочий раствор 1 x SSC рН 7.0 путем разбавления 2,5 мл 20 x SSC pH 7.0 в 47,5 мл ddH2O.
    3. Приготовить рабочий раствор 0,2 x SSC рН 7.0 путем разбавления 5 мл 2 x SSC pH 7.0 в 45 мл ddH2O.
  15. Подготовка 1 x гибридизации решение путем разбавления 0,5 мл 2 x microRNA иш буфера в 0,5 мл DEPC-лечение ddH2O. Make свежий перед использованием.
  16. Подготовка 200 мм Стоковый раствор левамизол, добавив 250 мг в 5 мл ddH2O. Алиготе и хранить при температуре от-20 ° C.
  17. Приготовляют раствор блокировки для шага 5 (10% овец serum/1% BSA/0,2 мм левамизол) путем разбавления 1 мл сыворотки овец в 9 мл PBST и добавление 0,1 г BSA. Добавьте 10 мкл левамизол перед использованием. Сделайте свежий перед использованием.
  18. Готовят раствор блокировки для шага 6 (10% козье serum/1% BSA) путем разбавления 1 мл сыворотки Коза в 9 мл PBST и добавление 0,1 г BSA. Хранить при 4 ° C и использовать в течение недели.
  19. Подготовка prestaining решения путем разбавления 3,3 мл 3 M NaCl, 5 мл 1 М MgCl2, 10 мл 1 М трис рН 9,5, 100 мкл Tween-20, 100 мкл левамизол 81,5 мл ddH2O. Make свежий перед употреблением.
  20. Использование nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly фосфат (ПКВП) таблетки подготовить 20 мл раствора субстрата щелочной фосфатазы (AP) согласно инструкциям производителя. Добавьте 20 мкл Левамизол. Сделать свежий перед использованием и защищать от света.
  21. Готовят раствор KTBT путем добавления 4 g трис, 4,4 г NaCl и 375 мг в 500 мл ddH2O. автоклав (121 ° C) хлористого калия.
  22. Дополнительно: Подготовьте DAPI рабочего раствора (1 мкг/мл) путем разбавления 50 мкл DAPI Стоковый раствор (1 мг/мл) в 50 мл ПБС.
    Примечание: Стандартные решения, например 3 M NaCl, MgCl 1 M2, 1 М трис-HCl, свободной от нуклеиназы ddH2O, ПБС и 20 x SSC можно также приобрести. Для настоящего Протокола, Coplin стеклянных банках емкостью 50 мл и 20 мл полипропиленовые слайд Мейлер банки были использованы.

2. ткань подготовка

Примечание: В разделах сердце мыши, используемый здесь были подготовлены Йельского патологии ткани услуг, от формалин-Исправлена/парафин врезанных тканей, разрезать на 5 мкм и позиционируется на заряженных слайды.

  1. Ткани для регидратации.
    1. Теплый слайды на 60 ° C в течение 10 мин, в печь гибридизации пока заметно плавления парафина.
    2. Инкубируйте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл коммерчески доступных таможенного агента (см. Таблицу материалы) за 10 мин, дважды.
    3. Инкубируйте слайды в стеклянной банке Coplin содержащие 50 мл 100% этанола за 2 мин, дважды, а затем 90% этанола за 2 мин, этанол 70% за 2 мин, дважды, 50% этанола на 2 мин и 30% этанола на 2 мин.
    4. Инкубируйте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл DEPC-лечение ddH2O 5 мин.
    5. Инкубируйте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл ПБС втечение 5 мин.
  2. Ткани де proteinating.
    1. Инкубируйте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 20 мкг/мл прок рабочего раствора, при 37 ° C 15 минут в духовке гибридизации.
      Предупреждение: Заместитель пищеварение может привести к бедным или нет сигнала развития, в то время как чрезмерная пищеварение может привести к деградации ткани и развития окрашивания фона. Оптимизация может потребоваться для этого шага (1-20 мкг/мл прок, 5-20 минут инкубации, RT-37 ° C).
    2. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл ПБС за 5 мин., на RT, дважды.
  3. Фиксация ткани.
    1. Используйте гидрофобные перо для рисования водоотталкивающая круг вокруг ткани на каждом слайде.
    2. Применить 500 мкл раствора PFA 4% к длине каждого слайда и инкубировать слайды по горизонтали за 10 мин., на RT.
    3. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл ПБС за 5 мин., на RT, дважды.
    4. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 0.13 М 1-метил за 10 мин., на RT, дважды.
    5. Применить 500 мкл раствора EDC 0,16 М по длине каждого слайда и инкубировать слайды по горизонтали за 1 час на RT, в камере увлажненной.
    6. Промойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 50 мм трис рН 8,0 на RT.
    7. Промойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 1 x PBS на RT, дважды.
      Примечание: Как PFA и EDC фиксации шаги требуются для сшивки Мирна и не должна быть пропущена. 31
  4. Блок эндогенной пероксидазы.
    1. Инкубируйте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащие 50 мл 1% H2O2 за 30 минут на RT.
    2. Промойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 1 x PBS на RT, дважды.

3. Гибридизация

  1. Разогрейте гибридизации раствор (500 мкл каждого слайда) при 50 ° C в печь гибридизации, до заданной температуры, достигается (10-15 мин).
  2. Подготовить камеру гибридизации, поместив 2 шт фильтр или папиросной бумаги в нижней части камеры и увлажнения бумаги с 50% формамида/1 x SSC.
    Предупреждение: Формамид вредных слизистых оболочек, глаз и кожи, только ручка зонта.
  3. Применить 200 мкл раствора гибридизации к длине каждого слайда. Инкубируйте слайды по горизонтали для 1-3 ч при 50 ° C, в камере увлажненной.
  4. Приготовляют раствор зонд, смешивая 0.5 мкл запасов зонд (25 мкм) в 250 мкл ofhybridization раствора (конечная концентрация 50 Нм) в 1,5 мл.
    Примечание: Различные интерферирующим выражаются на различных уровнях, поэтому оптимизация относительно концентрации зонд может потребоваться для этого шага (1 – 50 Нм) избежать нет сигнала или высокая предпосылка развития.
  5. Применить 250 мкл раствора зонд к длине каждого слайда и место РНКазы бесплатно coverslip на вершине. Избегайте образования пузырьков.
  6. Тщательно уплотнение камеры гибридизации с парафина и Инкубируйте O/N на 50 ° C.
    Примечание: Гибридизации температуры следует установить около 30 ° C ниже температуры плавления РНК (Tm) каждого зонда. Может потребоваться оптимизация. Здесь, 50 ° C используется как гибридизации/температуру для Мирна-182, скорректировать для различных датчиков.

4. жесткости смывки

  1. Prewarm 200 мл 2 x SSC при 50 ° C в печь гибридизации, до достижения заданной температуры (20 – 40 мин.).
  2. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 2 x SSC при 50 ° C за 5 мин, или до тех пор, пока coverslips ослабить.
  3. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 2 x SSC на RT на 5 мин, дважды.
  4. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 0,2 x SSC на RT на 5 мин.
  5. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл PBST на RT на 5 мин.
  6. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 1 x PBS на RT на 5 мин.
    Примечание: Использование РНКазы свободных условий необходимо больше не так как РНК-RNA гибридов считаются стабильной.

5. КОПАТЬ обнаружение антител

  1. Используйте гидрофобные перо нарисовать заново водоотталкивающая круг вокруг ткани на каждом слайде при необходимости.
  2. Примените 500 мкл преграждая разрешение на длину каждого слайда. Инкубируйте слайды по горизонтали для 30 мин на RT, в камере увлажненной.
  3. Подготовьте раствор антител КОПАТЬ (1:1, 000) путем разбавления 0.5 мкл антител КОПАТЬ в 500 мкл раствора ofblocking в 1,5 мл.
    Предупреждение: Оптимизация может потребоваться для этого шага (1: 500 – 1:2, 000).
  4. Применить 500 мкл раствора DIG антитела к длине каждого слайда. Инкубируйте слайды по горизонтали за 1 час на RT, в камере увлажненной.
  5. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл PBST на RT на 5 мин, трижды.
  6. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл prestaining раствора на RT на 5 мин, дважды.
  7. Инкубируйте слайды в банку почтовой полипропиленовые слайд, содержащий 20 мл ofAP раствора субстрата при 37 ° C, 6-24 ч, защищенном от света.
    Внимание: Цвет развития должны быть проверены, что каждые 2 ч. Оптимизация может потребоваться для этого шага.
  8. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащие 50 мл KTBT раствора на RT на 5 мин, дважды.
  9. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 1 x PBS на RT на 5 мин.

6. cTnT обнаружения антител

  1. Используйте гидрофобные перо нарисовать заново водоотталкивающая круг вокруг ткани на каждом слайде при необходимости.
  2. Примените 500 мкл преграждая разрешение на длину каждого слайда. Инкубируйте слайды по горизонтали за 1 час на RT, в камере увлажненной.
  3. Подготовьте раствор антител cTnT (1: 100) путем разбавления 2 мкл антител cTnT в 200 мкл раствора ofblocking в 1,5 мл.
  4. Применить 200 мкл раствора cTnT антитела к длине каждого слайда. Инкубируйте слайды по горизонтали O/N на 4 ° C, в камере увлажненной.
  5. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащие 50 мл 1 x PBS на RT на 5 мин, трижды.
  6. Подготовьте раствор антител rabbit-568 (1: 500) путем разбавления 0.5 мкл антител rabbit-568 в 250 мкл раствора ofblocking в 1,5 мл.
  7. Применить 250 мкл раствора rabbit-568 антитела к длине каждого слайда. Инкубируйте слайды по горизонтали за 1 час на RT, в камере увлажненной.
  8. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащие 50 мл 1 x PBS на RT на 5 мин, трижды.
  9. Необязательно: Применить 250 мкл рабочего раствора DAPI к длине каждого слайда и инкубировать слайды по горизонтали за 1 мин на RT, защищенном от света.
  10. Вымойте слайды в стеклянной банке Coplin, содержащих 50 мл 1 x PBS на RT на 5 мин, дважды.

7. Монтаж и обработка изображений

  1. Смонтируйте слайды с 2 – 3 капли монтажа средних и стекла Крышка выскальзования. Разрешить слайды для сушка на плоской поверхности, O/N, при 4 ° C, защищать от света.
  2. Перейти к epifluorescent или confocal микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

микроРНК в situ гибридизация была оптимизирована на мыши сердце разделов с помощью схватка Мирна и U6-мяРНК, который служил в качестве отрицательных и положительных элементов, соответственно. Положительный пятнать указывается в синий, в то время как негативные пятнать обозначается на отсутствие развития цвета (рис. 1A-1В). Конкретное выражение cardiomyocyte Мирна-182 оценивалась в разделах сердца от управления и PlGF избытком мышей. Мышей, перевозящих трансген PlGF под αMHC промоутер развитие гипертрофии сердца, среднее увеличение ангиогенеза, в течение 6 недель трансген активации26. Мы выступали в situ Гибридизация и обнаружили увеличение выражение Мирна-182 в сердцах PlGF мышей, по сравнению с элементами управления (рисунок 2A-2 H), обозначенный голубой окраски. Чтобы определить, какие типы клеток выразить Мирна-182, мы затем выполняются иммуноокрашивания для cTnT на те же разделы. Мы обнаружили микроРНК-182 совместно локализованы с клетки cardiomyocyte cTnT положительных, а также DAPI окрашенных ядер, как управления, так и PlGF мыши сердце секции (рис. 2 c-2 H), обозначенный красного и синего окрашивания соответственно. Эти изображения были с 20 X цели.

Figure 1
Рисунок 1: Отрицательный и положительный в situ гибридизация пятнать. (A) в situ гибридизация для схватка микроРНК (25 Нм) в разделах сердце мышь контроля. (B) в situ гибридизация для U6-мяРНК (25 Нм) в разделах сердце мышь контроля. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: конкретное выражение Cardiomyocyte Мирна-182 в управления и сердца мыши PlGF. (A-B) В situ гибридизация для Мирна-182 в управления и PlGF мыши сердце секций. (C-D) Иммуноокрашивания для cTnT управления и PlGF мыши сердце секции, которые были ранее окрашенных для Мирна-182. (E-F) DAPI counterstaining ядерной локализации в области контроля и PlGF мыши сердце разделы, которые были ранее окрашенных для Мирна-182. (G-H) Объединенного изображения Мирна-182 (синий), cTnT (красный) и DAPI (светло-голубой) пятная для управления и PlGF мыши сердце секций. Шкалы бар = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мирна Стенограмма обнаружения может быть достигнуто через различные методы, которые варьируются в чувствительность, специфичность и количественные власти. Здесь, мы демонстрируем муфта микроРНК в situ гибридизация с иммуноокрашивания и описать протокол, который позволяет для параллельной оценки уровней выражение Мирна и белковых молекул, на те же разделы сердца. Сначала мы покажем, как выполнять в situ Гибридизация зондов Мирна DIG-меченых LNA на разделы парафина встроенных сердца. Далее мы опишем, как для выполнения иммуноокрашивания cTnT на те же разделы. Наконец мы продемонстрируем объединить результирующий цвет и флуоресцентных изображений. Этот протокол был оптимизирован для фиксированной формалина (4 ° C, O/N) / парафин врезанных тканей сердца мыши, с использованием зондов Мирна DIG-меченых LNA и cTnT. Дальнейшая оптимизация может потребоваться для различных тканей, зонд или типы антител, как указано ниже.

Бесплатные РНКазы условия должны осуществляться тщательно во всех шагах, которые доводят до зонд гибридизации, как загрязнение РНКазы сильно может поставить под угрозу результаты эксперимента. Все решения должны быть сделаны с DEPC-лечение ddH2O, и все Coplin банки должны рассматриваться с решением РНКазы обеззараживания. Кроме того следующие соображения должны учитываться при работе с различными зондами Мирна DIG-меченых LNA. Гибридизация температура зависит от температуры плавления (Tm) каждого зонда. Как правило температура, которая составляет 30 ° C ниже заданной ТМ РНК или 20 ° C ниже заданной ТМ ДНК должны использоваться для гибридизации зонда. Кроме того концентрация идеальный зонд должен быть оптимизирован. Он обычно находится между 1-50 Нм. Наконец содержащие решение гибридизации зонда может быть нагрета до 95 ° C за 5 мин до денатурировать любых вторичных структур, если это беспокойство. Важным шагом для тестирования специфика зонд, особенно когда используется для в первый раз, является включение отрицательный (платные) также как положительные (например U6) управления зондом, для обеспечения успеха экспериментального (рис. 2). Подобный контроль (например CD31 эндотелиальная антитела) должны использоваться на этапе иммуноокрашивания.

Общей проблемой в situ гибридизация экспериментов является развитие пятнать артефакт/фонового сигнала. Чтобы избежать или свести к минимуму артефакт, окрашивание шаги, ткани должны быть защищены от высыхания на всех этапах, особенно во время долгого инкубаций. Мы рекомендуем, охватывающий слайды с РНКазы бесплатная coverslips в гибридизации шаг, особенно при высоких температурах, а также использование увлажнения камер. Мы также предлагаем использование 568 или 594 Флюорофор для обнаружения cTnT или протеина интереса на этапе иммуноокрашивания. Это позволит устранить любые аутофлюоресценция, который часто возникает с использованием 488 флуорофоров, используемых на формальдегид фиксированной тканей.

Другая переменная, которую мы рекомендуем, обращая внимание является продолжительность AP, окрашивание развития, который зависит от уровня конкретных Мирна, присутствующих в ткани. Мы предлагаем проверку AP окрашивание прогрессии каждые 2 ч, для первого эксперимента. Дальнейшая оптимизация может включать изменение температуры инкубации (RT-37 ° C) параметра. Наконец если фон начинает развиваться до окрашивания зонд истинный Мирна, или если AP, окрашивание раствора меняет цвет голубой-коричневый, мы предлагаем мытья слайды в PBST дважды и замену окрашивание раствора с свежезаваренным сделал.

Наконец хотя этот протокол был оптимизирован для тканей сердца формалин-Исправлена/парафин врезанных мыши, он может быть адаптирована в качестве альтернативы переработанных тканей (PFA фиксированной/OCT встроенный) и/или использование различных типов зонд или антитела. Ограничение объединения в situ Гибридизация и иммуноокрашивания, которые должны быть рассмотрены является неспособность несколько антител для привязки к их соответствующих epitopes, из-за возможного уничтожения последних при высоких температурах, используемый во время Гибридизация и жесткости, мытье шаги. Дальнейшие ограничения в situ Гибридизация и иммуноокрашивания методы чаще всего относятся к власти этих методов, чтобы обнаружить очень низкие концентрации молекул белка или Мирна соответственно. Наборы для усиления сигнала можно использовать для обнаружения антител или КОПАТЬ когда Мирна или белка изобилия является проблемой. Такие комплекты также являются альтернативой флуоресценции для обнаружения адаптивной, который, в сочетании с флуоресцентной иммуноокрашивания можно упростить получение изображения. Альтернативные методы, такие как Real-Time PCR и западный Blotting, имеют большую чувствительность, может также вопросы низкой изобилия. Однако вопреки в situ гибридизация/иммуноокрашивания протокола, эти методы предоставляют никакой информации о локализации ткани конкретных Мирна/белковых молекул.

Подводя итог, мы описать протокол, который обеспечивает одновременное обнаружение Мирна и белковых молекул на же ткани, который мы считаем, будет бесценным инструментом в Мирна исследования на моделях мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Атанасиоса Papangelis, за критические замечания по рукописи. FM поддерживается биотехнологии и биологических наук научно-исследовательский совет (СИББН; BB/M009424/1). IP поддерживается грант развития ассоциации ученый американского сердца (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

Генетика выпуск 139 микро РНК выражение профилирование LNA зонда в situ гибридизация иммуноокрашивания гипертрофии сердца
Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации <em>In Situ</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter