Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die effiziente, Bulk und schnelle chemische Rückfall von konventionellen Linie grundiert menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in einen Epigenomically-Stall naiv Präimplantations Epiblast-ähnliche pluripotenten Zustand. Diese Methode ergibt verringerte Abstammung grundiert Genexpression und deutliche Verbesserung der gerichteten multilineage Differenzierung über ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien.
Abstract
Naive menschliche pluripotenten Stammzellen (N-hPSC) mit verbesserter Funktionalität möglicherweise einen großen Einfluss in der regenerativen Medizin. Das Ziel dieses Protokolls ist effizient Abstammung grundiert, konventionellen menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gepflegt Feeder-frei oder Feeder-abhängige Bedingungen ein naiv anmutenden Pluripotenz mit verbesserter Funktionalität wiederherzustellen. Diese chemischen naiv Rückfall-Methode setzt den klassischen Leukämie hemmenden Faktor (LIF), GSK3β, MEK/ERK Hemmung und cocktail (LIF-2i), ergänzt mit nur einem Tankyrase Inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i wird konventionelle hPSC einen stabilen pluripotenten Zustand Annahme biochemische, transkriptionelle und epigenetischen Merkmale des Menschen vor der Implantation Epiblast zurückgesetzt. Diese LIF-3i-Methode erfordert minimale Zelle Kultur Manipulation und ist in ein breites Repertoire an humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und Transgen-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC) Linien sehr reproduzierbar. Die LIF-3i-Methode erfordert keinen erneut grundieren Schritt vor der Differenzierung; N-hPSC unterscheiden sich direkt mit sehr hohen Wirkungsgraden und pflegen karyotypic und epigenomischen Stabilitäten (unter Einschluss der aufgedruckten Loci). Um die Universalität der Methode zu erhöhen, werden die konventionellen hPSC zuerst in der LIF-3i-Cocktail, ergänzt durch zwei zusätzliche kleine Moleküle, die Proteinkinase (Forskolin) und sonic Hedgehog (sHH) (Purmorphamine) Signalisierung (LIF-5i) potenzieren kultiviert. Dieser kurze LIF-5i Anpassung Schritt deutlich verbessert die erste klonale Expansion der konventionellen hPSC und ihnen erlaubt, anschließend naiv-zurückversetzt mit LIF-3i allein in Großmengen, damit die Notwendigkeit einer Kommissionierung/subcloning seltene N-hPSC vermieden werden später Kolonien. LIF-5i-stabilisierten hPSCs anschließend in LIF-3i allein ohne die Notwendigkeit von Anti-apoptotische Molekülen bestehen. Am wichtigsten ist, verbessert LIF-3i Rückfall deutlich die funktionelle Pluripotenz ein breites Repertoire von konventionellen hPSC durch Verringerung ihrer Abstammung grundiert Genexpression und löschen die Interline-Variabilität der gerichteten Differenzierung häufig unter den unabhängigen hPSC Linien beobachtet. Repräsentative Charakterisierungen von LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC sind vorgesehen ist, und experimentelle Strategien für funktionale Vergleiche der isogenen hPSC in Linie grundiert Vs. naiv-ähnliche Zustände werden beschrieben.
Introduction
Das Kultursystem 2i (MEK/ERK und GSK3β-Hemmer) wurde ursprünglich entwickelt, um heterogene Serum-Maus embryonale Stammzellen (mESC) Kulturen in eine einheitliche Grundzustand der Pluripotenz verwandt mit der Maus Präimplantations Epiblast1zu verfeinern. 2i unterstützt jedoch nicht die stabile Erhaltung der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) Linien2. Die verschiedenen komplexe niedermolekularer Wachstumsfaktor ergänzt, und transgene Ansätze vor kurzem berichtet wurde, vermeintlich erfassen ähnlich menschlichen naiv anmutenden pluripotenten Molekulare heißt es2. Jedoch viele der "naiv-Like" Staaten schuf mit diesen Methoden auch ausgestellt karyotypic Instabilität, epigenomischen Mängel (z. B. globale Verlust der elterlichen genomische Prägung) oder Differenzierungspotenzial beeinträchtigt.
In Kontrast, des Cocktails der dreifache chemische Hemmung der GSK3β, ERK und Tankyrase Signalisierung und Leukämie hemmenden Faktor (LIF-3i) war ausreichend für die stabile naiv anmutenden Umkehr ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien3. LIF-3i-zurückversetzt naiv hPSC (N-hPSC) gepflegt normalen Karyotyp und erhöht ihre Ausdrücke der naiv-spezifische menschliche Präimplantations Epiblast-Gene (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i Rückfall auch übertragenen hPSC mit einer Reihe von molekularen und biochemischen Eigenschaften einzigartig für mESC-wie naiv Pluripotenz, die enthalten erhöhte phosphorylierten STAT3 Signaltechnik, verringerte ERK Phosphorylierung, global 5 Methylcytosine CpG Hypomethylierung, genomweite CpG Demethylierung an embryonalen Stammzellen (ESC)-spezifisches Gen Promotoren und dominanten distal OCT4 Enhancer Verwendung. Darüber hinaus im Vergleich zu anderen naiv Rückfall-Methoden, die akzessorisch hypomethyliert führten eingeprägt genomic Loci, LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC waren frei von systematischen aufgedruckten CpG Muster oder Verlust der DNA Methyltransferase Ausdruck (z.B. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Eine direkte LIF-3i-Kultur einer breiten Palette von konventionellen humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC) auf Feeder oder E8 Feeder-freien Bedingungen angebaut erzielt schnelle und Schüttgut eine Rückkehr zu einem naiven Epiblast-ähnlichen Zustand. Direkten LIF-3i naiv Rückfall kann jedoch ineffizient in einigen Sparten instabil konventionellen hPSC aufgrund der inhärenten genomic und Abstammung grundiert Variabilitäten aus dem Spender genetisch vielfältigen Hintergründe sein.
So, um das Dienstprogramm der LIF-3i-Methode zu erweitern, eine schrittweise Optimierung wurde entwickelt und wird hier präsentiert ermöglicht universelle naiv Rückfall mit fast jedem herkömmlichen hESC oder Transgen-freie HiPSC Linie auf Feeder kultiviert. Diese universalisierte naiv Rückfall Methode setzt einen transiente anfängliche Kultur Schritt in konventionellen hPSC, die die LIF-3i-Cocktail mit zwei zusätzlichen kleinen Molekülen (LIF-5i) ergänzt, die Proteinkinase (Forskolin) und sonic Hedgehog (sHH) (potenzieren Purmorphamine) signalisiert. Eine erste Passage der konventionellen hPSC in LIF-5i passt sie an nachfolgende stabile LIF-3i Rückfall in Großmengen. Anfängliche LIF-5i Anpassung steigert deutlich die ersten Einzeller klonalen Proliferation von konventionellen hPSC auf E8 oder Feeder (vor ihren späteren stabilen, kontinuierlichen Übergang in LIF-3i allein) angebaut. Konventionelle hPSC Linien angepasst tolerieren zunächst auf eine Passage in LIF-5i nachfolgende Masse klonalen passagierung naiv-zurückversetzt Zellen in LIF-3i Bedingungen, die entfällt die Notwendigkeit für die Kommissionierung und subcloning von den seltenen stabile Kolonien oder den routinemäßigen Einsatz von Anti-apoptotische Moleküle oder Rho-assoziierten Protein Kinase (ROCK)-Inhibitoren.
Die LIF-3i-Methode erfolgreich eingesetzte stabil ausbauen und pflegen ein breites Repertoire von > 30 unabhängige, genetisch vielfältigen konventionellen hPSC Zeilen für > 10 – 30 Passagen mit beiden Methoden nicht-enzymatische oder enzymatischen Dissoziation und ohne Nachweis der Induktion von chromosomalen oder epigenomischen Abweichungen, einschließlich Anomalien am aufgedruckten gen-Loci. Darüber hinaus sequentielle LIF-5i/LIF-3i-Kultur ist die einzige naiv Rückfall Methode, die bisher berichtet wurde, die die funktionale Pluripotenz ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien verbessert durch eine Verringerung ihrer Abstammung grundiert Genexpression und dramatisch verbessern ihre multipotenten Differenzierung Potenz. Die LIF-3i naiv Rückfall Methode löscht die inhärente interline-Variabilität der Differenzierung der Linie grundiert, konventionelle hPSC Linien und haben einen großen Nutzen der Anwendung in der regenerativen Medizin und zelluläre Therapien.
