Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke In Situ hybridisering

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

mikro-RNAs (miRNAs) er korte og svært homologe RNA sekvenser, som post-transcriptional regulatorer av messenger RNAs (mRNAs). Gjeldende miRNA gjenkjenningsmetoder varierer i sensitivitet og spesifisitet. Vi beskriver en protokoll som kombinerer i situ hybridisering og immunostai-samtidige deteksjon av miRNA og protein molekyler på musen hjertet vev deler.

Abstract

mikro-RNAs (miRNAs) er enkelt-strandet RNA utskrifter som binder til messenger RNAs (mRNAs) og hemme deres oversettelse eller fremme deres degradering. Hittil har miRNAs vært innblandet i en rekke biologiske og sykdom prosesser, som har markert behovet for pålitelig gjenkjenningsmetoder for miRNA transkripsjoner. Her beskriver vi en detaljert protokoll for digoxigenin-merket (graver) låst Nucleic Acid (LNA) probe-baserte miRNA oppdagelsen, kombinert med protein immunostaining på musen hjertet deler. Først utført vi en i situ hybridisering teknikk ved hjelp av sonden for å identifisere miRNA-182 uttrykk i hjertet delene av kontroll og hjerte-hypertrofi mus. Neste, vi utført immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, på i samme avsnitt, å lokalisere co miRNA-182 med cardiomyocyte celler. Bruker denne protokollen, kunne vi oppdage miRNA-182 gjennom en alkalisk fosfatase basert kolorimetrisk analysen, og cTnT gjennom fluorescerende flekker. Denne protokollen kan brukes til å oppdage uttrykk for alle miRNA rundt gjennom grave-merket LNA sonder, og relevante protein uttrykk på musen hjertet vev deler.

Introduction

mikro-RNAs (miRNAs) er kort (18-25 nukleotider), enkelt-strandet, noncoding RNAs som fungerer som negative regulatorer av genuttrykk på post-transcriptional nivå av hemme budbringer RNA (mRNA) oversettelse og/eller fremme mRNA degradering 1. miRNAs er transkribert fra introns eller exons koding eller noncoding gener og er kløyvde i kjernen av DROSHA, til forløperen miRNAs (pre-miRNAs), som er kort stilk-sløyfe strukturer av 70 nukleotider2. Etter cytoplasmatiske eksportere, pre-miRNAs behandles videre av DICER i eldre miRNAs som spenner over 18-25 nukleotider3,4. Deretter omfatter RNA-indusert stanse komplekset (RISC) disse miRNAs som enkelt-strandet RNAs, som tillater for deres tilknytning til 3 uoversatt regionen (3-UTR) deres mål mRNAs å undertrykke deres uttrykk3,5 .

I de siste tre tiårene, siden de ble først identifisert, miRNAs har dukket opp til master regulatorer av genuttrykk, som selv uttrykk er strengt kontrollert6. Roller for miRNAs er beskrevet i orgel utvikling7,8,9,10,11,12, vedlikehold av homeostase13,14 , samt sykdom sammenhenger med nevrologiske15,16,17,18,19, hjerte20, autoimmune tilstander21 ,22, kreft23,24og andre25. Den økende forståelse for relevansen av miRNA uttrykk mønstre har brakt frem behovet for pålitelig gjenkjenningsmetoder av miRNA transkripsjoner. Slike metoder omfatter sanntid PCR, microarrays, nordlige Blotting, i situ hybridisering og andre, som varierer i følsomhet, spesifisitet og kvantitative makt, hovedsakelig på grunn av at miRNA transkripsjoner består av kort og svært homologe sekvenser6.

Vi har nylig rapportert en viktig rolle for miRNA-182 i utviklingen av hjerteinfarkt hypertrofi26, en tilstand som beskriver strukturell tilpasning av hjertet svar til forhøyet hemodynamic krav27,28. Hjerte-hypertrofi er preget av økningen i hjerteinfarkt masse, som, hvis knyttet mistilpasset remodeling29, kan føre til økt risiko for hjertesvikt, en tilstand regnskap for 8,5% av alle dødsfall skyldes hjerte sykdom30.

Her beskriver vi våre protokollen som kombinerer i situ hybridisering med digoxigenin-merket (graver) låst Nucleic Acid (LNA) sonde og immunostai-for samtidige påvisning av miRNA og protein molekyler på musen hjertet vev deler, i våre modell av hjerte-hypertrofi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Musen hjertet vevsprøver for denne studien ble innhentet i henhold til relevante lover og institusjonelle retningslinjer og ble godkjent av Yale University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. løsning forberedelse

  1. Forberede RNase gratis ddH2O, ved å behandle 5 L ddH2O med 5 mL 0,1% diethylpyrocarbonate (DEPC) natten (O/N), ved romtemperatur (RT). Autoclave (121 ° C) for å deaktivere i DEPC. Bruk DEPC-behandlet ddH2O for utarbeidelse av nedstrøms løsninger som angitt.
    FORSIKTIG: DEPC er et kjent karsinogen, bare håndtere i avtrekksvifte.
  2. Forberede 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) løsning ved å løse opp 5 PBS tavle-1 L DEPC-behandlet ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  3. Klargjør 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel/PBS (PBST) ved å fortynne 1 mL av ikke-ioniske vaskemiddel per 1 L 1 x PBS.
  4. Forberede 90%, 70%, 50% og 30% etanol i DEPC-behandlet ddH2O.
  5. Forbereder en 10 mg/mL lagerløsning proteinasen k (ProK) i DEPC-behandlet ddH2O. Aliquot og lagre på 20 ° C. Forberede en 20 μg/mL fungerende løsning av ProK ved utvannende 100 μL ProK lagerløsning i 50 mL av DEPC-behandlet ddH2O. gjør frisk før bruk.
  6. Forberede 4% paraformaldehyde (PFA) ved å legge 2 g PFA i 50 mL 1 x PBS. Varme på 65 ° C med sporadisk riste, til oppløst. Aliquot og butikk på 20 ° C.
    Forsiktig: PFA er et kjent karsinogen, bare håndtere i avtrekksvifte.
  7. Utarbeide en 3 M NaCl løsning ved å legge til 87,8 g 500 mL ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  8. Forberede en 1 M MgCl2 løsning ved å legge 20,3 g til 100 mL ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  9. Forberede 1 M Tris pH 8.0 av oppløsning 121.1 g i 800 mL av ddH2O. justere pH til 8.0 med noen dråper av 1 N HCl, bringe volumet til 1 L og autoklav (121 ° C). Forberede en fungerende løsning av 50 mM Tris pH 8.0 fortynne 2,5 mL 1 M Tris pH 8.0 i 47.5 mL ddH2O.
  10. Forberede 1 M Tris pH 9,5 av oppløsning 60.6 g i 400 mL av ddH2O. justere pH til 9,5 med noen dråper av 1 N HCl, bringe volumet til 500 mL og autoklav (121 ° C).
  11. Forberede 0,13 M 1-Methylimidazole pH 8.0 ved utvannende 1.6 mL 1-Methylimidazole til 130 mL av DEPC-behandlet ddH2O. justere pH til 8.0 med ca 450 µL av 12 N HCl. legge til 16 mL av 3 M NaCl og bringe volumet til 160 mL. Gjør frisk før bruk.
    Forsiktig: 1-Methylimidazole er skadelig for slimhinner, øyne og hud, bare håndtere i avtrekksvifte.
  12. Klargjør 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydroklorid (EDC) ved utvannende 176 µL av EDC til 10 mL 0,13 M 1-Methylimidazole. Justere pH til 8.0 med omtrent 100 µL av 12 N HCl. gjør friske før bruk.
    FORSIKTIG: EDC er skadelig for slimhinner, øyne og hud, bare håndtere i avtrekksvifte.
  13. Klargjør % 1 H2O2 fortynne 1,5 mL av 30% H2O2 i 50 mL 1 x PBS. Gjør frisk før bruk.
  14. Forberede 20 x SSC pH 7.0 ved å løse opp 175.3 g av NaCl og 88.2 g natriumsitrat (Na3C6H5O7) i 800 mL av ddH2O. justere pH 7.0 med noen dråper 1 N HCl, bringe volumet til 1 L og autoklav (121 ° C).
    1. Forberede en fungerende løsning av 2 x SSC pH 7.0 fortynne 20 mL 20 x SSC pH 7.0 i 180 mL av ddH2O.
    2. Forberede en fungerende løsning av 1 x SSC pH 7.0 fortynne 2,5 mL av 20 x SSC pH 7.0 i 47.5 mL av ddH2O.
    3. Forberede en fungerende løsning av 0,2 x SSC pH 7.0 fortynne 5 mL av 2 x SSC pH 7.0 i 45 mL av ddH2O.
  15. Klargjør 1 x hybridisering løsning ved å fortynne 0,5 mL av 2 x microRNA ISH buffer i 0,5 mL av DEPC-behandlet ddH2O. gjør frisk før bruk.
  16. Forberede 200 mM lager løsning av Levamisole ved å legge til 250 mg 5 mL av ddH2O. Aliquot og lagre på 20 ° C.
  17. Klargjør blokkerer løsning for trinn 5 (10% sauer serum/1% BSA/0.2 mM Levamisol) ved å fortynne 1 mL av sau serum i 9 mL PBST, og legger til 0,1 g av BSA. Tilsett 10 μL av Levamisole før du bruker. Gjør frisk før bruk.
  18. Klargjør blokkerer løsning for trinn 6 (10% geit serum/1% BSA) ved å fortynne 1 mL av geit serum i 9 mL av PBST, og legger til 0,1 g av BSA. Lagre på 4 ° C og bruk innen en uke.
  19. Forberede prestaining løsning fortynne 3.3 mL av 3 M NaCl, 5 mL 1 M MgCl2, 10 mL 1 M Tris pH 9,5, 100 µL Tween-20, 100 µL av Levamisole i 81,5 mL av ddH2O. gjør frisk før bruk.
  20. Bruk nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly fosfat (BCIP) bord å forberede 20 mL alkalisk fosfatase (AP)-substratløsningen i henhold til produsentens instruksjoner. Legge til 20 μL Levamisole. Gjør frisk før bruk og beskytte mot lyset.
  21. Forberede KTBT løsning ved å legge til 4 g Tris, 4.4 g av NaCl og 375 mg KCl på 500 mL ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  22. Valgfritt: Klargjør en DAPI fungerende løsning (1 μg/mL) ved utvannende 50 μL av DAPI lager løsning (1 mg/mL) i 50 mL 1 x PBS.
    Merk: Standard løsninger som 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, nuclease-fri ddH2O, 1 x PBS og 20 x SSC kan alternativt kjøpe. For denne protokollen, 50 mL glass Coplin glass eller 20 mL polypropylen lysbildet mailer har glass blitt brukt.

2. vev forberedelse

Merk: Mus hjertet delene som brukes her ble utarbeidet av Yale patologi vev tjenester, fra Formalin-fast/parafin-embedded vev, kuttet på 5 μm og plassert på ladet lysbilder.

  1. Vev utvanning.
    1. Varm lysbildene ved 60 ° C i 10 min, i hybridisering ovnen før parafinen smelter synlig.
    2. Inkuber lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av kommersielt tilgjengelig clearing agent (se Tabell for materiale) i 10 min, to ganger.
    3. Inkuber lysbildene i et glass Coplin jar inneholder 50 mL av 100% etanol i 2 minutter, to ganger, etterfulgt av 90% etanol i 2 minutter, 70% etanol i 2 minutter, to ganger, 50% etanol i 2 minutter og 30% etanol i 2 minutter.
    4. Inkuber lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av DEPC-behandlet ddH2O for 5 min.
    5. Inkuber lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS i 5 min.
  2. Vev de-proteinating.
    1. Inkuber lysbilder i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av 20 μg/mL ProK fungerende løsning på 37 ° C i 15 min i hybridisering ovnen.
      FORSIKTIG: Under fordøyelsen kan resultere i dårlig eller ingen signal utvikling, mens over fordøyelsen kan føre vev nedbrytning og utviklingen av bakgrunnen flekker. Optimalisering kan kreves for dette trinnet (1 – 20 μg/mL ProK, 5-20 min inkubasjon RT-37 ° C).
    2. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS i 5 min, på RT, to ganger.
  3. Vev fiksering.
    1. Bruk en hydrofobe pennen tegner en vannavstøtende sirkel rundt vev i hvert lysbilde.
    2. 500 µL av 4% PFA løsningen gjelder lengden på hvert lysbilde og ruge lysbilder for 10 min, på RT.
    3. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS i 5 min, på RT, to ganger.
    4. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av 0,13 M 1-methylimidazole for 10 min, på RT, to ganger.
    5. 500 µL av 0,16 M EDC-løsningen gjelder lengden på hvert lysbilde og ruge lysbilder for 1 h på RT, i en fuktet kammer.
    6. Skyll lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av 50 mM Tris pH 8.0 på RT.
    7. Skyll lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS på RT, to ganger.
      Merk: Begge PFA og EDC fiksering trinn kreves for miRNA crosslinking og bør ikke bli unlatt. 31
  4. Endogene peroxidase blokk.
    1. Inkuber lysbilder i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1% H2O2 for 30 min på RT.
    2. Skyll lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS på RT, to ganger.

