Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية

Published: June 10, 2018 doi: 10.3791/57921
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

نقدم بروتوكول للكفاءة والسائبة والسريع الارتداد الكيميائية الخلايا الجذعية pluripotent البشرية التقليدية أعدادا النسب (هبسك) إلى دولة برييمبلانتيشن مثل epiblast pluripotent السذاجة ابيجينوميكالي مستقرة. نتائج هذا الأسلوب في التعبير الجيني انخفاض النسب أعدادا وتحسن ملحوظ في تمايز مولتيلينيجي الموجهة عبر مرجع واسع النطاق من خطوط هبسك التقليدية.

Abstract

السذاجة البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (N-هبسك) مع تحسين الأداء الوظيفي قد أثر على نطاق واسع في الطب التجديدي. والهدف من هذا البروتوكول أن تعود كفاءة الخلايا الجذعية pluripotent البشرية أعدادا النسب، التقليدية (هبسك) المحافظة على ظروف خالية من علبة التغذية بالورق أو علبة التغذية بالورق-تعتمد على أن السذاجة مثل بلوريبوتينسي مع تحسين الأداء الوظيفي. يستخدم هذا الأسلوب الارتداد السذاجة الكيميائية اللوكيميا الكلاسيكية المثبطة عامل (LIF)، GSK3β، ومنظمة مجاهدي خلق/إيرك تثبيط كوكتيل (ليف-2i)، وتستكمل مع فقط مثبط تانكيراسي XAV939 (ليف-3i). ليف-3i يعود هبسك التقليدية إلى دولة مستقرة pluripotent اعتماد النسخي، والكيمياء الحيوية، وميزات جينية من epiblast غرس ما قبل البشرية. يتطلب الحد الأدنى خلية ثقافة التلاعب هذا الأسلوب ليف-3i وهو الغاية استنساخه في مرجع واسع النطاق من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسك) وخطوط خالية من التحوير البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسك). لا يتطلب الأسلوب ليف-3i خطوة إعادة فتيلة قبل التمايز؛ ن-هبسك يمكن أن تكون متباينة مباشرة مع كفاءات عالية للغاية والحفاظ على كاريوتيبيك وزيادة ابيجينوميك (بما في ذلك في مواضع مطبوع). ولزيادة الطابع العالمي للأسلوب، تستزرع هبسك التقليدية أولاً في كوكتيل ليف-3i تكملة مع اثنين من جزيئات صغيرة إضافية أن تحفيز البروتين كيناز (فورسكولين) وسونيك القنفذ (sHH) (بورمورفاميني) مما يشير إلى (ليف-5i). هذه الخطوة التكيف 5i ليف قصيرة إلى حد كبير يعزز توسيع الاستنساخ الأولية هبسك التقليدية ويسمح لها أن تكون بعد ذلك عادت ساذجة مع ليف-3i وحدها بكميات كبيرة، مما ينفي الحاجة إلى الانتقاء/سوبكلونينغ نادرة N-هبسك المستعمرات في وقت لاحق. يتم الاحتفاظ هبسكس ليف-5i-استقرت فيما بعد في ليف-3i وحدها دون الحاجة للجزيئات المضادة أبوبتوتيك. الأهم من ذلك، العودة ليف-3i يحسن ملحوظا بلوريبوتينسي الوظيفية مرجع واسع النطاق هبسك التقليدية بالتناقص على التعبير الجيني أعدادا النسب ومحو تقلب الناقلات من التمايز الموجهة عادة ولاحظ بين خطوط هبسك المستقلة. هي الأوصاف تمثيلاً لليف-3i-عادت N-هبسك الاستراتيجيات المقدمة، والتجريبية للمقارنات الفنية من هبسك اسوي في النسب معبي مقابل. وترد الدول الشبيهة بالسذاجة.

Introduction

نظام الثقافة 2 طاء (مثبط لمنظمة مجاهدي خلق/إيرك و GSK3β) وضعت أصلاً صقل الماوس غير متجانسة على أساس المصل الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الثقافات إلى دولة أرض موحدة من بلوريبوتينسي أقرب إلى preimplantation epiblast الماوس1. ومع ذلك، لا يدعم 2 طاء مستقرة صيانة خطوط الخلايا الجذعية (هبسك) pluripotent البشرية2. جزيء صغير معقدة، عامل النمو-تستكمل، ومحوره وراثيا النهج المختلفة ذكرت في الآونة الأخيرة لالتقاط مزعومة مماثلة pluripotent الشبيهة بالسذاجة البشرية الجزيئية الدول2. ومع ذلك، العديد من الدول "ساذجة مثل" التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الأساليب أيضا أظهرت عدم الاستقرار كاريوتيبيك، ابيجينوميك العيوب (مثلاً، الخسارة العالمية للطباعة الجينوم الأبوية)، أو ضعف التمايز المحتملة.

في التباين، مزيج تثبيط الكيميائية ثلاثية GSK3β، إيرك وإشارات تانكيراسي والعوامل المثبطة اللوكيميا (ليف-3i) كان كافياً لعودة الشبيهة بالسذاجة مستقرة مرجع واسعة ل خطوط هبسك التقليدية3. هبسك ليف-3i-عادت السذاجة (N-هبسك) المحافظة على كاريوتيبيس العادي وزيادة تعبيرهم عن الجينات البشرية epiblast preimplantation الخاصة بالسذاجة (e.g.,NANOG، KLF2، NR5A2، DNMT3L، هيرفه، ستيلا (DPPA3)، KLF17 ، TFCP2L1). ليف-3i الارتداد أيضا تمنح هبسك مع مجموعة خصائص الجزيئية والبيوكيماويه فريدة من نوعها بلوريبوتينسي ساذجة مثل مسك شملت زيادة إشارات STAT3 فوسفوريلاتيد، وانخفض إيرك الفسفرة، البد العالمية 5-ميثيلسيتوسيني هيبوميثيليشن، ديميثيليشن البد على نطاق الجينوم في الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)-المروجين جين معين، ومهيمنة استخدام محسن OCT4 القاصي. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع غيرها من السذاجة مطبوع أساليب العودة التي أدت إلى أبيرانتلي هيبوميثيلاتيد المكاني الجينوم، هبسك ن ليف-3i-عادت كانت تخلو من فقدان مطبوع البد أنماط منتظمة أو فقدان التعبير methyltransferase الحمض النووي (مثلاً، DNMT3B DNMT1، DNMT3A،)3.

ثقافة 3i ليف مباشرة من مجموعة واسعة من التقليدية البشرية الخلايا الجذعية الجنينية (هيس)، والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك) نمت على مغذيات أو ظروف خالية من تغذية E8 تحقيق العودة السريعة والسائبة لدولة مثل epiblast ساذجة. بيد 3i ليف مباشرة ساذجة العودة قد تكون غير فعالة في بعض خطوط هبسك التقليدية غير مستقرة بسبب التقلبات الجينوم وتستعد النسب المتأصلة الناجمة عن الخلفيات المتنوعة وراثيا المانحين.

وهكذا، لتوسيع الأداة المساعدة لأسلوب ليف-3i، تحسين تدريجي ووضعت وهو المقدمة في هذه الوثيقة، التي يسمح العودة السذاجة العالمي مع ما يقرب من أي هيس التقليدية أو خط هيبسك خالية من التحوير مثقف على مغذيات. يستخدم هذا الأسلوب الارتداد السذاجة إضفاء الطابع العالمي خطوة عابرة ثقافة أولية في هبسك التقليدية التي تكمل كوكتيل ليف-3i مع اثنين إضافية الجزيئات الصغيرة (ليف-5i) أن تحفيز البروتين كيناز (فورسكولين) و (سونيك القنفذ (sHH) مما يشير إلى بورمورفاميني). مرور أولية واحدة هبسك التقليدية في ليف 5i لهم تتكيف مع الارتداد ليف-3i مستقرة اللاحقة بكميات كبيرة. الأولية 5i ليف التكيف تقوي إلى حد كبير وحيد الخلية الأولى انتشار الاستنساخ هبسك التقليدية التي نمت في E8 أو مغذيات (قبل اللاحقة مستقرة ومستمرة مرورهم في ليف-3i وحدها). خطوط هبسك التقليدية تكييفها أولاً إلى مرور واحد في ليف 5i تحمل الجملة اللاحقة الاستنساخ باساجينج من السذاجة عادت الخلايا في ظروف ليف-3i، مما يغني عن الحاجة إلى الانتقاء وسوبكلونينغ المستعمرات مستقرة نادرة، أو الاستخدام الروتيني الجزيئات المضادة أبوبتوتيك أو مثبطات البروتين المرتبطة رو كيناز (روك).

الأسلوب ليف-3i قد استخدمت بنجاح لتوسيع ستابلي والحفاظ على مرجع واسع النطاق > 30 خطوط هبسك التقليدية مستقلة ومتنوعة جينياً > الممرات 10 – 30 باستخدام أما أساليب الانفصال غير الانزيمية أو الانزيمية، و دون دليل على تحريض كروموسومية أو شذوذ ابيجينوميك، بما في ذلك التشوهات في الجينات مطبوع المكاني. بالإضافة إلى ذلك، متسلسلة ليف-5i/ليف-3i الثقافة هو السذاجة فقط عودة الأسلوب تم الإبلاغ عنها حتى الآن أن يحسن بلوريبوتينسي الوظيفية مرجع واسعة لخطوط هبسك التقليدية بالتناقص على التعبير الجيني أعدادا النسب و شكل كبير تحسين قوتها التمايز مولتيبوتينت. ليف-3i السذاجة العودة أسلوب يمحو الأصيل داخلية تقلب للتفريق بين خطوط هبسك معبي النسب، والتقليدية، وسيكون لها فائدة كبيرة للتطبيق في الطب التجديدي، والعلاجات الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان والبروتوكولات التي وافقت عليها جون هوبكنز مدرسة للطب معهد رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إياكوك).

1-التحضير للماوس الجنينية الليفية (MEF) لتعتمد على التغذية التقليدية (هيسك المتوسطة/MEF) أو السذاجة عادت هبسك (ليف-3i المتوسطة/MEF) الثقافة

  1. شراء أو إعداد داخلية منخفضة-مرور الإمدادات من مغذيات MEF من CF1 أو CF1 x DR4 الهجين E13.5 الماوس الأجنة بعد البروتوكولات المنشورة4.
    1. كريوبريسيرفي مرور منخفضة (p1-p2) MEF ثقافات ما قبل (للتخزين على المدى الطويل) أو التشعيع بعد (لمدة 6 أشهر) ومخزن في النتروجين السائل كما تم وصفه سابقا4.
    2. تشعيع (5,000 راد) السائبة MEF موسعة تحت p5 استخدام γ-أو X-أشعة-إيرادياتور وتحضير مختبرين في 1.5 × 106 خلايا كل قنينة لتخزين قصيرة الأجل (أقل من 6 أشهر) في-80 درجة مئوية في الثلاجة درجة حرارة منخفضة للغاية.
    3. لوحة بين 1.2 x 106 (طازجة المشع غير cryopreserved) و 1.5 × 106 (المشع cryopreserved) MEF كل لوح مهيلم 6-بئر واحدة لإعداد الثقافات الفرعية، كما هو موضح أدناه.
  2. إعداد المغلفة بالجيلاتين ألواح المعالجة بزراعة الأنسجة المعقمة 6-جيدا بإضافة 1.5 مل من 0.1% العقيمة الجيلاتين الحل لكل بئر في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
  3. احتضان لوحات المغلفة بالجيلاتين في 37 درجة مئوية على الأقل 1 ح أو بين ليلة وضحاها في حاضنة مختبر CO2 .
  4. في اليوم التالي، ذوبان الجليد مرور منخفضة (مثل P2 إلى P4) cryopreserved [دمس] والمشع (راد 5,000) MEF وفقا للخطوات المبينة أدناه.
    ملاحظة: غير المشعع MEF ينبغي أيضا مذاب، توسعت والمشع فورا قبل الاستخدام.
  5. ضع قاسمة MEF cryopreserved في حمام مائي 37 درجة مئوية. عند ذوبان الجليد، تعقيم الأنبوب مع الإيثانول وتمييع فورا كريوبروتيكتانت [دمس] إذ على الأقل مع MEF المتوسطة (الجدول 1) داخل مجلس الوزراء السلامة (مثل نقل 1 مل [دمس]-MEF قاسمة إلى 9 مل MEF المتوسطة في 15 مل العقيمة بوقي).
  6. الطرد المركزي الخلايا MEF المخفف في 200 x غ لمدة 5 دقائق في أنابيب معقمة 15 مل المخروطية.
  7. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، نضح وتجاهل المادة طافية خالية من الخلايا وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 – 2 مل الطازجة MEF المتوسطة.
  8. بلطف تجاهل الحل الجيلاتين وإضافة 2 مل MEF إعادة تعليق في المتوسط MEF لكل بئر من لوحة 6-بئر جيلاتينيزيد، كما هو مبين أعلاه. MEF عد الخلايا ولوحة 1.2 x 106 (طازجة المشع غير cryopreserved) أو 1.5 × 106 (المشع cryopreserved) MEF كل لوح مهيلم 6-بئر واحدة.
    ملاحظة: جميع لوحات ثقافة الخلية التي يتم نقلها من حاضنة2 CO للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء يمكن أن تمحى بلطف مع ورقة رش الإيثانول ولكن ينبغي أن لا تكون مباشرة رش مع الحل الإيثانول 70% لتجنب نشر الإيثانول في الآبار.
  9. احتضان لوحات MEF عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة مختبر CO2 (5% CO2، الأجواء الرطبة) للسماح للمرفق، قبل استخدامها.

2-الجملة استقرار الثقافات التقليدية هبسك "الارتداد السذاجة اللاحقة" مع "خطوة التكيف" 5i ليف موجزة

  1. التحقق من صحة كافة بنود هبسك التقليدية لحيازته تناذر عادية بالنطاقات ز، قبل بداية ليف-5i/ليف-3i الارتداد.
    ملاحظة: ليف-3i العودة لخطوط عالية-مرور هبسك التقليدية (مثلاً.، ف > 40-50) ينبغي تجنبها، نظراً لهذه الثقافات قد سبق المرفأ الجينوم الانحرافات التي قد تؤثر سلبا على الارتداد ليف-3i مستقرة وفعالة، والجزء الأكبر من جاهزة، خطوط هبسك التقليدية.
  2. الحفاظ على وتوسيع الثقافات التقليدية هبسك مع كاريوتيبيس العادية المصادق عليها في نظام ثقافة على أساس MEF (كما ورد في القسم 1)، أو نظام ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق (وفقا لتفضيل المحقق).
    ملاحظة: كلا تعتمد على تغذية هبسك/MEF كوكولتوريس (مثلاً، هيس المتوسطة (الجدول 1) وتستكمل مع 4 – 10 نانوغرام/مل بفجف) أو خالية من علبة التغذية بالورق (على سبيل المثال.، وسائط 6 5 أو متسير E8 (وفقا لإرشادات الشركة المصنعة في لوحات المغلفة فيترونيكتين) أساليب متوافقة مع الجزء الأكبر من السذاجة الارتداد استخدام نظام ليف-5i/ليف-3i/MEF (الشكل 1). أساليب عدم الانزيمية المفضلة باساجينج هبسك التقليدية قبل أعدادهم للعودة. ولا تتضمن تركيبات وسائط 5i ليف وليف-3i المضادات الحيوية أو العوامل المضادة للفطور. ويتوقع القواعد العملية القياسية للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء العقم وصيانة احتراما صارما لتجنب أي تلوث البكتيرية أو الفطرية.
  3. MEF-على أساس نظام الثقافة، تحضير مغذيات MEF في لوحة 6-بئر جيلاتينيزيد كما هو موضح في القسم 1 يوم واحد على الأقل قبل باساجينج من الثقافات ليف-5i-تكييف هبسك التقليدية.
  4. بعد أن وصلت إلى الثقافات التقليدية هبسك كونفلوينسي ~ 50 ٪ (أي، 3-5 أيام بعد الطلاء الأولى)، يستعاض عن مستنبت القياسي هيس بليف 5i المتوسطة (2 مل في البئر؛ الجدول 1).
    ملاحظة: هذه الخطوات في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  5. الثقافة والمحافظة على التقليدية هبسك/MEF مدة تصل إلى 2 يوما في 5i ليف في الحاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة). تغيير المتوسطة 5i ليف يوميا لتكييفها لمرور اللاحقة والعودة مستقرة في ليف-3i.
  6. وبدلاً من ذلك، لثقافات خالية من التغذية التقليدية (مثلاً، في E8)، هبسك الثقافة في ليف 5i فقط بين عشية وضحاها قبل باساجينج في صباح اليوم التالي.
    ملاحظة: الثقافات 5i ليف وليف-3i يمكن كلاهما الحفاظ على مع الغلاف الجوي (21% O2) أو الأكسجين الفسيولوجية (5% O2) مستويات في الحاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة).
  7. قبل باساجينج، وضع لوحات الثقافة في خزانة السلامة البيولوجية وتغسل ليف-5i-تكييف هبسك التقليدية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل كاشف تفكك خلية لكل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO، وتريتوراتي برفق مع ماصة في تعليق خلية واحدة إلى الوراء في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك يمكن استخدام المخازن المؤقتة للانفصال غير الانزيمية لإعداد الخلايا المفردة باساجينج.
  8. جمع تعليق خلية في المتوسط هيس (إضعاف إضعاف على الأقل) في أنابيب مخروطية عقيمة 15 مل، ولطف تريتوراتي الخلايا التي بيبيتينج للحصول على تعليق خلية مفردة.
  9. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق، أسبيراتي/تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند بيليه الخلية في 1-2 مل المتوسطة 5i ليف في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
  10. أغسل لوحة MEF مطلي مسبقاً مرتين مع برنامج تلفزيوني (2 مل كل بئر في لوحات 6-جيدا) وتوزيع 1 – 2 × 106 خلايا (في المتوسط 2 مل LIF 5i) على 1 جيدا لصفيحة MEF غسلها في برنامج تلفزيوني.
  11. تعديل وتحسين كثافة الطلاء الأولى لكل خط هبسك الفردية أن تكون ساذجة-عادت، ريبلاتينج الكفاءة يمكن أن تكون شديدة متغيرة. ضع اللوحة في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة).
    ملاحظة: الاستخدام الروتيني لمكافحة apoptotic الكواشف لا ينصح لمعظم خطوط هبسك مع هذا الأسلوب. نظام 5i ليف يعزز إلى حد كبير الفعل الكفاءة إعادة الطلاء الاستنساخ الجملة الأولى من خطوط هبسك التقليدية. ومع ذلك، استخدام مرة واحدة للمانع روك (5 – 10 ميكرومترات Y-27632) يمكن زيادة تحسين الأولية 5i ليف كفاءة إعادة الطلاء الاستنساخ الثقافات التقليدية هبسك في المقطع الأول لبعض خطوط هبسك معبي النسب غير مستقرة مع الميل لعفوية التفريق.
  12. إذا بدءاً من الثقافات خالية من علبة التغذية بالورق (مثلاً، E8)، مباشرة نقل بئر واحدة من هبسك التقليدية منفصلان في 5i ليف في تكييف أحد المشع MEF مطلي جيدا (أي، مرور 1:1).
  13. في اليوم التالي، بلطف دوامة لوحة لرفع كافة الخلايا غير مرفقة، نضح المتوسطة (المياه والصرف الصحي برنامج تلفزيوني اختياري) واستبدال مع 2 مل من ليف 5i المتوسطة. تنفيذ هذه الخطوة في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء يوميا لمدة 3 – 5 أيام أو حتى يتم الخلايا روافد 60-70% (الشكل 1). ضع اللوحة في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة).

3-الصيانة الطويلة الأجل والتوسع في هبسك ن في المتوسط ليف-3i

  1. عقب أولية 5i ليف التكيف، ممر اللاحقة مستقر الثقافات ليف-3i كل 3 – 4 أيام في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، أو عندما تصبح الثقافات روافد 60-70% (الشكل 1).
    ملاحظة: تتطلب الثقافات ليف-3i صيانة صارمة والسماح للثقافات هبسك ن للوصول إلى كثافة عالية كونفلوينسي/خلية من ثقافة طويلة (مثلاً.، > 4 أيام) يقلل من كفاءة إعادة الطلاء الاستنساخ اللاحقة، ويعزز العفوية التفريق.
  2. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، تجاهل المتوسطة الثقافة وتغسل كل جيدا للثقافات ليف-5i/ليف-3i بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني بلطف. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية. احتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة).
  3. جمع تعليق خلية، إضافة المتوسطة هيس (دون موانع أو عوامل النمو (الجدول 1)؛ إضعاف إضعاف على الأقل) استرداد جميع هبسك ولطف تريتوراتي الخلايا التي بيبيتينج للحصول على تعليق خلية مفردة. نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل.
  4. الطرد المركزي في 300 غرام لمدة 5 دقائق و aspirate/تجاهل المادة طافية. إعادة تعليق بيليه خلية في المتوسط ليف-3i. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
  5. لوحة ~ 2 × 105 خلايا كل بئر على MEF المشع في لوحة 6-جيدا جيلاتينيزيد باساجينج الروتيني للثقافات ليف-3i. لثقافات ليف-5i-تكييف الأولية، لوحة بكثافة أعلى في البداية (4 × 105 خلايا/جيد) قبل مرور الأولى إلى ليف-3i/MEF.
  6. إعادة لوحة وتوزيع هبسك ليف-5i-تكييفها على طازجة غسلها PBS المشع MEF تغذية لوحات (أعد في اليوم السابق كما ذكر أعلاه) في الأجلين المتوسط وليف-3i. استبدال المتوسطة ليف-3i يوميا.
  7. مرور N-هبسك أقل السائبة المستمر 4 – 7 مقاطع في مسبقة ليف-3i المتوسطة استخدام هبسك ن في الدراسات الفنية أو تجميد. تسجيل عدد الممرات هبسك ن أما التقليدية أو ليف-3i وسائل الإعلام.
    ملاحظة: ليف-3i العودة المرور عالية (مثل > p40) لا ينصح بخطوط هبسك معبي النسب، والتقليدية. وينبغي بذل مجهود لتعود خطوط هبسك التقليدية في أدنى مرور ممكن أن تكون متوفرة. بالإضافة إلى ذلك، استخدام هبسك ليف-3i-عادت التي شهدت أكبر من 10 ليف-3i الممرات لا ينصح للدراسات الفنية، ومنذ هذه الثقافات هبسك ن قد إيواء الحيوانات المستنسخة كاريوتيبيكالي غير طبيعي بسبب تحديد ثقافة الخلية الاستنساخ المطول. ريفيرسيونس ليف-5i/ليف-3i جديدة من خطوط هبسك التقليدية المنخفضة-المرور ينبغي أن تجري الدراسات الفنية، إذا مخزونات هبسك ن مع < 10 مقاطع من ليف-3i غير متوفرة.

4-تجميد وذوبان الجليد من ليف-3i-عادت N-هبسك

  1. قم بتوسيع هبسك ن عادت للممرات على الأقل 5-7 في ليف-3i، كما هو مبين أعلاه، قبل استخدامها في الدراسات الفنية أو تجميد طويلة الأجل. سجل عدد الممرات في الشروط التقليدية وفي ظروف ليف-3i على كل قنينة كريوبريسيرفيد.
    ملاحظة: يمكن أن فائض ليف-3i-عادت N-هبسك لا تستخدم في الاختبارات الوظيفية cryopreserved في كل مرور، لكن تجميد أقل العودة بعد انتهاء فقرات (على سبيل المثال.، < p3) قد يؤدي إلى الفقراء، أو الكفاءة الانتعاش بعد ذوبان الجليد اختلافاً كبيرا.
  2. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، نضح المتوسطة الثقافة وتغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني (2 مل كل بئر)، نضح برنامج تلفزيوني وتنأى هبسك المستعمرات إلى الخلايا المفردة باستخدام الخلية المفرزة الحل (1 مل كل بئر). وضع لوحة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة). تمييع الحل مفرزة الخلية مع المتوسطة ليف-3i (2-fold)، وجمع هبسك في عقيمة 15 مل مخروطية والطرد المركزي خلايا في 200 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه الخلية في ليف-3i المتوسطة (1 – 2 مل كل ما يعادل جيدا). حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
  3. الطرد المركزي هبسك ن في الأجلين المتوسط وليف-3i (200 x ز لمدة 5 دقائق) وريسوسبيند الخلايا في خزانة السلامة الأحيائية في حل تجميد (الجدول 2)، كثافة على الأقل 1 × 106 خلايا/مل.
  4. نقل الخلايا في أنابيب التبريد التخزين الطويل الأجل، ووضع في حاوية تجميد بطيء. تسمح العينات لتجميد بين عشية وضحاها في ثلاجة-80 درجة مئوية.
  5. في اليوم التالي، نقل كريوفيالس في ثلاجة النتروجين سائل للتخزين على المدى الطويل.
  6. لذوبان الجليد، ضع قنينة مجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية ل ~ 2 دقيقة تعقيم القنينة (أي رذاذ الإيثانول) ونقل هبسك في عقيمة 15 مل مخروطية وتمييع الخلايا هيس في الوقت المتوسط (الجدول 1) وتستكمل مع 5 ميكرومترات من بطء البروتينات المرتبطة رو كيناز (روك) مثبط Y-27632 داخل غطاء سلامة بيولوجية عقيمة مجلس الوزراء.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، تجاهل المادة طافية خالية من الخلايا وريسوسبيند بيليه الخلية في ليف-3i المتوسطة (1-2 مل) وتستكمل مع 5 ميكرومترات روك مثبط Y-27632.
    ملاحظة: سيؤدي إلى استبعاد Y-27632 الكفاءة الانتعاش بعد ذوبان الفقراء (الشكل 2).
  8. نقل الخلايا المذابة حراكه في المانع ليف-3i/روك على الآبار اﻻستطﻻعية مطلي غسلها في برنامج تلفزيوني. كريوبريسيرفي ليف-3i الثقافات في كثافة 1 × 106 خلايا للقنينة الواحدة. ذوبان الجليد كل من هذه القنينات إلى مغذيات في بئر واحدة للوحة 6-جيدا جيلاتينيزيد.
  9. في اليوم التالي، تبدأ العادية ليف-3i التوسع المتوسط دون رو كيناز المانع.

5-تغذية لإزالة لجمع العينات هبسك ن

  1. إعداد عينات من ليف-3i/MEF (أو هيسك/MEF التقليدية) الثقافات (أي، للتعبير الجيني (مثلاً الكمية الرايت-بكر، [ميكروارس]) أو تحليل البروتين (مثلاً، وصمة عار الغربية)، تستنزف الثقافات 3i ليف من مغذيات MEF استخدام مغناطيسية تنشيط الخلية الفرز (ماك) مع الأجسام المضادة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-81 المغلفة ميكروبيدس وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  2. وبدلاً من ذلك، استخدام الأسلوب التالي بسيطة الطلاء قبل أن تستنفد ثقافات مغذيات، كما هو موضح أدناه.
  3. في غطاء سلامة بيولوجية عقيمة مجلس الوزراء، تجاهل المادة طافية خالية من الخلية، وتغسل بيليه مع PBS العقيمة 2 مل كل بئر. فصل الثقافات ليف-3i/MEF ملتصقة باستخدام الخلية المفرزة الحل (1 مل/جيد). احتضان لمدة 5 دقائق في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة). جمع هبسك في عقيمة 15 مل مخروطية الشكل. أغسل هيس في إضعاف متوسطة، نقل الخلايا إلى العقيمة 15 مل المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 200 x غ لمدة 5 دقائق.
  4. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، إعادة تعليق كل بئر ليف-3i/MEF فصل الخلايا إلى 2 مل الوسط ليف-3i، ونقل مباشرة إلى بئر جديدة للوحة 6-جيدا أنه قد تم حديثا المغلفة مع الجيلاتين 0.1%.
  5. احتضان خلايا هبسك ليف-3i/MEF ح 1 في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة). جمع الخلايا غير ملتصقة مع ماصة في أنبوب مخروطي الشكل جديد. بلطف إضافة 2 مل هيس متوسطة لكل بئر ودوامه لجمع الخلايا غير ملتصقة المتبقية.
    ملاحظة: سيتم إرفاق أغلبية MEF المشع إلى لوحة جيلاتينيزيد في ح 1، تاركة أغلبية هبسك في تعليق.
  6. الجمع والطرد المركزي خلايا في 300 x غ 5 كحد أدنى من المياه والصرف الصحي في برنامج تلفزيوني. الأداة الإضافية-تجميد بيليه الخلية في النتروجين السائل بعد الطرد المركزي، أو بدلاً من ذلك إعادة تعليق الكريات في المخزن مؤقت ليسينج متوافق مع تحليل البروتين أو الأحماض النووية المصب (الشكل 2ب).
  7. إجراء الأوصاف لخطوط هبسك ليف-3i مع عنصر تحكم هبسك اسوي معبي تقليدية مطابقة.
    ملاحظة: بسبب التغيرات الجوهرية بين الثقافات وداخلها معبي، يتم إعداد عناصر التحكم ذات الصلة في تيميبوينت مطابقة في الثقافة أو قبل عودة ساذجة. بروتوكولات مفصلة ومواد للمتلقين للمعلومات بيويماجينج إيمونوفلوريسسينت، التدفق الخلوي، النشاف الغربية، التعبير الجيني (RT-PCR فحوصات و [ميكروارس])، ودراسات مثلايشن (دوت وصمة عار، البد مثلايشن ميكرواري)، ومحسن OCT4 الدانية والبعيدة يتم توفير فحوصات مراسل غلبة وإشارات المانع فحوصات في أماكن أخرى3.

6-مرحلة ما بعد العودة من السذاجة: التحقق من سلامة الجينوم والاحتفاظ ببصمات الوالدين من هبسك ن ليف-3i-عادت قبل استخدامها في "الاختبارات الوظيفية"

  1. الشاشة الثقافات هبسك معبي التقليدية، والانطلاق لحيازته تناذر طبيعية (مثلاً، مع تحليل الموجات جيمسا المصبوغة باستخدام أساليب نشر 7) قبل الشروع في العودة ليف-5i/ليف-3i.
    ملاحظة: هذا هو للقضاء على السكان هبسك التقليدية التي قد تأوي التعديلات الجينوم الشاذة التي قد تدفع ميزة أرتيفاكتوال بقاء انتقائية في الاستنساخ ليف-3i الظروف.
  2. لتحقيق أفضل النتائج، طازجة تعود هبسك التقليدية الثقافات إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع ليف-3i أسابيع عدة قبل استخدامها في الدراسات الفنية أو توجيه التمايز.
    ملاحظة: روتين الثقافة 'صيانة' في ظروف ليف-3i لأكثر من 10 مقاطع لا ينصح بالتالي من السذاجة العودة لفترات طويلة. توسيع الروتينية وصيانة خطوط هيس وهيبسك ينبغي أن يؤديها باستخدام نظم الثقافة التقليدية (مثلاً في E8 أو MEF/هيس متوسطة مع بفجف).
  3. تقييم خطوط هبسك ن بعد إعادتها للإبقاء على وضعها الطبيعي كاريوتيبيس الفقرات 5-7 بعد انتكاس ليف-3i (على سبيل المثال-، مع تحليل المصبوغة جيمسا-الفرقة7، أو أي طريقة أخرى لاختيار).
  4. تقييم كافة الأسطر N-هبسك reverted للاحتفاظ ببصمات الجينوم الأبوية العادية بتحليل الحمض النووي مثلايشن الاختيار (بروتوكولاتمثل"الحمض النووي البد" ميكرواري تحليل بصمات الأبوية في هبسك ن ليف-3i-عادت ترد في مكان آخر3 ) بعد 5 – 10 مقاطع من الارتداد ليف-3i.

7-وظيفة ساذجة الأيلولة: التصميم التجريبي المبادئ التوجيهية لفحوصات الكمية الموجهة تمايز استخدام ليف-3i-عادت N-هبسك

  1. مباشرة استخدام ليف-3i ن-هبسك بروتوكولات التمايز توجه المنشأة دون التلاعب الثقافة خلية إضافية.
    ملاحظة: إعادة فتيلة (أي تحويل هبسك ن العودة إلى ظروف معبي التقليدية قبل استخدامها في فحوصات التمايز الموجهة) ليس من الضروري مع أسلوب ليف-3i ولا ينصح.
  2. للتحكم في الآثار للمقايسة وداخلية تقلب في اختبار وظيفية لخطوط هبسك الفردية، عبر-التحقق من صحة مقايسات التمايز النسب المحددة باستخدام بروتوكولات التمايز مستقلة مع هبسك مالا يقل عن ثلاثة خطوط المستمدة من الخلفيات الوراثية مستقلة (أي، هيبسك المستمدة من المانحين وهيس متعددة).
  3. للمقارنات الفنية، إعداد الثقافات المشابهة، في مرور أي ما يعادل عدد، ومن نفس الخط هبسك (اسوي) بالتوازي مع معبي النسب التقليدية والثقافات هبسك ليف-3i-عادت. الحفاظ على الثقافات هبسك اسوي معبي السذاجة الأخوة في وسائل الإعلام الخاصة بها (على سبيل المثال-، E8 مقابل. LIF-3i)، وفي نفس الوقت التفريق بين استخدام بروتوكولات التمايز متطابقة والمواد، وإلى القضاء على أي تحيز التجريبية (الشكل 4).
  4. اسوي معبي مقابل مقارنات هبسك ساذجة، تعديل وتحسين كثافة الطلاء الأولى لكل تحليل التمايز الفردي.
    ملاحظة: تتوفر بروتوكولات مفصلة للسلف العصبية والأنسجة نهائي والتفريق بين توجيه حمتو غشائي هبسك ن ليف-3i-عادت في أماكن أخرى 3. ن-هبسك ليف-3i-عادت لديها القدرة التكاثري والتمايز أكثر قوة في فحوصات التمايز الموجهة من هبسك التقليدية. ن-هبسك عادة ما يتطلب تركيز طلاء أولى أقل من هبسك التقليدية، وخلافا لما هبسك معبي التقليدية النظراء، لا تتطلب استخدام الكواشف مكافحة apoptotic لتعزيز بقائها الاستنساخ عقب الانزيمية الهضم في فحوصات التمايز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا البروتوكول يحسن كفاءة ساذجة مثل العودة مع ليف-3i في كلتا الثقافتين هبسك التقليدية أعدادا النسب تعتمد على التغذية وتغذية مستقلة (الشكل 1). البروتوكول مفصلاً، والموضحة هنا، التكيف متسلسلة الخطوط العريضة لليف-3i بدءاً من أما الشروط هبسك تعتمد على تغذية أو خالية من التغذية التقليدية (مثل E8 المتوسطة).

الممثل يؤدي لعودة 3i ليف هيس التقليدية عدة وتعرض خطوط هيبسك خالية من التحوير في الأرقام 1 – 3. هذه النتائج النموذجية يمكن التحقق من صحتها مع خط هيسك المتاحة تجارياً H9، أو مع المتاحة تجارياً خالية من التحوير، حبل المشتقة من الدم هيبسك ابيسومال خط (6.2) مشتقة في مختبر زامبيديس8،9. مقدمة لخطوة أولية في التكيف 5i ليف تصاريح نشر الثقافات التقليدية هبسك الاستنساخ ذات كفاءة عالية اللاحقة، والجزء الأكبر في ليف-3i، ولا تتطلب وكلاء مكافحة apoptotic أو روك مثبطات10 (الشكل 1أ وب ). لوحات متعددة من هبسك الشبيهة بالسذاجة ويمكن جمع عينات سريعاً لتحليلات المصب أو مولتيلينيجي الموجهة تمايز إلا بعد الفقرات 5-7 في ليف-3i. وبدلاً من ذلك، يمكن cryopreserved الثقافات ليف-3i للتطبيقات المستقبلية. بعد ذوبان الجليد خلية الإنعاش يمكن أن تحسن (الشكل 2) عن طريق إدراج مثبط روك في وسائل الإعلام نعد وذوبان الجليد بعد11.

وكانت المحددات بلوريبوتينسي الجزيئية والوظيفية، على حد سواء في المختبر ، وفي الجنين تمت مراجعتها مؤخرا2. وتشمل هذه العوامل الخلفية الوراثية، واقتناء طفرات الجينات الإنمائية الرئيسية، والاختلافات في هيس، واشتقاق هيبسك ومنهجيات الثقافة المرتبطة بالثقافة. المقدمة أدناه هو ملخص للاختبارات القياسية التي يمكن استخدامها لتوصيف والتحقق من الصحة للمظهرية، الجزيئية، وبلوريبوتينسيس الفنية لليف-3i-عادت هبسك.

مورفولوجيا مستعمرة
الانتقال بين أنظمة الثقافة معبي والتقليدية وليف-3i-عادت يرافق التغيرات الجسدية متميزة في هبسك مستعمرة مورفولوجيا (الشكل 1ب). تتكاثر الخلايا هبسك التقليدية شقة، المستعمرات أحادي الطبقة على نطاق واسع أن يتوسع بسرعة من كتل خلية صغيرة (على MEF أو ظروف خالية من التغذية)، ولكن سيئة كخلايا مفردة. تعرض خطوط هبسك التقليدية لليف-3i يعزز النمو والتوسع وأصغر حجماً، ومعبأة بأحكام، واحد على شكل قبة المستعمرات التي تنشأ كلونالي من الخلايا. هذه التغييرات الشكلية التي عكسها تماما، وليف-3i-عادت المستعمرات على شكل قبة عفويا يمكن الانتقال مرة أخرى إلى التشكل أحادي الطبقة تقليدية إذا سحبت ليف-3i وإعادة تستزرع خلايا في المتوسط القياسي هيسك التقليدية وتستكمل مع بفجف. بالإضافة إلى ذلك، توسيع نطاق النتائج ليف-3i-عادت الخلايا عالية الكثافة المتلاقية (أو الثقافة المطولة دون باساجينج متكررة) في اكتسابها العفوية مورفولوجية مسطحة، التقليدية مع انخفاض كفاءة الاستنساخ؛ وإذ تشدد على الحاجة إلى صيانة الدؤوب ورعاية هبسك ليف-3i-عادت (مثلاً.، < التقاء 40-60 في المائة).

يعيش تلطيخ الفلورة وتحليل سيتوميتريك بلوريبوتينسي السطح علامات تدفق
رصد تقييم علامات بلوريبوتينسي أثناء الانتقال من التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة الثقافة ليف-3i المستمر التالية يمكن أن تكون غير إينفاسيفيلي باستخدام جسم الحية تلطيخ دون الكشف عن أي آثار سلبية على (توسيع ليف-3i/MEF على سبيل المثال-، يعيش تلطيخ مترافق fluorochrome الأجسام المضادة ضد هيئة تنظيم الاتصالات-1-81 وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60، و SSEA4).

الإبقاء على بلوريبوتينسي أثناء العودة ليف-3i يمكن رصدها بشكل روتيني أيضا بتحليل سيتوميتريك تدفق التعبير المرتبطة بلوريبوتينسي ماركر السطحية لهيئة تنظيم الاتصالات-1 والمستضدات سا خلال وحيدة الخلية باساجينج (الشكل 1ج) أو الفلورة لحالها، إصلاح المستعمرات في الموقع (الشكل 3). على الرغم من أن هذه العلامات لا تميز بين التقليدية وليف-3i الدول، على مستويات ترتبط عكسيا مع تواتر التمايز العفوية التي قد تحدث في هبسك عند الانتقال من هبسك التقليدية لظروف ليف-3i. يمكن أيضا أن تستخدم المستضدات السطحية الإضافية التي قد أكثر تحديداً مارك البشرية مثل السذاجة الدول في المختبر2،12،13 للكشف عن فعالية ليف-3i هبسك الارتداد.

التحقق من صحة بلوريبوتينسي الجزيئية من هبسك ن
نظراً لأن الخلفية الوراثية لخطوط هبسك اتسم كمساهم قوي داخلية تقلب، من المهم تقييم دقة الثقافات اسوي في مطابقة تيميبوينتس الثقافة عند مقارنة نظم الثقافة هبسك (الشكل 4). نظراً لبعض هذه النظم أظهرت فعلا لتوليد هبسك السكان مع تكوينات الجينوم وجينيه شاذة2، ينبغي جزيئي أي أسلوب الارتداد ساذجة مع عدد من هبسك ن من الخلفيات الوراثية مستقلة، بطريقة وهذا يكفي للتحقق من إمكانية تكرار نتائج بيولوجية واستبعاد الدول غير تنمويا ذات الصلة "الزائفة-pluripotent" (أي، مع بصمات واضحة بلوريبوتينسي الجزيئية ولكن تفتقر إلى قدرات التفرقة الوظيفية). زيميرلين وآخرون. زيادة توسيع نطاق التحقق من صحة نظام الثقافة ليف-3i تشمل المعايرة بلوريبوتينسيس الجزيئية والوظيفية لعادت N-هيبسك المستمدة من مختلف طرق إعادة برمجة، ومساهم المفترضة معروف آخر التقلبات الوظيفية بين pluripotent الدول2.

تبعاً لذلك، ركزت معظم الدراسات من السذاجة البشرية الثقافة نظم المعايرة بلوريبوتينسي الجزيئية من هبسك ن 1) مستوى جينية (مثلاً هيستون علامات حسب تسلسل شريحة أو رقاقة-بكر، مثلايشن الحمض النووي العالمي إيمونوبلوتس أو كامل الجينوم بيكبريتيت التسلسل، محددة اليل البد مثلايشن [ميكروارس]، OCT4 محسن الاستخدام السائد بنظم مراسل، والنشاط العالمي في العناصر التنظيمية التي الدناز أنا فرط الحساسية، وتكرار عنصر التشكيل الجانبي بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي)، 2) ترانسكريبتوميك مستوى (تسلسل الحمض النووي الريبي والتعبير [ميكروارس]، والكمية RT-PCR)، تحليل التعبير البروتين (مثلاً.، نظام مراقبة الأصول الميدانية والفحص المجهري إيممونوفلوريسسينت النشاف الغربية) و 3) عن طريق الدراسات الأيضية (مثلاً، تحلل، عنصر مؤكسد استقلاب الفسفرة ونيكوتيناميد). تظهر الأمثلة التمثيلية البقع الفلورة وكشف لطخة غربية للتعبير عن علامات رئيسية من بلوريبوتينسي الجزيئية (الشكل 3ب، ج). على سبيل المثال، يظهر في الشكل 3B هي تنشيط فوسفوريلاتيد (والرمات) ومجموع إيسوفورمس STAT3 و ERK1/2، وبصمات الجزيئية مفتاح الماوس ساذجة مثل ESC بلوريبوتينسي. واكتشفت هذه باستخدام الأجسام المضادة الأولية STAT3 المضادة ومكافحة--ERK1/2. بالإضافة إلى ذلك، يتضح بلوريبوتينسي الوظيفية في فحوصات التمايز تيراتوما التقليدية مقابل. الأنسجة teratoma هبسك ليف-3i-عادت تشريح 10 أسابيع بعد الحقن وثابتة في 4% فورمالدهايد والبارافين مضمن (الشكل 3د).

ينبغي أن يشمل إعداد ليف-3i/MEF أو عينات هيس/MEF/بفجف للتحليل الجزيئي المصب MEF استنفادها. ويرد نهجين أعلاه لاستنفاد اﻻستطﻻعية التي استخدمت بنجاح في المختبر. الطلاء قبل MEF بسيطة وموثوق بها، وطريقة فعالة من حيث التكلفة للقضاء على مغذيات من هبسك ن عينات الدراسات الجزيئية وهو بديل مفضل لفصل نظام مراقبة الأصول الميدانية أو أجهزة ماكينتوش (أي مكافحة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-81 أو مكافحة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 المستندة إلى جسم الانفصال ). بالإضافة إلى ذلك، تلقائياً التفريق بين الخلايا ملتصقة هيئة تنظيم الاتصالات-1-السلبية في الثقافات ليف-5i/ليف-3i يمكن سرعة القضاء من الثقافات ليف-5i/ليف-3i ن-هبسك قبل مرور ليف-3i اللاحقة على MEF الطازجة بالطلاء قبل هضمها انزيماتيكالي الخلايا المفردة ح 1 على ألواح مغلفة مسبقاً مع الجيلاتين 0.1% (الشكل 2).

تقييم بلوريبوتينسي الفنية من هبسك ن
فحص أكثر صرامة من بلوريبوتينسي الفنية من PSC هو مقايسة الوهم حقن الكيسة، الذي يقتصر في اختبار خطوط هبسك ن لأسباب أخلاقية. بدلاً من ذلك، حاول العديد من المجموعات التي أبلغت عن توليد هبسك ن مع مختلف الأساليب الأخرى لتوليد التركيبات فيما. إلا أن هذه المحاولات قد أسفرت عن مساهمة الأنساب N-هبسك المتباينة للأجنة مورين أو الخنزير، مقارنة بقدرة توليد الوهم الماوس القياسية ESC2منخفضة أو غير ناجحة للغاية.

الدراسات الفنية الإضافية حققت الموجه في المختبر تمايز المفترضة هبسك ن المتأتية عن طريق أساليب مختلفة، ولكن قد كشفت عن قدرة التمايز مولتيلينيجي متحيزة أو المعيبة، أو تقلص، بمصاحبة إيواء لتشوهات جينية2،13. تم الكشف عن الانحرافات ابيجينوميك مماثلة، خاصة في مطبوع المكاني، في الماوس ESC عقب التعرض المطول ل ليف-2 طاء كوكتيل14. من المثير للاهتمام، أفادت بعض النظم ثقافة العودة التحسينات العالمية في سمات معينة من بلوريبوتينسي الفنية من PSC مثل القدرات المعززة في فيفو مساهمة تروفيكتوديرم2،15 .

باستخدام مجموعة واسعة من هبسك ليف-3i-عادت مستمدة بشكل مستقل، زيميرلين et al. يعمل فحوصات التمايز مولتيلينيجي لإظهار أن النظام ليف-3i يحسن بشكل كبير بلوريبوتينسي الفنية من خطوط هبسك التقليدية 3. يسمح هذا التحليل المنهجي التقليدية مقابل خطوط هبسك ليف-3i في أزواج اسوي للقضاء على الاختلافات تعتمد على داخلية (الشكل 4). خطوط هبسك ليف-3i-عادت لا تتطلب خطوة إعادة فتيلة قبل التمايز EB. ومع ذلك، تتكاثر هبسك ليف-3i في الاستنساخ معدلات أعلى بكثير من الخلايا اسوي الموسع في E8، ومن ثم، الأولى أقل كثافة الطلاء تتطلب التكيف للسماح لكل ثقافة للتوصل إلى التقاء في تيميبوينت مماثلة.

المحققين أن تستخدم بشكل روتيني فحوصات متعددة لإظهار وظائف محسنة هبسك ليف-3i-عادت يتضمن في فيفو فحوصات تيراتوما ليس فقط، بل أيضا في المختبر توجه فحوصات التمايز للعصبية، نهائي الأنسجة وهيماتوفاسكولار الأنساب3 استخدام فحوصات متعددة (مثلاً، 2D أبل3،16 وأنظمة الجسم امبريويد 3D17،18 ). للتحكم في لإمكانية تكرار نتائج تعتمد على التحليل، ينبغي أن يقوم اثنين على الأقل التمييز بين مختلف الأساليب في تكرار لكل زوج اسوي هبسك معبي/ليف-3i الثقافات (مثلاً، الرقم 4، أبل، امبريويد الجسم بروتوكولات التمايز). ينبغي أن يشمل التصميم التجريبي عددا قوية (مثلاً، > 3 – 5) أزواج هبسك اسوي معبي/ليف-3i خطوط خلفيات متعددة، مانحة مستقلة الوراثية (الشكل 4).

Figure 1
رقم 1: تدريجي انتقال الثقافات هبسك التقليدية، وتستعد النسب في ظروف أشبه بالسذاجة مع أسلوب ليف-3i. (أ) مخطط البروتوكولات التدرجي ليف-3i الارتداد. (أعلى التخطيطي) طريقة عامة للانتقال من معبي، هبسك التقليدية للثقافات ليف-3i. (أسفل الرسومات) استراتيجيتين ملخصة لعودة ساذجة ليف-3i التقليدية (معبي) هبسك مثقف في علبة التغذية بالورق (أي، رسمت/MEF إلى ليف-3i/MEF)، أو ظروف خالية من علبة التغذية بالورق (أي، رسمت/E8 لليف-3i/MEF). (ب) PSC البشرية مورفولوجيس. يظهر هي photomicrographs الممثل من هبسك أثناء العودة ليف-3i استخدام خط اللجنة التوجيهية ابيسومال بشرية متاحة تجارياً (6.2). سيظهر لاحظت الانتقالات بين المستعمرات الأولى أحادي الطبقة المسطحة التقليدية، والمستعمرات كلونوجينيك على شكل قبة اللاحقة التي تنشأ عقب مرور في 5i ليف الوسيطة وليف-3i الثقافة ظروف مستقرة. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. (ج) الممثل سيتوميتريك تحليل تدفق علامات بلوريبوتينسي السطحية. سيظهر هي هيئة تنظيم الاتصالات-1-81 وسا-4 السطح التعبيرات في خط هبسك التقليدية 6.2 (p40) توسعت في E8، ومرور أولية في ليف-5i/MEF والفقرات 1 إلى 9 التالية (P1-P9) في ظروف ليف-3i. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : نعد هبسك ن وإعداد العينة اﻻستطﻻعية قبل الطلاء. (أ) المثال دورة التجميد/ذوبان الجليد من ليف-3i/MEF الثقافات. خط اللجنة التوجيهية المستمدة من الدم، وغير متكاملة، خالية من التحوير البشرية الحبل التقليدية المستمدة E5C3 وتوسعت في مغذيات MEF في هيسك المتوسطة وتستكمل مع بفجف 4ng/mL للممرات 18. E5C3 التقليدية، وتستعد النسب في ليف-5i (يسار) وانتقلت إلى المتوسطة ليف-3i للفقرات 3 (مركز). E5C3 ليف-3i الخلايا تظهر في لوحة مركز كانت cryopreserved استخدام المستندة إلى [دمس] cryoprotectant المتوسطة (الجدول 2؛ 1 × 106 خلايا للقنينة الواحدة) وتخزينها في النتروجين السائل). قنينة واحدة قد تحسنت بعد شهر وتم نقل خلايا E5C3 في علبة التغذية بالورق المغلفة جيدا من صفيحة 6-جيدا (على اليمين). خلية الإنعاش يمكن أن تتعزز المكمل المتوسطة ليف-3i مع 5 ميكرومتر Y-27632 للذوبان بعد يوم واحد فقط. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. القضاء MEF (ب) (وأيضا ملتصقة سالب ترا متمايزة خلايا) في الثقافات هبسك ليف-3i/MEF بطريقة ما قبل الطلاء. يظهر هي تدفق التحليلات سيتوميتريك قبل وبعد ما قبل الطلاء PE مترافق مكافحة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-81 وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60 الأجسام المضادة والأجسام المضادة مترافق APC سا-4 سا-1/CD15 الأجسام المضادة مما يدل على استنفاد هيئة تنظيم الاتصالات-1 مستضد السلبية والخلايا اﻻستطﻻعية باستخدام طريقة الطلاء قبل ساعة واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : وصف بلوريبوتينسي في الثقافات ليف-3i/MEF N-هبسك. (أ) علامات بلوريبوتينسي السطحية والنووية. التعبير عن بلوريبوتينسي عامل نانج في نفس (اسوي) في هيئة تنظيم الاتصالات-1-81 م+SSEA4+ التقليدية، تستعد الحبل المستمدة من الدم هيبسك خط E5C3 (p39) توسعت في معبي (E8)، أو السذاجة ليف-3i (+ p8 في ليف-3i/MEF) الظروف. كشف البقع إيمونوفلوريسسينت من الثقافات هبسك الممثل على شرائح الدائرة تعبير موحد، النووي عامل بلوريبوتينسي الأساسية نانج في سا-4+هبسك هيئة تنظيم الاتصالات-1-81+ المستزرعة في معبي، التقليدية (E8 المتوسطة) أو ليف-3i/MEF شروط. شريط المقياس = 100 ميكرومتر- (ب) لطخة غربية التحليل. STAT3 (يسار)، إيرك (في الوسط)، والتعبير البروتين بيتا-أكتين التحكم لخط هبسك ممثل (خط هيسك H9) التقليدية (E8 المتوسطة) أو شروط ليف-3i/MEF (3i). (ج) التعبير عن عوامل النسخ المرتبطة بلوريبوتينسي ساذج. يظهر هي ستيلا/DPPA3، و NR5A2، و TFCP2L1 الفلورة في ثقافة ليف-3i/MEF ممثل (سلك خط المستمدة من الدم هيبسك E5C3 في p33 (هيسك/MEF) + p8 (ليف-3i/MEF). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تيراتوما (د) فحوصات هبسك التقليدية وليف-3i-عادت. التحقق من صحة بلوريبوتينسي الفنية في خط هيبسك ممثل اسوي (الحبل E32C6 المستمدة من الدم) مثقف في أما E8 (p9) أو ليف-3i/MEF (+ p12) بفحص تيراتوما. 10 × 106 خلايا هبسك ليف-3i-عاد اسوي مقابل التقليدية، معبي مثقف التوازي تم حقن تحت الجلد في أطرافه من العوز مجموعة موردي المواد النووية الفئران. كشف البقع الهيماتوكسيلين وويوزين من ميكروسيكتيونس تيراتوما التمايز قوية في كل الطبقات الجرثومية الثلاث مع الأديم الظاهر تنظيماً جيدا (روزيت العصبية: NR، ابيثيليام المصطبغة الشبكية: RPE)، ميسوديرم (تشوندروبلاستس: Ch)، والأنسجة (غدي الأنسجة: غي) الأنساب. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
4 الرقم: مقارنة بلوريبوتينسي الوظيفية بين الدول اسوي معبي والسذاجة. (أ) التخطيطي لاستراتيجية لتقييم بلوريبوتينسي الفنية من الدول pluripotent متميزة في اسوي التقليدية مقابل هبسك ليف-3i مثقف في البروتوكولات التمايز مستقلة. يظهر هي السلف حمتو والأوعية الدموية التمايز نظامين (أحادي الطبقة أبل وأجهزة الجسم امبريويد 3D (EB)) التي استخدمت سابقا لتقييم فاعلية التمايز التقليدية مقابل ليف-3i-عادت في نفس السطر هبسك (اسوي) مثقف في وظيفة موازية ليف-3i العودة مع نفس إصدار الأرقام. خطوط هبسك ليف-3i-عادت لا تتطلب خطوة إعادة فتيلة قبل التمايز EB ويتعرضون للبروتوكول التمايز مباشرة. (ب) EB نظام التمايز السلف الأوعية الدموية (نائب الرئيس). وكان نظام التمايز 3D EB المستخدمة لهذه الدراسة هو موضح سابقا17،18. سيظهر هي نتائج الممثل في يوم 10 من التمايز EB (لوحات الأيسر) للثقافات اسوي دم الحبل السري نفسه (CB)-تستمد E5C3 هبسك السطر9، مثقف في أما هيس/MEF التقليدية (رسمت/MEF) الظروف أو السذاجة ليف-3i/MEF شروط. إظهار التدفق الخلوي تحليل هذه الخلايا EB زيادات هائلة في CD31+CD146+ نائب الرئيس السكان عقب العودة ليف-3i خط E5C3 قبل التمايز. يعرض الرسم البياني ±SD يعني من CD31+CD146+ نائب رئيس خلية المستردة في يوم 10 في هذا النظام EB ثلاثة أزواج اسوي خطوط هبسك مستقلة (أي سي بي-هيبسك اثنين وواحد بالغ تنتجها الخلايا الليفية المستمدة باستخدام النسب المئوية هيبسك، الخطوط المنقطة الاتصال أزواج اسوي). وتبين النتائج تحسنا كبيرا لنائب الرئيس تمايز الكفاءة في نظام المجلس التنفيذي عبر الخلفيات الوراثية لخطوط هبسك متعددة. (ج) أبل أحادي الطبقة السلف الأوعية الدموية التمايز النظام. يمكن التقليدية (معبي E8) وليف-3i-عادت هبسك مباشرة المتباينة باستخدام نفس الثقافة ظروف وعوامل النمو، السيتوكينات وجزيئات صغيرة من التفريق بين غشائي أبل التدرجي بروتوكول 3، 16. يظهر هي مستقلة أبل التمايز تجارب استخدام السطر هيبسك المشتقة من دم الحبل السري E5C3، والنسبة المئوية ل CD31+CD146+ السكان السلف الأوعية الدموية في يوم 7 من التمايز أبل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يطبق النظام ليف-3i نسخة معدلة من السذاجة 2 طاء موريني الكلاسيكية كوكتيل الارتداد1 للخلايا الجذعية pluripotent البشرية. المتمتعة بالحكم الذاتي-تجديد هبسك (التي لا يمكن أن يتوسع في 2 طاء وحدها) استقرت في ليف-2 طاء بتكميل هذا الكوكتيل مع مثبط تانكيراسي XAV939. يسمح ليف-3i الثقافة السائبة وكفاءة عودة هبسك التقليدية إلى دولة pluripotent تشبه epiblast preimplantation البشرية3. على الرغم من أن آليات العمل من XAV939 في هبسك مجمع المحتمل والتآزر مع 2 طاء، يرجح أن تشمل في الحد أدنى، وأهمية تحقيق الاستقرار وزيادة هبسك الذاتي تجديد عبر WNT مما يشير إلى مسارات3.

الثقافات التقليدية هبسك عادة اعتماد طائفة دول pluripotent مع تعبيرات الجين معبي النسب اختلافاً كبيرا وعلامات جينية غرس ما بعد ابيبلاست التي قد تؤدي إلى بلوريبوتينسي الوظيفية غير متناسقة أو تقلص2 . قد تتداخل هذه النسب الأصيل فتيلة من الثقافات التقليدية هبسك أيضا مع عودة بعض خطوط هبسك2ليف-3i ناجحة. بيد إدراج الخطوة التكيف 5i ليف الأولية (الجدول 1) في أسلوب ليف-3i يوسع كفاءة ليف-3i الارتداد بين العديد من خطوط هبسك عالمياً ويعزز العودة السذاجة الجزء الأكبر من خطوط هبسك التقليدية بطريقة أن تلتف الانتقاء مملة وسوبكلونينغ المستعمرات عادت السذاجة نادرة، أو الحاجة إلى استخدام الجزيئات الروتينية المضادة-apoptotic لتحقيق الاستقرار في قدرتها على البقاء.

الأسلوب الارتداد السذاجة ليف-5i/ليف-3i استنساخه في مجموعة متنوعة واسعة من خطوط هيس وهيبسك. فهو يتطلب قدر ضئيل من التدريب بمهارة ثقافة الخلية الأساسية. زيميرلين et al. استخدمت بنجاح هذه الاستراتيجية متسلسلة للعودة > 30 هيسك المستقلة وخطوط هيبسك خالية من التحوير من طائفة عريضة من الجهات المانحة 3. ممر واحد في ليف-5i (الشكل 1) غير كافية لمعظم خطوط هبسك بالخضوع للارتداد السذاجة كفاءة في معظم الثقافات هبسك، ومواصلة صيانتها مستقرة اللاحقة والتوسع في ليف-3i وحدها.

وعلاوة على ذلك، يدعم النظام ليف-3i/MEF جل قوي التوسع في الاستنساخ الكفاءة في جميع الخطوات بين الثقافة أعدادا النسب هبسك التقليدية وصولاً إلى انتكاس المكتملة الشبيهة بالسذاجة هبسك (أي.، التكيف، الانتقال والتوسع لمقاطع ليف-3i/MEF وحدها من 7 – 10). على الرغم من أن الصيغة الحالية لهذا النظام الثقافة يتطلب دعم التغذية، يقدم طريقة بسيطة وميسورة لاستنزاف مغذيات تقنية الطلاء قبل إجراء تحليل للثقافات ليف-3i (الشكل 2).

الدول متعددة الثقافة الأخرى أبلغ أيضا أنظمة لتشجيع هبسك التقليدية إلى مشابهة مثل السذاجة pluripotent2. على الرغم من أن هذه النظم الثقافة هبسك قد استندت أيضا إلى الاستفادة الظروف 2 طاء من السذاجة الماوس الكلاسيكية، في معظم الحالات هذه الأساليب باساجينج خلية واحدة أيضا المطلوب التحوير الكيميائي إضافية لاستقرار غير مستقرة طبيعتها/ الدولة يتواجد السذاجة البشرية. الأهم من ذلك، أثبتت معظم هذه الأساليب الأخرى البصر بلوريبوتينسي الوظيفية بعد التمايز و/أو ابيجينوميك غير طبيعي المكتسبة بصمات أو كاريوتيبيس2. على الرغم من ظهور كاريوتيبيس غير طبيعي داخل الثقافات التقليدية هبسك معبي بالفعل كذلك توثيق19، لفترات طويلة، الانزيمية خلية واحدة باساجينج الأساليب التي تستخدم بشكل روتيني في معظم طرق العودة ساذجة. هذا أيضا قد تبين لتحفيز توليد تكوينات الصبغية الشاذة20،21؛ قد تكشف عن تقنيات أكثر حساسية (مثلاً، نسخ الاختلافات عدد، وتعدد الأشكال النوكليوتيدات واحدة) تعديلات إضافية22،23.

في المقابل، تأكدت مرجع واسعة من خطوط هبسك ليف-3i-عادت لامتلاك كاريوتيبيس العادي في الممرات المنخفضة والمتوسطة (مثل p5-p15)، وأيضا في أرقام مرور عالية (على سبيل المثال.، > p30) عقب ليف-3i ثقافة3. بالإضافة إلى ذلك، وجد بصمات ابيجينوميك في هبسك ليف-3i-عادت تكاثر طبيعية وسليمة في 5 – 10 مقاطع وظيفة ليف-3i الارتداد2. استخدام منصة الصفيف مثلايشن تجارية محددة اليل حساسة، قد تجلى سابقا أنه تم العثور على علامات مثلايشن البد في مطبوع المكاني مرجع واسعة لخطوط هبسك ليف-3i-عادت (4 – 7 المقاطع التالية في ليف-3i) أن يكون جسيما عادي في هيكل1. إذ قد تنال بصمات الجينوم الشاذ وكاريوتيبيس في نهاية المطاف قدرة وظيفية هبسك، المبادئ التوجيهية اللازمة مبينة في هذا البروتوكول، وتشجع الباحثين على التحقق من صحة الثقافات هبسك قبل وبعد انتكاس السذاجة، باستخدام هذا الأسلوب، فضلا عن آخرين.

تحسين أسلوب ليف-3i بلوريبوتينسي الفنية عبر الطبقات الجرثومية في مرجع كبير هيس وخطوط هيبسك غير المعدلة وراثيا (الشكل 3). على عكس الأخرى بروتوكولات الارتداد ساذجة، لا أسلوب ليف-3i لا تتطلب خطوة إعادة فتيلة للتفريق بين لاحقة N-هبسك (أي تحويل هبسك ن العودة إلى ظروف معبي التقليدية قبل استخدامها في توجيه فحوصات التمايز). هبسك ن ليف-3i-عادت عرض قدرات التمايز إلى حد كبير أكثر كفاءة من نظرائهم اسوي هبسك التقليدية في كلا فحوصات تيراتوما (الشكل 3د)، وتوجيه البروتوكولات التمايز الأنساب للجميع 2من الطبقات الجرثومية الثلاث. سبب تعتمد على التحليل وداخلية الاختلافات في اختبار وظيفي من هبسك التقليدية، يجب أن يتم تقييم المفاضلة الخاصة بنسب استخدام البروتوكولات التمايز الموجه المستقلة وهبسك المستمدة من الخلفيات الوراثية متعددة. استخدام التصميم التجريبي الدقيق، مجموعة واسعة من خطوط هبسك يمكن أن يتوقع تحسن إلى حد كبير على الكفاءة التمايز مولتيلينيجي مقارنة بنظيراتها التقليدية اسوي بعد 4 – 10 فقرات في ظروف ليف-3i.

باختصار، هذا الأسلوب كلونالي وسرعة توسع إعداد الإنسان PSC، يحسن كفاءتها التمايز المصب، زيادات أرقام الخلية السلف النسب التي ارتكبت بعد التمايز، والنقصان داخلية تقلب من بين خطوط هبسك التقليدية، وتستعد النسب. كذلك قد هذه ن هبسك مع تحسين الأداء الوظيفي لها تأثير واسع لقدرتها على المساهمة في أنسجة وظيفية لجنين النامي. على سبيل المثال، يجوز هيسك ن مستقرة لتطوير الأجهزة البشرية الأولى، والخلايا الجذعية البالغة في وضع التركيبات الحيوانية، أو لتوليد أنسنة استهداف الجين نماذج حيوانية للمرض. التحسين المزيد من هذه تانكيراسي استخدام المانع أسلوب ليف-3i في تعريف خالية من تغذية GMP المتوافقة مع شروط الثقافة سيسهل كفاءة توليد سريرياً مفيدة لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا الوظيفية وانجرافتابل ل الاستخدام العلاجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

بموجب اتفاق ترخيص بين "التكنولوجيات الحياة" وجامعة هوبكينز جونز (الرهبان)، يحق للدكتور زامبيديس أن نصيباً الإتاوات التي تلقتها الجامعة لمنح التراخيص للخلايا الجذعية. شروط هذا الترتيب يديرها الرهبان وفقا لسياساته تضارب في المصالح. وهذا لا يغير من صاحبي التقيد بالسياسات اليومية على تقاسم البيانات والمواد.

Acknowledgments

وأيد المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة/نيي (R01EY023962)، والمعاهد الوطنية للصحة/NICHD (R01HD082098)، جائزة الابتكار ستاين تجمع الشعب البوروندي، ميريلاند صندوق أبحاث الخلايا الجذعية (2018-مسكرفف-4048، 2014-مسكرفي-0742)، نوفو نورديسك العلم المنتدى جائزة، ومؤسسة موزلي لهذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Tags

علم الأحياء التنموي، 136 قضية، بلوريبوتينسي السذاجة، الخلايا الجذعية pluripotent البشرية، والتمايز، وتثبيط تانكيراسي، جزيء صغير، epiblast
الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, T. S., Zimmerlin, L.,… More

Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter