Summary
効率的な一括、および急速な化学復帰従来系列プライミングひと多能性幹細胞 (hPSC) の epigenomically 安定した素朴な着床前胚盤葉上層のような多能性状態にするためのプロトコルを提案します。このメソッド結果減少系統プライミング遺伝子発現と分化多能でマーク付きの改善で従来の hPSC ラインの幅広いレパートリー。
Abstract
素朴なひと多能性幹細胞 (N hPSC) 機能改善された再生医療全体への影響があります。このプロトコルの目的は、効率的にリネージュ プライミング、従来人間多能性幹細胞 (hPSC) を機能改善された世間知らずのような多能性フィーダー無料またはフィーダーに依存した条件で保持される元に戻すです。復帰するこの化学世間知らずの手法では古典的な白血病抑制因子 (LIF)、GSK3β、MEK/ERK 抑制がカクテル (LIF 2 i) の時にタンキラーゼ阻害剤 XAV939 のみと補われる (LIF 3 i)。LIF 3i 生化学的解析、転写を採用し安定した多能性状態と人間着床前胚盤葉上層のエピジェネティックな機能を従来の hPSC を元に戻します。この LIF 3i メソッドは、ヒト胚性幹細胞 (hESC) と transgene 無料ひと誘導多能性幹細胞 (による) 線の広いレパートリーの中で再現性の高い最小限細胞培養操作が必要です。LIF 3i 方法では分化; 前に再プライミングの手順は必要ありません。N hPSC は非常に高い効率を直接区別できる保守核型とエピゲノム安定性 (捺印された遺伝子を含む)。、法の普遍性を向上させるため、従来の hPSC は蛋白質キナーゼ (フォルスコリン) とソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i) のシグナルを増強する 2 つの追加小分子添加 LIF 3i カクテルで培養最初。この簡単な LIF 5i 適応ステップ大幅に従来の hPSC の初期のクローン性増殖を強化し、LIF-3i バルク量で一人でこうしてピッキング/subcloning 珍しい N-hPSC のための必要があるとその後素朴な復帰することができるようにその後の植民地。LIF 5i 安定 hPSCs その後に保持されます LIF 3i 抗アポトーシス分子を必要とせず単独で。最も重要なは、LIF 3i 復帰は著しくリネージュ プライミング遺伝子発現を減少させると分化のインター ライン変動をよく消去によって向上従来 hPSC の幅広いレパートリーの機能的な多能性独立した hPSC ラインの中で観察。LIF 3i 戻った N hPSC の代表的な特徴は、リネージュ プライミング対同質遺伝子 hPSC の機能比較のため、そして実験的戦略です。素朴なような状態のとおりです。
Introduction
2i (MEK/ERK と GSK3β 阻害剤) 文化システムはマウス着床前胚盤葉上層1と同類の多能性の基底状態の制服に異種血清を用いたマウス胚性幹細胞 (mESC) 文化を絞り込むに元々 開発されました。ただし、2 i は、ひと多能性幹細胞 (hPSC) 線2の維持安定をサポートしません。様々 な成長因子の添加、複合体の小さい分子や形質推定をキャプチャする報告されている最近似たような人間のような素朴な多能性分子状態2。ただしもこれらのメソッドで作成された「世間知らずのような」状態の多くは核型不安定性、エピゲノム欠陥 (親ゲノムインプリンティングの例えば、グローバル損失) を展示や分化の障害。
コントラスト、トリプルの化学的阻害剤 GSK3β、ERK およびタンキラーゼ シグナリングのカクテルと白血病抑制因子 (LIF 3 i) は従来の hPSC ライン3の幅広いレパートリーの安定した世間知らずのような復帰のため十分でした。LIF 3i 戻す素朴な hPSC (N hPSC) 正常核型を維持し、素朴な固有人間着床前胚盤葉上層の遺伝子の表現を増加した (e.g.,NANOG、 KLF2 NR5A2、DNMT3L、HERVH、ステラ (DPPA3)、 KLF17、 TFCP2L1)。MESC のような素朴な多能性リン酸化 STAT3 シグナリング増加含まれて、ERK のリン酸化、グローバル 5-メチルシトシン CpG を減少するユニークな分子および生化学的な特性の配列と LIF 3i 復帰も授与 hPSC低いメチル化、胚性幹細胞 (ESC) のゲノム広い CpG メチル-特定の遺伝子の促進者と支配的な遠位 OCT4 エンハンサー使用。また、他の世間知らずと比較して異常 hypomethylated の結果返還方法刻印ゲノム遺伝子座, LIF 3i 戻った N hPSC 刻印 CpG パターンの体系や DNA メチルトランスフェラーゼ式の損失を欠いている (などDNMT3A、DNMT1 DNMT3B)3。
従来ヒト胚性幹細胞 (hESC)、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) の送り装置か E8 フィーダー無料条件で栽培の広範な配列の直接 LIF 3i 文化は、素朴な鱗のような状態に迅速かつ一括返還を実現しました。ただし、直接 LIF 3 i 素朴な返還が遺伝的多様なドナーの背景から生じる固有のゲノムとリネージュ プライミングの変動のためのいくつかの不安定な従来の hPSC ラインで効率的にあります。
したがって、LIF 3i 手法の有用性を広げるため開発された段階的最適化と記載はほぼ従来 hESC や無料の遺伝子によるラインと普遍的な素朴な復帰をフィーダーに培養可能します。このじっさい素朴な復帰メソッドが 2 つ追加小さな分子 (LIF-5i) プロテインキナーゼ (フォルスコリン) とソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (sHH) (増強と LIF 3i カクテルを補足する従来の hPSC の一時的な初期文化ステップを採用していますpurmorphamine) 信号。LIF-5i で従来の hPSC の 1 つの初期の通路はバルク量でその後の安定した LIF 3i 復帰にそれらを適応させます。初期の LIF 5i 適応は、E8 または送り装置 (LIF-3 i だけでその後安定的、連続的な通路) の前に上に成長した従来の hPSC の初期の単一細胞のクローン増殖を大幅強化します。適応従来の hPSC ライン最初 LIF 5i で 1 つの通路に耐える以降一括クローン継 LIF 3i 条件で素朴な戻す細胞のまれな安定したコロニーのルーチンの使用の subcloning を選択しする必要がなくなります、抗アポトーシス分子または Rho 関連タンパク質キナーゼ (ロック) 阻害剤。
LIF 3i メソッドを正常に安定して拡大し、幅広いレパートリーを維持に雇われている > の 30 の独立した、遺伝的に多様な従来の hPSC ライン > 非酵素または酵素の解離のいずれを使用して 10-30 通路と染色体の誘導の証拠なしやエピゲノム異常、インプリント遺伝子の遺伝子異常を含みます。さらに、シーケンシャルの LIF 5i/LIF 3i 文化はリネージュ プライミング遺伝子発現を減少させることによって従来の hPSC ラインの幅広いレパートリーの機能的な多能性を向上させるだけの素朴な復帰方法これまで報告されているとその多能性分化能が大幅に向上。素朴な復帰メソッドの LIF 3i 消去固有インター ラインの血統で、プライミング、従来の hPSC ラインの分化の変動と再生医療と細胞療法のアプリケーションの偉大なユーティリティ。
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Protocol
動物のケアのガイドラインと、ジョンズ ・ ホプキンズ大学院の医学大学のアニマル ・ ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されたプロトコルに従ってすべての動物の手続きを行った。
1. 準備マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) の送り装置に依存した従来 (hESC 媒体/MEF) または素朴な元に戻したり (LIF 3i 媒体/MEF) hPSC 文化
-
購入または DR4 ハイブリッド E13.5 マウス胚次の公開プロトコル4x CF1 やから CF1 MEF の送り装置の社内の低通路供給を準備します。
- 低い通路 (p1 ・ p2) MEF 文化 (長期間保存) の前を凍結または4が前述した照射 (6 ヶ月) の後、液体窒素内のストア。
- 照射 (5,000 rad)、γ- または X-線-照射器を使用して p5 の下で展開された MEF を一括して-80 ° c 超低温冷凍庫で短期的なストレージ (6 ヶ月未満) の因数で 1.5 × 10 バイアルあたり6セルを準備します。
- 1.2 x 10 間板6 (非凍結した新鮮な照射) と 1.5 x 106 (照射凍結保存) 下記のようにフィーダー文化を準備するための 1 つの 6 ウェル糊プレートごと MEF。
- 6 ウェル滅菌培養処理板のゼラチン コーティングを準備するには、生物学的安全キャビネットの各ウェルに滅菌 0.1% ゼラチン溶液 1.5 mL を追加します。
- 少なくとも 1 h 37 ° C でゼラチン コーティング プレートを孵化させなさいまたは CO2研究室のインキュベーターで一晩します。
- 次の日、低通過 (例えばP2 に P4) DMSO, 凍結保存と照射を解凍 (5,000 rad) MEF の手順に従って以下に示します。
注: 非照射 MEF はまた解凍、展開し、使用する前にすぐに照射します。 - 37 ° C の水浴中凍結 MEF 因数を配置します。融解時にエタノールでチューブを滅菌してすぐにバイオ セーフティ キャビネット (例えば転送 1 mL の DMSO MEF 因数 9 mL MEF 培地 15 ml の滅菌に内、DMSO 保護剤の検討の少なくとも 10 倍と MEF 培地 (表 1) を希釈円錐形)。
- 200 x g滅菌 15 mL の円錐管に 5 分で希薄化後の MEF のセルを遠心します。
- バイオ セーフティ キャビネット、における吸引無細胞上澄みを廃棄し、1-2 mL 新鮮な MEF 培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- 優しくゼラチン液を捨て、上記のように糊 6 ウェル プレートの各ウェルに MEF 培地に再浮遊 MEF の 2 mL を追加します。カウント MEF のセルとプレート 1.2 x 106 (非凍結した新鮮な照射) または 1.5 x 106 (照射凍結保存) MEF 糊ワンプレート 6 ウェルあたり。
メモ: CO2インキュベーターからバイオ セーフティ キャビネットに転送されるすべての細胞培養皿エタノール スプレー紙で軽く拭くことができるが必要があります散布すること直接の井戸にエタノール普及を避けるために 70% エタノール溶液で。 - 使用前に、添付ファイルを許可する (5% CO2、湿気のある大気) CO2研究所インキュベーターで一晩 37 ° C で MEF の版を孵化させなさい。
2. 一括簡単な LIF 5i 適応ステップ以降の素朴な復帰のため従来の hPSC 文化の安定化
- 最初 LIF 5i/LIF 3i 返還前 G バンディングによって正常核型を所持のためすべての従来の hPSC 行を検証します。
メモ: 高一節従来の hPSC ラインの LIF 3i 復帰 (e.g、P > 40 – 50) これらの文化は既に否定的に影響を与えるの安定性が、効率的な、一括の LIF 3i 復帰準備万端、ゲノムの収差を抱く可能性があるので避けるべき。在来の hPSC ライン。 - 維持し、MEF 文化システム (セクション 1 で説明した) として、または (治験責任医師の好み) フィーダー フリー培養システムで検証済みの正常核型と従来の hPSC 文化を展開します。
注: 両方フィーダー依存 hPSC/MEF 共培養系 (例えば悪名高く培 (表 1) 4-10 ng/mL bFGF) またはフィーダー フリー (e.g、E8 5または mTSER 6メディア (の製造元の指示に従って。ビトロネクチン コーティング プレート) メソッドは、LIF-5i/LIF/3 i MEF システム (図 1) を使用して一括素朴な復帰と互換性があります。非酵素的メソッドが復帰のためにそれらを準備する前に従来の hPSC の通過を優先されます。LIF-5i と LIF 3i メディア製剤には、抗生物質や抗真菌剤は含まれません。バイオ セーフティ キャビネット不稔やメンテナンスのための標準的な運用ルールは、任意の細菌や真菌の汚染を避けるために厳しく観察されるべき期待されます。 - MEF ベース文化システム、LIF 5i 適応従来 hPSC 文化の通過する前に少なくとも 1 日のセクション 1 で説明したように糊 6 ウェル プレートで MEF の送り装置を準備します。
- 従来の hPSC 文化は ~ 50% の confluency (すなわち、初期めっき後 3-5 日) に達して後に、置き換える標準 hESC 培 LIF 5i 媒体 (2 mL/ウェル;表 1)。
注: は、バイオ セーフティ キャビネットのこれらの手順を実行します。 - 文化および CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) LIF 5i で最大 2 日間従来 hPSC/MEF を維持します。毎日 LIF 5i 媒体を変更すると、それに続く通路の LIF 3 i で安定した復帰それらを適応させます。
- また、従来フィーダー フリーの文化 (例えばE8 で)、LIF 5i で文化 hPSC のみ次の朝を通過する前に一晩します。
注: LIF 5i と LIF 3i の文化の両方を維持でき、大気 (21% O2) または生理学的な (5% O2) 酸素 CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) のレベル。 - 通過、前に一度、PBS と LIF 5i 適応従来 hPSC を安全キャビネットに培養皿を配置、洗って各ウェルの細胞解離試薬 1 mL を追加します。CO2インキュベーターで 37 ° C で 5 分間インキュベートし、キャビネットのバイオに戻って単一細胞懸濁液にピペットで軽くカップ刻んだ。
注: 非酵素的解離バッファーは、継の単一セルを準備するためまたは使用可能性があります。 - HESC 媒体 (少なくとも 2 倍希釈) 滅菌 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を収集し、単一細胞懸濁液を取得するピペッティングにより細胞を優しくカップ刻んだ。
- 5 分間 300 × gで遠心分離、吸引/破棄、上澄みとバイオ セーフティ キャビネットにおける LIF 5i 媒体の 1-2 mL で細胞ペレットを再懸濁します。診断またはセルの自動カウンターを使用してセルをカウントします。
- PBS (6 ウェル プレートのウェルあたり 2 mL) を 2 回事前メッキ MEF、洗浄および PBS 洗浄 MEF プレートの 1 に (LIF 5i 2 mL 中) 10 の6セル × 1-2 を配布します。
- 調整し、それぞれ個々 の hPSC ライン非常に可変することができます効率を replating 素朴な復帰を初期めっき密度を最適化します。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) でプレートを配置します。
注: 抗アポトーシス試薬のルーチン使用はこの方法ではほとんどの hPSC ラインのため推奨されません。LIF-5i システムは既にかなり従来の hPSC ラインの初期一括クローンの再めっき効率を向上します。ただし、ROCK 阻害剤の使い捨て (5-10 μ M Y-27632) ための傾向のいくつかの不安定な系統先読み hPSC ラインの最初の通路で従来の hPSC 文化の初期の LIF 5i クローン再めっき効率が向上さらに自発的な差別化。 - 場合に LIF 5i で合わせられる解離の従来の hPSC の 1 つの井戸を転送直接フィーダー無料文化 (例えばE8) から始まって 1 つは MEF メッキも (すなわち1:1 通路) を照射しました。
- 次の日、ゆっくり旋回非添付のすべてのセルを持ち上げ、培地を吸引するプレート (PBS 洗浄はオプション) LIF 5i 培地 2 mL に置き換えます。バイオ セーフティ キャビネットの 3-5 日のために毎日、またはセルが 60-70% 合流 (図 1) まででこの手順を実行します。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) でプレートを配置します。
3. 長期的な保守と LIF 3i 中 N hPSC の拡大
- 次の初期の LIF 5i 適応以降安定した LIF 3i 文化文化が 60-70% 合流 (図 1) になったら、バイオ セーフティ キャビネット、3-4 日おきの通路します。
メモ: LIF 3i 文化必要厳密なメンテナンスと長期にわたる文化から高密度/細胞密度に到達する N hPSC 文化を許可する (e.g、> 4 日) 以降のクローンの再めっき効率が下がると自発性を促進します。。差別化。 - バイオ セーフティ キャビネット、における培養液を破棄し、それぞれを洗う優しく 2 mL の PBS の追加によって LIF 5i/LIF 3i 文化のことをよくします。PBS を破棄し、細胞剥離液の 1 mL を追加します。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) で 37 ° C で 5 分間インキュベートします。
- 細胞懸濁液を収集、悪名高く媒体を追加 (阻害剤や成長因子 (表 1); せず、少なくとも 2 倍希釈) すべて hPSC を回復し、単一細胞懸濁液を取得するピペッティングにより細胞を優しくカップ刻んだ。懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。
- 5 分の 300 g で遠心し、上清を吸引/破棄。再 LIF 3i 培地で細胞ペレットを中断します。診断またはセルの自動カウンターを使用してセルをカウントします。
- LIF 3i 文化の日常継用糊 6 ウェル プレートで照射された MEF に x 10 の5細胞/ウェル プレート 〜 2。初期の LIF 5i 適応文化最初の通過する前に、最初に高い密度 (4 × 105細胞/ウェル) プレート LIF-3 i/MEF に。
- 再プレートし、プレートの上に新鮮な PBS 洗浄照射 MEF フィーダー (上記の前日準備) LIF 3i 中 LIF 5i 適応 hPSC を配布します。毎日 LIF 3i 媒体を交換してください。
- 最小通路 N hPSC 4-7 連続一括は N hPSC の機能解析や凍結で使用する LIF 3i 媒体前の通路します。いずれかでのレコード数 N hPSC の通路の従来または LIF 3i メディア。
メモ: 高い通路の LIF 3i 復帰 (例えば> p40) リネージュ プライミング、従来の hPSC ラインはお勧めしません。彼らがあります最低の可能な通路で従来の hPSC ラインを元に戻す努力をすべきであります。さらに、N hPSC のような文化は長期細胞培養淘汰による karyotypically 異常クローンを抱く可能性があるので、機能研究では、10 LIF 3i 通路より大きいを受けた LIF 3i 戻った hPSC の使用は推奨されません。もし低通路従来の hPSC ラインの新鮮な LIF 5i/LIF 3i 差し戻し機能研究われるべきである N-hPSC との株式 < LIF 3i 10 通路はご利用いただけません。
4. 凍結と LIF 3i 戻った N hPSC の解凍
- 機能研究や長期凍結保存法で使用する前に、上記のように LIF-3 i、少なくとも 5-7 通路を戻した N hPSC を展開します。従来条件と各凍結バイアルの LIF 3i 条件では、通路の数を記録します。
注: 過剰 LIF 3i 戻った N hPSC 機能の試金で使用されていないは各通路に凍結が低い復帰後通路の凍結をすることができます(例えば.、< p3) 貧しい、または非常に可変解凍後回復効率があります。 - バイオ セーフティ キャビネット、培養培地を吸引、PBS (ウェルあたり 2 mL) のセルを洗浄、吸引 PBS および細胞剥離液 (ウェルあたり 1 mL) を使用して 1 つのセルに hPSC のコロニーを分離します。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) で 37 ° C で 5 分間プレートを配置します。(倍) LIF 3i 培地で細胞剥離液を希釈、滅菌 15 mL の円錐形に hPSC を収集、200 x gで 5 分で細胞を遠心分離機、LIF 3i 中 (まあ相当につき 1-2 mL) 細胞ペレットを再懸濁します。診断またはセルの自動カウンターを使用してセルの数をカウントします。
- LIF 3i 媒体 (200 x gで 5 分) の N hPSC を遠心し、少なくとも 1 x 10 の6セル/ml の密度で凍結溶液 (表 2)、安全キャビネットで細胞を再懸濁します。
- 長期貯蔵低温管にセルを転送し、, 凍結コンテナーに配置します。一晩-80 ° C のフリーザーで凍結するサンプルを許可します。
- 次の日は、長期保存用液体窒素冷凍庫に、クリオバイアルを転送します。
- 融解、〜 2 分定置滅菌バイアル (すなわち、エタノール スプレー) 37 ° C の水浴に凍結バイアルを配置、滅菌 15 mL の円錐形に hPSC を転送および、セル 10 倍で悪名高く培 (表 1) の 5 μ M をゆっくりと希釈Rho 準蛋白質キナーゼ (ロック) 阻害剤 Y-27632 無菌生物学的安全フード キャビネット内。
- 200 x gで 5 分間遠心します。バイオ セーフティ キャビネット、無細胞上澄みを廃棄し、LIF 3i 媒体 (1-2 mL) を 5 μ M ROCK 阻害剤 Y-27632 を添加した細胞ペレットを再懸濁します。
注: Y-27632 の除外は、貧しい後融解回復効率 (図 2) になります。 - PBS 洗浄 MEF メッキ井戸に LIF-3 i/ROCK 阻害剤で再停止される解凍のセルを転送します。バイアルあたり 1 x 10 の6セルの密度で LIF 3i 文化を凍結します。各糊 6 ウェル プレートのウェル 1 個でフィーダーにこれらのバイアルを解凍します。
- 次の日は、Rho キナーゼ阻害剤なし正規 LIF 3i 媒体拡大を開始します。
5. フィーダー N hPSC サンプルのコレクションの除去
- LIF-3 i/MEF (または悪名高く/MEF 従来) からのサンプルの文化を準備する (すなわち、遺伝子発現のため (例えば、定量的 RT-PCR 法、マイクロ アレイ) 蛋白質 (例えば、西部のしみ) 解析を使い果たす LIF 3 i MEF の送り装置を使用してから文化や磁気活性化セルの並べ替え (MAC) 対策-トラ-1-81 抗体コーティング メーカーのプロトコルに従ってマイクロ ビーズです。
- また、下記のとおりフィーダー、文化を破壊する次の簡単なプレめっき方法を利用します。
- 無菌生物学的安全フード キャビネット、無細胞上澄みを廃棄、ウェルあたり 2 mL 滅菌 PBS でペレットを洗浄します。細胞剥離溶液 (1 mL/も) を用いた付着性の LIF-3 i/MEF 文化をデタッチします。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) で 5 分間インキュベートします。滅菌 15 mL の円錐形に hPSC を収集します。転送細胞滅菌 15 mL コニカル 200 x gで 5 分間遠心し、2 倍の hESC 中洗浄
- バイオ セーフティ キャビネットで再 LIF 3i 培地 2 mL に LIF-3 i/MEF 解離細胞の各ウェルを中断し、たて 0.1% ゼラチンでコーティングされている 6 ウェル プレートの新しい井戸に直接転送します。
- LIF-3 i/MEF hPSC セル (5% CO2、湿気のある大気) の CO2インキュベーターで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。新しい円錐管にピペットと非付着性細胞を収集します。優しく各ウェルに hESC 培地 2 mL を追加し、残りの非付着性細胞を収集するために旋回します。
注: 照射の MEF の大半にアタッチされます糊板 1 h の懸濁液、hPSC の大半を残してします。 - 300 x gで 5 分間 PBS で洗浄で細胞を遠心分離機し、組み合わせます。スナップ-凍結細胞ペレット液体窒素で遠心分離後またはまた再下流蛋白質または核酸の分析 (図 2B) と互換性のある lysing バッファー内のペレットを中断します。
- 一致する従来のプライム同質遺伝子 hPSC コントロールと LIF 3 i hPSC ラインの特徴づけを実行します。
注: 間およびプライミングの文化の内で本質的な可変性のため関連するコントロールに文化または素朴な返還前一致する timepoint で用意しています。詳細なプロトコルおよび下流の蛍光イメージングのための材料流れ cytometry、西部にしみが付くこと、遺伝子発現 (RT-PCR の試金およびマイクロ アレイ)、メチル化研究 (ドットのしみ、CpG メチル化マイクロ アレイ)、OCT4 の近位および遠位エンハンサー優位性記者試金およびシグナル伝達阻害アッセイにより、3を他の場所で提供しています。
6. 素朴な復帰の記事: ゲノム整合性検証と LIF 3i 戻す機能アッセイに使用する前に N-hPSC の親印しの保持
- LIF-5i-3 i の LIF 返還を開始する前に (例えば、公開の方法7を使用してギムザ バンド染色による) 染色体の所持開始プライミング、従来の hPSC 文化を画面します。
注: これはクローンの LIF 3i 条件で artefactual 選択的生存の優位性を運転するかもしれない異常なゲノム変化を抱くことができる従来の hPSC 集団を排除するためには。 - 最適な結果を得るには、たてに戻す従来の hPSC の機能研究での使用前に数週間 LIF 3i と世間知らずのような状態に文化や監督の差別化。
注: ルーチンは次の素朴な復帰は推奨されません以上 10 の通路の LIF 3i 条件の 'メンテナンス' 文化を延長しました。従来の培養系を用いた、ルーチンの拡張と悪名高くとによる線のメンテナンスを実行必要があります (例えばE8、または MEF/hESC の bFGF の中)。 - 通常の保持は LIF 3i 復帰後 5-7 通路を karyotypes の後復帰した N hPSC ラインを評価 (e.g。 バンド ギムザ染色解析7、または選択の他のメソッドで、)。
- 通常親ゲノム インプリントの保持のためすべての復帰した N hPSC 行を選択の DNA メチル化解析による評価 (例えば、プロトコル用 LIF 3i 戻った N hPSC で親の出版社の CpG DNA マイクロ アレイ解析他3) 5-10 通路 LIF 3i 復帰の後。
7 LIF 3i 戻った N hPSC を用いた定量的分化アッセイの記事素朴な復帰: 実験的設計ガイドライン
- 直接確立された分化プロトコル追加細胞培養操作なしに LIF 3 i N-hPSC を利用します。
注: 再プライミング (すなわち、 N hPSC を従来のプライミング条件は分化アッセイでの使用前に変換する) LIF 3i メソッドを使用する必要はないとお勧めできません。 - アッセイの影響の制御、インター ラインの個々 の hPSC ラインの機能テストの可変性、少なくとも 3 つの hPSC を持つ独立した微分のプロトコルを採用することにより特定の系統分化能のクロス検証由来は独立した遺伝的背景 (すなわち、複数のドナー由来による、hESC)。
- 機能的な比較兄弟文化、等価通路番号、従来系列プライミングと並行して同じ (同質) hPSC ラインから、LIF 3i 戻す hPSC 文化を設定します。それぞれのメディアにプライム/素朴な兄弟同質遺伝子 hPSC 文化を維持 (e.g。、E8対。LIF-3i) と同時に区別 (図 4) 実験的バイアスを排除するために同じ微分のプロトコルおよび材料を使用しています。
- 同質の素朴な hPSC 比較対プライミング、調整し、それぞれの個々 の分化の試金のための初期めっき密度を最適化します。
注: 神経前駆、決定的な内胚葉と LIF 3i 戻った N hPSC の血液内皮分化のための詳しいプロトコルは、他の場所で3で提供されます。LIF 3i 戻った N hPSC 従来の hPSC よりも分化アッセイにより堅牢な増殖と分化の能力があります。N hPSC は通常従来の hPSC よりも低い初期めっき濃度を必要し、の対応は次の酵素クローン生き残りを図る抗アポトーシス試薬の使用とは異なり、従来のプライム hPSC 不要分化アッセイで消化。
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Representative Results
このプロトコルには、両方のフィーダーに依存し、フィーダー独立系統プライミング従来 hPSC 文化 (図 1) で LIF 3i と効率的な世間知らずのような返還が最適化されます。詳細なプロトコルに記載、アウトライン LIF 3i いずれかのフィーダーに依存または従来フィーダー無料 hPSC 条件 (例えばE8 中) から始まって順次適応。
代表結果いくつかの従来の hESC の LIF 3i の復帰のため、transgene 無料による線が図 1-3に表示されます。これらの典型的な結果は市販 hESC ライン H9、検証することができます。 または市販の transgene 無料コードの血由来 episomal によるライン (6.2) ・ ザンビディス研究室8,9に派生します。最初の LIF 5i 適応ステップの導入は LIF-3 i、従来 hPSC 文化の非常に効率的なその後、一括クローン増殖を許認可抗アポトーシス エージェントまたはロック阻害剤10 (図 1A, Bを必要としません。).サンプルは急速に下流解析の multilineage を集めることができる素朴なのような hPSC の複数の板は、LIF 3 i で 5-7 通路後のみ差別化を指示しました。また、LIF 3i 文化を将来のアプリケーション, 凍結保存することができます。細胞回復後に解凍することができます (図 2) を凍結および解凍後メディア11ROCK 阻害剤の含有により改善します。
最近の見直し2分子と機能性多能性、両方生体外での胚の決定要因であった。これらの要因には、遺伝的背景、キー発達遺伝子と hESC による導出と文化の方法論の違いのための突然変異の文化関連の取得が含まれます。提供される以下の分子特性と、表現型の検証に用いられる標準的な試金の概要と LIF 3i 戻った hPSC の機能 pluripotencies です。
コロニー形態
プライミング、従来、LIF 3i 戻す文化システムの間の移行は hPSC コロニー形態 (図 1B) 異なる物理的な変化に伴われます。従来 hPSC 細胞が増殖、フラット、急速に拡大する (MEF またはフィーダー無料条件)、上小細胞塊からしかし単一セルとして不十分な広い単層植民地。LIF 3 i に従来の hPSC ラインの露出は成長と拡大を促進して小さく、密集、クローンから発生したドーム状のコロニーは単一セル。これらの形態学的変化は完全に可逆的であり、LIF 3i を撤回し、セルは標準的な従来の hESC の培地で培養される再場合、ドーム型コロニーの LIF 3i 復帰が従来単層形態に戻る移行自発的にできます。bFGF を補充しました。さらに、LIF 3i 戻す細胞高合流密度 (または頻繁に通過せず長期にわたる文化) の拡張クローン効率が低下; フラット、従来の形態の自発的な買い戻しの結果します。勤勉なメンテナンスと LIF 3i 戻す hPSC ケアの必要性を強調 (e.g。、< 40-60% の合流点)。
免疫蛍光染色をライブし、フローサイトメトリー法による表面多能性マーカーの解析
従来から次連続 LIF 3i カルチャは、世間知らずのような状態への移行中に多能性マーカーの評価は、非侵襲的 LIF-3 i/MEF の拡張 (任意の負の影響を検出することがなく汚染ライブの抗体を使用して監視例えば。、TRA-1-81、TRA-1-60 SSEA4 と蛍光色素標識された抗体をライブ染色)。
LIF 3i 復帰多能性の保持も日常的に監視できるトラ 1 の多能性表面マーカー発現のフローサイトメトリーによる解析によって、シングル中 SSEA 抗原細胞継 (図 1C) またはそのままの植民地修正その場で(図 3)。ただし、これらのマーカーを差別しない従来と LIF 3 i の州のレベルは反比例 LIF 3i 条件に従来の hPSC から遷移するとき hPSC で発生するへの分化の頻度と相関します。具体的にはマーク人間の素朴なような状態の in vitro2,12,13を可能性があります追加の表面抗原は、効果的な LIF 3 i hPSC 復帰を検出するため用いることができます。
N-hPSC の分子の多能性の検証
HPSC ラインの遺伝の背景変動をインター ラインに強力に貢献として特徴づけされている、ため文化縦長に一致する hPSC 文化システム (図 4) を比較するときに同質の文化を厳しく評価することが重要です。N-hPSC の方法で、独立した遺伝的背景の数と素朴な復帰メソッドを試金するべきこれらのシステムのいくつかが既に異常なゲノムおよびエピジェネティックな構成2hPSC 集団を生成する示されている、ので生物学的再現性を検証し、非発達に関連する「擬似多能」状態 (すなわち、分子多能性が機能分化能力に欠けているの明白な特徴と) を除外するのに十分であります。Zimmerlinら。さらに復帰した N-による様々 なリプログラミング手法から派生した機能変動の別の知られている推定貢献であるの分子・機能 pluripotencies の試金を含める LIF 3i 文化システムの検証多能性の状態の2を実行します。
したがって、人間の素朴な文化系のほとんどの研究を 1 から N hPSC の分子多能性を試金当てている) (例えば、ヒストン チップ配列またはチップ-PCR、immunoblots または全 genomic グローバル DNA のメチル化によってエピジェネティックなレベル重亜硫酸塩の配列特異的遺伝子 CpG メチル化マイクロ アレイ、OCT4 エンハンサーの優勢な使用をレポーター系、DNAse によって規制要素をグローバル活動私過敏症と繰り返し要素の RNA 塩基配列解読によってプロファイリング)、2) トランスクリプトームレベル (RNA 配列、発現のマイクロ アレイ、および定量的 RT-PCR) 蛋白質発現解析 (e.g、FACS、蛍光顕微鏡観察および西部にしみが付くこと)、3) 代謝の研究 (例えば、解糖作用、酸化を介して。リン酸化とニコチンアミド代謝)。(図 3B、C) 蛍光汚れおよび分子多能性のキー マーカーの発現の西部のしみの検出の代表的な例のとおりです。たとえば、図 3B に示すように、活性化リン酸化 (リン) と STAT3、ERK1/2 マウス ESC のような素朴な多能性のキー分子特徴の合計。これらはアンチ STAT3 と反-ERK1/2 の一次抗体を使用して検出されました。さらに、機能的な多能性奇形腫分化アッセイでは、従来のvsで示されます。LIF 3i 戻す hPSC 奇形腫組織解剖 10 週間投与し 4% のホルムアルデヒドに固定、パラフィン埋め込まれた (図 3D)。
LIF-3 i/MEF または悪名高く、MEF、bFGF サンプルの下流の分子分析のための準備は、MEF の枯渇を含める必要があります。2 つの方法が正常に私たちの研究室で採用されている MEF 枯渇について上述。MEF 前めっき加工がシンプルで信頼性の高いと N hPSC からフィーダーを排除するためにコスト効率の高い方法で分子研究のためのサンプル、FACS や MAC の分離 (すなわち抗-トラ-1-81 または反-トラ-1-60 抗体ベースの分離に好ましい代替).さらに、LIF 5i/LIF 3i 文化でトラ 1 負付着細胞を自発的に差別化急速にによって排除できます前の新鮮な MEF に後続の LIF 3i 通路 LIF-5i/LIF-3 i N-hPSC 文化から酵素によって消化済みめっき0.1% ゼラチン (図 2) でプレコート プレート上で 1 時間の単一のセルです。
N hPSC の機能的な多能性の評価
PSC の機能的な多能性の最も厳格な試金は倫理的な理由のための N hPSC ラインのテストで限られた胚盤胞注入キメラ試金。また、さまざまな方法で N hPSC の生成を報告しているいくつかのグループが種間キメラを生成しようとしています。しかし、これらの試みは、標準マウス esc キー2のキメラを生成する能力と比較して、ネズミやブタ胚に分化した N hPSC 系統の非常に低いまたは失敗した貢献を得られています。
追加機能研究推定 N hPSC、さまざまな方法で派生の監督の in vitro分化を検討したが、併用での偏りのある、欠陥のある、または低下の多能分化能力を明らかにしています。エピジェネティック異常2,13をかくまっています。捺印された遺伝子座で特に同様のエピゲノム異常マウス esc キーで検出された LIF 2i カクテル14への長期暴露に続きます。興味深いことに、いくつか返還文化システムは PSC の体内栄養外胚葉貢献強化された能力などの機能的な多能性の特定の属性の全体的な改善を報告している2,15.
LIF 3i 戻った hPSC の独立して派生の広範なコレクションを使用して、ZimmerlinらLIF 3 i システムが従来の hPSC ラインの機能的な多能性を大幅に向上を多能分化アッセイを採用3です。 これにより従来の vs の体系的な解析、LIF 3 i hPSC ライン インター ライン依存バリエーション (図 4) を除去するために同質のペアで。LIF 3i 戻す hPSC ラインでは、EB 分化前再プライミングの手順は必要ありません。ただし、LIF 3 i hPSC は、同質細胞は E8 に拡大し、したがって、初期めっき密度が低いと同様 timepoint の合流地点に到達する各文化を許可するように調整が必要よりも有意に高いクローンのレートで増殖します。
調査官は日常的に奇形アッセイ体内だけでなく、神経系に分化アッセイの in vitro監督を含む LIF 3i 戻った hPSC の改善された機能を示す複数のアッセイを活用すべき決定的な内胚葉と hematovascular 系統3を使用して複数のアッセイ (例えば、2 D APEL3,16と 3 D の胚様体17,18システム)。プライミング/LIF-3 i hPSC 文化 (例えば図 4アペル、胚様体の同質遺伝子ペアごとに複製の試金に依存した再現性を制御するために少なくとも 2 つの異なる分化メソッドを実行すべき微分のプロトコル)。実験的なデザインは、堅牢な番号を含める必要があります (例えば、> 3-5) 複数、独立したドナーの遺伝的背景 (図 4) から hPSC のプライミング/LIF 3i 同質遺伝子ペアのラインします。
図 1:3 i の LIF 法による素朴なような条件に、従来の系統先読み hPSC 文化の、段階的移行。(A) LIF 3i の段階的な復帰のためのプロトコルのスキーマ。(上部の図)移行のための一般的な方法は、LIF 3i 文化に従来の hPSC 準備万端。(下の図)従来の LIF 3 i 素朴な復帰のため 2 つの集計方法 (準備万端) hPSC (すなわちPrimed/LIF-3 i/MEF に MEF) の送り装置またはフィーダー無料条件 (すなわちPrimed/E8 LIF-3 i/MEF に) 上で培養しました。(B)人間の PSC の形態。LIF 3i 復帰市販人間 episomal iPSC ライン (6.2) を使用して中には hPSC の代表的な顕微鏡写真を示します。遷移初期従来フラット化単分子膜のコロニー間観察を行い、次の発生する後続のドーム型クローン コロニー通路中間 LIF 5i と安定した LIF 3i 培養条件で示されています。スケール バー = 200 μ m (C)代表的なフロー フローサイトメトリー分析多能性表面マーカーの。表示は、TRA-1-81 SSEA 4 表面のと式従来の hPSC ライン 6.2 (p40) E8、LIF-5i/MEF で初期の航路と次の 1 に 9 通路 (P1-P9) に拡大 LIF 3i 条件。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: N hPSC の凍結保存および MEF プレめっきによるサンプル作製。(A) LIF-3 i/MEF 文化の凍結/融解サイクルの例です。従来のコード血由来、統合されていない、人間の遺伝子無料 iPSC 行 E5C3 は派生あり 18 通路を 4ng/mL bFGF hESC 培の MEF の送り装置で拡大しました。従来、リネージュ プライミング E5C3 は LIF-5i (左) で採用され、3 通路 (センター) のための LIF 3i 媒体に移行します。中央のパネルで示した E5C3 LIF 3i セルが凍結した DMSO を用いた凍結媒体 (表 2; バイアルあたり 1 x 10 の6セル) を使用して、液体窒素に保存)。1 バイアル 1 ヶ月後解凍し、E5C3 セル 6 ウェル プレート (右) のフィーダー コーティングに移った。5 μ M と LIF 3i 媒体を補うことで細胞の回復を高めることができるだけ 1 日解凍後の Y-27632。スケール バー = 200 μ m。 (B) MEF 除去 (また付着 TRA 負分化細胞) MEF LIF 対応 3 i hPSC 文化でプレめっき法による。例は、フロー フローサイトメトリー解析前に、と PE 共役アンチ-トラ-1-81 とトラ 1 60 抗体、APC 共役 SSEA 4 抗体および TRA 1 抗原陰性と使用して MEF 細胞の枯渇を示す SSEA-1/CD15 抗体のプレめっき後、1 時間前めっき法。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: MEF LIF 対応 3 i N-hPSC 文化多能性を評価します。(A)表面と核の多能性マーカー。因子の発現多能性、同じ (同質) トラ-1-81+SSEA4 の NANOG+従来、プライミング臍帯血由来によるライン E5C3 (p39) プライム (E8)、または素朴な LIF 3i (+ p8 の LIF-3 i/MEF の) 条件のいずれかで展開します。チャンバー スライド代表 hPSC 文化の蛍光汚れコア多能性因子 NANOG SSEA 4+で培養したトラ-1-81+ hPSC で準備万端、従来 (E8 媒体) または LIF-3 i/MEF の制服、原子力発現を明らかに条件。スケールバー = 100 μ m (B)西部のしみの分析。STAT3 (左)、ERK (センター)、コントロール従来 (E8 中) または LIF-3 i/MEF 条件 (3 i) で代表的な hPSC ライン (hESC ライン H9) の β-アクチン発現。(C)素朴な多能性関連転写因子発現代表 LIF-3 i/MEF 文化で蛍光抗体法によってステラ/DPPA3、NR5A2、および TFCP2L1 を示す (臍帯血由来によるライン E5C3 p33 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3 i/MEF)。スケールバー = 100 μ m (D)奇形から LIF 3i 戻される従来の hPSC のアッセイ。同質の代表によるラインの機能性多能性の検証 (臍帯血由来 E32C6) いずれかの E8 で培養 (p9) または LIF-3 i/MEF (+ p12) 奇形の試金によって。同質の並列培養、従来のプライム対 LIF 3i 戻った hPSC の 10 x 10 の6セルは、NSG マウスの手足に皮下注射しました。奇形 microsections のヘマトキシリンとエオシン汚れは、堅牢なよく構造化された外胚葉とすべて 3 つの胚葉分化を明らかにした (神経ロゼット: 網膜色素 epitheliam NR: RPE)、中胚葉 (軟骨細胞: Ch) と内胚葉 (腺組織: GI) の系統。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:機能性多能性同質遺伝子プライミングとナイーブな状態の間の比較。(A)機能多能性同質遺伝子の異なる多能性州から独立した微分のプロトコルの LIF 3i 培養 hPSC 対従来の評価のための戦略の概略図。2 血液血管前駆細胞分化システム (アペル単層・ 3 D 胚様体 (EB) システム)対従来の分化能を評価するために雇用された以前は同じ (同質) hPSC 行の LIF 3i 戻りました並列の記事で同じ通路番号と LIF 3i 復帰を培養しました。LIF 3i 戻す hPSC 行 EB 分化前再プライミングの手順を必要としないし、差別化プロトコルを直接受けます。(B)理事会 (VP) 血管前駆細胞分化システム。この研究のために用いられる EB 3 D 分化システムは前述の17,18だった同じ臍帯血 (CB) の同質文化の EB 分化 (左側パネル) の 10 日目で代表的な結果を表示-派生 E5C3 hPSC9号線いずれかの従来の hESC/MEF の培養 (Primed/MEF) 条件や LIF-3 i/MEF ナイーブ条件。これらの EB 細胞の流れフローサイトメトリー解析 CD31 の劇的な増加を示す+CD146+ VP 分化前 E5C3 ラインの LIF 3i 復帰に続いている人口。ヒストグラム表示 CD31 の平均 ±SD+CD146+ VP 細胞の独立した hPSC ライン (すなわち、 2 CB による、大人 1 名様線維芽細胞由来の3 つの同質のペアを使用してこの EB システムの 10 日目に復旧率点線接続の同質遺伝子ペア)。結果は、hPSC の複数行の遺伝的背景に EB システムで VP 分化効率の大幅な改善を示しています。(C) APEL 単分子膜血管前駆細胞分化システム。従来型 (プライミング E8) と LIF 3i 戻す hPSC 直接3、プロトコルを同じ培養条件、成長因子、サイトカイン、段階的 APEL 内皮への分化の小分子を使用して差別化をすることができます。16. E5C3 臍帯血由来によるラインおよび CD31 の割合を使用して独立した APEL 分化実験は+CD146+ APEL 分化 7 日目で血管前駆細胞集団。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
LIF 3 i システムは、ひと多能性幹細胞に古典的なマウス 2i 素朴な復帰カクテル1の修正版を適用されます。(これは 2 i だけで展開できない) hPSC の自己更新タンキラーゼ阻害剤 XAV939 とこのカクテルを補うことで LIF 2i で安定させます。LIF 3i 文化では、バルクと人間着床前胚盤葉上層3のような多能性の状態に従来の hPSC の効率的な帰属をことができます。HPSC の XAV939 の作用機序が可能性があります複雑な彼らは可能性が最低でも、重要な安定化と WNT シグナル伝達経路3を介して hPSC の自己更新の増強に含める 2i 相乗効果。
従来の hPSC 文化は通常高い変数系列プライミング遺伝子発現と矛盾または減少された機能性多能性2 可能性があります着床後胚盤葉上層のエピゲノム多能性の状態のスペクトルを採用します。.従来 hPSC 文化のこの固有の系統のプライミングは、いくつかの hPSC ライン2の成功の LIF 3i 復帰を妨げる可能性も。ただし、LIF 3i メソッドで最初の LIF 5i 適応ステップ (表 1) の包含は普遍的に hPSC 線の多数の間で LIF 3i 復帰の効率を広げるし、方法で従来の hPSC ラインの一括素朴な返還を促進します。退屈なピッキングと珍しい素朴な復帰コロニーまたは彼らの生存率を安定させるためにルーチンの抗アポトーシス分子の使用の必要性の subcloning を回避できます。
LIF-5i-3 i の LIF 素朴な復帰方法は、幅広い hESC とによる線で再現できます。基本の細胞培養技術で最小限のトレーニングを必要とします。Zimmerlinらは正常に戻りますこの逐次方式を採用 > 30 の独立した hESC とドナー 3の広い配列から遺伝子無料によるライン。LIF-5i (図 1) の単一通路は一括 hPSC 文化で効率的な素朴な復帰を経るし、その後の安定した保守と LIF-3 i だけの拡大の進展するほとんどの hPSC ラインに十分です。
さらに、LIF-3 i/MEF システムは完成した世間知らずのような hPSC の復帰までリネージュ プライミング従来 hPSC 文化の間の階段すべて全体の堅牢な一括クローン性増殖効率をサポート (すなわち、適応、。変遷と LIF-3 i/MEF だけで 7-10 通路の拡張)。この文化システムの現行の処方には、フィーダーのサポートが必要ですが、プレめっきによる LIF 3i 文化の分析のための送り装置を破壊するシンプルかつ手頃な手法を提案する (図 2)。
システムは、同じような世間知らずのような多能性を従来の hPSC を促進するために報告されている他の複数の文化の状態2。これらの hPSC 文化システムも、古典的なマウスの素朴な 2i 条件の使用率に依存している、ほとんどの場合これらの単一セルの passaging メソッドも必要追加化学変調本質的に不安定を安定させるため/準安定の人間の素朴な状態。重要なは、これらのメソッドのほとんどを示した次の分化障害の機能的な多能性および/または得られた異常なエピゲノム出版社または染色体2。従来のプライム hPSC 文化の中で染色体異常の出現はすでによく記載19、延長、酵素的単一細胞継方法最も素朴な復帰方法で日常的に採用されています。これはまた、異常染色体構成20,21の世代を増強する示されています。敏感な技術 (例えばコピー数変異、一塩基多型) は、追加変更22,23を明らかにするかもしれない。
対照的に、LIF 3i 戻す hPSC ラインの幅広いレパートリーは、正常核型低中通路 (例えばp5-p15) で、高い通路番号を所有する確認された (e.g。、> p30) 次の LIF 3i 文化3。さらに、LIF 3i 戻った hPSC のエピゲノムの出版社では、5-10 の通路ポスト LIF 3i 復帰2で再現性をもって通常とそのままを発見されました。機密性の高い対立遺伝子特定商業メチル化アレイ プラットフォームを使用して、それ以前を示した LIF 3i 戻す hPSC ライン (LIF 3 i で 4-7 節) の幅広いレパートリーの捺印された遺伝子の CpG メチル化マークが肉眼的に発見されました。構造1の通常。前提条件となるガイドライン hPSC 文化を検証する前に、これを使用して、単純な復帰後に研究者を奨励するこのプロトコルで輪郭を描かれたゲノム異常の印影と染色体は最終的に hPSC の機能を損なう可能性があります、ので方法他と同様。
LIF 3i メソッドは、悪名高くと非組み換えによる線 (図 3) の大規模なレパートリーで胚芽層にわたって機能多能性を改善しました。LIF 3i メソッドは、素朴な復帰の他のプロトコルとは異なりないN hPSC の後続の差別化のため再プライミングの手順を必要とする (すなわち、 N hPSC で、使用前に従来のプライミング条件に変換する監督分化の試金)。LIF 3i 戻った N hPSC 両方奇形試金 (図 3D) に同質の従来の hPSC よりはるかに効率的分化能力を表示し、すべての系統の分化プロトコルを指示3 つの胚葉2。試金依存のため、インター ラインの従来の hPSC の機能テストの変化、独立した分化プロトコルと複数の遺伝的背景から派生した hPSC を使用して特定の系統分化を評価すべき。慎重な実験的なデザインを使用して、LIF 3i 条件 4-10 通路、次の同質従来の同等と比較される、多能の分化効率を大幅に向上させる hPSC ラインの広い配列が期待できます。
要約すると、このメソッド急速とクローン拡大人間数 PSC、向上の下流の分化効率増加次の分化系譜コミット前駆細胞数とインター ライン変動の減少従来、リネージュ先読み hPSC 系統。改良された機能を持つこれらの N hPSC さらにその潜在的な胚に機能的な組織に貢献する全体への影響があります。たとえば、安定した N hESC は移植臓器および動物のキメラの開発に成体幹細胞の開発にまたは病気のヒトの遺伝子をターゲットとした動物モデルを生成するために使用されるかもしれない。タンキラーゼ阻害剤活用 LIF 3 i でこのメソッドのさらなる最適化定義フィーダー無料 GMP 準拠の機能および engraftable 細胞型の広い配列の効率的な臨床的に有用な生成を容易にする、培養条件治療上の使用。
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Disclosures
生命技術とジョンズ ・ ホプキンス大学 (JHU) との間のライセンス契約の下で博士・ ザンビディス幹細胞のライセンスのための大学によって受信料の共有する権利があります。この整理の用語は、その利益相反ポリシーに従ってビジネスキャリーによって管理されます。これは、共有データと材料にジャーナル ポリシーへの著者の付着は変わりません。
Acknowledgments
この作品は、NIH/ネイ (R01EY023962)、NIH/NICHD (R01HD082098)、RPB スタイン ・ イノベーション ・ アワードのメリーランド州の幹細胞研究基金 (2014-MSCRFE-0742 2018-MSCRFV-4048)、ノボ ノルディスク科学フォーラム賞、モーズリー財団からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
References
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