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Protocol
Alle tierische Verfahren wurden nach Tierbetreuung Leitlinien und Protokolle von der Johns Hopkins Schule von Medizin Institut der Tierpflege und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt.
1. Vorbereitung der Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) für Feeder-abhängige konventionelle (hESC Medium/MEF) oder naiv-zurückversetzt (LIF-3i Medium/MEF) hPSC Kultur
-
Kaufen oder Inhouse Low-Passage Lieferungen von MEF Feeder von CF1 oder CF1 x DR4 Hybrid E13.5 mausembryonen nach veröffentlichten Protokolle4vorbereiten.
- Tiefgefrieren niedrigen Durchgang (p1-p2) MEF Kulturen vor (für langfristige Lagerung) oder (für bis zu 6 Monate) nach Bestrahlung und Store in flüssigem Stickstoff wie oben beschrieben4.
- Bestrahlen (5.000 rad) bulk erweiterte MEF unter p5 mit einem γ - oder X-ray-Brutapparat und Aliquote 1,5 x 106 Zellen pro Fläschchen für kurzfristige Lagerung (weniger als 6 Monate) bei-80 ° C in eine extrem niedrige Temperatur Gefrierschrank vorbereiten.
- Platte zwischen 1,2 x 106 (frisch bestrahlt nicht konserviert) und 1,5 x 106 (bestrahlt kryokonserviert) MEF pro ein verkleisterte 6-Well-Platte für die Zubereitung von Feeder Kulturen, wie unten beschrieben.
- Bereiten Sie Gelatine beschichtet 6-Well sterile Gewebekultur imprägnierte Platten durch Zugabe von 1,5 mL sterile 0,1 % Gelatine-Lösung in jede Vertiefung in einem biologischen Sicherheitsschrank.
- Inkubieren Sie Gelatine beschichtete Platten bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde oder über Nacht in einem Labor CO2 Inkubator.
- Am nächsten Tag Auftauen niedrigen Durchgang (z. B. P2, P4) DMSO kryokonserviert und bestrahlten (5.000 rad) MEF entsprechend den Schritten unten angegeben.
Hinweis: Nicht bestrahlten MEF sollte auch werden aufgetaut, erweitert und unmittelbar vor Gebrauch bestrahlt. - Legen Sie eine kryokonservierten MEF aliquoten im Wasserbad 37 ° C. Sterilisieren Sie beim Auftauen das Rohr mit Ethanol zu und sofort verdünnen Sie die DMSO kryoprotektivum mindestens 10-divisibel mit MEF Mittel (Tabelle 1) innerhalb eines Biosafety Kabinett (z.B. Transfer 1 mL DMSO-MEF aliquoten in 9 mL MEF Medium in einer sterilen 15 mL (konisch).
- Zentrifugieren Sie die verdünnten MEF-Zellen bei 200 X g für 5 min in sterilen 15 mL konische Röhrchen.
- In ein Kabinett Biosafety Aspirieren und zellfreie überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 – 2 mL frisches MEF Medium.
- Sanft verwerfen Sie die Gelatinelösung zu und 2 mL MEF Re MEF Mittel-und in jede Vertiefung eine verkleisterte 6-Well-Platte ausgesetzt wie oben angegeben. Graf MEF Zellen und Platte 1,2 x 106 (frisch bestrahlt nicht kryokonserviert) oder 1,5 x 106 (bestrahlt kryokonserviert) MEF pro ein verkleisterte 6-Well-Platte.
Hinweis: Alle Zellplatten Kultur, die die Biosicherheit Kabinett aus dem CO2 Inkubator übertragen werden können mit Ethanol besprüht Papier vorsichtig abgewischt werden aber sollte nicht direkt auf gesprüht mit 70 % Ethanol Ethanol Verbreitung in den Vertiefungen zu vermeiden. - Inkubieren Sie MEF Platten bei 37 ° C über Nacht in einem Labor CO2 Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) um die Anlage, vor der Verwendung ermöglichen.
2. Stabilisierung des konventionellen hPSC Kulturen für nachfolgende naiv Rückfall mit einem kurzen LIF-5i Anpassung Schritt bulk
- Überprüfen Sie alle herkömmlichen hPSC Linien für einen normalen Karyotyp von G-banding, vor Beginn LIF-5i/LIF-3i Rückfall zu besitzen.
Hinweis: LIF-3i Rückfall des hoch-Passage konventionellen hPSC Linien (zB., P > 40 – 50) sollte vermieden werden, da diese Kulturen bereits genomische Aberrationen, die stabil, effizient und Bulk LIF-3i Umkehrung negativ können grundiert beherbergen können, Convetional hPSC Linien. - Pflegen Sie und erweitern Sie herkömmliche hPSC Kulturen mit validierten normalen Karyotyp eine MEF-basierte Kultursystem (wie in Abschnitt 1 beschrieben) oder ein Feeder-freie Kultursystem (nach Wahl der Prüfer).
Hinweis: Beide Feeder-abhängige hPSC/MEF Kokulturen (z. B. hESC Medium (Tabelle 1) ergänzt mit 4 – 10 ng/mL bFGF) oder Feeder-freie (zB., E8 5 oder mTSER 6 Medien (nach Angaben des Herstellers auf Vitronectin-beschichtete Platten) Methoden sind kompatibel mit Masse naiv Rückfall mit dem LIF-5i/LIF-3i/MEF-System (Abbildung 1). Nicht-enzymatische Methoden werden bevorzugt passagierung der konventionellen hPSC vor bereitet sie für die Umkehr. LIF-5i und LIF-3i Medien Formulierungen enthalten keine Antibiotika oder Antimykotika. Normalbetrieb Regeln für die biologische Sicherheit Kabinett Sterilität und Wartung sollen konsequent eingehalten werden, um eine bakterielle oder Pilzinfektionen Kontamination zu vermeiden. - Die MEF-basierte Kultursystem Vorbereitung MEF Feeder in die verkleisterte 6-Well-Platte wie in Abschnitt 1 beschrieben mindestens einen Tag vor passagierung LIF-5i-angepasste konventionelle hPSC Kulturen.
- Nach konventionellen hPSC Kulturen ~ 50 % Konfluenz (d. h. 3 – 5 Tage nach der ersten Beschichtung) erreicht haben, ersetzen Sie das standard hESC Kulturmedium mit LIF-5i Medium (2 mL pro Bohrloch; ( Tabelle 1).
Hinweis: Führen Sie diese Schritte in eine biologische Kabinett. - Kultur und konventionellen hPSC/MEF für bis zu 2 Tage in LIF-5i im CO2 Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) zu erhalten. Verändern Sie das LIF-5i Medium täglich, um sie für ihre anschließende Verabschiedung und stabile Rückfall in LIF-3i anzupassen.
- Alternativ für die Feeder-freien konventionellen Kulturen (z. B.in E8), Kultur hPSC in LIF-5i nur Übernachtung vor passagierung am nächsten Morgen.
Hinweis: LIF-5i und LIF-3i Kulturen können sowohl mit atmosphärischen (21 % O2) oder physiologische (5 % O2) Sauerstoff Niveaus in den CO-2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) gepflegt werden. - Platzieren Sie vor passagierung die Kultur-Platten in einem Biosafety-Schrank, waschen Sie LIF-5i-angepasste konventionelle hPSC einmal mit PBS und fügen Sie 1 mL der Zelle Dissoziation Reagenz in jede Vertiefung. 5 min bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator inkubieren und sanft mit einer Pipette in eine einzelne Zelle Suspension zurück in die Biosicherheit Kabinett genannte.
Hinweis: Nicht-enzymatische Dissoziation Puffer können alternativ zur Vorbereitung, dass einzelner Zellen passagierung verwendet werden. - Die Zellsuspension in hESC Medium (mindestens 2-fold Verdünnung) in eine sterile 15 mL konische Röhrchen zu sammeln, und sanft genannte Zellen durch pipettieren, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten.
- 300 X g für 5 min zentrifugieren Absaugen/entsorgen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 – 2 mL des Mediums LIF-5i im Kabinett der Biosicherheit. Zählen Sie die Zellen mit einer Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler.
- Waschen vor vergoldete MEF-Platte zweimal mit PBS (2 mL pro Bohrloch in 6-Well Platten) und 1 – 2 x 106 Zellen (in 2 mL LIF-5i Mittel) auf 1 auch der PBS gewaschen MEF Platte verteilen.
- Anpassung und Optimierung der ersten Beschichtung dichten für jede einzelne hPSC Linie zu naiv-zurückversetzt, wie replating Effizienz sehr variabel sein kann. Legen Sie die Platte in eine CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre).
Hinweis: Die routinemäßige Verwendung von Anti-apoptotische Reagenzien ist für die meisten hPSC Linien mit dieser Methode nicht empfohlen. Das LIF-5i-System erhöht bereits erste Masse klonalen neu Galvanik Wirkungsgrade von konventionellen hPSC Linien. Jedoch eine einmalige Verwendung von ROCK-Inhibitor (5 – 10 μM Y-27632) kann weiter zu verbessern die anfängliche LIF-5i klonale neu Galvanik Effizienz der konventionellen hPSC Kulturen in der ersten Passage für einige instabile Abstammung grundiert hPSC Linien mit der Neigung zu spontanen Differenzierung. - Wenn ausgehend von Feeder-freie Kulturen (z.B., E8), direkt einen Brunnen der dissoziierten konventionellen hPSC angepasst in LIF-5i in übertragen bestrahlt man MEF-plated gut (d.h. 1:1 Durchgang).
- Am nächsten Tag sanft Schwenken die Platte zu heben alle fraktionslosen Zellen, Aspirieren Sie das Medium (PBS waschen ist optional) und ersetzen Sie mit 2 mL LIF-5i Medium. Führen Sie diesen Schritt in eine biologische Kabinett täglich für 3 bis 5 Tage oder bis die Zellen sind 60 – 70 % Zusammenfluss (Abbildung 1). Legen Sie die Platte in eine CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre).
3. langfristige Pflege und Ausbau der N-hPSC in LIF-3i Medium
- Nach anfänglichen LIF-5i Anpassung Durchgang nachfolgende stabile LIF-3i Kulturen alle 3 – 4 Tage in eine biologische Kabinett oder wenn Kulturen werden 60 – 70 % Zusammenfluss (Abbildung 1).
Hinweis: LIF-3i Kulturen erfordern konsequente Wartung und damit N-hPSC Kulturen, hohe Konfluenz/Zelldichte von längeren Kultur zu erreichen (zB., > 4 Tage) verringert sich anschließenden klonalen neu Galvanik Effizienz und fördert die spontane Differenzierung. - In eine biologische Kabinett, das Kulturmedium zu verwerfen und waschen jeweils gut von LIF-5i/LIF-3i Kulturen durch sanft Zugabe von 2 mL PBS. Verwerfen Sie PBS zu, und fügen Sie 1 mL der Zelle Ablösung Lösung. 5 min bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) inkubieren.
- Sammeln Sie die Zellsuspension, hESC Medium hinzufügen (ohne Inhibitoren oder Wachstumsfaktoren (Tabelle 1); mindestens 2-fold Verdünnung) wiederherstellen alle hPSC und sanft genannte Zellen durch pipettieren, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Übertragen Sie die Aussetzung auf eine sterile 15 mL konische Rohr.
- 300 g für 5 min zentrifugieren Sie und Absaugen/entsorgen des Überstands. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in LIF-3i Medium. Zählen Sie die Zellen mit einer Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler.
- Platte ~ 2 x 105 Zellen pro Bohrloch auf der bestrahlten MEF in die verkleisterte 6-Well-Platte für routinemäßige passagierung LIF-3i Kulturen. Für die ersten LIF-5i-angepasst Kulturen Platte eine anfänglich höhere Dichte (4 x 105 Zellen/na) vor der ersten Durchfahrt in LIF-3i/MEF.
- Neu Platte und LIF-5i-angepasst hPSC auf frische PBS gewaschen bestrahlten MEF Feeder Teller (wie oben beschrieben am Vortag vorbereitet) in das LIF-3i-Medium zu verteilen. Ersetzen Sie täglich das LIF-3i-Medium.
- Durchgang N-hPSC für wenigsten Passagen 4 – 7 kontinuierliche Massen in die mittlere vor der LIF-3i in funktionelle Studien oder Kryokonservierung von N-hPSC verwenden. Notieren Sie die Anzahl der Passagen des N-hPSC entweder konventionell oder LIF-3i Medien.
Hinweis: LIF-3i Rückfall der hoch-Passage (z. B. > p40) Linie grundiert, konventionelle hPSC Linien wird nicht empfohlen. Sollte versucht werden konventionelle hPSC Linien an der niedrigsten Stelle zurückkehren, dass sie verfügbar sind. Darüber hinaus empfiehlt sich die Verwendung von LIF-3i-zurückversetzt hPSC, die größer als 10 LIF-3i Passagen unterzogen wurden nicht für funktionelle Studien, da so N hPSC Kulturen karyotypisch abnorme Klone aufgrund längerer klonalen Zellenauswahl Kultur beherbergen können. Frische LIF-5i/LIF-3i Kellergalerie Low-Passage konventionellen hPSC Linien für funktionelle Studien durchgeführt werden sollten, wenn Vorräte an N-hPSC mit < 10 Passagen in LIF-3i stehen nicht zur Verfügung.
4. Kryokonservierung und Auftauen des LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC
- Erweitern Sie wiederhergestellte N-hPSC für mindestens 5-7 Passagen in LIF-3i, wie oben erwähnt, vor der Verwendung in funktionelle Studien oder langfristige Kryokonservierung. Notieren Sie die Anzahl der Durchgänge unter herkömmlichen Bedingungen und in LIF-3i Bedingungen auf jeder kryokonservierten Fläschchen.
Bemerkung: Überschuss LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC nicht in funktionelle Assays verwendet kann kryokonservierten bei jedem Durchgang, aber eiskalten unteren Post-Rückfall Passagen (z.B.., < p3) kann Armen oder sehr variabel nach dem Tauwetter Erholung Effizienz führen. - In ein Kabinett Biosafety Aspirieren das Kulturmedium, Waschen mit PBS-Puffer (2 mL pro Well) Zellen, Aspirieren PBS und distanzieren hPSC Kolonien in Einzelzellen mit Zelle Ablösung Lösung (1 mL pro Well). Legen Sie die Platte für 5 min bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre). Verdünnen Sie die Zelle Ablösung Lösung mit dem LIF-3i-Medium (2-fach), sammeln hPSC in einem sterilen 15 mL konisch, Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in LIF-3i Medium (1 – 2 mL pro Brunnen-Äquivalent). Die Anzahl der Zellen mit einer Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler.
- Zentrifugieren Sie N-hPSC im LIF-3i Medium (200 X g für 5 min) und Aufschwemmen Sie Zellen in einem Biosafety-Schrank in die eiskalte Lösung (Tabelle 2), bei einer Dichte von mindestens 1 x 106 Zellen/mL.
- Zellen in die langfristige Lagerung Kryo Röhrchen und in einen Behälter langsam-einfrieren. Lassen Sie die Proben in einem-80 ° C Gefrierschrank über Nacht einfrieren.
- Übertragen Sie am nächsten Tag, die Cryovials in flüssigem Stickstoff Gefrierschrank für langfristige Lagerung.
- Zum Auftauen, platzieren Sie das gefrorene Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad für ~ 2 min. entkeimen das Fläschchen (z. B. Ethanol Spray), übertragen Sie hPSC in einem sterilen 15 mL konische und verdünnen Sie langsam die Zellen 10-divisibel in hESC Medium (Tabelle 1) ergänzt mit 5 μM von Rho-assoziierten Protein Kinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 in eine sterile biologische Schutzhaube Kabinett.
- Zentrifuge bei 200 X g für 5 Minuten. In ein Kabinett Biosafety zellfreie überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in LIF-3i Medium (1 – 2 mL) mit 5 μM ROCK Inhibitor Y-27632 ergänzt.
Hinweis: Ausschluss des Y-27632 führt zu schlechter nach dem Auftauen Erholung Effizienz (Abbildung 2). - Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in LIF-3i/ROCK-Hemmer auf die PBS gewaschen MEF-plated Brunnen Nukleinsäuretablette. Tiefgefrieren Sie LIF-3i Kulturen bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen pro Fläschchen. Tauen Sie diese Fläschchen auf Anleger in einem Brunnen der gelatinierte 6-Well-Platte.
- Starten Sie am nächsten Tag regelmäßige LIF-3i mittlerer Ausdehnung ohne Rho-Kinase-Inhibitor.
(5) Feeder Entfernung zur Erfassung von N-hPSC Proben
- Proben von LIF-3i/MEF (oder hESC/MEF konventionelle) Kulturen vorzubereiten (d. h.für die Genexpression (z. B. quantitative RT-PCR, Microarrays) oder Eiweiß (z.B. Western-Blot) Analysen zum Abbau LIF-3i Kulturen aus den MEF-Stationen mit Magnetische aktiviert Zelle Sortieren (MACS) mit Anti-TRA-1-81 Antikörper beschichtet Microbeads laut Protokoll des Herstellers.
- Alternativ nutzen Sie die folgende einfache Pre-Beschichtung-Methode um Kulturen der Feeder, zum Abbau, wie unten beschrieben.
- In eine sterile biologische Schutzhaube Kabinett zellfreie überstand verwerfen Sie, waschen Sie das Pellet mit steril 2 mL PBS pro Bohrloch. Lösen Sie anhaftende LIF-3i/MEF-Kulturen mit Zelle Ablösung Lösung (1 mL/na). Inkubieren Sie für 5 min in eine CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre). HPSC in einem sterilen 15 mL konisch zu sammeln. Waschen 2-fold in hESC Medium, Transfer-Zellen in die sterile 15 mL konische und Zentrifuge bei 200 X g für 5 Minuten.
- In ein Kabinett Biosafety erneut suspendieren jedes gut von den Zellen der LIF-3i/MEF getrennt in 2 mL des Mediums LIF-3i und direkt übertragen auf einen neuen Brunnen von einem 6-Well-Platte, die frisch mit 0,1 % Gelatine überzogen wurde.
- LIF-3i/MEF hPSC Zellen für 1 h bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) inkubieren. Nicht-anhaftende Zellen mit einer Pipette in eine neue konische Rohr zu sammeln. Sanft fügen Sie 2 mL hESC Medium in jede Vertiefung und Schwenken Sie, um die verbleibenden nicht-anhaftende Zellen zu sammeln.
Hinweis: Der Großteil der bestrahlten MEF wird die verkleisterte Platte in 1 h beimessen verlassen die meisten der hPSC in der Schwebe. - Kombinieren Sie und Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 5 min Waschen in PBS. Snap-Freeze Zelle Pellet in flüssigem Stickstoff nach Zentrifugation oder alternativ wieder auszusetzen Sie Pellets in einem lysiereinrichtung Puffer, der mit der nachgeschalteten Protein oder Nukleinsäure-Analyse (Abbildung 2B) kompatibel ist.
- Durchführen Sie Charakterisierungen von LIF-3i hPSC Linien mit einem passenden konventionellen grundiert isogenen hPSC Kontrolle.
Hinweis: Aufgrund intrinsischer Variabilität zwischen und innerhalb der grundiert Kulturen, relevanten Steuerelemente an eine passende Timepoint in Kultur oder vor dem naiven Rückfall vorbereitet werden. Detaillierte Protokolle und Materialien für nachgeschaltete immunofluorescent Bioimaging, flow Cytometry, Western blotting, Genexpression (RT-PCR-Assays und Microarrays), Methylierung Studien (Dot-Blot, CpG Methylierung Microarray), OCT4 proximalen und distalen enhancer Dominanz-Reporter-Assays und Signalisierung Inhibitor-Assays sind an anderer Stelle3vorgesehen.
6. post naiv Reversion: Validierung von Genomic Integrität und Aufbewahrung der elterliche Abdrücke von LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC vor dem Einsatz im funktionellen Assays
- Bildschirm der Ausgangspunkt grundiert, konventionelle hPSC Kulturen für den Besitz von einen normalen Karyotyp (z. B.mit Giemsa-Band befleckenden Analyse mit veröffentlichten Methoden 7) vor der Einleitung von LIF-5i/LIF-3i Rückfall.
Hinweis: Dies ist herkömmlichen hPSC Populationen zu beseitigen, die abnorme genomische Veränderungen hegen kann die artifizielle selektive Überlebensvorteil in klonalen LIF-3i Bedingungen fahren können. - Für ein optimales Ergebnis frisch wiederherstellen konventionellen hPSC Kulturen, eine naiv-artigen Zustand mit LIF-3i mehrere Wochen vor ihrer Verwendung in funktionelle Studien oder Differenzierung gerichtet.
Hinweis: Routine verlängert "Instandhaltung" Kultur in LIF-3i Bedingungen für mehr als 10 stellen folgende naive Rückfall ist nicht empfehlenswert. Routinemäßige Ausbau und die Erhaltung der hESC und HiPSC Linien durchgeführt werden mit herkömmlichen Kultur-Systemen (z. B. in E8 oder MEF/hESC mittlere mit bFGF). - Nach dem wiederhergestellte N-hPSC Linien zu bewerten, für die Beibehaltung des normalen 5 – 7 Passagen nach LIF-3i Rückfall karyotypes (zB., mit Giemsa-Band befleckenden Analyse7, oder jede andere Methode der Wahl).
- Bewerten Sie alle wiederhergestellte N-hPSC Linien für die Aufbewahrung von normalen elterlichen genomische Abdrücke durch eine DNA-Methylierung Analyse der Wahl (z. B.Protokolle für CpG-DNA Microarray Analyse der elterlichen Prägungen in LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC angeboten anderswo3 ) nach 5 – 10 Passagen des LIF-3i Rückfall.
7. Post naiv Reversion: Experimentelle Design-Richtlinien für Quantitative gerichtete Differenzierung Assays mit LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC
- Nutzen Sie direkt LIF-3i N-hPSC in etablierten gerichtete Differenzierung Protokolle ohne zusätzliche Zelle Kultur Manipulationen.
Hinweis: Erneut grundieren (z. B. Umwandlung von N-hPSC zurück zu herkömmlichen grundiert Voraussetzungen vor ihrer Verwendung in gezielten Differenzierung Assays) ist nicht notwendig mit der LIF-3i-Methode und wird nicht empfohlen. - Kontrolle für die Auswirkungen des Assays und interline-Variabilität in der Funktionsprüfung der einzelnen hPSC Linien, Kreuz-Validierung der Geschlecht-spezifische Differenzierung Potenzen durch den Einsatz von unabhängigen Differenzierung Protokolle mit mindestens drei hPSC Linien von unabhängigen genetische Hintergründe abgeleitet (d. h. mehrere Spender abgeleitet HiPSC und hESC).
- Für funktionale Vergleiche Geschwister, bei gleichwertigen Passagenanzahl und aus der gleichen (isogenen) hPSC Linie parallel zu den üblichen Linie grundiert und LIF-3i-zurückversetzt hPSC Kulturen eingerichtet. Grundiert/naiv Geschwister isogenen hPSC Kulturen in ihren jeweiligen Medien zu erhalten (zB., E8 Vs. LIF-3i), und gleichzeitig differenzieren mit identischen Differenzierung Protokolle und Materialien, um jede experimentelle Bias (Abbildung 4) zu beseitigen.
- Für vs. naiv hPSC Vergleiche isogenen grundiert, Anpassung und Optimierung erste Beschichtung dichten für jedes individuelle Differenzierung-Assay.
Hinweis: Ausführliche Protokolle für neurale Vorläuferzellen, definitive Entoderm und hämato-endothelialen gerichtete Differenzierung der LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC sind an anderer Stelle 3vorgesehen. LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC haben robuster proliferative und Differenzierung Kapazität in die gezielte Differenzierung Assays als konventionelle hPSC. N-hPSC erfordert in der Regel eine geringere Konzentration der ursprünglichen Beschichtung als die herkömmlichen hPSC, und im Gegensatz zu ihren herkömmlichen grundiert hPSC Gegenstücke, erfordern nicht die Verwendung von Anti-apoptotische Reagenzien zur Verbesserung ihrer klonalen Überlebens nach enzymatischer Verdauung in Differenzierung Assays.
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Representative Results
Dieses Protokoll optimiert effizient naiv anmutenden Rückfall mit LIF-3i in beiden Feeder-abhängige und Feeder-unabhängige Linie grundiert konventionellen hPSC Kulturen (Abbildung 1). Das ausführliche Protokoll beschriebenen Umrisse fortlaufende Anpassung an LIF-3i entweder Feeder-abhängige oder Feeder-freien konventionellen hPSC Bedingungen (z. B. E8 Mittel) ab.
Vertreter ergibt sich für die LIF-3i Rückfall von mehreren herkömmlichen hESC und Transgen-freie HiPSC-Linien sind in den Abbildungen 1 – 3vorgestellt. Diese typische Ergebnisse mit den im Handel erhältlichen hESC-Linie H9 überprüft werden können, oder mit einem handelsüblichen Transgen-frei, Schnur Blut abgeleitet episomal HiPSC Linie (6.2) in die Zambidis Labor8,9abgeleitet. Einführung von LIF-5i Anpassung zunächst ermöglicht hocheffiziente nachfolgende, Bulk klonalen Vermehrung von konventionellen hPSC Kulturen in LIF-3i und erfordert keine Anti-apoptotische Agenten oder ROCK-Inhibitoren10 (Abbildung 1A, B ). Mehrere Platten von naiv anmutenden hPSC gesammelten Proben schnell für nachgelagerte Analysen oder Multilineage werden können Regie Differenzierung erst nach 5 – 7 Passagen in LIF-3i. Alternativ können für zukünftige Anwendungen LIF-3i Kulturen kryokonserviert werden. Nach dem Auftauen Zelle Erholung werden kann (Abbildung 2) über die Aufnahme von einer ROCK-Inhibitor Kryokonservierung und nach dem Auftauen Medien11verbessert.
Die Determinanten der molekularen und funktionellen Pluripotenz, sowohl in-vitro- und in den Embryo wurden kürzlich überarbeiteten2. Zu diesen Faktoren gehören die genetischen Hintergrund, Kultur-assoziierten Erwerb von Mutationen für Entwicklungsstörungen schlüsselgene und Unterschiede in hESC und HiPSC Ableitung und Kultur-Methoden. Zur Verfügung gestellt unten stehend finden Sie eine Zusammenfassung der standard-Assays, die zur Charakterisierung und Validierung von phänotypischen, Molekulare eingesetzt werden können und funktionellen Pluripotencies der hPSC LIF-3i-zurückversetzt.
Kolonie Morphologie
Der Übergang zwischen grundiert, konventionelle und LIF-3i-zurückversetzt Kultur-Systeme wird durch verschiedene körperliche Veränderungen im hPSC Kolonie Morphologie (Abbildung 1B) begleitet. Konventionelle hPSC Zellen vermehren so flach, Breite Monolayer-Kolonien, die von kleinzelligen Klumpen (auf MEF oder Feeder-freien Bedingungen), aber schlecht als Einzelzellen rasch expandieren. Gegenüber der konventionellen hPSC Linien LIF-3i fördert das Wachstum und die Expansion und der kleineren, dicht gepackt, kuppelförmigen Kolonien, die aus klonal entstehen einzelne Zellen. Diese morphologischen Veränderungen sind vollständig reversibel und LIF-3i-zurückversetzt kuppelförmigen Kolonien spontan Übergang zurück zu einer konventionellen Monolage Morphologie wenn LIF-3i zurückgezogen und Zellen sind neu im standard konventionellen hESC Medium kultiviert mit bFGF ergänzt. Darüber hinaus Erweiterung des LIF-3i-zurückversetzt Zellen bei hohen dichten konfluierende (oder längere Kultur ohne häufige passagierung) Ergebnisse in der spontanen hochschlag der flachen, konventionellen Morphologie mit reduzierter klonalen Leistungsfähigkeit; unter Betonung der Notwendigkeit für die sorgfältige Wartung und Pflege von LIF-3i-zurückversetzt hPSC (zB., < Zusammenfluss von 40 – 60 %).
Leben Sie Immunfluoreszenz-Färbung zu und fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der Oberfläche Pluripotenz Marker
Evaluierung der Pluripotenz Marker in den Übergang vom konventionellen zum einen naiv-artigen Zustand, die folgenden ständigen LIF-3i Kultur sein kann überwacht nicht-invasiv mit live Antikörper Färbung ohne Erkennung keine negativen Auswirkungen auf LIF-3i/MEF Erweiterung ( zB., Leben-Färbung Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen TRA-1-81, TRA-1-60 und SSEA4).
Beibehaltung der Pluripotenz während LIF-3i Rückfall von durchflusszytometrischen Analyse der Pluripotenz-assoziierten Oberfläche Marker Ausdruck der TRA-1 kann auch routinemäßig überwacht und SSEA Antigene während einzelne Zelle passagierung (Abbildung 1C) oder Immunfluoreszenz von intakt, festen Kolonien in Situ (Abbildung 3). Obwohl diese Markierungen nicht zwischen herkömmlichen unterscheiden und LIF-3i Staaten, ihre Niveaus umgekehrt korrelieren mit der Frequenz der spontanen Differenzierung, die beim Übergang vom konventionellen hPSC LIF-3i Bedingungen in hPSC auftreten können. Zusätzliche Oberflächenantigenen, die genauer Mark menschlichen naiv-ähnliche Zustände in-vitro-2,12,13 Mai können auch eingesetzt werden, um effektive LIF-3i hPSC Rückfall zu erkennen.
Validierung der molekularen Pluripotenz von N-hPSC
Weil der genetische Hintergrund der hPSC Linien als einem starken Standbein interline-Variabilität gekennzeichnet worden ist, ist es wichtig, konsequent isogene Kulturen im passenden Kultur Zeitpunkte hPSC Kultur Systeme (Abbildung 4) im Vergleich zu bewerten. Da einige dieser Systeme bereits hPSC Populationen mit aberranten genomische und epigenetische Konfigurationen2zu erzeugen nachweislich, sollte jede naiv-Reversion-Methode mit einer Reihe von N-hPSC von unabhängigen genetischen Hintergründen, in gewissem Sinne untersucht Das reicht zur Validierung biologischer Reproduzierbarkeit und Ausschließen nicht entwicklungspolitisch relevanten "Pseudo-pluripotenten" Staaten (d. h. mit scheinbaren Kennzeichen der molekularen Pluripotenz aber funktionale Differenzierung Fähigkeiten fehlen). Zimmerlin Et Al. die Validierung des Systems der LIF-3i-Kultur gehören, prüfen die molekulare und funktionelle Pluripotencies der wiederhergestellten N-HiPSC abgeleitet von verschiedenen Neuprogrammierung Methoden, die einen weiteren bekannten vermeintlichen Beitrag funktionale Variabilität ist weiter ausgebaut zwischen pluripotenten Zuständen2.
Dementsprechend konzentrierten sich die meisten Studien der menschlichen naiv-Kultur-Systeme auf Untersuchung molekularer Pluripotenz von N-hPSC 1) epigenetischer Ebene (z. B. Histon Marken durch Sequenzierung von ChIP oder ChIP-PCR, globale DNA-Methylierung von Immunoblots oder ganze genomischen Bisulfit-Sequenzierung, Allel-Spezifische CpG Methylierung Microarrays, OCT4 Enhancer vorherrschende Nutzung durch Reporter Systeme, globale Aktivität auf regulatorische Elemente durch DNAse ich Überempfindlichkeit und wiederholte Element Profilierung durch RNA-Sequenzierung), 2) transkriptomischen Stufe (RNA-Sequenzierung, Ausdruck Microarrays und quantitative RT-PCR), Protein Expressionsanalyse (zB., FACS, immunofluorescent Mikroskopie und Western blotting) und 3) über metabolische Studien (z. B. Glykolyse, oxidativen Phosphorylierung und Nicotinamid-Stoffwechsel). Repräsentative Beispiele von Immunfluoreszenz Flecken und Western-Blot-Erkennung des Ausdrucks für wichtige Marker der molekularen Pluripotenz werden (Abbildung 3B, C) angezeigt. Beispielsweise sind dargestellt in Abbildung 3 b aktivierte phosphorylierten (Phospho) und total Isoformen des STAT3 und ERK1/2, die wichtigsten molekularen Kennzeichen der Maus ESC-wie naiv Pluripotenz sind. Diese wurden mit Anti-STAT3 und Anti-ERK1/2 primären Antikörper nachgewiesen. Darüber hinaus zeigt sich funktionale Pluripotenz in Teratom Differenzierung Assays in konventionellen Vs. LIF-3i-zurückversetzt hPSC Teratom Gewebe seziert 10 Wochen nach der Injektion und in 4 % Formaldehyd festgelegt und paraffin eingebettete (Abbildung 3D).
Vorbereitung von LIF-3i/MEF oder hESC/MEF/bFGF Proben für die nachgelagerten molekulare Analyse gehören MEF Erschöpfung. Zwei Ansätze sind oben beschrieben, für MEF-Abbau, die erfolgreich in unserem Labor beschäftigt sind. MEF Pre-Beschichtung ist eine einfache, zuverlässige und kostengünstige Methode, um Anleger aus N-hPSC zu beseitigen Proben für Molekulare Studien und ist eine bevorzugte Alternative zu FACS oder MACS Trennung (z. B. Anti-TRA-1-81 oder Anti-TRA-1-60 Antikörper-basierten Trennung ). Darüber hinaus können spontan-differenzierenden TRA-1-Negative adhärente Zellen in LIF-5i/LIF-3i Kulturen schnell von LIF-5i/LIF-3i N-hPSC Kulturen vor nachfolgenden LIF-3i Durchfahrt auf frischen MEF beseitigt werden durch Pre Ausplattieren der enzymatisch verdaut einzelne Zellen für 1 h auf Tellern vorbeschichtet mit 0,1 % Gelatine (Abbildung 2).
Bewertung der funktionellen Pluripotenz von N-hPSC
Der strengste Test der funktionalen Pluripotenz der PSC ist die Blastozyste Injektion Chimäre Assay, die bei der Prüfung von N-hPSC Linien aus ethischen Gründen begrenzt ist. Alternativ haben mehrere Gruppen, die mit verschiedenen anderen Methoden die Generation der N-hPSC gemeldet haben versucht, Interspezies Chimären zu erzeugen. Diese Versuche haben jedoch extrem niedrig oder erfolglosen Beitrag der differenzierten N-hPSC Übertragungslinien murinen oder porcinen Embryonen im Vergleich zu der Chimäre erzeugenden Kapazität des Standardmaus ESC2geführt.
Zusätzliche funktionelle Studien habe Regie in Vitro Differenzierung von vermeintlichen N-hPSC abgeleitet über verschiedene Methoden untersucht, aber voreingenommen, defekt oder verminderte multilineage Differenzierung Kapazität mit Begleiterscheinung ergaben Beherbergung von epigenetischen Veränderungen2,13. Ähnliche epigenomischen Aberrationen, vor allem am aufgedruckten Loci in Maus ESC erkannt wurden nach längerer Exposition gegenüber der LIF-2i cocktail14. Interessanterweise berichteten einige Rückfall-Kultur-Systeme umfassende Verbesserungen der spezifischen Eigenschaften der funktionalen Pluripotenz PSC wie die erweiterte Kapazität für in Vivo trophektoderm Beitrag2,15 .
Verwenden eine breite Sammlung von LIF-3i-zurückversetzt hPSC unabhängig voneinander abgeleitet, beschäftigt Zimmerlin Et Al. multilineage Differenzierung Assays zu zeigen, dass das LIF-3i-System dramatisch die funktionelle Pluripotenz von konventionellen hPSC Linien verbessert 3. dadurch systematische Analyse von konventionellen Vs LIF-3i hPSC Linien isogenen paarweise interline-abhängige Variationen (Abbildung 4) zu beseitigen. LIF-3i-zurückversetzt hPSC Linien erfordern keinen erneut grundieren Schritt vor der EB Differenzierung. Jedoch LIF-3i hPSC vermehren sich zu deutlich höheren klonalen Preisen als isogene Zellen in E8 erweitert, und somit erste untere Beschichtung dichten Anpassung erfordern an jede Kultur Zusammenfluss bei einem ähnlichen Timepoint erreichen lassen.
Ermittler sollten routinemäßig nutzen mehrere Tests um die verbesserte Funktionalität der LIF-3i-zurückversetzt hPSC zu demonstrieren, die nicht nur in Vivo Teratom Assays, sondern auch in-vitro- Regie Differenzierung Assays zu neuronalen enthält, definitive Entoderm und Hematovascular Linien3 verwenden mehrere Tests (z.B., 2D APEL3,16 und 3D Embryoid Körpersysteme17,18 ). Um für Assay-abhängige Reproduzierbarkeit zu steuern, sollten mindestens zwei verschiedene Differenzierung Methoden in Wiederholung für jedes isogenen grundiert/LIF-3i hPSC Kulturen (z. B. Abbildung 4, APEL, Embryoid Körper durchgeführt werden Differenzierung-Protokolle). Das experimentelle Design sollte eine robuste Reihe enthalten (z. B.> 3 – 5) grundiert/LIF-3i isogenen Paare von hPSC Linien von mehreren, unabhängigen Spender genetische Hintergründe (Abbildung 4).
Abbildung 1: Einen schrittweisen Übergang von konventionellen, Linie grundiert hPSC Kulturen zu naiv-ähnlichen Bedingungen mit der LIF-3i-Methode. (A) Schema von Protokollen zur schrittweisen LIF-3i Rückfall. (Oben schematisch) Eine allgemeine Methode für den Übergang von grundiert, konventionelle hPSC LIF-3i Kulturen. (Unten Schaltpläne) Zwei zusammengefasste Strategien für LIF-3i naiver Umkehrung der konventionellen (grundiert) hPSC Feeder (d. h. Primed/MEF, LIF-3i/MEF) oder Feeder-freien Bedingungen (dh, Primed/E8, LIF-3i/MEF) kultiviert. (B) menschlichen PSC Morphologien. Gezeigt werden repräsentative Vergößerung der hPSC während LIF-3i Rückfall mit einem handelsüblichen menschlichen episomal iPSC (6.2). Gezeigt sind die Übergänge zwischen den ersten konventionellen flachen Monolage Kolonien beobachtet, und die anschließende kuppelförmige klonogenen Kolonien, die nach entstehen passage im mittleren LIF-5i und stabile LIF-3i Kulturbedingungen. Skalieren von Balken = 200 µm. (C) repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Analyse der Pluripotenz oberflächenmarker. Gezeigt werden TRA-1-81 und SSEA-4 Oberfläche Ausdrücke in konventionellen hPSC Linie 6.2 (p40) erweitert in E8, der erste Durchgang im LIF-5i/MEF und folgenden 1-9 Passagen (P1-P9) in LIF-3i Bedingungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Kryokonservierung von N-hPSC und Probenvorbereitung von MEF Pre-Beschichtung. (A) Beispiel eines Frost/Tau-Zyklus von LIF-3i/MEF Kulturen. Die herkömmliche Schnur Blut abgeleitet, nicht integrierte, Transgen-freien menschlichen iPSC Linie, die e5c3 wurde abgeleitet und erweitert auf MEF-Feeder in hESC Medium mit 4ng/mL bFGF für 18 Passagen ergänzt. Konventionelle, Linie grundiert E5C3 wurden angepasst in LIF-5i (links) und in LIF-3i Medium für 3 Durchgänge (Mitte). Die E5C3 LIF-3i-Zellen in der Mittelkonsole dargestellt wurden kryokonserviert, Verwendung von DMSO-basierte kryoprotektivum Medium (Tabelle 2; 1 x 106 Zellen pro Fläschchen) und in flüssigem Stickstoff gelagert). Eine Durchstechflasche wurde einen Monat später aufgetaut und E5C3 Zellen wurden in ein Feeder beschichteten gut von einem 6-Well-Platte (rechts). Handy Recovery kann verbessert werden, durch die Ergänzung der LIF-3i-Medium mit 5 µM Y-27632 für nur einen Tag nach dem Tauwetter. Skalieren von Balken = 200 µm. (B) Beseitigung des MEF (und auch anhaftende TRA-Negative differenzierte Zellen) in LIF-3i/MEF hPSC Kulturen durch die Pre-Beschichtung-Methode. Gezeigt werden Fluss durchflusszytometrischen Analyse vor und nach der Pre-Beschichtung von PE-konjugierten Anti-TRA-1-81 und TRA-1-60 Antikörper, APC-konjugiert SSEA-4 Antikörper und SSEA-1/CD15 Antikörper Nachweis Erschöpfung der TRA-1-Antigen negativ und MEF-Zellen unter Verwendung der eine Stunde vor Überzug Methode. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Charakterisierung der Pluripotenz in LIF-3i/MEF N-hPSC Kulturen. (A) Oberfläche und nukleare Pluripotenz Marker. Ausdruck der Pluripotenz Faktor NANOG in der gleichen (isogenen) TRA-1-81+SSEA4+ konventionell, grundiert Schnur Blut abgeleitet HiPSC Linie E5C3 (p39) erweitert grundiert (E8) oder naiv LIF-3i (+ p8 in LIF-3i/MEF) Bedingungen. Immunofluorescent Flecken der repräsentativen hPSC Kulturen auf Kammer Folien offenbart die einheitliche, nukleare Ausdruck der Pluripotenz Kernfaktor NANOG SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC in kultivierten grundiert, konventionelle (E8 Mittel) "oder" LIF-3i/MEF Bedingungen. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) Western-Blot Analyse. STAT3 (links), ERK (Mitte) und Kontrolle-Beta-ACTIN-Protein-Expression für eine repräsentative hPSC (Linie hESC H9) in herkömmlichen (E8 Mittel) "oder" LIF-3i/MEF Bedingungen (3i). (C) Ausdruck der naiven Pluripotenz-assoziierten Transkriptionsfaktoren. Gezeigt werden STELLA/DPPA3, NR5A2 und TFCP2L1 durch Immunfluoreszenz in einer repräsentativen LIF-3i/MEF-Kultur (Schnur Blut abgeleitet HiPSC Linie E5C3 bei p33 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Maßstabsleiste = 100 µm. (D) Teratom Assays von konventionellen und LIF-3i-zurückversetzt hPSC. Validierung von funktionalen Pluripotenz in einer isogenen repräsentative HiPSC (Schnur Blut abgeleitet E32C6) in beiden E8 kultiviert (p9) oder LIF-3i/MEF (+ p12) von Teratom Assay. 10 x 106 Zellen der isogenen Parallel-kultivierte konventionelle, grundiert Vs LIF-3i-zurückversetzt hPSC wurden die Glieder der immungeschwächte NSG Mäusen subkutan injiziert. Hämatoxylin und Eosin Flecken von Teratom Microsections offenbart robuste Differenzierung in alle drei mikrobeschichten mit gut strukturierten Ektoderm (neuronale Rosette: NR, retinale pigmentierten Epitheliam: RPE), Mesoderm (Chondroblasten: Ch), und Entoderm (Drüsen Gewebe: GI) Linien. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Vergleich der funktionellen Pluripotenz zwischen isogenen grundiert und naiv. (A) schematische Strategie für die Beurteilung der funktionalen Pluripotenz aus unterschiedlichen pluripotenten Staaten isogenen konventionelle vs. LIF-3i kultiviert hPSC in unabhängige Differenzierung Protokolle. Gezeigt werden zwei Hämato-Kreislauf Stammvater Differenzierung Systeme (APEL monomolekularen Film und 3D Embryoid (EB) Körpersysteme), die zuvor, zur Differenzierung Potenz des konventionellen vs. Bewertung beschäftigt waren LIF-3i-zurückversetzt in der gleichen Zeile (isogenen) hPSC LIF-3i Rückfall mit gleichen Durchgang Zahlen kultiviert in parallelisierungspfosten. LIF-3i-zurückversetzt hPSC Linien erfordern keinen erneut grundieren Schritt vor der EB Differenzierung und Differenzierung-Protokoll direkt ausgesetzt sind. (B) EB vaskulären Vorläuferzellen (VP) Differenzierung System. Das EB 3D Differenzierung System für diese Studie war zuvor beschriebenen17,18. Gezeigt werden die repräsentativen Ergebnisse am Tag 10 der EB Differenzierung (linke Platten) für isogenen Kulturen der gleichen Nabelschnurblut (CB)-abgeleitet E5C3 hPSC Linie9, kultiviert in entweder konventionelle hESC/MEF (Primed / MEF) Bedingungen oder LIF-3i/MEF naiv Bedingungen. Flow-zytometrie Analyse dieser EB Zellen zeigen dramatische Steigerungen von CD31+CD146+ VP Populationen nach LIF-3i Umkehrung der E5C3 Linie vor der Differenzierung. Das Histogramm zeigt die mittlere ±SD CD31+CD146+ VP Prozentsätze erholt am Tag 10 in diesem EB-System mit drei isogenen Paare von unabhängigen hPSC Linien (d. h. zwei CB-HiPSC und einem Erwachsenen Fibroblasten-abgeleitete Zellen HiPSC, gepunktete Linien verbinden isogenen Paare). Ergebnisse zeigen signifikante Verbesserung der VP Differenzierung Wirkungsgrade in der EB-System über genetische Hintergründe der hPSC mehrzeilig. (C) APEL Monolage vaskulären Stammvater Differenzierung System. Konventionelle (grundiert E8) und LIF-3i-zurückversetzt hPSC kann direkt differenziert mit den gleichen Kulturbedingungen, Wachstumsfaktoren, Zytokine und kleine Moleküle der schrittweisen APEL endothelialen Differenzierung Protokoll 3, 16. dargestellt sind unabhängige APEL Differenzierung Experimente mit E5C3 Schnur Blut abgeleitet HiPSC Linie, und der Anteil der CD31+CD146+ vaskuläre Stammvater Populationen am 7. Tag von APEL Differenzierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das LIF-3i-System wendet eine modifizierte Version des klassischen murinen 2i naiv Rückfall cocktail1 auf menschlicher pluripotenter Stammzellen. Die Selbsterneuerung der hPSC (die in 2i allein erweitern kann) wird in LIF-2i durch Ergänzung dieser Cocktail mit dem Tankyrase-Inhibitor XAV939 stabilisiert. LIF-3i Kultur ermöglicht Bulk und effiziente Umkehrung der konventionellen hPSC in einen pluripotenten Zustand ähnlich der menschlichen Präimplantations Epiblast-3. Obwohl die Wirkmechanismen der XAV939 in hPSC wahrscheinlich komplex sind und synergistisch mit 2i, sie wahrscheinlich auch auf ein Minimum, eine wichtige Stabilisierung und Vermehrung der hPSC Selbsterneuerung über WNT signalisieren Wege3.
Konventionelle hPSC Kulturen anzunehmen normalerweise ein Spektrum an pluripotenten Staaten mit hochvariablen Abstammung grundiert gen Ausdrücken und nach der Implantation Epiblast epigenetischen Markierungen, die inkonsistent oder verminderte funktionelle Pluripotenz2 führen kann . Diese inhärente Abstammung grundieren der konventionellen hPSC Kulturen kann auch mit der erfolgreichen LIF-3i Rückfall von einigen hPSC Linien2beeinträchtigen. Jedoch die Aufnahme von dem LIF-5i Anpassung Startschritt (Tabelle 1) in der LIF-3i-Methode allgemein erweitert die Leistungsfähigkeit von LIF-3i Rückfall unter einer Vielzahl von hPSC Linien und fördert die Masse naiv Umkehrung der konventionellen hPSC Linien in einer Art und Weise Das umgeht mühsam Kommissionierung und subcloning selten naiv-zurückversetzt Kolonien oder die Notwendigkeit der Verwendung von routinemäßigen Anti-apoptotische Moleküle um ihre Lebensfähigkeit zu stabilisieren.
Die LIF-5i/LIF-3i naiv Rückfall Methode ist reproduzierbar in einer breiten Vielzahl von hESC und HiPSC Linien. Es erfordert minimale Schulung mit Grundzelle Kultur Geschick. Zimmerlin Et Al. erfolgreich eingesetzte diese sequentielle Strategie zurückkehren > 30 unabhängige hESC und Transgen-freie HiPSC Zeilen aus einer breiten Palette von Spender- 3. Ein Durchgang in LIF-5i (Abbildung 1) ist ausreichend für die meisten hPSC Linien, effiziente naiv Rückfall in loser Schüttung hPSC Kulturen zu unterziehen, und ihre spätere stabile Wartung und Erweiterung in LIF-3i allein weiter.
Darüber hinaus unterstützt das LIF-3i/MEF System robust Masse klonalen Expansion Effizienz in allen Stufen zwischen Linie grundiert konventionellen hPSC Kultur bis hin zu abgeschlossenen naiv anmutenden hPSC Rückfall (i.e., Anpassung, Umstellung und Erweiterung für 7 – 10 Passagen in LIF-3i/MEF allein). Obwohl die aktuelle Formulierung dieses Kultur-Systems Feeder Unterstützung benötigt, ist eine einfache und kostengünstige Methode, um Anleger durch die Pre-Plating-Technik für die Analyse von LIF-3i Kulturen zum Abbau (Abbildung 2) vorgestellt.
Mehrere andere Kultur, die Systeme auch gemeldet wurden, konventionelle hPSC, ähnlich naiv anmutenden pluripotenten zu fördern heißt2. Obwohl diese hPSC-Kultur-Systeme auch auf die Nutzung der klassischen Maus naiv 2i Bedingungen verlassen haben, in den meisten Fällen diese einzelligen passaging Methoden auch erforderliche zusätzliche chemische Modulation zur Stabilisierung eine inhärent instabil / metastabile menschlichen naiv Zustand. Wichtig ist, die meisten dieser anderen Methoden gezeigt beeinträchtigt funktionale Pluripotenz nach Differenzierung und/oder erworbene abnorme epigenomischen Abdrücke oder Karyotypen2. Obwohl die Entstehung von abnormen Karyotypen innerhalb der konventionellen grundiert hPSC Kulturen bereits gut dokumentiert19, verlängert, enzymatische einzellige passagierung Methoden, die in den meisten naiv Rückfall Methoden routinemäßig eingesetzt werden. Dies wurde auch gezeigt, die Generation der abnormen chromosomalen Konfigurationen20,21potenzieren; empfindlichere Techniken (z. B. Kopie Nummer Variationen, Einzel-Nukleotid Polymorphie) können zusätzliche Änderungen22,23offenbaren.
Im Gegensatz dazu ein breites Repertoire von LIF-3i-zurückversetzt hPSC Linien zu normalen Karyotyp auf niedrige mittlere Passagen (z.B. p5-p15), und auch bei hohen Durchgang Zahlen besitzen bestätigt wurden (zB., > p30) nach LIF-3i Kultur3. Darüber hinaus fanden epigenomischen Abdrücke in LIF-3i-zurückversetzt hPSC reproduzierbar normale und intakte bei 5 – 10 Passagen Post LIF-3i Rückfall2. Mit der sensiblen Allel-Spezifische kommerzielle Methylierung-Array-Plattform, wurde zuvor nachgewiesen, dass CpG Methylierung gegenüberstehenden aufgedruckten Loci ein breites Repertoire von LIF-3i-zurückversetzt hPSC Linien (4 – 7 folgenden Passagen LIF-3i) erwiesen sich grob normale Struktur1. Da abnorme genomische Prägungen und Karyotypen letztlich die Funktionsfähigkeit der hPSC beeinträchtigen können, wurden erforderliche Richtlinien in diesem Protokoll beschrieben, die Forscher hPSC Kulturen vor und nach der naiven Rückfall, mit diesem validieren fördert Methode sowie andere.
Die LIF-3i-Methode verbessert funktionelle Pluripotenz mikrobeschichten in ein großes Repertoire an hESC und nicht-transgenen HiPSC Linien (Abbildung 3). Im Gegensatz zu anderen naiv-Rückfall-Protokollen, die LIF-3i-Methode führt nicht erneut grundieren Schritt für spätere Differenzierung von N-hPSC erfordern (z. B. Umwandlung von N-hPSC zurück zu herkömmlichen grundiert Voraussetzungen vor ihrer Verwendung in Regie Differenzierung-Assays). LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC deutlich effizientere Differenzierung Kapazitäten als ihre Pendants isogenen konventionellen hPSC in beide Teratom Assays (Abbildung 3D) anzeigen und Differenzierung Protokolle der Linien aller gerichtet drei mikrobeschichten2. Aufgrund der Assay-abhängige und interline-Variationen in Funktionstests von konventionellen hPSC, Geschlecht-spezifische Differenzierung mit unabhängigen gerichtete Differenzierung Protokolle und hPSC abgeleitet von mehreren genetischen Hintergründen ausgewertet werden soll. Mit sorgfältiger experimentelles Design, ein breites Spektrum an hPSC Linien rechnen ihre multilineage Differenzierung-Effizienz im Vergleich zu herkömmlichen isogenen nach 4 – 10 Passagen in LIF-3i Bedingungen deutlich zu verbessern.
Zusammenfassend lässt sich sagen, diese Methode schnell und klonal erweitert die Zahl der menschlichen PSC, verbessert ihre nachgelagerten Differenzierung Effizienz, erhöht die Lineage-committed Stammvater Zellzahlen nach Differenzierung und sinkt interline-Variabilität unter den konventionellen, Linie grundiert hPSC Linien. Diese N-hPSC mit verbesserter Funktionalität kann sich weiter Breite für ihr Potenzial zur funktionellen Geweben zu einer sich entwickelnden Embryos auswirken. Stabilen N-hESC kann beispielsweise für die Entwicklung der transplantierbaren menschlicher Organe und adulte Stammzellen bei der Entwicklung von tierischer Chimären oder zur Erzeugung von humanisierten gen gezielt Tiermodellen der Krankheit eingesetzt werden. Die weitere Optimierung der Tankyrase unter Verwendung der Inhibitor LIF-3i Methode im definierten Feeder-freie GMP-konforme Kulturbedingungen erleichtert die effiziente klinisch nützlich Erzeugung einer breiten Palette von Funktions- und engraftable Zelltypen für therapeutische Anwendung.
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Disclosures
Unter einem Lizenzvertrag zwischen Life Technologies und der Johns Hopkins University (JHU) hat Dr. Zambidis Anspruch auf einen Anteil des Königtums erhielt von der Universität für die Lizenzierung von Stammzellen. Die Bedingungen dieser Vereinbarung werden von JHU gemäß seinen Interessenkonflikt Richtlinien verwaltet. Dies ändert nichts an Autoren Einhaltung Zeitschrift Richtlinien auf den Austausch von Daten und Materialien.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award und die Moseley Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
References
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