3. hybridisering

  1. Forvarm hybridisering løsning (500 µL per lysbilde) ved 50 ° C i hybridisering ovnen, til ønsket temperatur, nås (10-15 min).
  2. Forberede hybridisering kammeret ved å plassere 2 stykker eller vev i bunnen av kammeret og tisse papiret med 50% formamide/1 x SSC.
    Forsiktig: Formamide er skadelig for slimhinner, øyne og hud, bare håndtak i avtrekksvifte.
  3. 200 µL av hybridisering løsningen gjelde lengden på hvert lysbilde. Inkuber lysbilder for 1-3 h ved 50 ° C, i en fuktet kammer.
  4. Forberede sonde løsningen ved å blande 0,5 µL lager sonde (25 µM) i 250 µL ofhybridization løsning (siste konsentrasjon 50 nM) i en 1,5 mL tube.
    Merk: Ulike miRNAs uttrykkes på ulike nivåer, så optimalisering om sonden konsentrasjonen kan kreves for dette trinnet (1-50 nM), å unngå ingen signal eller høye utvikling.
  5. 250 µL av sonden løsningen gjelder lengden på hvert lysbilde, og Plasser en RNase gratis dekkglassvæske på toppen. Unngå dannelse av bobler.
  6. Nøye forsegle hybridisering kammeret med parafilm og ruge O/N på 50 ° C.
    Merk: Hybridisering temperaturen bør settes ca 30 ° C nedenfor RNA-Smeltetemperaturen (Tm) for hver probe. Optimalisering kan være nødvendig. Her 50 ° C brukes som hybridisering/vask temperaturen for miRNA-182, justeres tilsvarende for ulike sonder.

4. stringens vasker

  1. Prewarm 200 mL 2 x SSC ved 50 ° C i hybridisering ovnen, inntil ønsket temperatur nås (20-40 minutter).
  2. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av 2 x SSC ved 50 ° C i 5 minutter, eller til coverslips løsne.
  3. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av 2 x SSC på RT for 5 min, to ganger.
  4. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av 0,2 x SSC på RT for 5 min.
  5. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av PBST på RT i 5 min.
  6. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS på RT i 5 min.
    Merk: Bruk av RNase-gratis forhold er ikke lenger nødvendig siden RNA-RNA hybrider anses stabil.

5. grave antistoff gjenkjenning

  1. Bruk en hydrofobe til å tegne en vannavstøtende sirkel rundt vev i hvert lysbilde om nødvendig.
  2. Bruke 500 µL av blokkering løsning lengden på hvert lysbilde. Inkuber lysbilder for 30 min på RT, i en fuktet kammer.
  3. Klargjør grave antistoff løsningen (1:1, 000) ved utvannende 0,5 μL grave antistoff 500 µL ofblocking løsning i en 1,5 mL tube.
    FORSIKTIG: Optimalisering kan kreves for dette trinnet (1:500-1:2, 000).
  4. 500 µL av grave antistoff løsningen gjelde lengden på hvert lysbilde. Inkuber lysbilder for 1 h på RT, i en fuktet kammer.
  5. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av PBST på RT i 5 min, tre ganger.
  6. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av prestaining løsning på RT for 5 min, to ganger.
  7. Inkuber lysbilder i en polypropylen lysbildet mailer glasset som inneholder 20 mL ofAP substrat løsning på 37 ° C, 6-24 h, beskyttet mot lyset.
    Forsiktig: Farge utvikling bør kontrolleres hver 2 h. optimalisering kan kreves for dette trinnet.
  8. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL av KTBT løsning på RT for 5 min, to ganger.
  9. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS på RT i 5 min.

6. cTnT antistoff gjenkjenning

  1. Bruk en hydrofobe til å tegne en vannavstøtende sirkel rundt vev i hvert lysbilde om nødvendig.
  2. Bruke 500 µL av blokkering løsning lengden på hvert lysbilde. Inkuber lysbilder for 1 h på RT, i en fuktet kammer.
  3. Klargjør cTnT antistoff løsningen (1: 100) ved utvannende 2 μL cTnT antistoff 200 μL ofblocking løsning i en 1,5 mL tube.
  4. 200 µL cTnT antistoff løsning gjelde lengden på hvert lysbilde. Inkuber lysbilder vannrett O/N ved 4 ° C, i en fuktet kammer.
  5. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS på RT i 5 min, tre ganger.
  6. Klargjør rabbit-568 antistoff løsningen (1:500) ved utvannende 0,5 μL rabbit-568 antistoff 250 μL ofblocking løsning i en 1,5 mL tube.
  7. 250 µL av rabbit-568 antistoff løsningen gjelde lengden på hvert lysbilde. Inkuber lysbilder for 1 h på RT, i en fuktet kammer.
  8. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS på RT i 5 min, tre ganger.
  9. Valgfritt: 250 µL av DAPI fungerende løsning gjelder lengden på hvert lysbilde, og ruge lysbilder for 1 min på RT, beskyttet mot lyset.
  10. Vask lysbildene i en glasskrukke for Coplin som inneholder 50 mL 1 x PBS på RT i 5 min, to ganger.

7. montering og tenkelig

  1. Montere lysbildene med 2-3 dråper montering medium og et glass cover slip. Gi lysbildene fasong, O/N, ved 4 ° C, beskyttet mot lyset.
  2. Gå til epifluorescent eller AC confocal mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

miRNA i situ hybridisering var optimalisert på musen hjertet deler bruker scramble miRNA og U6-snRNA, som fungerte som negative og positive kontroller henholdsvis. Positiv flekker er angitt i blå, mens den negative flekker er angitt for farge utvikling (figur 1A-1B). Cardiomyocyte bestemte uttrykk for miRNA-182 ble vurdert i hjertet deler av kontroll og PlGF overexpressing mus. Mus bærer PlGF transgene under en αMHC promoter utvikle hjerte-hypertrofi, sekundært til økt angiogenese, innen 6 uker av transgene aktivisering26. Vi utført i situ hybridisering og fant økt uttrykk for miRNA-182 i hjertene til PlGF mus, sammenlignet med kontrollene (figur 2A-2 H), angitt av den blå flekker. For å avgjøre hvilke celletyper express miRNA-182, utført vi har immunostaining for cTnT på samme seksjoner. Vi fant miRNA-182 Co lokalisert med cTnT-positive cardiomyocyte celler, i tillegg til DAPI farget atomkjerner, i PlGF musen hjertet delene og kontroll (figur 2C-2 H), angitt av røde og blå flekker henholdsvis. Disse bildene ble med en 20 X-målet.

Figure 1
Figur 1: Negative og Positive i situ hybridisering farging. (A) i situ hybridisering for scramble miRNA (25 nM) i kontroll musen hjertet deler. (B) i situ hybridisering for U6-snRNA (25 nM) i kontroll musen hjertet deler. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Cardiomyocyte spesifikke uttrykk for miRNA-182 i kontroll og PlGF musen hjerter. (AB) In situ hybridisering for miRNA-182 i kontroll og PlGF musen hjertet. (C-D) Immunostaining for cTnT i kontroll og PlGF musen hjertet inndelinger som tidligere har blitt farget for miRNA-182. (E-F) DAPI counterstaining for kjernefysisk lokalisering i kontroll og PlGF musen hjertet inndelinger som tidligere har blitt farget for miRNA-182. (G-H) Flettede bilder av miRNA-182 (dyp blå), cTnT (rød) og DAPI (lys blå) flekker for kontroll og PlGF musen hjertet deler. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNA transkripsjon gjenkjenning kan oppnås gjennom forskjellige teknikker som varierer i sensitivitet og spesifisitet kvantitative makt. Her viser vi koblingen av miRNA i situ hybridisering med immunostai- og beskrive en protokoll som tillater samtidig vurdering av uttrykket miRNA og protein molekyler, på samme hjertet seksjoner. Først viser vi hvordan du utfører i situ hybridisering av grave-merket LNA miRNA sonder på innebygd hjertet parafinsnitt. Deretter beskriver vi hvordan å utføre immunostaining for cTnT på samme seksjoner. Til slutt, viser vi hvordan du fletter den resulterende fargen og fluorescerende bilder. Denne protokollen er optimalisert for Formalin fast (4 ° C, O/N) / parafin innebygd mus hjertet vev, med bruk av grave-merket LNA miRNA sonder og cTnT. Ytterligere optimalisering kan være nødvendig for forskjellige vev, undersøke eller antistoff typer, som beskrevet nedenfor.

RNase-gratis forhold skal implementeres nøye hvert trinn som fører opp til sonde hybridisering, som RNase forurensning kan alvorlig svekke resultatet av eksperimentet. Alle løsninger bør gjøres med DEPC-behandlet ddH2O, og alle Coplin glass bør behandles med en RNase dekontaminering løsning. I tillegg må følgende hensyn tas i betraktning når du arbeider med ulike grave-merket LNA miRNA sonder. Hybridisering temperaturen avhenger Smeltetemperaturen (Tm) for hver probe. Som en generell regel bør en temperatur som er 30 ° C under gitt RNA Tm eller 20 ° C nedenfor gitt DNA Tm brukes for sonden hybridisering. Videre bør ideelt sonde konsentrasjonen optimaliseres. Det ligger vanligvis mellom 1-50 nM. Til slutt, sonden inneholder hybridisering løsning kan være oppvarmet til 95 ° C i 5 min til denature eventuelle sekundære strukturer, hvis dette er en bekymring. Et viktig skritt for å teste spesifisitet av en sonde, er spesielt når de brukes for første gang, å inkludere en negativ (kryptert) så vel som positive (for eksempel U6) kontroll sonde, for å sikre eksperimentelle suksess (figur 2). Lignende kontroller (for eksempel et CD31 endothelial antistoff) benyttes immunostai-trinnet.

Et vanlig problem i situ hybridisering eksperimenter er utviklingen av flekker gjenstand/bakgrunn signal. For å unngå eller minimere gjenstand flekker trinn, bli vevet beskyttet tørker ut gjennom alle trinnene, spesielt under lange incubations. Vi anbefaler dekker lysbildene med RNase uten coverslips under det hybridisering trinnet, spesielt ved høye temperaturer er, og bruk av fukter kamre. Vi foreslår også bruk av en 568 eller 594 fluorophore å oppdage cTnT eller protein rundt under immunostai-trinnet. Dette vil eliminere noen autofluorescence som ofte oppstår med bruk av 488 fluorophores brukes på formaldehyd fast vev.

En annen variabel anbefaler vi betaler oppmerksomhet til er varigheten av AP flekker utvikling som avhenger av nivåene av den spesifikke miRNA i vevet. Vi foreslår sjekke AP flekker progresjon hver 2 h, for det første eksperimentet. Ytterligere optimalisering kan omfatte endre temperaturen på inkubering (RT-37 ° C) parameter. Til slutt, hvis bakgrunnen begynner å utvikle før den sanne miRNA sonde flekker eller AP flekker løsning endrer farge til blå-brun, foreslår vi at vaske lysbildene i PBST to ganger, og erstattet flekker løsningen med en nystekte.

Til slutt, selv om denne protokollen er optimalisert for Formalin-fast/parafin-innebygd mus hjertet vev, det kan være tilpasset også behandlet vev (PFA fast/OCT innebygd) og/eller bruk av ulike proben eller antistoff. En begrensning av i situ hybridisering og immunostai-som bør vurderes er svikt i flere antistoffer til å binde til deres respektive epitopes, på grunn av den mulige ødeleggelsen av de sistnevnte seg på de høye temperaturene som brukes under hybridisering og stringens vaske trinnene. Ytterligere begrensninger i både i situ hybridisering og immunostai-teknikker se ofte kraften av disse teknikkene til å oppdage svært lave konsentrasjoner av miRNA eller protein molekyler henholdsvis. Signal forsterkning kits er tilgjengelig for bruk for grave eller antistoff gjenkjenning når miRNA eller protein overflod er en bekymring. Slike kits gir også en fluorescens alternativ for påvisning av miRNAs, som, når kombinert med fluorescerende immunostaining kan forenkle image vinningen. Alternative metoder, for eksempel Real-Time PCR og Western Blotting som har større følsomhet, kan også håndtere lav overflod problemer. Men i motsetning til i situ hybridisering/immunostai-protokollen gir disse teknikkene ingen informasjon om vev-spesifikke lokalisering av miRNA/protein molekyler.

For å oppsummere, beskriver vi en protokoll som gir samtidig påvisning av miRNA og protein molekyler på samme vev, som vi tror vil være et uvurderlig verktøy i miRNA forskning på musen modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Athanasios Papangelis, for kritiske kommentarer på manuskriptet. FM støttes av bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP er støttet av den American Heart Association forsker Development Grant (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

Genetikk problemet 139 mikro-RNA expression profilering LNA sonde i situ hybridisering immunostai- hjerte-hypertrofi
Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke <em>In Situ</em> hybridisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter