Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Væv-specifikke miRNA udtryk profilering i mus hjerte sektioner ved hjælp af In Situ hybridisering

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

mikro-RNA'er (miRNAs) er korte og meget homologe RNA sekvenser, der tjener som post-transcriptional regulatorer af messenger RNA'er (mRNAs). Nuværende miRNA påvisningsmetoder varierer i følsomhed og specificitet. Vi beskriver en protokol, der kombinerer i situ hybridisering og immunfarvning for samtidige påvisning af miRNA og protein molekyler på musen hjerte væv sektioner.

Abstract

mikro-RNA'er (miRNAs) er enkeltstrenget RNA afskrifter, der binder til messenger RNA'er (mRNAs) og hæmme deres oversættelse eller fremme deres nedbrydning. Til dato, har miRNAs været impliceret i en lang række biologiske og sygdom processer, som har tilkendegivet nødvendigheden af metoderne pålidelig detektering af miRNA udskrifter. Her beskriver vi en detaljeret protokol til digoxigenin-mærket (grave) låst nukleinsyre (LNA) sonde-baserede miRNA påvisning, kombineret med protein immunfarvning på musen hjerte sektioner. Vi uropført en i situ hybridisering teknik bruger sonden til at identificere miRNA-182 udtryk i hjertet sektioner fra kontrol og Hjertehypertrofi mus. Næste, vi udførte immunfarvning for kardiale Troponin T (cTnT) protein, på de samme strækninger, at co lokalisere miRNA-182 med cardiomyocyte celler. Ved hjælp af denne protokol, var vi købedygtig opdager miRNA-182 gennem en alkalisk fosfatase baseret kolorimetriske assay og cTnT gennem fluorescerende farvning. Denne protokol kan bruges til at registrere udtryk for enhver miRNA interesse gennem grave-mærket LNA sonder og relevante protein udtryk på musen hjerte væv sektioner.

Introduction

mikro-RNA'er (miRNAs) er korte (18 – 25 nukleotider), enkelt-strenget, noncoding RNA'er, der fungerer som negative regulatorer af genekspression på det post-transcriptional niveau af hæmme messenger RNA (mRNA) oversættelse og/eller fremme mRNA nedbrydning 1. miRNAs er transskriberet fra introner eller exons kodning eller noncoding gener og er kløvet i kernen af DROSHA, at forløber miRNAs (pre-miRNAs), som er korte stem-loop strukturer af 70 nukleotider2. Efter cytoplasmatisk eksport, pre-miRNAs forarbejdes yderligere af DICER til modne miRNAs, der strækker sig over 18 – 25 nukleotider3,4. Efterfølgende, indarbejder den RNA-induceret silencing complex (RISC) disse miRNAs som enkeltstrenget RNA'er, som gør det muligt for deres binding til den 3' utranslaterede region (3'-UTR) af deres mål mRNAs at undertrykke deres udtryk3,5 .

Inden for de sidste tre årtier, siden de blev først identificeret, opstået miRNAs til master regulatorer af genekspression, hvis eget udtryk niveauer er stramt kontrolleret6. Roller for miRNAs har været beskrevet i orgel udvikling7,8,9,10,11,12, opretholdelse af homeostase13,14 , samt sygdom sammenhænge, der omfatter neurologiske15,16,17,18,19, hjerte-kar-20, autoimmune sygdomme21 ,22, kræft23,24, og andre25. Den stigende forståelse for relevansen af miRNA udtryk mønstre har fremsat behovet for pålidelige påvisningsmetoder af miRNA udskrifter. Disse metoder omfatter Real Time PCR, microarrays, nordlige Blotting, i situ hybridisering og andre, som varierer i følsomhed, specificitet og kvantitative strøm, overvejende at miRNA udskrifter består af korte og stærkt homologe sekvenser6.

Vi har for nylig rapporteret en vigtig rolle for miRNA-182 i udvikling af myokardieinfarkt hypertrofi26, en tilstand, der beskriver den strukturelle tilpasning af hjertet som reaktion på forhøjet hæmodynamiske krav27,28. Hjertehypertrofi er karakteriseret ved stigning i Myokardie massen, som hvis forbundet med utilpasset remodeling29, kan føre til øget risiko for hjertesvigt, en tilstand, der tegner sig for 8,5% af alle dødsfald skyldes hjerte-kar- sygdom30.

Her beskriver vi vores protokol, der kombinerer i situ hybridisering med digoxigenin-mærket (grave) låst nukleinsyre (LNA) sonde og immunfarvning for samtidige påvisning af miRNA og protein molekyler på musen hjerte væv sektioner, i vores model af Hjertehypertrofi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Musen hjerte vævsprøver for denne undersøgelse blev indhentet i overensstemmelse med de relevante love og institutionelle retningslinjer og blev godkendt af Yale University institutionelle Animal Care og brug udvalget.

1. løsning forberedelse

  1. Forberede RNase gratis ddH2O, ved at behandle Hedeselskabet2O 5 L, med 5 mL af 0,1% diethylpyrocarbonate (DEPC) natten over (O/N), ved stuetemperatur (RT). Autoklave (121 ° C) til at deaktivere DEPC. Brug DEPC-behandlet ddH2O udarbejdelse af downstream løsninger som angivet.
    Forsigtig: DEPC er et kendt carcinogen, kun håndtere i stinkskab.
  2. Forberede 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) løsning ved at opløse 5 PBS tabletter i 1 L af DEPC-behandlet ddH2O. autoklave (121 ° C).
  3. Forberede 0,1% nonionisk detergent/PBS (PBST) ved fortynding af 1 mL nonioniske detergenter per 1 L 1 x PBS.
  4. Forberede 90%, 70%, 50% og 30% ethanol i DEPC-behandlet ddH2O.
  5. Forberede en 10 mg/mL stamopløsning af Proteinase K (ProK) i DEPC-behandlet ddH2O. delprøve og opbevares ved-20 ° C. Forberede en 20 μg/mL brugsopløsning af ProK ved at fortynde 100 μL af ProK stamopløsning i 50 mL af DEPC-behandlet ddH2O. gøre friske før brug.
  6. Forbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved at tilføje 2 g af PFA i 50 mL af 1 x PBS. Varme på 65 ° C under lejlighedsvis omrystning, indtil opløst. Alikvot og opbevares ved-20 ° C.
    Forsigtig: PFA er et kendt carcinogen, kun håndtere i stinkskab.
  7. Forbered en 3 M NaCl løsning ved at tilføje 87.8 g til 500 mL af Hedeselskabet2O. autoklave (121 ° C).
  8. Forbered en 1 M MgCl2 løsning ved at tilføje 20,3 g til 100 mL af Hedeselskabet2O. autoklave (121 ° C).
  9. Forberede 1 M Tris pH 8,0 ved at opløse 121.1 g i 800 mL af Hedeselskabet2O. Juster til pH 8,0 med et par dråber 1 N HCl, bringe volumen på 1 L og autoklave (121 ° C). Forberede en brugsopløsning af 50 mM Tris pH 8,0 ved fortynding af 2,5 mL 1 M Tris pH 8,0 i 47,5 ml af Hedeselskabet2O.
  10. Forberede 1 M Tris pH 9.5 af opløsende 60.6 g i 400 mL af Hedeselskabet2O. Juster pH-værdien til 9,5 med et par dråber 1 N HCl, bringe volumen til 500 mL og autoklave (121 ° C).
  11. Forberede 0,13 M 1-Methylimidazole pH 8,0 ved at fortynde 1,6 mL af 1-Methylimidazole til 130 mL af DEPC-behandlet ddH2O. Juster til pH 8,0 med ca 450 µL af 12 N HCl. tilføje 16 mL af 3 M NaCl og bringe volumen til 160 mL. Gøre friske før brug.
    Forsigtig: 1-Methylimidazole er skadelige for slimhinder, øjne og hud, kun håndtere i stinkskab.
  12. Forbered 0.16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorid (EDC) ved at fortynde 176 µL af EDC til 10 mL af 0,13 M 1-Methylimidazole. PH indstilles til 8,0 med ca. 100 µL af 12 N HCl. gøre friske før brug.
    Advarsel: EDC er skadelige for slimhinder, øjne og hud, kun håndtere i stinkskab.
  13. Forberede 1% H2O2 ved fortynding af 1,5 mL 30% H2O2 i 50 mL af 1 x PBS. Gøre friske før brug.
  14. Forberede 20 x SSC pH 7,0 ved at opløse 175.3 g NaCl og 88.2 g natrium citrat (Na3C6H5O7) i 800 mL af Hedeselskabet2O. Juster pH 7.0 med et par dråber 1 N HCl, bringe volumen på 1 L og autoklave (121 ° C).
    1. Forberede en brugsopløsning af 2 x SSC pH 7,0 ved at fortynde 20 mL 20 x SSC pH 7,0 i 180 mL ddH2O.
    2. Forberede en brugsopløsning i 1 x SSC pH 7,0 ved at fortynde 2,5 mL 20 x SSC pH 7,0 i 47,5 mL ddH2O.
    3. Forberede en brugsopløsning af 0,2 x SSC pH 7,0 ved at fortynde 5 mL 2 x SSC pH 7,0 i 45 mL ddH2O.
  15. Forberede 1 x hybridisering løsning ved at fortynde 0,5 mL af 2 x microRNA ISH buffer i 0,5 mL af DEPC-behandlet ddH2O. gøre friske før brug.
  16. Forbered 200 mM stamopløsning af levamisol ved at tilføje 250 mg til 5 mL af Hedeselskabet2O. delprøve og opbevares ved-20 ° C.
  17. Forberede blokerende løsning for trin 5 (10% får serum/1% BSA/0,2 mM Levamisol) ved fortynding af 1 mL af fårene serum i 9 mL PBST, og tilføje 0,1 g af BSA. Tilsættes 10 μL levamisol før brug. Gøre friske før brug.
  18. Forberede blokerende løsning til trin 6 (10% ged serum/1% BSA) ved fortynding af 1 mL af ged serum i 9 mL PBST, og tilføje 0,1 g af BSA. Opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for en uge.
  19. Forberede prestaining løsning ved at fortynde 3,3 mL 3 M NaCl, 5 mL 1 M MgCl2, 10 mL 1 M Tris pH 9.5, 100 µL af Tween-20, 100 µL af levamisol i 81.5 mL af Hedeselskabet2O. gøre friske før brug.
  20. Bruge nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly fosfat (BCIP) tabletter til at forberede 20 mL basisk fosfatase (AP) substratopløsning efter fabrikantens anvisninger. Tilsæt 20 μL af levamisol. Gøre friske før brug og beskytte mod lys.
  21. Forbered KTBT løsning ved at tilføje 4 g af Tris, 4,4 g NaCl og KCl 375 mg i 500 mL af Hedeselskabet2O. autoklave (121 ° C).
  22. Valgfrit: Forbered en DAPI brugsopløsning (1 μg/mL) ved at fortynde 50 μL af DAPI stamopløsning (1 mg/mL) i 50 mL af 1 x PBS.
    Bemærk: Standard løsninger såsom 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, nukleasen-fri ddH2O, 1 x PBS og 20 x SSC Alternativt kan købes. For denne protokol, 50 mL glas Coplin krukker eller 20 mL polypropylen dias mailer har krukker været brugt.

2. væv forberedelse

Bemærk: Mus hjerte sektioner, der anvendes her blev udarbejdet af Yale patologi væv tjenester, fra Formalin-fast/Paraffin-embedded væv, skåret på 5 μm og placeret på ladet dias.

  1. Væv rehydrering.
    1. Varm dias ved 60 ° C i 10 min, i hybridisering ovnen indtil paraffin synligt smelter.
    2. Glassene inkuberes i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af kommercielt tilgængelige clearing agent (Se Tabel af materialer) i 10 min, to gange.
    3. Glassene inkuberes i glas Coplin, der indeholder 50 mL 100% ethanol i 2 min., to gange, efterfulgt af 90% ethanol i 2 min., 70% ethanol i 2 min., to gange, 50% ethanol i 2 min. og 30% ethanol i 2 min.
    4. Glassene inkuberes i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af DEPC-behandlet ddH2O i 5 min.
    5. Glassene inkuberes i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS i 5 min.
  2. Væv de-proteinating.
    1. Inkuber dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 20 μg/mL ProK brugsopløsning, ved 37 ° C i 15 min i ovnen hybridisering.
      Forsigtig: Under fordøjelsen kan resultere i dårlig eller ingen signal udvikling, mens over fordøjelsen kan resultere i forringelse af væv og udvikling af baggrunden farvning. Optimering kan være nødvendig for dette trin (1-20 μg/mL ProK, 5-20 min inkubation, RT-37 ° C).
    2. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS for 5 min på RT, to gange.
  3. Væv fiksering.
    1. Brug en hydrofobe pen til at tegne en vandafvisende cirkel omkring vævet på hvert dias.
    2. Anvende 500 µL af 4% PFA løsning til længden af hvert dias og inkuberes dias vandret i 10 min på RT.
    3. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS for 5 min på RT, to gange.
    4. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 0,13 M 1-methylimidazole i 10 min på RT, to gange.
    5. Anvende 500 µL af 0.16 M EDC løsning til længden af hvert dias og inkuberes dias vandret for 1 h i RT, i en fugtig kammer.
    6. Skyl dias i et glas Coplin krukke indeholdende 50 mL 50 mM Tris pH 8,0 på RT.
    7. Skyl dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS på RT, to gange.
      Bemærk: Både PFA og EDC fiksering trin er nødvendige for miRNA crosslinking og bør ikke udelades. 31
  4. Endogene peroxidase blok.
    1. Inkuber dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1% H2O2 for 30 min på RT.
    2. Skyl dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS på RT, to gange.

3. hybridisering

  1. Forvarm hybridisering løsning (500 µL pr. slide) ved 50 ° C i ovnen hybridisering indtil mål temperaturen, er nået (10-15 min).
  2. Forberede hybridisering kammer ved at placere 2 stykker af filter eller silkepapir i kammerets bund og fugte papir med 50% formamid/1 x SSC.
    Forsigtig: Formamid er skadelige for slimhinder, øjne og hud, eneste håndtag i stinkskab.
  3. Anvende 200 µL af hybridisering løsning til længden af hvert lysbillede. Inkuber dias vandret i 1-3 timer ved 50 ° C, i en fugtig kammer.
  4. Forberede sonde løsning ved at blande 0,5 µL stock sonde (25 µM) i 250 µL ofhybridization løsning (slutkoncentration 50 nM) i 1,5 mL rør.
    Bemærk: Forskellige miRNAs er udtrykt på forskellige niveauer, så optimering vedrørende sonde koncentration kan være nødvendig for dette trin (1-50 nM), at undgå ingen signal eller høj baggrund udvikling.
  5. Anvende 250 µL af sonden løsning til længden af hvert dias og placere en RNase gratis coverslip på toppen. Undgå dannelsen af boblerne.
  6. Omhyggeligt forsegle hybridisering kammer med parafilm og inkuberes O/N ved 50 ° C.
    Bemærk: Hybridisering temperaturen bør der fastsættes ca 30 ° C under RNA-smeltepunktet (Tm) for hver enkelt sonde. Optimering kan være påkrævet. Her, 50 ° C bruges som hybridisering/vask temperatur for miRNA-182, justere i overensstemmelse hermed for forskellige sonder.

4. strenghed vasker

  1. Prewarm 200 mL af 2 x SSC ved 50 ° C i hybridisering ovn, indtil målet temperatur er nået (20-40 min).
  2. Vaske dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 2 x SSC ved 50 ° C i 5 min, eller indtil coverslips løsne.
  3. Vaske dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 2 x SSC på RT for 5 min, to gange.
  4. Vaske dias i et glas Coplin krukke indeholdende 50 mL 0,2 x SSC på RT for 5 min.
  5. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af PBST på RT for 5 min.
  6. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS på RT for 5 min.
    Bemærk: Brug af RNase-fri betingelser er ikke længere nødvendigt, da RNA-RNA hybrider der betragtes som stabilt.

5. grave påvisning af antistof

  1. Brug en hydrofobe pen til at re-drage en vandafvisende cirkel omkring vævet på hver slide hvis nødvendigt.
  2. Anvende 500 µL blokerende løsning til længden af hvert lysbillede. Inkuber dias vandret i 30 min på RT, i en fugtig kammer.
  3. Forbered grave antistof løsning (1:1, 000) ved at fortynde 0,5 μl af grave antistof i 500 µL ofblocking løsning i en 1,5 mL tube.
    Forsigtig: Optimering kan være påkrævet til dette trin (1: 500-1:2, 000).
  4. Anvende 500 µL af grave antistof løsning til længden af hvert lysbillede. Inkuber dias vandret for 1 h i RT, i en fugtig kammer.
  5. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af PBST på RT for 5 min, tre gange.
  6. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af prestaining løsning på RT for 5 min, to gange.
  7. Inkuber dias i en polypropylen dias mailer krukke indeholdende 20 mL ofAP substratopløsning ved 37 ° C, for 6 – 24 h, beskyttet mod lys.
    Forsigtig: Farve udvikling skal checkes hver 2 h. optimering kan være nødvendig for dette trin.
  8. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af KTBT løsning på RT for 5 min, to gange.
  9. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS på RT for 5 min.

6. cTnT påvisning af antistof

  1. Brug en hydrofobe pen til at re-drage en vandafvisende cirkel omkring vævet på hver slide hvis nødvendigt.
  2. Anvende 500 µL blokerende løsning til længden af hvert lysbillede. Inkuber dias vandret for 1 h i RT, i en fugtig kammer.
  3. Forbered cTnT antistof løsning (1: 100) ved at fortynde 2 μl af cTnT antistof i 200 μl ofblocking løsning i en 1,5 mL tube.
  4. Anvende 200 µL af cTnT antistof løsning til længden af hvert lysbillede. Inkuber dias vandret O/N ved 4 ° C, i en fugtig kammer.
  5. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS på RT for 5 min, tre gange.
  6. Forbered rabbit-568 antistof løsning (1: 500) ved at fortynde 0,5 μl af rabbit-568 antistof i 250 μL ofblocking løsning i en 1,5 mL tube.
  7. Anvende 250 µL af rabbit-568 antistof løsning til længden af hvert lysbillede. Inkuber dias vandret for 1 h i RT, i en fugtig kammer.
  8. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS på RT for 5 min, tre gange.
  9. Valgfrit: Anvende 250 µL af DAPI brugsopløsning til længden af hvert dias, og Inkuber dias vandret for 1 min på RT, beskyttet mod lys.
  10. Vask dias i et glas Coplin jar indeholder 50 mL af 1 x PBS på RT for 5 min, to gange.

7. montering og billedbehandling

  1. Montere dias med 2-3 dråber af montering medium og et glas dækning slip. Tillad dias til tør flad, O/N, ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
  2. Gå til epifluorescerende eller Konfokal mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

miRNA i situ hybridisering var optimeret på musen hjerte sektioner ved hjælp af en scramble miRNA og U6-snRNA, der fungerede som negativ og positiv kontrol henholdsvis. Positive farvning er indiceret i blåt, mens den negative farvning er indiceret ved manglende farve udvikling (figur 1A-1B). Cardiomyocyte specifikt udtryk for miRNA-182 blev vurderet i hjertet sektioner fra kontrol og PlGF overekspression mus. Musene transporterer PlGF transgenet under en αMHC promoter udvikle Hjertehypertrofi, sekundære til øget angiogenese, inden 6 uger af transgenet aktivering26. Vi udførte i situ hybridisering og fundet øget udtryk for miRNA-182 i hjerter af PlGF mus, i forhold til kontrol (figur 2A-2 H), anført af den blå farvning. For at fastslå, hvilke celletyper express miRNA-182, udført vi derefter immunfarvning for cTnT på de samme strækninger. Vi fandt miRNA-182 Co lokaliseret med cTnT-positive cardiomyocyte celler samt DAPI farves kerner, i både kontrol- og PlGF mus hjerte sektioner (figur 2 c-2 H), angivet ved den røde og blå farvning henholdsvis. Disse billeder var med en 20 X mål.

Figure 1
Figur 1: Negative og Positive i situ hybridisering farvning. (A) In situ hybridisering til scramble miRNA (25 nM) i kontrol mus hjerte sektioner. (B) In situ hybridisering for U6-snRNA (25 nM) i kontrol mus hjerte sektioner. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Cardiomyocyte specifikt udtryk for miRNA-182 i kontrol og PlGF mus hjerter. (A-B) In situ hybridisering til miRNA-182 i kontrol og PlGF mus hjerte sektioner. (C-D) Immunfarvning for cTnT i kontrol og PlGF mus hjerte sektioner, der har været tidligere farvet for miRNA-182. (E-F) DAPI counterstaining for nukleare lokalisering i kontrol og PlGF mus hjerte sektioner, der har været tidligere farvet for miRNA-182. (G-H) Flettede billeder af miRNA-182 (deep blue), cTnT (rød) og DAPI (lyseblå) farvning for kontrol og PlGF mus hjerte sektioner. Skalalinjen = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNA udskrift afsløring kan opnås gennem forskellige teknikker, der varierer i følsomhed, specificitet og kvantitative magt. Her, vi påvise kobling af miRNA i situ hybridisering med immunfarvning og beskrive en protokol, der giver mulighed for samtidige vurdering af udtryk niveauer af miRNA og protein molekyler, på de samme hjerte sektioner. Først viser vi hvordan du udfører i situ hybridisering af grave-mærket LNA miRNA sonder på paraffinsnit indlejret hjerte. Næste, vi beskriver, hvordan du udføre immunfarvning for cTnT på de samme strækninger. Endelig vil demonstrere vi hvordan man flette den resulterende farve og fluorescerende billeder. Denne protokol er blevet optimeret til Formalin fast (4 ° C, O/N) / Paraffin embedded mus hjerte væv, med brug af grave-mærket LNA miRNA sonder og cTnT. Yderligere optimering kan kræves for forskellige væv, sonde eller antistof typer, som beskrevet nedenfor.

RNase-fri betingelser bør gennemføres omhyggeligt i hele de trin, der fører op til sonde hybridisering, som RNase kontaminering kan alvorligt kompromittere resultatet af eksperimentet. Alle løsninger bør foretages med DEPC-behandlet ddH2O, og alle Coplin krukker skal behandles med en RNase dekontaminering løsning. Derudover tages følgende overvejelser i betragtning, når du arbejder med forskellige grave-mærket LNA miRNA sonder. Hybridisering temperaturen afhænger smeltepunktet (Tm) for hver enkelt sonde. Som hovedregel bør en temperatur, der er 30 ° C under de givne RNA Tm eller 20 ° C under de givne DNA Tm anvendes til sonde hybridisering. Desuden, den ideelle sonde koncentration skal optimeres. Det ligger normalt mellem 1 – 50 nM. Endelig kan sonden indeholdende hybridisering løsning opvarmes til 95 ° C i 5 min til at denaturere enhver sekundær strukturer, hvis dette er en bekymring. Et vigtigt skridt til at teste specificiteten af en sonde, er især når det anvendes for første gang, at inkludere en negativ (scrambled) såvel som en positiv (for eksempel U6) kontrol sonde, for at sikre eksperimentelle succes (figur 2). Ens kontrolelementer (f.eks en CD31 endotel antistof) bør anvendes under trinnet immunfarvning.

Et fælles problem i i situ hybridisering eksperimenter er udvikling af farvningen artefakt/baggrund signal. For at undgå eller minimere artefakt farvning trin, skal vævet beskyttes mod udtørring i hele alle trin, specielt under lange inkubationer. Vi anbefaler, der dækker diasene med RNase-fri coverslips under trinnet hybridisering, især ved høje temperaturer, og brugen af befugtning kamre. Vi foreslår også brugen af en 568 eller 594 fluorophore at opdage cTnT eller protein af interesse under trinnet immunfarvning. Dette vil fjerne enhver autofluorescence, der ofte opstår ved brug af 488 fluorophores anvendes på formaldehyd faste væv.

En anden variabel anbefales opmærksomhed er varigheden af AP farvning udvikling, som afhænger af niveauet af den specifikke miRNA stede i vævet. Vi foreslår, at kontrollere AP farvning progression hver 2 h, for det første eksperiment. Yderligere optimering kan omfatte skiftende temperatur af inkubationen (RT-37 ° C) parameter. Endelig, hvis baggrund begynder at udvikle før sande miRNA sonde farvning, eller hvis AP farvning løsning skifter farve til blå-brun, vi foreslår vask dias i PBST to gange, og udskiftning Farvningsopløsningen med en frisklavet.

Endelig, selv om denne protokol er blevet optimeret til Formalin-fast/Paraffin-embedded mus hjerte væv, det kan være tilpasset til alternativt behandlede væv (PFA fast/OLT indlejret) og/eller anvendelse af de forskellige sonde eller antistof. En begrænsning af kombinerer i situ hybridisering og immunfarvning, der bør overvejes er den manglende af flere antistoffer binder sig til deres respektive epitoper, på grund af den mulige ødelæggelse af sidstnævnte dem ved de høje temperaturer bruges under hybridisering og strenghed vaske trin. Yderligere begrænsninger af både i situ hybridisering og immunfarvning teknikker refererer oftest til magten af disse teknikker til at opdage meget lave koncentrationer af miRNA eller protein molekyler henholdsvis. Signal amplifikation kits er tilgængelige til brug for enten grave eller antistof påvisning når miRNA eller protein overflod er en bekymring. Disse kits også give et fluorescens alternativ til påvisning af miRNAs, som, når kombineret med fluorescerende immunfarvning kan forenkle billede erhvervelse. Alternative metoder, såsom Real-Time PCR og Western Blotting der har større følsomhed, kan også behandle lav overflod spørgsmål. Men i modsætning til i situ hybridisering/immunfarvning protokol, disse teknikker giver ingen oplysninger om væv-specifikke lokalisering af miRNA/protein molekyler.

For at opsummere, vi beskriver en protokol, der giver samtidig registrering af miRNA og protein molekyler på det samme væv, som vi mener vil være et uvurderligt værktøj i miRNA forskning på musemodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Athanasios Papangelis, for kritiske kommentarer til manuskriptet. FM er støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP er støttet af American Heart Association videnskabsmand udvikling Grant (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

Genetik sag 139 mikro-RNA udtryk profilering LNA sonde i situ hybridisering immunfarvning Hjertehypertrofi
Væv-specifikke miRNA udtryk profilering i mus hjerte sektioner ved hjælp af <em>In Situ</em> hybridisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter