Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage

Published: June 10, 2018 doi: 10.3791/57921
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

אנו מציגים עבור יעיל בתפזורת, מהירה כימי לדוגמות של תאי גזע pluripotent האנושי שושלת היוחסין-איפה זה מונח קונבנציונאלי (hPSC) לתוך מצב של epiblast דמוי pluripotent יציב epigenomically תמים פרוטוקול. שיטה זו התוצאה ביטוי גנים שושלת היוחסין-איפה זה מונח ירד שיפור ניכר תוך בידול multilineage מכוונת על-פני רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת.

Abstract

נאיבי האדם גזע pluripotent (N-hPSC) עם פונקציונליות משופרת עשוי להיות בעל השפעה רחב של רפואה רגנרטיבית. המטרה של פרוטוקול זה היא לחזור ביעילות את שושלת היוחסין-איפה זה מונח, קונבנציונאלי האנושי גזע pluripotent (hPSC) נשמר בתנאים או ללא מזין או תלויי-מזין כדי pluripotency כמו תמימה עם פונקציונליות משופרת. שיטה זו לדוגמות תמים כימי מעסיקה את לוקמיה קלאסית מעכבות פקטור (LIF), GSK3β, וניגוד MEK/טיפשה קוקטייל (LIF-2i), בתוספת רק מעכב tankyrase XAV939 (LIF-3עכשיו). LIF-3עכשיו חוזרת hPSC המקובלת למצב יציב pluripotent אימוץ הביוכימי, תעתיק, ותכונות epigenetic של epiblast האנושי טרום השרשה. שיטה זו LIF-3עכשיו דורש תא מינימלי תרבות מניפולציה, והוא מאוד לשחזור ב רפרטואר רחב של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) וקווים תאי גזע (hiPSC) ללא transgene האנושי pluripotent המושרה. השיטה LIF-3עכשיו אינה דורשת צעד priming מחדש לפני הבידול; N-hPSC ניתן להבחין ישירות עם יעילות גבוהה מאוד ולתחזק karyotypic, stabilities epigenomic (כולל ב לוקוסים הדומיננטיות). כדי להגביר את האוניברסליות של השיטה, hPSC המקובלת מתורבתים לראשונה בקוקטייל LIF-3עכשיו בתוספת שתי מולקולות קטנות נוספות פלאטין קינאז (forskolin), סוניק הקיפוד (שקט) (purmorphamine) איתות (LIF-5i). שלב ההסתגלות LIF-5i קצר באופן משמעותי משפר הרחבה המשובטים הראשונית של hPSC קונבנציונלי ו המאפשר להם להיות לאחר מכן תמימה-להחזירה עם LIF-3עכשיו לבד בכמויות, ובכך obviating את הצורך subcloning/איסוף נדיר N-hPSC מושבות מאוחר יותר. LIF 5i-מיוצב hPSCs לאחר מכן נשמרים ב- LIF-3עכשיו לבד ללא הצורך של מולקולות אנטי-מוות. והכי חשוב, לדוגמות LIF-3עכשיו משפר בצורה ניכרת את pluripotency תפקודית של רפרטואר רחב של hPSC המקובלת על-ידי הפחתת ביטוי הגנים בשלה שושלת היוחסין שלהם ומוחקת את ההשתנות interline של התמיינות מכוונת בדרך כלל הבחינו בין השורות hPSC עצמאית. אפיוני נציג של LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC הם שסופקו, ניסיוני אסטרטגיות להשוואות פונקציונלי של isogenic hPSC היוחסין-איפה זה מונח vs. תמים כמו הברית מתוארים.

Introduction

מערכת התרבות 2i (MEK/טיפשה, GSK3β מעכב) פותח במקור כדי לחדד את העכבר מבוסס-סרום הטרוגנית תרבויות בתאי גזע עובריים (mESC) למצב הקרקע אחידה של pluripotency דומה epiblast של העכבר1. עם זאת, 2i אינו תומך קיום אנושי pluripotent תאי גזע (hPSC) קווים2יציבה. מולקולה קטנה מורכבים, שיושלם פקטורי גדילה, השונים, גישות הטרנסגניים דווחו לאחרונה כדי ללכוד putatively דומה pluripotent תמים כמו האדם מולקולרית קובע2. עם זאת, רבים של הברית "תמים כמו" שנוצרו באמצעות שיטות אלה גם הציג יציבות karyotypic, epigenomic פגמים (למשל, גלובל אובדן הורים החתמה גנומית), או לקוי בידול פוטנציאליים.

ב לעומת זאת, את הקוקטייל של דיכוי כימי משולשת של GSK3β, טיפשה, tankyrase איתות, לוקמיה מעכבות פקטור (LIF-3עכשיו) היה מספיק עבור השחזור תמים כמו יציבה של רפרטואר רחב של קווים hPSC קונבנציונלי3. LIF-3עכשיו-להחזירה תמים hPSC (N-hPSC) karyotypes נורמלי ולא מוגברת שלהם ביטויים של גנים ספציפיים תמים epiblast של האדם (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, סטלה (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). HPSC לדוגמות גם הענקת LIF-3עכשיו עם מערך של הביוכימי המולקולריים מאפיינים ייחודיים ל- pluripotency כמו mESC תמים שכלל מוגברת phosphorylated STAT3 איתות, ירד טיפשה זרחון, CpG 5 העולמית-methylcytosine hypomethylation, demethylation CpG הגנום כולו-תאי גזע עובריים (ESC)-גנים ספציפיים היזמים ושימוש דומיננטי דיסטלי OCT4 משפר. יתר על כן, לעומת אחרים תמים שיטות לדוגמות שתוצאתם aberrantly hypomethylated טבוע לוקוסים גנומית, להחזירה-LIF-3עכשיו N-hPSC היו ללא אובדן שיטתית של דפוסי CpG הדומיננטיות או ההפסד הדי methyltransferase הביטוי (למשל, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

תרבות LIF-3עכשיו ישיר של מגוון רחב של קונבנציונאלי תאי גזע עובריים (hESC), אנושי המושרה גזע pluripotent (hiPSC) גדל על מזינים או E8 מזין ללא תנאים מושגת לדוגמות מהיר ולא בתפזורת מדינה כמו epiblast תמים. עם זאת, לדוגמות תמים LIF-3עכשיו ישיר עשוי להיות בלתי-יעיל כמה שורות hPSC קונבנציונלי לא יציב בגלל variabilities גנומית, שושלת היוחסין-איפה זה מונח הטבועה הנובעים הרקעים התורם מגוונת מבחינה גנטית.

לפיכך, כדי להרחיב את תוכנית השירות של השיטה LIF-3עכשיו, אופטימיזציה stepwise פותחה והיא מוצגת בזאת, מאפשר לדוגמות תמים אוניברסלי עם כמעט כל hESC קונבנציונאלי או קו hiPSC ללא transgene בתרבית על מזינים. שיטה זו לדוגמות תמים universalized מעסיקה צעד ארעי התרבות הראשונית המקובלת hPSC המשלימים את הקוקטייל LIF-3עכשיו עם שני נוספים מולקולות קטנות (LIF-5i) פלאטין קינאז (forskolin) ו- (סוניק הקיפוד, (שקט) purmorphamine) איתות. פסקה אחת הראשונית hPSC המקובלת ב- LIF-5i עצמו אותם עוקבות לדוגמות LIF-3עכשיו יציב בכמויות. הסתגלות LIF-5i הראשונית מגבירה באופן משמעותי התפשטות המשובטים תא בודד הראשונית של hPSC המקובלת גדל על E8 או כדורים אקדחים סטרט (לפני שלהם עוקבות יציב, מתמשך מעבר LIF-3עכשיו לבד). קווים hPSC המקובלת הותאם קודם על פסקה אחת ב- LIF-5i לסבול בצובר עוקבות המשובטים passaging של תאים להחזירה תמים בתנאים LIF-3עכשיו, אשר obviates את הצורך לאסוף, subcloning של המושבות יציב נדיר או השימוש השגרתי מולקולות אנטי-מוות או מעכבי קינאז (רוק) Rho-הקשורים חלבון.

השיטה LIF-3עכשיו כבר מועסקים בהצלחה להרחיב ולתחזק רפרטואר רחב של stably > 30 קווי hPSC המקובלת עצמאי, מגוונת מבחינה גנטית > פסוקים 10 – 30, בשיטות או דיסוציאציה-אנזימטי או אנזימטיות, ללא עדות אינדוקציה של כרומוזומלית או חריגות epigenomic, לרבות ליקויים ב לוקוסים גן הדומיננטיות. בנוסף, תרבות LIF-5i/LIF-3עכשיו סדרתית היא תמימה היחידה לדוגמות השיטה שדווחו עד כה המשפרת את pluripotency תפקודית של רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת על ידי הפחתת ביטוי הגנים בשלה שושלת היוחסין שלהם, שיפור דרמטי מחוזקה בידול multipotent. LIF-3עכשיו תמים לדוגמות שיטת ומוחק הגלום לבטן השתנות של בידול של קווי hPSC היוחסין-איפה זה מונח, קונבנציונאלי, ויהיה כלי נהדר של היישום ברפואה רגנרטיבית וטיפולים הסלולר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולים שאושרו על-ידי ג'ונס הופקינס הספר של המכון לרפואה של טיפול בבעלי חיים, שימוש הוועדה (IACUC).

1. הכנה של העכבר מתחלקים Fibroblasts (MEF) תלויי-מזין Conventional (hESC בינוני/MEF) או להחזירה תמימה (LIF-3עכשיו בינוני/MEF) hPSC תרבות

  1. לרכוש או להכין אספקה נמוך-מעבר ללא צורך במיקור חוץ של מאכילי MEF CF1 או CF1 x DR4 היברידית E13.5 העכבר העוברים בעקבות פרוטוקולים שפורסמו4.
    1. Cryopreserve המעבר נמוך (p1-p2) MEF תרבויות קדם (עבור אחסון לטווח ארוך) או הקרנה שלאחר (עבור עד 6 חודשים) בחנות חנקן נוזלי תיאר כאמור4.
    2. להאיר (5,000 ראד) לרשימת תפוצה MEF מורחבת תחת p5 באמצעות γ - או X-ray-בעוצמה, להכין את aliquots ב 1.5 x 106 תאים לכל מבחנה לאחסון לטווח קצר (פחות מ- 6 חודשים) ב-80 מעלות צלזיוס במקפיא טמפרטורה נמוכה במיוחד.
    3. צלחת בין 1.2 x 106 (טרי מוקרן שאינם cryopreserved) 1.5 x 106 (מוקרן cryopreserved) MEF לכל לוח אחד של gelatinized 6-ובכן להכנת מזין תרבויות, כמתואר להלן.
  2. להכין מצופים ג'לטין צלחות שטופלו תרביות רקמה סטרילי 6-טוב על-ידי הוספת 1.5 מ של פתרון סטרילי של ג'לטין 0.1% מכל קידוח בבטיחות הביולוגי ארון.
  3. דגירה צלחות מצופה ג'לטין ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה או לינה חממה מעבדה CO2 .
  4. ביום הבא, להפשיר נמוכה מעבר (למשל, P2 כדי P4) cryopreserved דימתיל סולפוקסיד ו לקרינה (rad 5,000) MEF לפי השלבים המצוין להלן.
    הערה: MEF שאינו מוקרן צריך גם להיות הקרת, מורחב, וכן מוקרן מייד לפני השימוש.
  5. מקום של aliquot MEF cryopreserved באמבט מים 37 º C. על מפשיר, לעקר את הצינור עם אתנול, מיד לדלל את cryoprotectant דימתיל סולפוקסיד לפחות 10-fold MEF בינונית (טבלה 1) בתוך ארון אבטחה (למשל העברת 1 מ"ל דימתיל סולפוקסיד-MEF aliquot לתוך 9 מ ל MEF במדיום 15 מ"ל סטרילי חרוט).
  6. Centrifuge התאים MEF מדולל ב 200 x גרם במשך 5 דקות צינורות חרוט סטרילי 15 מ"ל.
  7. באבטחה הקבינט, תשאף למחוק את תגובת שיקוע ללא תא ו resuspend בגדר תא במדיום MEF טרי 1 – 2 מ"ל.
  8. לבטל את הפתרון הג'לטין ולהוסיף בעדינות 2 מיליליטר MEF מחדש מושעה במדיום MEF ל כל טוב של צלחת 6-טוב gelatinized, כמצוין לעיל. MEF ספירת תאים וצלחת 1.2 x 106 (טרי מוקרן הלא-cryopreserved) או 1.5 x 106 (מוקרן cryopreserved) MEF לכל אחד צלחת gelatinized 6-. טוב.
    הערה: כל הצלחות התרבות תאים מועברים מן החממה2 CO כדי אבטחה ארון יכול להימחק בעדינות עם נייר ריססה אתנול אך צריך לא להיות ישירות ריססו על 70% אתנול פתרון כדי למנוע הפצת אתנול ב הבארות.
  9. דגירה MEF צלחות ב 37 מעלות צלזיוס לילה בחממה מעבדה CO2 (5% CO2, אווירה לח) כדי לאפשר מצורף, לפני השימוש.

2. ייצוב של תרבויות hPSC המקובלת עוקבות לדוגמות תמים עם צעד הסתגלות קצרה LIF-5i פרירים

  1. אמת כל הקווים hPSC המקובלת על אחזקת קריוטיפ נורמלי על ידי G-banding (פסים), לפני תחילתו LIF-5i/LIF-3עכשיו השחזור.
    הערה: לדוגמות LIF-3עכשיו של קווי גבוה-מעבר hPSC קונבנציונלי (למשל., P > 40 – 50) יש להימנע, מאז תרבויות אלה עשויים כבר הנמל סטיות גנומית זה עשויה להיות השפעה שלילית על השחזור LIF-3עכשיו בתפזורת, יעיל ויציב של טענתי, convetional hPSC קווים.
  2. לתחזק ולהרחיב תרבויות hPSC קונבנציונאלי עם המאומת karyotypes רגיל מערכת מבוססת-MEF תרבות (כמתואר בסעיף 1) או מערכת תרבות נטולת מזין (בהתאם להעדפות של החוקר).
    הערה: שני תלויי-מזין hPSC/MEF cocultures (למשל, hESC בינוני (טבלה 1) בתוספת 4 – 10 ננוגרם למ"ל bFGF) או ללא מזין (למשל., E8 5 או mTSER 6 מדיה (לפי הוראות היצרן שיטות vitronectin מצופה לוחות) תואמים בצובר תמים השחזור באמצעות מערכת LIF-5i/LIF-3עכשיו/MEF (איור 1). שיטות Non-אנזימטי עדיפים passaging של hPSC המקובלת לפני והכנתם השחזור. ניסוחים מדיה LIF-5i ו LIF-3עכשיו מכיל אנטיביוטיקה או סוכני פטריות. כללי פעולה סטנדרטי עקרות ארון אבטחה ותחזוקה צפויים להיות נצפתה בקפדנות כדי למנוע כל זיהום חיידקי או פטרייתי.
  3. עבור MEF-מבוסס מערכת תרבות, להכין MEF מזיני בצלחת 6-ובכן gelatinized כמתואר בסעיף 1 לפחות יום אחד לפני passaging של תרבויות LIF-5i-הותאם hPSC קונבנציונלי.
  4. לאחר hPSC המקובלת תרבויות הגיעו ~ 50% confluency (קרי, 3-5 ימים לאחר ציפוי ראשוני), להחליף את המדיום תרבות hESC רגיל עם LIF-5i בינוני (2 מ"ל לכל טוב; טבלה 1).
    הערה: בצע את הפעולות הבאות באבטחה ארון.
  5. תרבות ולתחזק hPSC קונבנציונאלי/MEF עד 2 ימים ב- LIF-5i בחממה CO2 (5% CO2, אווירה לח). לשנות המדיום LIF-5i מדי יום כדי להתאים אותם מעבר עוקבות, לדוגמות יציב ב- LIF-3עכשיו.
  6. לחלופין, עבור התרבויות נטולת המזין רגיל (למשל, ב- E8), תרבות hPSC ב LIF-5i רק לילה לפני passaging למחרת בבוקר.
    הערה: תרבויות LIF-5i LIF-3עכשיו שניתן שניהם לתחזק את האטמוספירה (21% O2) או חמצן הפיזיולוגיות (5% או2) רמות בחממה CO2 (5% CO2, אווירה לח).
  7. לפני passaging, למקם את הצלחות תרבות בארון אבטחה, לשטוף LIF-5i-הותאם hPSC המקובלת פעם אחת עם PBS, ומוסיפים 1 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה תא מכל קידוח. תקופת דגירה של 5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO, triturate בעדינות עם פיפטה להשעיה תא בודד בימים אבטחה בארון.
    הערה: מאגרי דיסוציאציה-אנזימטי לחלופין ניתן להשתמש להכנת תאים בודדים passaging.
  8. לאסוף את התליה תא hESC בינוני (דילול 2-fold לפחות) צינורות חרוט סטרילי 15 מ"ל, triturate בעדינות תאים על-ידי pipetting כדי לקבל השעיה תא בודד.
  9. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות לשאוב/להשליך תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 1-2 מ"ל של המדיום LIF-5i ב אבטחה הקבינט. לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
  10. לשטוף את הצלחת MEF מצופים מראש פעמיים עם PBS (2 מ"ל לכל טוב טוב 6 צלחות) ולהפיץ 1 – 2 x 106 תאים (בינוני 2 מ"ל LIF-5i) על גבי 1 טוב של צלחת MEF מסוידים PBS.
  11. לכוונן ולמטב את צפיפויות ציפוי הראשוני עבור כל קו hPSC בודדים להיות תמים-להחזירה, replating היעילות יכולה להיות משתנה מאוד. מקם את הצלחת חממה2 CO (5% CO2, אווירה לח).
    הערה: השימוש השגרתי נוגדנים anti-מוות לא מומלץ עבור רוב קווי hPSC בשיטה זו. מערכת LIF-5i כבר באופן משמעותי משפר את היעילות מחדש משוריין המשובטים בצובר הראשונית של קווי hPSC קונבנציונלי. עם זאת, שימוש חד פעמי של רוק מעכב (5 – 10 μM Y-27632) עשויה לשפר עוד יותר את ראשוני LIF-5i המשובטים מחדש משוריין היעילות של תרבויות hPSC המקובלת במעבר הראשון עבור כמה שורות hPSC היוחסין-איפה זה מונח לא יציב עם נטיה עבור ספונטנית בידול.
  12. אם החל מתרבויות נטולת מזין (למשל, E8), ישירות מעביר אחד טוב של hPSC המקובלת dissociated הותאם ב LIF-5i לתוך אחד מוקרן מצופה MEF טוב (כלומר, מעבר 1:1).
  13. למחרת, מערבולת בעדינות את הצלחת כדי להרים את כל התאים שאינם מצורפים, תשאף המדיום (שטיפת PBS היא אופציונלית) ולהחליף עם 2 מיליליטר LIF-5i בינוני. לבצע שלב זה אבטחה בארון מדי יום למשך 3-5 ימים או עד תאים הם 60-70% confluent (איור 1). מקם את הצלחת חממה2 CO (5% CO2, אווירה לח).

3. לטווח ארוך תחזוקה והרחבה של N-hPSC במדיום LIF-3עכשיו

  1. בעקבות הסתגלות LIF-5i הראשונית, המעבר עוקבות תרבויות LIF-3עכשיו יציבה כל 3-4 ימים של אבטחה בארון, או כאשר תרבויות הופכים 60-70% confluent (איור 1).
    הערה: תרבויות LIF-3עכשיו דורשים תחזוקה קפדני, ומאפשר N-hPSC תרבויות להגיע צפיפות גבוהה confluency תא מתרבות ממושך (למשל., > 4 ימים) מקטין את יעילות מחדש משוריין המשובטים עוקבות, ומקדם ספונטנית בידול.
  2. באבטחה הקבינט, למחוק את המדיום תרבות ולשטוף כל טוב של תרבויות LIF-5i/LIF-3עכשיו על-ידי הוספת בעדינות 2 מ"ל ל- PBS. למחוק PBS ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 ° C ב- CO2 מיכלים (5% CO2, אווירה לח).
  3. לאסוף את התליה תא, להוסיף hESC בינוני (ללא מעכבי או גורמי גדילה (טבלה 1); 2-fold לפחות דילול) כדי לשחזר את כל hPSC בעדינות triturate תאים על-ידי pipetting כדי לקבל השעיה תא בודד. להעביר את המתלים צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה-300 גרם במשך 5 דקות, וביופסיה/הסר תגובת שיקוע. מחדש להשעות בגדר תא במדיום LIF-3עכשיו. לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
  5. צלחת ~ 2 x 105 תאים לכל טוב על גבי MEF לקרינה בצלחת 6-ובכן gelatinized עבור passaging שגרתית של תרבויות LIF-3עכשיו. על התרבויות LIF-5i-הותאם הראשונית, צלחת עם צפיפות גבוהה יותר בתחילה (4 x 105 תאים/טוב) לפני המעבר הראשון לתוך LIF-3עכשיו/MEF.
  6. לוחית רישוי מחדש ולהפיץ LIF-5i-הותאם hPSC על גבי טריים מסוידים PBS לקרינה MEF מזין הצלחות (להכין ביום הקודם כאמור לעיל) המדיום LIF-3עכשיו. החלף את המדיום LIF-3עכשיו מדי יום.
  7. מעבר N-hPSC עבור פחות בצובר רציף 4 – 7 פסוקים המנזר בינוני LIF-3עכשיו לשימוש של N-hPSC מחקרים תפקודית או הקפאה קריוגנית. לרשום את מספר קטעים של N-hPSC גם קונבנציונאלי או מדיה LIF-3עכשיו.
    הערה: לדוגמות LIF-3עכשיו גבוהה-מעבר (למשל > p40) קווי היוחסין-איפה זה מונח, המקובלת hPSC אינו מומלץ. מאמץ צריכה להיעשות כדי לחזור hPSC המקובלת קווי המעבר אפשרי הנמוך ביותר כי הם זמינים. בנוסף, השימוש hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה שעברו גדול מ- 10 קטעים LIF-3עכשיו לא מומלץ ללימודים פונקציונלי, מאז תרבויות שכאלה N-hPSC ייתכן הנמל שיבוטים karyotypically חריג בשל הבחירה התרבות התאים המשובטים ממושך. Reversions LIF-5i/LIF-3עכשיו טריים של קווי hPSC המקובלת נמוך-מעבר וצריך להתנהל ללימודים פונקציונלי, אם המלאי של N-hPSC עם < פסוקים 10 LIF-3עכשיו אינם זמינים.

4. הקפאה קריוגנית והפשרתו של LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC

  1. הרחב להחזירה N-hPSC לפחות 5-7 פסוקים LIF-3עכשיו, כמצוין לעיל, לפני השימוש מחקרים תפקודית או הקפאה קריוגנית לטווח ארוך. לרשום את מספר קטעים בתנאים רגילים, בתנאים LIF-3עכשיו על כל בקבוקון cryopreserved.
    הערה: עודף LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC בשימוש מבחני תפקודית יכולה להיות cryopreserved על כל קטע, אבל הקפאה של מעברים השחזור שלאחר התחתון (למשל., < p3) עלול לגרום לעניים, או היעילות התאוששות שלאחר הפשרה משתנה מאוד.
  2. באבטחה הקבינט, תשאף המדיום התרבות התאים ב- PBS (2 מ"ל לכל טוב), תשאף PBS וקונטה מביצועם hPSC המושבות לתוך תאים בודדים באמצעות פתרון ניתוק התא (1 מ"ל לכל טוב). מקם את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 37 ° C ב- CO2 מיכלים (5% CO2, אווירה לח). לדלל את הפתרון ניתוק התא עם המדיום LIF-3עכשיו (קיפול. כפול), לאסוף את hPSC ב סטרילי חרוט 15 מ"ל, צנטריפוגה תאים ב x 200 גרם במשך 5 דקות, resuspend בגדר תא במדיום LIF-3עכשיו (1-2 מ לכל טוב-שוות-ערך). לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
  3. צנטריפוגה N-hPSC במדיום LIF-3עכשיו (200 x g למשך 5 דקות), resuspend תאים בשידת אבטחה הפתרון קפוא (טבלה 2), על צפיפות של פחות 1 x 106 תאים למ"ל.
  4. להעביר תאים לתוך הצינורות ההקפאה לאחסון לטווח ארוך ומניחים לתוך מיכל קירור איטי. לאפשר את הדגימות להקפיא ללילה במקפיא-80 ° C.
  5. למחרת, להעביר את cryovials לתוך מקפיא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
  6. עבור מפשיר, למקם את המבחנה קפוא לתוך אמבט מים 37 ° C עבור ~ 2 מינימלית Sterilize המבחנה (קרי, ספריי אתנול), העברה hPSC ב סטרילי חרוט 15 מ"ל, לאט לדלל את המדיום 10-fold hESC בתוך התאים (טבלה 1) בתוספת 5 μM של רו-הקשורים חלבון קינאז (רוק) מעכב Y-27632 בתוך כיסוי סטרילי בטיחות ביולוגית בארון.
  7. צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות. אבטחה הקבינט, למחוק את תגובת שיקוע ללא תא, resuspend בגדר תא LIF-3עכשיו בינוני (1 – 2 מ"ל) בתוספת 5 μM רוק מעכבי Y-27632.
    הערה: אי-הכללה של Y-27632 תגרום המסכן היעילות התאוששות שלאחר שהביקושים (איור 2).
  8. העבר את התאים המופשרים resuspended ב LIF-3עכשיו/רוק מעכב על גבי מסוידים PBS מצופה MEF הבארות. Cryopreserve תרבויות LIF-3עכשיו-צפיפות של תאים6 עונה 1 פרק 10 לכל מבחנה. הפשרת כל אחד את שתי המבחנות על גבי אבוסים טוב אחד של צלחת 6-טוב gelatinized.
  9. למחרת, התחל רגיל LIF-3עכשיו הרחבה בינונית ללא מעכבי קינאז רו.

5. מזין להסרת עבור האוסף של דוגמאות N-hPSC

  1. כדי להכין דגימות LIF-3עכשיו/MEF (או hESC/MEF קונבנציונלי) תרבויות (קרי, עבור ביטוי גנים (למשל, כמותיים RT-PCR, מיקרו-מערכים) או חלבון (למשל, תספיג) ניתוחים, לרוקן של מאכילי MEF באמצעות תרבויות LIF-3עכשיו מגנטי הופעל התא מיון (מקינטוש) עם נוגדן anti-TRA-1-81 מצופה גרגרי לפי הפרוטוקול של היצרן.
  2. לחלופין, לנצל את השיטה הבאה ציפוי קדם פשוטה כדי לרוקן תרבויות מזיני, כמפורט להלן.
  3. בשכונה בטיחות ביולוגית סטרילי cabinet, למחוק את תגובת שיקוע ללא תאים, לשטוף את גלולה עם PBS סטרילי 2 מ"ל לכל טוב. ניתוק חסיד תרבויות LIF-3עכשיו/MEF באמצעות פתרון ניתוק התא (1 מ"ל/טוב). תקופת דגירה של 5 דקות ב- CO2 מיכלים (5% CO2, אווירה לח). לאסוף את hPSC ב סטרילי חרוט 15 מ"ל. שטיפת hESC בתוך 2-fold בינוני, העברת תאים לתוך סטרילי 15 מ"ל חרוט צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
  4. באבטחה הקבינט, מחדש להשעות כל טוב של תאים LIF-3עכשיו/MEF הפומבית לתוך 2 מ"ל של המדיום LIF-3עכשיו, ולהעביר ישירות אל באר חדשה של צלחת 6-ובכן זה יש כבר מצופה טרי עם ג'לטין 0.1%.
  5. דגירה LIF-3עכשיו/MEF תאים hPSC עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב CO2 מיכלים (5% CO2, אווירה לח). איסוף תאים שאינם מחסידי עם פיפטה צינור חרוטי חדש. בעדינות להוסיף 2 מ של hESC בינוני מכל קידוח ו מערבולת כדי לאסוף את התאים שאינם מחסידי הנותרים.
    הערה: רוב MEF לקרינה לצרף הצלחת gelatinized ב 1 h, עוזב את רוב hPSC ההשעיה.
  6. לשלב, צנטריפוגה תאים ב 300 x גרם במשך 5 דק שטיפת ב- PBS. Snap-הקפאת בגדר תא בחנקן נוזלי לאחר צנטריפוגה, או לחלופין מחדש להשעות את כדורי במאגר lysing התואמת הזרם חלבון או חומצות גרעין הניתוח (איור 2B).
  7. לבצע אפיוני LIF-3עכשיו קווים hPSC עם פקד קונבנציונלי hPSC isogenic להתקפת תואמות.
    הערה: בשל השתנות מהותי בין ובתוך תרבויות להתקפת, בקרות רלוונטיות מוכנות ב timepoint תואמים בתרבות או לפני השחזור תמים. פרוטוקולים מפורט וחומרים עבור bioimaging immunofluorescent במורד הזרם, flow cytometry, סופג המערבי, ביטוי גנים (מבחני ה-RT-PCR ומיקרו-מערכים), מחקרים מתילציה (נקודה חשופה, CpG מתילציה microarray), משפר לקרע, OCT4 דומיננטיות כתב מבחני מבחני מעכב איתות ניתנים במקום3.

6. פוסט נאיבי לדוגמות: אימות של תקינות גנומית ואת השמירה של הורים חריטות LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC לפני השימוש במבחני פונקציונלי

  1. מסך התרבויות hPSC כאשר הבחינה, קונבנציונאלי ההתחלתי על אחזקת קריוטיפ נורמלי (למשל, באמצעות ניתוח צביעת Giemsa-הלהקה באמצעות שיטות שפורסמו 7) לפני ביצוע השחזור LIF-5i/LIF-3עכשיו.
    הערה: זה היא לחסל אוכלוסיות hPSC קונבנציונלי יכול הנמל שינויים גנומית חריג אשר ייתכן כונן יתרון הישרדות סלקטיבי artefactual בתנאים LIF-3עכשיו המשובטים.
  2. לקבלת תוצאות מיטביות, טרי שחזר hPSC המקובלת תרבויות למצב תמים כמו עם LIF-3עכשיו מספר שבועות לפני השימוש בהם במחקרים תפקודית או מכוונת בידול.
    הערה: השגרה ממושך 'תחזוקה' תרבות בתנאים LIF-3עכשיו עבור יותר מ- 10 קטעים לדוגמות תמים הבאים אינו מומלץ. הרחבת שוטף ותחזוקה של קווי hESC ו- hiPSC צריכה להתבצע באמצעות מערכות התרבות קונבנציונאלי (למשל, E8, או MEF/hESC בינוני עם bFGF).
  3. להעריך שלאחר להחזירה N-hPSC קווים עבור השמירה של רגיל karyotypes 5 – 7 קטעים לאחר השחזור LIF-3עכשיו (למשל., עם ניתוח צביעת Giemsa-band,7, או כל שיטה אחרת של הבחירה).
  4. להעריך את כל השורות N-hPSC reverted עבור השמירה של שמירות גנומית הורים רגילה על-ידי בדיקת מתילציה DNA של בחירה (למשלפרוטוקולים עבור ניתוח microarray CpG DNA הטבעה הורית LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC הינם מסופקים במקום אחר3 ) לאחר 5-10 קטעים לדוגמות LIF-3עכשיו.

7. פוסט נאיבי לדוגמות: הנחיות תכנון ניסויים מבחני התמיינות מכוונת כמותית באמצעות LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC

  1. ישירות לנצל LIF-3עכשיו N-hPSC לתוך התמיינות מכוונת הוקמה פרוטוקולים ללא מניפולציות התרבות תאים נוספים.
    הערה: אין צורך בשיטה LIF-3עכשיו priming מחדש (קרי, המרת N-hPSC לחזור קונבנציונאלי תנאים כאשר הבחינה לפני השימוש בהם במסגרת מבחני התמיינות מכוונת) והיא אינה מומלצת.
  2. כדי לשלוט על ההשפעות של וזמינותו לבטן השתנות בבדיקת תפקודי של קווי hPSC בודדים, קרוס-לאמת את הלוחמים שושלת היוחסין הספציפי בידול על-ידי הפעלת פרוטוקולים בידול עצמאית לפחות שלושה hPSC קווים נגזר מרקע גנטי עצמאית (קרי, מרובים התורם, נגזר hiPSC, hESC).
  3. להשוואות פונקציונלי, להגדיר את תרבויות בין אחים, במספר שווה ערך מעבר, ומתוך אותו קו hPSC (isogenic) במקביל המקובל שושלת היוחסין-איפה זה מונח ותרבויות להחזירה-LIF-3עכשיו hPSC. לשמור על טענתי/נאיבי אחים isogenic hPSC תרבויות בתקשורת שלהם בהתאמה (למשל., E8 vs. LIF-3i), וההבחנה בו זמנית באמצעות בידול זהים פרוטוקולים וחומרים, לחסל את כל הטיה ניסיוני (איור 4).
  4. עבור isogenic טענתי נגד השוואות hPSC תמים, לכוונן ולמטב צפיפויות ציפוי הראשוני עבור כל assay בידול בודדים.
    הערה: פרוטוקולים מפורט עבור קדמון עצבית, האנדודרם סופית ובידול מכוונת המטו-אנדותל של N-hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה ניתנים במקום 3. LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC יש קיבולת proliferative ובידול עמידים יותר מבחני התמיינות מכוונת יותר hPSC רגיל. N-hPSC בדרך כלל דורש ריכוז ציפוי ראשוני נמוך יותר מאשר hPSC המקובלת, בניגוד hPSC להתקפת קונבנציונלי שלהם עמיתיהם, שאינן מחייבות השימוש של נוגדנים אנטי-מוות כדי לשפר את ההישרדות שלהם המשובטים בעקבות אנזימטי מערכת העיכול של מבחני בידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מייעל יעיל לדוגמות תמים כמו עם LIF-3עכשיו שתי תרבויות תלויי-מזין ועצמאי מזין שושלת היוחסין-איפה זה מונח קונבנציונלי hPSC (איור 1). פרוטוקול מפורט, כפי שיתואר בהמשך, מתאר רציפים ההסתגלות LIF-3עכשיו החל מגם תנאי hPSC תלויי-מזין או נטול המזין רגיל (למשל E8 בינוני).

נציג תוצאות עבור השחזור LIF-3עכשיו של מספר hESC המקובלת, hiPSC ללא transgene קווים מוצגים איורים 1 –3. תוצאות אלה אופייני הניתנים לאימות עם קו hESC זמינים מסחרית H9, או עם זמינים מסחרית ללא transgene, כבל קו דם, נגזר hiPSC episomal (6.2) נגזר ב מעבדה Zambidis8,9. הקדמה של צעד עיבוד ראשוני LIF-5i מתיר יעילים ביותר עוקבות, בתפזורת התפשטות המשובטים של תרבויות hPSC המקובלת LIF-3עכשיו, ואין צורך סוכנים אנטי-מוות או רוק מעכבי10 (איור 1א', ב' ). לוחות מרובים של hPSC תמים כמו דגימות ניתן לאסוף במהירות במורד הזרם ניתוחים או multilineage ביים בידול רק לאחר 5-7 קטעים ב- LIF-3עכשיו. לחלופין, תרבויות LIF-3עכשיו יכול להיות cryopreserved עבור יישומים עתידיים. פוסט מפשיר שחזור התא יכול להיות שיפור (איור 2) באמצעות הכללת מעכב רוק מדיה הקפאה קריוגנית, הפשרה שלאחר11.

גורמים של pluripotency מולקולרית ופונקציונליים, שניהם במבחנה , העובר היו לאחרונה שנסקרה2. גורמים אלה כוללים את הרקע הגנטי, תרבות-הקשורים רכישת מוטציות גנים התפתחותיים מרכזיים, הבדלים בין hESC ו hiPSC נגזרת ומתודולוגיות תרבות. שסופק להלן הוא סיכום של מבחני תקן זה יכול להיות מועסק עבור איפיון ואימות של פנוטיפי, מולקולרית, pluripotencies תפקודית של hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה.

מורפולוגיה המושבה
המעבר בין התרבות כאשר הבחינה, LIF-3עכשיו-להחזירה קונבנציונאלי מערכות מלווה שינויים פיזיים ברורים ב hPSC המושבה מורפולוגיה (איור 1B). HPSC המקובלת התאים להתרבות שטוח, מושבות טפט רחב להרחיב במהירות תאים קטנים גושים (על MEF או מזין ללא תנאי), אך גרוע כמו תאים בודדים. חשיפה של קווי hPSC המקובלת LIF-3עכשיו מקדם צמיחה והרחבת, קטן יותר, ארוז היטב, מושבות בצורת כיפה הנובעות clonally ופנויה תאים אלה שינויים מורפולוגיים הם הפיכים, LIF-3עכשיו-להחזירה מושבות בצורת כיפה באופן ספונטני יכול מעבר בחזרה אל מורפולוגיה טפט קונבנציונאלי LIF-3עכשיו נסוגה ואם תאים מחדש מתורבתים במדיום סטנדרטי hESC המקובלת בתוספת bFGF. בנוסף, הרחבה של תוצאות LIF-3עכשיו-להחזירה תאים על צפיפות גבוהה confluent (או תרבות ממושך ללא passaging בתדירות גבוהה) הכל נראה טוב ספונטני המורפולוגיה שטוחים, קונבנציונאלי עם יעילות המשובטים מופחת; הדגשת הצורך לתחזוקה חרוץ, טיפול של hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה (למשל., < 40-60% זרימה).

לחיות immunofluorescence מכתים, לזרום cytometric ניתוח של סמנים pluripotency פני השטח
הערכת סמנים pluripotency בשלב המעבר המקובלת למצב תמים כמו תרבות LIF-3עכשיו רציף הבאים יכולים להיות במעקב לא-פולשנית באמצעות נוגדן בשידור חי מכתים ללא זיהוי לתופעות שליליות על LIF-3עכשיו/MEF הרחבה ( למשל., לחיות מכתים fluorochrome מצומדת נוגדנים נגד TRA-1-81, טרה-1-60 ו- SSEA4).

השמירה של pluripotency במהלך השחזור LIF-3עכשיו יכול גם להיות שגרתי המנוטרת על-ידי ניתוח תזרים cytometric pluripotency-הקשורים סמן משטח הביטוי של טרה-1, SSEA אנטיגנים במהלך יחיד תא passaging (איור 1C) או immunofluorescence של שלמה, קבועה במושבות בחיי עיר (איור 3). למרות סמנים אלה לא להפלות בין קונבנציונאלי LIF-3עכשיו הברית, הרמות שלהם הפוך לתאם עם התדירות של בידול ספונטנית שעלולות להתרחש ב- hPSC בעת מעבר מ hPSC המקובלת לתנאים LIF-3עכשיו. גם יכול להיות מועסק אנטיגנים משטח נוספים שלא ניתן באופן ספציפי יותר מרק אנושית תמימה כמו הברית במבחנה2,12,13 כדי לזהות יעיל לדוגמות hPSC LIF-3עכשיו.

אימות של pluripotency מולקולרית של N-hPSC
כי הרקע הגנטי של קווי hPSC מלווה כתורם חזק כדי לבטן השתנות, חשוב להעריך בקפדנות תרבויות isogenic-התאמת התרבות timepoints בעת השוואת מערכות התרבות hPSC (איור 4). מאז כמה מהמערכות הללו כבר הוכחו ליצירת hPSC אוכלוסיות בעלות תצורות גנומית של epigenetic aberrant2, כל שיטה לדוגמות תמים צריך להיות לבדיקה עם מספר של N-hPSC של רקע גנטי עצמאית, באופן . זה מספיק כדי לאמת הביולוגית הפארמצבטית ולהשמיט את הברית הלא-התפתחותי רלוונטי "פסאודו-pluripotent" (קרי, עם המחפשים לכאורה pluripotency מולקולרית אבל חסר יכולות התמיינות תפקודית). Zimmerlin et al. עוד הרחיב את האימות של המערכת תרבות LIF-3עכשיו כדי לכלול assaying את pluripotencies מולקולרית ופונקציונליים של להחזירה N-hiPSC נגזר התיכנות בשיטות שונות, אשר משתתף בשם ידוע אחר ההשתנות פונקציונלי בין pluripotent קובע2.

בהתאם לכך, רוב המחקרים של מערכות תרבות אנושית תמימה התמקדו assaying pluripotency מולקולרית של N-hPSC-1) רמת epigenetic (למשל, היסטון סימני באמצעות שבב רצף או שבב-PCR, מתילציה DNA הכללית על-ידי immunoblots או כל גנומית ביסולפאט רצף ספציפי אלל CpG מתילציה מיקרו-מערכים, OCT4 מעצם השימוש השולט על ידי מערכות כתב, פעילות גלובאלית-elements הרגולציה על ידי DNAse אני רגישות יתר, אלמנט חוזר פרופיל על ידי RNA-רצף), 2) transcriptomic רמה (RNA-רצף, מיקרו-מערכים ביטוי ו- RT-PCR כמותי), ביטוי חלבונים (למשל., FACS, מיקרוסקופ immunofluorescent ו סופג המערבי) ו 3) באמצעות מחקרים מטבולית (למשל, גליקוליזה, חמצון זרחון ו nicotinamide חילוף החומרים). דוגמאות מייצגות של כתמים immunofluorescence וזיהוי תספיג הביטוי עבור סמני מפתח של pluripotency מולקולרית מוצגים (איור 3ב, ג). לדוגמה, באיור איור 3B הם מופעל phosphorylated (פוספו) איזופורמים סך של STAT3, ERK1/2, אשר הופכים מולקולרית מפתח בית pluripotency תמים כמו ESC העכבר. אלו אותרו באמצעות נוגדנים anti-STAT3 ו- anti-ERK1/2 ראשי. בנוסף, pluripotency תפקודית, טרטומה בידול מבחני הוא הפגינו קונבנציונאלי vs. HPSC LIF-3עכשיו-להחזירה טרטומה רקמות גזור 10 שבועות לאחר ההזרקה קבוע ב- 4% פורמלדהיד, שעוות פרפין מוטבע (איור 3ד').

הכנת LIF-3עכשיו/MEF או hESC/MEF/bFGF דגימות לבדיקה מולקולרית במורד הזרם צריך לכלול MEF דלדול. שתי הגישות שתוארו לעיל עבור דלדול MEF זה יש כבר מועסקים בהצלחה במעבדה שלנו. ציפוי קדם MEF הוא פשוט, אמין, וכן בשיטה וחסכוניים כדי לחסל את מזיני מ- N-hPSC דוגמאות ללימודי מולקולרית היא חלופה מועדפת ההפרדה FACS או מקינטוש (קרי, אנטי-TRA-1-81 או אנטי-TRA-1-60 נוגדן מבוססי ההפרדה ). בנוסף, מבדילים באופן ספונטני TRA-1-שלילית תאים חסיד בתרבויות LIF-5i/LIF-3עכשיו במהירות יסולקו מתרבויות LIF-5i/LIF-3עכשיו N-hPSC לפני המעבר עוקבות LIF-3עכשיו על גבי MEF טריים על ידי ציפוי מראש את enzymatically-מעוכלים תאים בודדים עבור h 1 על צלחות מצופה מראש עם ג'לטין 0.1% (איור 2).

הערכת תפקודי pluripotency של N-hPSC
וזמינותו קפדני ביותר של pluripotency תפקודית של PSC הוא וזמינותו כמירה הזרקת הבלסטוציסט, המוגבלת של בדיקת קווים N-hPSC מסיבות מוסריות. לחלופין, מספר קבוצות אשר דיווחו על הדור של N-hPSC עם שיטות שונות ניסו ליצור כימרות בין זנים. עם זאת, ניסיונות אלה הניבו התרומה מאוד נמוך או לא מוצלח של שושלות N-hPSC הבדיל את העוברים מאתר או חזירי, בהשוואה הקיבולת ביצירת כמירה של עכברים רגילים ESC2.

מחקרים פונקציונליים נוספים חקרו מכוונת במבחנה הבידול של בשם N-hPSC נגזר באמצעות שיטות שונות, אבל חשפו קיבולת בידול multilineage משוחד, פגומים או מופחתת, עם הנלווה מחסה של ליקויים epigenetic2,13. סטיות epigenomic דומה, במיוחד בזמן הדומיננטיות לוקוסים, זוהו אצל עכבר ESC בעקבות חשיפה ממושכת LIF-2i קוקטייל14. מעניין, כמה מערכות התרבות לדוגמות דיווחו על שיפורים הכללית תכונות ספציפיות של pluripotency תפקודית של PSC: היכולת המשופרת ויוו trophectoderm התרומה2,15 .

באמצעות אוסף רחב של נגזר באופן עצמאי hPSC להחזירה-LIF-3עכשיו, Zimmerlin. ואח המועסקים בידול multilineage מבחני להראות כי המערכת LIF-3עכשיו משפר באופן משמעותי את pluripotency תפקודית של קווי hPSC המקובלת 3. דבר זה מאפשר ניתוח שיטתי של vs קונבנציונאלי LIF-3עכשיו hPSC קווים בזוגות isogenic לחסל תלויי-לבטן וריאציות (איור 4). קווים hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה אינם מחייבים צעד priming מחדש לפני EB בידול. עם זאת, LIF-3עכשיו hPSC להתרבות בקצב המשובטים גבוה משמעותית מאשר תאים isogenic מורחבת ב- E8, לפיכך, צפיפויות ציפוי תחתון הראשונית דורשים התאמה כדי לאפשר כל תרבות להגיע למפגש ב timepoint דומה.

החוקרים באופן שגרתי צריך לנצל את מבחני מרובים כדי להדגים את הפונקציונליות המשופרת של hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה הכוללת לא רק מבחני טרטומה ויוו , אלא גם במבחנה ביים מבחני בידול כדי עצבית, סופי האנדודרם ו hematovascular שושלות3 באמצעות מבחני מרובים (למשל, אפל 2D3,16 ומערכות הגוף embryoid 3D17,18 ). כדי לשלוט על תלויי-assay הפארמצבטית, לפחות שתי שיטות שונות בידול צריכה להתבצע בשכפול עבור כל זוג isogenic של תרבויות טענתי/LIF-3עכשיו hPSC (למשל, איור 4, אפל, embryoid גוף בידול פרוטוקולים). הנבחנים צריכה לכלול מספר חזקים (למשל> 3-5) טענתי/LIF-3עכשיו זוגות isogenic של hPSC קווים מרקע מרובים, התורם עצמאית גנטי (איור 4).

Figure 1
איור 1: מעבר stepwise hPSC המקובלת, שושלת היוחסין-איפה זה מונח תרבויות לתנאים תמים כמו עם השיטה LIF-3עכשיו. (א) סכימה של פרוטוקולים stepwise לדוגמות LIF-3עכשיו. (סכמטי למעלה) שיטה כללית עבור המעבר של טענתי, hPSC המקובלת לתרבויות LIF-3עכשיו. (שרטוטים התחתון) שתי אסטרטגיות מסוכמים עבור LIF-3עכשיו לדוגמות תמים על-קונבנציונאלי (בשלה) hPSC תרבותי על מזין (קרי, Primed/MEF ל LIF-3עכשיו/MEF) או מזין ללא תנאים (כלומר, Primed/E8 כדי LIF-3עכשיו/MEF). מורפולוגיות PSC אנושי (B) . מוצגות photomicrographs נציג של hPSC במהלך השחזור LIF-3עכשיו באמצעות קו זמינים מסחרית iPSC episomal האנושית (6.2). המוצג המעברים שנצפה בין מושבות הראשונית המקובלת טפט שטוח, המושבות clonogenic בצורת כיפה עוקבות שעולות בעקבות המעבר LIF ביניים-5i ותנאי יציב LIF-3עכשיו תרבות. גודל ברים = 200 מיקרומטר. (ג) מייצג זרימה cytometric ניתוחים של סמני פני השטח pluripotency. מוצגות TRA-1-81 וביטויים SSEA-4 משטח בקו hPSC המקובלת 6.2 (p40) התרחב ב- E8, המעבר הראשונית ב LIF-5i/MEF ו 1 עד 9 להלן קטעים (P1-P9) בתנאים LIF-3עכשיו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הקפאה קריוגנית של N-hPSC, הכנת הדוגמא על ידי ציפוי קדם MEF. (א) דוגמה של מחזור ההקפאה/ההפשרה LIF-3עכשיו/MEF תרבויות. כבל קונבנציונאלי iPSC נגזר דם, שאינה משולבת, ללא transgene האנושי הקו E5C3 היה נגזר, הרחיבה MEF מזיני בינוני hESC בתוספת bFGF 4ng/mL עבור 18 קטעים. E5C3 המקובלת, שושלת היוחסין-איפה זה מונח הותאם ב LIF-5i (משמאל), מעבר מיגדרי לתוך בינוני LIF-3עכשיו עבור 3 קטעים (במרכז). התאים E5C3 LIF-3עכשיו מוצגים בחלונית מרכז היו cryopreserved באמצעות מבוססי דימתיל סולפוקסיד cryoprotectant בינוני (טבלה 2; 1 x 106 תאים לכל מבחנה) ומאוחסנים חנקן נוזלי). בקבוקון אחד היה הקרת כעבור חודש, תאים E5C3 הועברו מזין-מצופה היטב של צלחת 6-טוב (מימין). שחזור התא יכול להיות מוגברת על ידי שכשהם המדיום LIF-3עכשיו עם 5 מיקרומטר Y-27632 עבור היחידה יום אחד לאחר ההפשרה. גודל ברים = 200 מיקרומטר. חיסול של MEF (B) (וגם תאים TRA-שלילי הבדיל חסיד) בתרבויות hPSC LIF-3עכשיו/MEF בשיטת ציפוי מראש. מוצגות זרימת cytometric ניתוחים לפני ואחרי ציפוי מראש נוגדנים SSEA-1/CD15 הוכחת דלדול של אנטיגן TRA-1 שלילי ותאים MEF באמצעות נוגדנים מצומדת APC SSEA-4 ואת נוגדנים TRA-1-60, PE מצומדת אנטי-TRA-1-81 שיטת ציפוי לפני שעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : אפיון pluripotency בתרבויות LIF-3עכשיו/MEF N-hPSC. (א) pluripotency משטח וגרעיני סמנים. הביטוי של pluripotency גורם NANOG ב אותו (isogenic) טרה 1-81-+SSEA4+ המקובלת, טענתי קו דם, נגזר hiPSC חוט E5C3 (p39) מורחבת להתקפת (E8) או נאיבית LIF-3עכשיו (+ p8 ב LIF-3עכשיו/MEF) תנאים. כתמים immunofluorescent של תרבויות hPSC נציג בשקופיות קאמרית חשף את הביטוי אחיד, הגרעין של הגורם pluripotency ליבה NANOG SSEA-4+טרה-1-81+ hPSC בתרבית, בשלה, קונבנציונאלי (E8 בינוני) או LIF-3עכשיו/MEF תנאים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) תספיג ניתוח. STAT3 (משמאל), טיפשה (מרכז) ו שליטה בטא-אקטין חלבון הביטוי נציג hPSC (קו hESC H9) קונבנציונאלי (E8 בינוני) או LIF-3עכשיו/MEF תנאים (3עכשיו). (ג) ביטוי של גורמי שעתוק pluripotency-הקשורים תמים. מוצגות סטלה/DPPA3, NR5A2 ו- TFCP2L1 על ידי immunofluorescence בתרבות LIF-3עכשיו/MEF נציג (כבל קו דם, נגזר hiPSC E5C3-p33 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3עכשיו/MEF). סרגל קנה מידה = 100 (D) טרטומה מבחני מיקרומטר. של hPSC קונבנציונאלי LIF-3עכשיו-להחזירה. אימות של pluripotency תפקודית ב קו hiPSC נציג isogenic (כבל E32C6 דם-derived) תרבותי ב- E8 גם (p9) או LIF-3עכשיו/MEF (+ p12) על ידי assay טרטומה. 10 x 106 תאים של isogenic לעומת המקובלת, אין לנו זמן להפסיד במקביל תרבותי LIF-3עכשיו-להחזירה hPSC היו מוזרק subcutaneously הגפיים של עכברים NSG immunodeficient. כתמי hematoxylin ואאוזין של טרטומה microsections חשף בידול חזקים לתוך כל שלוש שכבות נבט עם האאקטודרם בנוי היטב (רוזט עצבית: נ, epitheliam פיגמנט הרשתית: RPE), והמזודרם (chondroblasts: Ch), והאנדודרם (הבלוטות רקמות: GI) שושלות. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: השוואה של pluripotency פונקציונלי בין מדינות isogenic להתקפת ותמימה. (א) סכמטי של אסטרטגיה להערכת תפקודית pluripotency ממדינות שונות pluripotent ב isogenic קונבנציונליות לעומת LIF-3עכשיו תרבותי hPSC בפרוטוקולים בידול עצמאית. מוצגות שתי קדמון המטו-וסקולרית בידול מערכות (טפט אפל ומערכות הגוף embryoid תלת-ממד (EB)) שהופעלו בעבר כדי להעריך בידול בעצמת קונבנציונליות לעומת LIF-3עכשיו-להחזירה באותה שורה hPSC (isogenic) תרבותי בפוסט מקבילים לדוגמות LIF-3עכשיו עם אותם מספרים המעבר. קווים hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה אינם דורשים צעד priming מחדש לפני EB בידול, נחשפים בפרוטוקול בידול ישירות. מערכת בידול של כלי דם קדמון (סמנכ ל) EB (B) . מערכת תלת-ממד בידול EB מועסקים במחקר זה היה שתואר לעיל17,18. מוצגות התוצאות נציג ביום 10 של בידול EB (לוחות שמאלה) עבור תרבויות isogenic אותו דם טבורי (CB)-נגזר E5C3 hPSC קו9, תרבותי ב או hESC/MEF קונבנציונאלי (Primed / MEF) תנאים או נאיבית LIF-3עכשיו/MEF תנאים. ניתוח cytometry זרימה של תאים אלה EB להראות עליות דרמטיות של CD31+CD146+ סמנכ ל אוכלוסיות בעקבות LIF-3עכשיו השחזור של הקו E5C3 לפני בידול. ההיסטוגרמה מציגה את ±SD אכזרי של CD31+CD146+ סמנכ ל תא אחוזי החלים ביום 10 במערכת EB באמצעות 3 זוגות isogenic של קווי hPSC עצמאית (קרי, CB בשני-hiPSC ומבוגר אחד נגזר פיברובלסט . hiPSC, קווים מנוקדים התחבר isogenic זוגות). תוצאות להפגין שיפור משמעותי של סמנכ ל בידול היעילות במערכת EB על פני רקע גנטי בין מספר קווים hPSC. (ג) אפל טפט קדמון וסקולרית בידול מערכת. Conventional (להתקפת E8) LIF-3עכשיו-להחזירה hPSC ניתן ישירות באמצעות הבדיל באותם תנאים תרבות, גורמי גדילה, ציטוקינים ומולקולות קטנות של בידול אנדותל אפל stepwise פרוטוקול 3, 16. מוצגות עצמאית ניסויים בידול של אפל, באמצעות קו דם, נגזר hiPSC חוט E5C3, ואת האחוז של CD31+CD146+ אוכלוסיות קדמון כלי דם ביום 7 של אפל בידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת LIF-3עכשיו חל גרסה מותאמת של קלאסי 2i מאתר תמים לדוגמות קוקטייל1 גזע pluripotent אנושי. העצמי-חידוש hPSC (אשר לא יכול להרחיב ב- 2i לבד) הוא התייצב LIF-2i להשלים זה קוקטייל עם החומר המדכא tankyrase XAV939. תרבות LIF-3עכשיו מאפשר בצובר לדוגמות יעיל של hPSC המקובלת מדינה pluripotent הדומה את האדם epiblast של3. למרות מנגנוני הפעולה של XAV939 ב hPSC הם מתחם הסבירות סינרגטי עם 2i, הם ככל הנראה כוללים-מינימום, ייצוב חשוב, הגדלת של התחדשות עצמית hPSC ויה ונ ט איתות המסלולים3.

תרבויות hPSC המקובלת בדרך כלל לאמץ קשת של הברית pluripotent עם ביטויים משתנה מאוד בשלה שושלת ג'ין, סימני epigenetic שלאחר ההשתלה epiblast שעלולים לגרום עקביים או פחת פונקציונלי pluripotency2 . זה לקרקע השושלת הטבועה של תרבויות hPSC המקובלת עלולים להפריע גם השחזור LIF-3עכשיו מוצלח של כמה שורות hPSC2. עם זאת, הכללת LIF-5i הסתגלות השלב הראשוני (טבלה 1) בשיטה LIF-3עכשיו אוניברסלית מרחיבה את היעילות של השחזור LIF-3עכשיו בין מספר רב של קווים hPSC ומקדם בצובר לדוגמות תמימה של קווי hPSC המקובלת בצורה זה עוקף מייגע איסוף, subcloning של מושבות להחזירה תמים נדיר, או הצורך לשימוש של מולקולות אנטי שגרתית-מוות כדי לייצב את הכדאיות שלהם.

השיטה לדוגמות LIF-5i/LIF-3עכשיו תמימה היא לשחזור במגוון רחב של קווי hESC ו- hiPSC. זה דורש הכשרה מינימלית עם מיומנות התרבות התא הבסיסי. . Zimmerlin et al. מועסקים בהצלחה אסטרטגיה זו רציפים כדי לחזור > 30 hESC עצמאית וקווים hiPSC ללא transgene ממגוון רחב של תורמים 3. קטע אחד קטן, LIF-5i (איור 1) מספיקה עבור מרבית hPSC קווים עוברים תמים יעיל לדוגמות בתרבויות hPSC בתפזורת, לקדם שלהם תחזוקה יציב עוקבות, הרחבת LIF-3עכשיו לבד.

יתר על כן, המערכת LIF-3עכשיו/MEF תומכת היעילות משובט הרחבה גורפת חזקים לאורך כל השלבים בין תרבות שושלת היוחסין-איפה זה מונח hPSC המקובלת עד hPSC תמים כמו השלמת השחזור (כלומר., הסתגלות, המעבר והתרחבות עבור פסוקים 7-10 LIF-3עכשיו/MEF לבד). למרות ניסוח הנוכחי של מערכת תרבות זו דורשת תמיכה מזין, שיטה פשוטה ובמחיר כדי לרוקן מזיני בטכניקת ציפוי קדם לניתוח של תרבויות LIF-3עכשיו מוצג (איור 2).

מרובים תרבות אחרים דווחו גם כדי לקדם את hPSC קונבנציונלי כדי דומה pluripotent תמים כמו מערכות קובע2. למרות המערכות תרבות hPSC צריכים לסמוך גם על הניצול של התנאים 2i קלאסית בעכבר נאיבי, ברוב המקרים שיטות passaging אלה תא בודד נדרש גם אפנון כימיים נוספים לייצוב יציב מטבעו / מצב והשלמת אנושית תמימה. חשוב, רוב השיטות האחרות הפגינו לקוי pluripotency תפקודית בעקבות בידול ו/או הנרכש epigenomic חריג דפוסים או karyotypes2. למרות הופעתה של karyotypes חריג בתוך תרבויות hPSC להתקפת קונבנציונלי הוא כבר טוב תיעד19, ממושך, אנזימטי שיטות passaging תא בודד באופן שגרתי המועסקים בשיטות לדוגמות רוב תמים. זה גם הוכח פלאטין הדור של תצורות כרומוזומלית חריג20,21; טכניקות רגיש יותר (למשל, העתק מספר וריאציות, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד) עלול לגלות שינויים נוספים22,23.

לעומת זאת, רפרטואר רחב של קווי hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה אומתו להחזיק karyotypes רגילה-מעברים נמוך-בינוני (למשל, p5-p15), וגם על מספרים גבוהים מעבר (למשל., > p30) בעקבות התרבות LIF-3עכשיו3. בנוסף, הטבעה epigenomic hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה נמצאו reproducibly רגילה ללא פגע 5 – 10 קטעים פוסט לדוגמות LIF-3עכשיו2. באמצעות פלטפורמת מערך רגיש מתילציה מסחריים ספציפיים אלל, בעבר הוכח כי נמצאו סימני מתילציה CpG ב לוקוסים הדומיננטיות של רפרטואר רחב של קווי hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה (להלן 4 – 7 פסוקים LIF-3עכשיו) להיות בגסות מבנה1נורמלי. מאז בסופו של דבר חריג. שמירות גנומית, karyotypes עשוי לפגום הקיבולת הפונקציונלית של hPSC, הנחיות תנאים מוקדמים היו המתוארות ב פרוטוקול זה שמעודד חוקרים כדי לאמת את התרבויות hPSC לפני ואחרי לדוגמות תמימה, בעזרת זה שיטה כמו גם אחרים.

השיטה LIF-3עכשיו שיפור תפקודי pluripotency על פני שכבות הנבט רפרטואר גדול של hESC, hiPSC הטרנסגניים קווים (איור 3). בניגוד פרוטוקולים אחרים לדוגמות תמימה, האם השיטה LIF-3עכשיו לא דורשים צעד priming מחדש עבור הבידול עוקבות של N-hPSC (קרי, המרת N-hPSC לחזור קונבנציונאלי תנאים כאשר הבחינה לפני השימוש בבוים בידול מבחני). N-hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה להציג קיבולות בידול באופן משמעותי יעיל יותר מאשר מקביליהם isogenic hPSC המקובלת בשני מבחני טרטומה (איור 3ד'), וביים בידול הפרוטוקולים של שושלות של כל שלוש שכבות הנבט2. עקב תלויי-assay לבטן בווריאציות בדיקות פונקציונליות של hPSC המקובלת, שושלת היוחסין הספציפי בידול צריך להעריך באמצעות בידול מכוונת עצמאית לפרוטוקולים של hPSC נגזר מרקע גנטי מרובים. שימוש זהיר תכנון ניסויים, מגוון רחב של קווי hPSC צפוי לשפר באופן משמעותי את היעילות שלהם בידול multilineage לעומת עמיתיהם קונבנציונלי isogenic בעקבות 4 – 10 קטעים בתנאים LIF-3עכשיו.

לסיכום, שיטה זו במהירות, clonally מרחיבה את המספרים של האדם PSC, משפר את היעילות שלהם בידול במורד הזרם, מגביר מספרי הטלפון הנייד קדמון ביצע שושלת היוחסין בעקבות בידול ולאחר ירידות לבטן השתנות בין שורות קונבנציונאלי, שושלת היוחסין-איפה זה מונח hPSC. אלה N-hPSC עם פונקציונליות משופרת עוד יותר עשוי להיות בעל השפעה רחב על הפוטנציאל שלהם לתרום רקמות תפקודית כדי העובר מתפתח. לדוגמה, יכול להיות מועסק יציב N-hESC עבור פיתוח שיפותחו איברי אדם בתאי גזע בוגרים בפיתוח כימרות בעלי חיים, או ליצירת humanized גן במיקוד מודלים חייתיים של מחלות. אופטימיזציה נוספת של tankyrase מעכב-ניצול LIF-3עכשיו שיטה זו של שהוגדרו ללא מזין GMP תואמי תרבות תנאים יקל על דור שימושי קלינית יעיל של מגוון רחב של סוגי תאים engraftable פונקציונלי עבור לשימוש טיפולית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

תחת הסכם רישוי בין החיים וטכנולוגיות של ג'ונס הופקינס אוניברסיטת (JHU), ד ר Zambidis זכאי נתח של תמלוגים התקבל לאוניברסיטת רישוי של תאי גזע. תנאי ההסדר הזה מנוהלות על-ידי JHU מדיניותה ניגוד אינטרסים. זה אינו משנה ההקפדה םירצוי יומן מדיניות שיתוף נתונים וחומרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), פרס החדשנות שטיין RPB, מרילנד תאי גזע מחקר הקרן (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), נובו נורדיסק המדע פורום פרס, קרן מוזלי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 136 תמימה pluripotency תאי גזע pluripotent אנושי בידול עיכוב tankyrase מולקולה קטנה epiblast
לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, T. S., Zimmerlin, L.,… More

Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter