Summary
Presenteren we een protocol voor snelle, efficiënte en bulk chemische terugkeer van conventionele lineage-primer menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) in een epigenomically-stable naïef voor inplanting epiblast-achtige pluripotente staat. Deze methode resulteert in verminderde lineage-primer genexpressie en duidelijke verbetering gestuurde multilineage differentiatie over een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen.
Abstract
Naïef menselijke pluripotente stamcellen (N-hPSC) met verbeterde functionaliteit wellicht een brede uitstraling in de regeneratieve geneeskunde. Het doel van dit protocol is efficiënt lineage-primer, conventionele menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) bijgehouden op feeder-vrije of feeder-afhankelijke voorwaarden aan een naïef-achtige pluripotent met verbeterde functionaliteit te herstellen. Deze chemische naïef terugkeer methode maakt gebruik van de klassieke leukemie remmende factor (LIF), GSK3β, en MEK/ERK inhibitie cocktail (LIF-2i), aangevuld met alleen een tankyrase-remmer XAV939 (LIF-3i). LIF-3i hersteld conventionele hPSC een stabiele pluripotente staat aanneming van biochemische, transcriptionele en epigenetische kenmerken van de menselijke pre-implantatie-epiblast. Deze methode LIF-3i vereist minimale cel cultuur manipulatie en is zeer reproduceerbaar in een breed repertoire van menselijke embryonale stamcellen (hESC) en menselijke transgenic-vrije geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) lijnen. De LIF-3i-methode vereist geen een opnieuw aanzuigende stap vóór de differentiatie; N-hPSC rechtstreeks met extreem hoge efficiëntie kan worden gedifferentieerd en onderhouden van karyotypic en epigenomic stabilities (ook op ingeprinte loci). Het vergroten van de universaliteit van de methode, worden de conventionele hPSC eerst gekweekt in de cocktail van de LIF-3i aangevuld met twee extra kleine moleculen die versterken proteïne kinase een (forskolin) en sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i) signalering. Deze korte LIF-5i aanpassing stap aanzienlijk verbetert de eerste klonale uitbreiding van conventionele hPSC en vergunningen kunnen worden vervolgens naïef-teruggekeerd met LIF-3i alleen in grote hoeveelheden, dus het wegnemen van de noodzaak van picking/subcloning zeldzame N-hPSC kolonies later. LIF-5i-gestabiliseerde hPSCs worden vervolgens bijgehouden in LIF-3i alleen zonder de noodzaak van anti-apoptotic moleculen. Bovenal verbetert LIF-3i terugkeer aanzienlijk de functionele pluripotent van een breed repertoire van conventionele hPSC door dalende hun lineage-primer genexpressie en wissen van de interline variabiliteit van gestuurde differentiatie algemeen waargenomen onder onafhankelijke hPSC lijnen. Representatieve karakterisaties voor N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd zijn verstrekt, en experimentele strategieën voor functionele vergelijkingen van isogene hPSC in bloedlijn-primer vs. naïef-achtige Staten worden beschreven.
Introduction
Het 2i (MEK/ERK en GSK3β-remmer) cultuur systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld om heterogene serum gebaseerde muis embryonale stamcellen (mESC) culturen tot een uniforme grondtoestand van pluripotent verwant aan de muis voor inplanting epiblast1te verfijnen. 2i biedt echter geen ondersteuning voor de stabiele onderhoud van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) lijnen2. De verschillende complexe klein molecuul, groeifactor-aangevuld, en transgene benaderingen hebben onlangs gemeld om vast te leggen van vermeende soortgelijke menselijke naïef-achtige pluripotente moleculaire stelt2. Echter veel van de "naïeve-achtige" toestanden aangemaakt met deze methoden ook tentoongesteld karyotypic instabiliteit, epigenomic gebreken (bijvoorbeeld globale verlies van ouderlijke genomic imprinting), of verminderde potentiële differentiatie.
In contrast, de cocktail van triple chemische remming van GSK3β, ERK en tankyrase signalering en leukemie remmende factor (LIF-3i) was voldoende om de stabiele naïef-achtige terugkeer van een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen3. LIF-3i-teruggekeerd naïef hPSC (N-hPSC) onderhouden van normale karyotypes en verhoogde hun uitdrukkingen van naïef-specifieke menselijke voor inplanting epiblast genen (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i terugkeer ook verleende hPSC met een array van moleculaire en biochemische kenmerken die uniek zijn voor mESC-achtige naïef pluripotent die verhoogde gefosforyleerd STAT3 signalering opgenomen, daalde ERK fosforylatie, global 5-methylcytosine-apr hypomethylation, genoom-brede apr demethylatie op embryonale stamcellen (ESC)-specifiek gen initiatiefnemers en dominante distale OCT4 versterker gebruik. Bovendien, in vergelijking met andere naïef terugkeer methoden die in aberrantly hypomethylated resulteerde bedrukt genomic loci, N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd waren verstoken van systematische verlies van ingeprinte CpG patronen of DNA methyltransferase expressie (b.v., DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Een directe LIF-3i cultuur van een breed scala aan conventionele menselijke embryonale cellen (hESC) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) gegroeid op feeders of E8 feeder-vrij voorwaarden bereikt snelle en bulk terugkeer naar een naïef epiblast-achtige toestand. Directe LIF-3i naïef terugkeer kan evenwel in sommige unstable conventionele hPSC lijnen als gevolg van de inherente genomic en lineage-primer variabiliteiten die voortvloeien uit de genetisch divers donor achtergronden inefficiënt.
Dus, het verbreden van het nut van de LIF-3i-methode, een stapsgewijze optimalisatie werd ontwikkeld en hierin wordt gepresenteerd waarmee universele naïef terugkeer met bijna elke conventionele hESC of transgenic-vrije hiPSC lijn gekweekte op feeders. Deze universalized naïef terugkeer methode maakt gebruik van een voorbijgaande eerste cultuur stap in conventionele hPSC dient als aanvulling op de LIF-3i cocktail met twee extra kleine moleculen (LIF-5i) die versterken proteïne kinase een (forskolin) en sonic hedgehog (sHH) ( purmorphamine) signalering. Één van de eerste passage van conventionele hPSC in LIF-5i past hen tot latere stabiele LIF-3i terugkeer in grote hoeveelheden. Eerste LIF-5i aanpassing verhoogt aanzienlijk de eerste eencellige klonale verspreiding van conventionele hPSC geteeld op E8 of feeders (vóór hun latere stabiele, continue passage in LIF-3i alleen). Conventionele hPSC lijnen aangepast eerst tolereren op één passage in LIF-5i latere bulk klonale passaging van cellen naïef-teruggekeerd in LIF-3i voorwaarden, die ondervangt de behoefte aan plukken en subcloning van de zeldzame stabiele kolonies, of het routinematig gebruik van anti-apoptotic moleculen of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) remmers.
De methode LIF-3i heeft gewerkt voor stabiel uitbreiden en onderhouden van een breed repertoire van > 30 onafhankelijke, genetisch divers conventionele hPSC lijnen voor > 10 – 30 passages met behulp van beide methoden niet-enzymatische of enzymatische dissociatie, en zonder bewijs van inductie van chromosomale of epigenomic voorkomende afwijkingen, waaronder afwijkingen op ingeprinte gene loci. Bovendien, sequentiële LIF-5i/LIF-3i cultuur is de enige naïef terugkeer methode die tot nu toe heeft gemeld dat de functionele pluripotent van een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen verbetert door het verlagen van hun afkomst-primer genexpressie en drastisch verbeteren van hun potentie multipotente differentiatie. De LIF-3i naïef terugkeer methode wist de inherente zal variabiliteit van differentiatie van lineage-primer, conventionele hPSC lijnen interline, en een groot nut van toepassing in de regeneratieve geneeskunde en cellulaire therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden verricht overeenkomstig de dierenverzorgers richtlijnen en protocollen die zijn goedgekeurd door de Johns Hopkins School of Medicine Institute of Animal Care en gebruik Comité (IACUC).
1. voorbereiding van muis embryonale fibroblasten (MEF) Feeder-afhankelijke conventionele (hESC medium/MEF) of naïef-teruggekeerd (LIF-3i medium/MEF) hPSC cultuur
-
Kopen of bereiden van in-house laag-passage leveringen van MEF feeders uit CF1 of CF1 x DR4 hybride E13.5 muis embryo's na gepubliceerde protocollen4.
- Cryopreserve lage passage (p1-p2) MEF culturen pre (voor lange termijn opslag) of (voor maximaal 6 maanden) na bestraling en winkel in vloeibare stikstof zoals eerder beschreven4.
- Bestralen (5.000 rad) bulk uitgebreide MEF onder p5 met behulp van een γ - of X-Vleug-irradiator en voorbereiden aliquots bij 1.5 x 106 cellen per flacon op korte termijn opslag (minder dan 6 maanden) bij-80 ° C in een ultra-lage temperatuur vriezer.
- Plaat tussen 1.2 x 106 (vers bestraald niet-cryopreserved) en 1,5 x 106 (bestraalde cryopreserved) MEF per één 6-well gelatinized plaat voor het voorbereiden van feeder culturen, zoals hieronder beschreven.
- Bereid gelatine beklede 6-well steriele Weefselkweek behandeld platen door toevoeging van 1,5 mL steriele 0,1% gelatine oplossing aan elk putje in een biologische veiligheidskast.
- Incubeer gelatine beklede platen bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur of overnachting in een laboratorium CO2 incubator.
- Op de volgende dag, ontdooien lage doorgang (bijvoorbeeld P2 naar P4) DMSO-cryopreserved en bestraald (5.000 rad) MEF volgens de stappen die hieronder worden aangegeven.
Opmerking: Nietdoorstraald MEF moet ook worden ontdooid, uitgebreid en bestraald onmiddellijk vóór gebruik. - Plaats een cryopreserved MEF aliquot in een waterbad 37 ° C. Bij het ontdooien, steriliseren van de buis met ethanol en onmiddellijk de DMSO cryoprotectant ten minste 10-fold met MEF medium (tabel 1) verdund in een kabinet bioveiligheid (bijvoorbeeld overdracht 1 mL DMSO-MEF aliquot tot 9 mL MEF medium in een steriele 15 mL conische).
- Centrifugeer het verdunde MEF cellen bij 200 x g gedurende 5 min in steriele 15 mL conische buisjes.
- In een kabinet bioveiligheid, gecombineerd en verwijder het supernatant cel-vrij en resuspendeer de pellet cel in 1-2 mL verse MEF medium.
- Zachtjes negeren de gelatine-oplossing en voeg toe 2 mL MEF opnieuw geschorst in het medium MEF aan elk putje van een gelatinized 6-well plaat, zoals hierboven aangegeven. Graaf MEF cellen en plaat 1.2 x 106 (vers bestraald niet-cryopreserved) of 1.5 x 106 (bestraalde cryopreserved) MEF per één 6-well gelatinized plaat.
Opmerking: Alle platen van cel-cultuur die uit de CO2 incubator worden overgedragen aan de bioveiligheid kabinet kunnen voorzichtig worden afgeveegd met ethanol-gespoten papier maar moeten niet worden rechtstreeks gespoten op met 70% ethanol oplossing om te voorkomen dat ethanol verspreiding in de putjes. - Incubeer MEF platen bij 37 ° C's nachts in een laboratorium CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer) zodat de bijlage, voorafgaand aan het gebruiken.
2. bulk stabilisatie van conventionele hPSC culturen voor latere naïef terugkeer met een korte LIF-5i aanpassing stap
- Alle conventionele hPSC lijnen voor het bezitten van een normale karyotype door G-banding, vóór begin LIF-5i/LIF-3i terugkeer te valideren.
Opmerking: LIF-3i terugkeer van hoge-passage conventionele hPSC lijnen (bv., P > 40 – 50) moet worden vermeden, omdat deze culturen al genomic aberraties die negatieve invloed hebben op bulk, stabiel en efficiënt LIF-3i terugkeer van Primer haven kunnen kunnen, convetional hPSC lijnen. - Onderhouden en uitbreiden van conventionele hPSC culturen met gevalideerde normale karyotypes in een MEF-gebaseerde cultuur-systeem (zoals uiteengezet in sectie 1) of een feeder-vrije cultuur systeem (volgens de onderzoeker de voorkeur).
Opmerking: Beide feeder-afhankelijke hPSC/MEF cocultures (b.v., hESC medium (tabel 1) aangevuld met 4 – 10 ng/mL bFGF) of feeder-gratis (bv., E8- 5 of mTSER 6 -media (volgens de instructies van de fabrikant op vitronectin-gecoate platen) methoden zijn compatibel met bulk naïef terugkeer met behulp van de LIF-5i/LIF-3i/MEF systeem (Figuur 1). Niet-enzymatische methoden hebben de voorkeur voor de passaging van conventionele hPSC vóór hen voorbereiden op terugkeer. LIF-5i en LIF-3i media formuleringen bevatten geen antibiotica of antifungale agenten. Standaardwerking voorschriften inzake bioveiligheid kabinet steriliteit en onderhoud wordt verwacht dat het strikt in acht worden genomen om eventuele bacteriële of schimmel verontreiniging te voorkomen. - Voorbereiden voor de MEF gebaseerde cultuur systeem, MEF feeders in de gelatinized 6-well plaat zoals beschreven in sectie 1 ten minste één dag voor de passaging van conventionele hPSC LIF-5i-aangepast culturen.
- Nadat conventionele hPSC culturen hebben bereikt ~ 50% confluentie (dat wil zeggen, 3-5 dagen na de eerste beplating), vervangen de standaard hESC-kweekmedium met LIF-5i medium (2 mL per putje; Tabel 1).
Opmerking: Deze stappen uitvoeren in een kabinet bioveiligheid. - Cultuur en conventionele hPSC/MEF gedurende maximaal 2 dagen in LIF-5i in de CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). Aangepast dat het LIF-5i medium dagelijks aan te passen voor hun latere passage en stabiele terugkeer in LIF-3i.
- Als alternatief voor de conventionele feeder-vrije culturen (bvin E8), cultuur hPSC in LIF-5i alleen overnachting vóór passaging de volgende ochtend.
Opmerking: LIF-5i en LIF-3i culturen kunnen zowel worden gehandhaafd met atmosferische (21% O2) of fysiologische (5% O2) zuurstof niveaus in de CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). - Voorafgaand aan passaging, plaats van de cultuur-platen in een kast van bioveiligheid, wassen LIF-5i-aangepast conventionele hPSC keer met PBS en voeg 1 mL van cel dissociatie reagens toe aan elk putje. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een broedstoof CO2 , en zachtjes triturate met een pipet in een enkele cel schorsing terug in het biosafety kabinet.
Opmerking: Niet-enzymatische dissociatie buffers kunnen als alternatief worden gebruikt voor het voorbereiden van afzonderlijke cellen voor passaging. - Verzamel de celsuspensie in hESC medium (op zijn minst 2-fold verdunning) in een conische buisjes van steriele 15 mL, en zachtjes triturate cellen door pipetteren om te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min aspirate/negeren het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 1-2 mL van het LIF-5i medium in de kast bioveiligheid. Met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller cellen tellen.
- Wassen van de vooraf vergulde MEF plaat twee keer met PBS (2 mL per putje in 6-Wells-platen) en 1-2 x 106 cellen (in 2 mL LIF-5i medium) op 1 van de PBS-gewassen MEF plaat goed verspreiden.
- Aanpassen en optimaliseren van eerste plating dichtheden voor elke individuele hPSC regel als naïef-teruggekeerd, mogelijk replating efficiëntie zeer variabel. Plaats de plaat in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer).
Opmerking: Het routinematig gebruik van anti-apoptotic reagentia wordt niet aanbevolen voor de meeste hPSC lijnen met deze methode. Het systeem van de LIF-5i verbetert al tot een aanzienlijke initiële bulk klonen opnieuw identificatietekens Efficiency van conventionele hPSC lijnen. Echter een eenmalig gebruik van ROCK-remmer (5 – 10 μM Y-27632) kan verdere verbetering van de initiële LIF-5i klonen opnieuw identificatietekens efficiëntie van conventionele hPSC culturen in de eerste passage voor sommige unstable lineage-primer hPSC lijnen met de neiging tot spontane differentiatie. - Als één putje van de gedissocieerde conventionele hPSC aangepast in LIF-5i in feeder-vrije culturen (bv, E8), rechtstreeks vanaf overbrengt bestraald een MEF-verguld goed (dat wil zeggen, passage van 1:1).
- De volgende dag, swirl zachtjes de plaat te heffen alle cellen van de niet-ingeschrevenen, gecombineerd het medium (PBS wassen is optioneel) en 2 mL LIF-5i voedingsbodem te vervangen. Voer deze stap in een bioveiligheid kast dagelijks gedurende 3-5 dagen of totdat de cellen zijn 60-70% heuvels (Figuur 1). Plaats de plaat in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer).
3. op lange termijn onderhoud en uitbreiding van N-hPSC in LIF-3i Medium
- Na aanvankelijke LIF-5i aanpassing, passage latere stabiele LIF-3i culturen elke 3-4 dagen in een kabinet bioveiligheid, of bij culturen worden 60-70% heuvels (Figuur 1).
Opmerking: LIF-3i culturen vereist strenge onderhoud en N-hPSC culturen te bereiken hoog confluentie/celdichtheid van langdurige cultuur toe te staan (bijv., > 4 dagen) verlaagt de daaropvolgende klonen opnieuw identificatietekens efficiëntie, en bevordert spontane differentiatie. - In een kast bioveiligheid, negeren het kweekmedium en wassen elk goed voor LIF-5i/LIF-3i culturen door zachtjes toevoeging van 2 mL PBS. Negeren van PBS en voeg 1 mL cell detachement oplossing. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer).
- Verzamelen van de celsuspensie, hESC medium toe te voegen (zonder remmers of groeifactoren (tabel 1); ten minste 2-fold verdunning) om te herstellen van alle hPSC en zachtjes triturate cellen door pipetteren om te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Spoel de suspensie aan een steriele 15 mL conische buis.
- Centrifugeer bij 300 g gedurende 5 min en aspirate/negeren het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in LIF-3i medium. Met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller cellen tellen.
- Plaat ~ 2 x 105 cellen per putje op de bestraalde MEF in de gelatinized 6-well plaat voor routine passaging van LIF-3i culturen. Plaat voor de initiële LIF-5i-aangepast culturen, een aanvankelijk hogere dichtheid (4 x 10,5 cellen/well) voorafgaand aan de eerste passage in LIF-3i/MEF.
- Opnieuw plaat en distribueren van LIF-5i-aangepast hPSC op verse PBS gewassen bestraalde MEF feeder platen (bereid de vorige dag als hierboven) in het medium LIF-3i. Het medium LIF-3i dagelijks vervangen.
- Passage N-hPSC voor minst 4 – 7 continu bulk passeren in de LIF-3i middellange voorafgaand aan het gebruik van N-hPSC in functionele studies of cryopreservatie. Registreren van het aantal passages van N-hPSC in hetzij conventionele of LIF-3i media.
Opmerking: LIF-3i terugkeer van hoge-passage (b.v. > p40) afkomst-primer, conventionele hPSC lijnen wordt niet aanbevolen. Een inspanning moet worden gedaan om terug te keren van conventionele hPSC lijnen bij de laagste passage los dat ze beschikbaar zijn. Bovendien is het gebruik van een LIF-3i-teruggekeerd hPSC die groter is dan 10 LIF-3i passages hebben ondergaan niet aanbevolen voor functionele studies, aangezien dergelijke N-hPSC culturen karyotypisch-abnormale klonen als gevolg van langdurige klonale celselectie cultuur haven kunnen. Verse LIF-5i/LIF-3i reversions van lage-passage conventionele hPSC lijnen moeten worden uitgevoerd voor functionele studies, voorraden van N-hPSC met < 10 passages in LIF-3i zijn niet beschikbaar.
4. cryopreservatie en ontdooien van N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd
- Vouw teruggekeerd N-hPSC voor ten minste 5-7 passages in LIF-3i, zoals hierboven aangegeven, voorafgaand aan het gebruik in functionele studies of op lange termijn cryopreservatie. Record het aantal passages in conventionele voorwaarden en in LIF-3i voorwaarden op elk cryopreserved vial.
Opmerking: Overmaat LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC niet gebruikt in de functionele testen kan worden cryopreserved bij elke passage, maar bevriezing van lagere na terugkeer passages (bijvoorbeeld., < p3) kan resulteren in armen, of zeer variabel na dooi herstel efficiëntie. - In een kast bioveiligheid, gecombineerd het kweekmedium, cellen in PBS (2 mL per putje) wassen, gecombineerd PBS en distantiëren hPSC kolonies in afzonderlijke cellen met behulp van mobiele-detachement oplossing (1 mL per putje). Plaats de plaat gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). Verdun de cel detachement oplossing met de LIF-3i-medium (2-fold), verzamelen hPSC in een steriele 15 mL kegelvormig, centrifugeer cellen bij 200 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet cel in LIF-3i medium (1-2 mL per well-equivalent). Het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller.
- Centrifugeer N-hPSC in het LIF-3i medium (200 x g gedurende 5 minuten) en resuspendeer de cellen in een kabinet van bioveiligheid in de ijskoude oplossing (tabel 2), bij een dichtheid van ten minste 1 x 106 cellen/mL.
- Pipetteer cellen in de lange termijn opslag cryogene buizen en leg in een langzaam-bevriezing container. Toestaan dat de monsters te bevriezen 's nachts in een vriezer-80 ° C.
- De volgende dag, breng de cryovials in een vloeibare stikstof vriezer voor langdurige opslag.
- Voor het ontdooien, plaats de bevroren ampul in een waterbad 37 ° C gedurende ~ 2 minuten Sterilize de flacon (dat wil zeggen, ethanol spray), breng hPSC in een steriele 15 mL conische en langzaam Verdun het medium van de cellen inzake 10-fold in hESC (tabel 1) aangevuld met 5 μM van Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) remmer Y-27632 binnen een steriele biologische veiligheid kap kabinet.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. In een kast bioveiligheid, verwijder cel-vrije supernatant en resuspendeer de pellet cel in LIF-3i medium (1-2 mL) aangevuld met 5 μM ROCK remmer Y-27632.
Opmerking: Uitsluiting van Y-27632 zal leiden tot slechte na ontdooien herstel efficiëntie (Figuur 2). - Overdracht van de ontdooide cellen geresuspendeerde in LIF-3i/ROCK remmer op de PBS-gewassen MEF basisstuk putten. Cryopreserve LIF-3i culturen bij een dichtheid van 1 x 106 cellen per flacon. Elk van deze flesjes op feeders in een put van een gelatinized 6-well-plate ontdooien.
- De volgende dag, start reguliere LIF-3i middellange uitbreiding zonder Rho kinase inhibitor.
5. feeder verwijdering voor de verzameling van N-hPSC monsters
- Ter voorbereiding van de monsters van LIF-3i/MEF (of hESC/MEF conventionele) culturen (dat wil zeggen, voor de expressie van genen (bijvoorbeeld kwantitatieve RT-PCR, microarrays) of eiwitten (bijvoorbeeld westelijke vlek) analyses, afbreken LIF-3i culturen van MEF feeders gebruik Magnetische geactiveerd cel sorteren (MACS) met anti-TRA-1-81 antilichaam gecoat microbeads volgens protocol van de fabrikant.
- Alternatief, gebruik de volgende eenvoudige pre beplating methode om het afbreken van de culturen van feeders, zoals hieronder beschreven.
- In een steriele biologische veiligheid kap kabinet, verwijder het supernatant cel-vrij, wassen van de pellet met 2 mL steriele PBS per well. Loskoppelen aanhangend LIF-3i/MEF culturen met behulp van mobiele-detachement oplossing (1 mL/putje). Incubeer gedurende 5 min. in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). Verzamelen hPSC in een steriele 15 mL kegelvormig. Wassen 2-fold in hESC medium, overdracht cellen de steriele 15 mL conische en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
- In een kast bioveiligheid, resuspendeer elk putje van LIF-3i/MEF losgekoppeld cellen in 2 mL van het medium LIF-3i en rechtstreeks overbrengen naar een nieuwe put van een 6-well plaat die vers heeft zijn bekleed met 0,1% gelatine.
- Incubeer LIF-3i/MEF hPSC cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). Het verzamelen van niet-aanhanger cellen met een pipet in een nieuwe conische buis. Zacht, voeg 2 mL van hESC medium aan elk putje en wervelen om te verzamelen van de resterende niet-aanhanger cellen.
Opmerking: De meerderheid van de bestraalde MEF zal hechten aan de gelatinized plaat in 1 h, de meerderheid van de hPSC verlaten in suspensie. - Combineer en centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen in PBS. Module-freeze de cel pellet in vloeibare stikstof na het centrifugeren, of als alternatief resuspendeer korrels in een lysing buffer die compatibel is met de downstream eiwit of nucleïnezuur analyse (Figuur 2B).
- Karakterisaties LIF-3i hPSC lijnen met een bijpassende conventionele voorbehandelde isogene hPSC-besturingselement uit te voeren.
Opmerking: Vanwege de intrinsieke variabiliteit tussen en binnen de primer culturen, relevante controlegroepen zijn bereid op een bijpassende timepoint in cultuur of vóór naïef terugkeer. Gedetailleerde protocollen en materialen voor downstream immunefluorescentie bioimaging, stroom cytometry westelijke bevlekken, genexpressie (RT-PCR-testen en microarrays), methylering studies (dot vlek, CpG methylation microarray), OCT4 proximale en distale enhancer overwicht verslaggever testen en signalering remmer vitrotests vindt u elders3.
6. post naïef terugkeer: validatie van Genomic integriteit en retentie van ouderlijke stempelt van LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC vóór gebruik in functionele Assays
- Het scherm van de eerste primer, conventionele hPSC culturen voor het bezit van een normale karyotype (b.v.met Giemsa-band kleuring analyse met behulp van gepubliceerde methoden 7) voordat LIF-5i/LIF-3i terugkeer.
Opmerking: Dit is het verwijderen van conventionele hPSC populaties die kunnen haven abnormale genomic veranderingen die artefactual selectieve overleving voordeel in klonen LIF-3i voorwaarden kunnen rijden. - Voor een optimaal resultaat vers terugkeren conventionele hPSC culturen aan een naïef-achtige toestand met LIF-3i verscheidene weken voorafgaand aan het gebruik ervan in functionele studies of differentiatie gericht.
Opmerking: Routine verlengd 'onderhoud' cultuur in LIF-3i voorwaarden voor meer dan 10 passages volgende naïef terugkeer wordt niet aanbevolen. Routine uitbreiding en het onderhoud van hESC en hiPSC lijnen moeten worden uitgevoerd met behulp van conventionele cultuur systemen (bijvoorbeeld in E8 of MEF/hESC medium met bFGF). - Na teruggekeerd N-hPSC lijnen te beoordelen voor het behoud van normale karyotypes 5 – 7 passages na LIF-3i terugkeer (bv., met Giemsa-band kleuring analyse7, of een andere methode van keuze).
- Alle teruggekeerd N-hPSC regels voor het bewaren van normale ouderlijke genomic opdrukken beoordelen door een analyse van de methylering van het DNA van keuze (bijvoorbeeldprotocollen voor CpG DNA microarray analyse van ouderlijke opdrukken in LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC vindt u elders3 ) na 5 – 10 passages van LIF-3i terugkeer.
7. post naïef terugkeer: Experimentele Design richtlijnen voor kwantitatieve gestuurde differentiatie testen met behulp van N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd
- Direct gebruiken LIF-3i N-hPSC in gevestigde gestuurde differentiatie protocollen zonder extra cel cultuur manipulaties.
Opmerking: Opnieuw priming (dat wil zeggen, N-hPSC terug omzetten in conventionele primer voorwaarden voorafgaandelijk aan het gebruik ervan in gestuurde differentiatie testen) is niet nodig met de LIF-3i-methode en wordt niet aanbevolen. - Om te controleren voor de effecten van de bepaling en interline variabiliteit in de functionele testen van individuele hPSC lijnen, kruis-valideren de geslacht-specifieke differentiatie potencies door gebruik te maken van onafhankelijke differentiatie protocollen met ten minste drie hPSC lijnen afgeleid van onafhankelijke genetische achtergronden (dat wil zeggen, meerdere donor afkomstige hiPSC en hESC).
- Voor de functionele vergelijkingen, broer of zus culturen, gelijkwaardige passage, en uit dezelfde (isogene) hPSC lijn parallel aan de conventionele lineage-primer en instellen LIF-3i-teruggekeerd hPSC culturen. Handhaven van de primer/naïef sibling isogene hPSC culturen in hun respectieve media (bv., E8 vs. LIF-3i), en tegelijkertijd onderscheid maken met behulp van identieke differentiatie protocollen en materialen, om te elimineren experimentele vooringenomenheid (Figuur 4).
- Voor isogene primer naïef hPSC vergelijkingen, aanpassen en optimaliseren van eerste plating dichtheden voor elke individuele differentiatie assay.
Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor neurale voorlopercellen, definitieve endoderm en hemato-endothelial gestuurde differentiatie van LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC vindt u elders 3. LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC hebben meer robuuste proliferatieve en differentiatie capaciteit in de gestuurde differentiatie testen dan conventionele hPSC. N-hPSC vereist meestal een lagere initiële plating concentratie dan de conventionele hPSC, en in tegenstelling tot hun conventionele primer hPSC tegenhangers, niet vereisen het gebruik van anti-apoptotic reagentia te verbeteren van hun klonen voortbestaan na enzymatische spijsvertering in differentiatie testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol optimaliseert efficiënte naïef-achtige terugkeer met LIF-3i in beide culturen feeder-afhankelijke en feeder-onafhankelijke lineage-primer conventionele hPSC (Figuur 1). Het gedetailleerd protocol, beschreven hierin, omtrekken sequentiële aanpassing aan LIF-3i vanaf beide feeder-afhankelijke- of feeder-vrije conventionele hPSC voorwaarden (bijvoorbeeld E8 medium).
Vertegenwoordiger resultaten voor de terugkeer van de LIF-3i van verschillende conventionele hESC en transgenic-vrije hiPSC lijnen worden gepresenteerd in de cijfers 1-3. Deze typische resultaten kunnen worden gevalideerd met de verkrijgbare hESC lijn H9, of met een commercieel beschikbare transgenic-vrij, het snoer van bloed afgeleide episomal hiPSC lijn (6.2) afgeleid van het Zambidis laboratorium8,9. Invoering van een eerste stap van de aanpassing in de LIF-5i vergunningen hoogefficiënte latere, bulk klonale verspreiding van conventionele hPSC culturen in LIF-3i, en vereist geen anti-apoptotic agenten of ROCK remmers10 (Figuur 1A, B ). Meerdere platen van naïef-achtige hPSC monsters snel kunnen worden verzameld voor downstream analyses of multilineage regisseerde differentiatie alleen na 5 – 7 passages in LIF-3i. LIF-3i culturen kunnen als alternatief worden cryopreserved voor toekomstige toepassingen. Na ontdooien cel herstel kan worden verbeterd (Figuur 2) via opneming van een ROCK-remmer in cryopreservatie en na dooi media11.
De determinanten van moleculaire en functionele pluripotent, beide in vitro en in het embryo waren onlangs herziene2. Deze factoren omvatten de genetische achtergrond, cultuur-geassocieerde verwerving van mutaties voor belangrijke developmental genen, en verschillen in hESC en hiPSC afleiding en cultuur methodologieën. Verstrekt hieronder is een samenvatting van standaard tests die kunnen worden ingezet voor de karakterisatie en validatie van de fenotypische, moleculaire en functionele pluripotencies van hPSC LIF-3i-teruggekeerd.
Kolonie morfologie
De overgang tussen primer, conventionele en LIF-3i-reverted cultuur systemen gaat gepaard met verschillende fysieke veranderingen in de morfologie van de kolonie hPSC (Figuur 1B). Conventionele hPSC cellen vermenigvuldigen als platte, brede enkelgelaagde kolonies die snel van kleincellige klontjes (op MEF of feeder-vrij voorwaarden), maar slecht als afzonderlijke cellen uitbreiden. Gasbedwelming met behulp van conventionele hPSC lijnen LIF-3i bevordert de groei en de uitbreiding en van kleinere, zorgvuldig verpakt, koepelvormige kolonies die klonaal voortvloeien uit enkele cellen. Deze morfologische wijzigingen zijn volledig omkeerbaar en LIF-3i-teruggekeerd koepelvormige kolonies kunnen spontaan overgang terug naar de morfologie van een conventionele enkelgelaagde als LIF-3i is ingetrokken en de cellen opnieuw in standaard conventionele hESC medium gekweekt worden aangevuld met bFGF. Bovendien, uitbreiding van LIF-3i-teruggekeerd cellen bij hoge confluente dichtheden (of langdurige cultuur zonder frequente passaging) resultaten in de spontane reacquisition van de morfologie van het platte, conventionele met lagere klonale rendement; nadruk op de noodzaak voor ijverig onderhoud en verzorging van LIF-3i-teruggekeerd hPSC (bv., < samenvloeiing van 40-60%).
Wonen immunofluorescentie kleuring en stromen van cytometrische analyse van oppervlakte pluripotent markers
Beoordeling van pluripotent markeringen tijdens de overgang van conventionele naar een naïef-achtige toestand volgende continu LIF-3i cultuur kan worden gecontroleerd niet-gebeurt met behulp van live antilichaam kleuring zonder eventuele negatieve effecten op LIF-3i/MEF expansie (opsporing bijv., live-kleuring fluorescerende-geconjugeerde antilichamen tegen TRA-1-81, TRA-1-60 en SSEA4).
Eigendomsvoorbehoud pluripotent tijdens LIF-3i terugkeer kan ook routinematig worden gevolgd door flow cytometrische analyse van oppervlakte marker pluripotent-geassocieerde expressie voor TRA-1 en SSEA antigenen tijdens één cel passaging (Figuur 1C) of immunofluorescentie van intact, vaste kolonies in situ (Figuur 3). Hoewel deze markeringen niet tussen conventionele discrimineren en valt bestuurlijk gezien onder LIF-3i, kwalificatieniveaus omgekeerd met de frequentie van spontane differentiatie voordoen bij hPSC correleren wanneer het transitioning van conventionele hPSC aan LIF-3i voorwaarden. Extra oppervlakte antigenen die meer in het bijzonder mark menselijke naïef-achtige Staten in vitro2,,12,13 kunnen kunnen ook worden gebruikt om te detecteren effectieve LIF-3i hPSC terugkeer.
Validatie van moleculaire pluripotent van N-hPSC
Omdat de genetische achtergrond van hPSC lijnen wordt gekenmerkt als een sterke bijdrage aan interline variabiliteit, is het belangrijk om te streng beoordelen isogene culturen op overeenkomende cultuur timepoints bij het vergelijken van hPSC cultuur systemen (Figuur 4). Aangezien sommige van deze systemen reeds is gebleken voor het genereren van hPSC populaties met afwijkende genomic en epigenetische configuraties2, moet een naïeve terugkeer methode worden bepaald met een aantal N-hPSC onafhankelijke genetische achtergronden, op een wijze dat is voldoende om biologische reproduceerbaarheid te valideren en uitsluiten van niet-ontwikkelingsachterstand relevante "pseudo-pluripotente" Staten (dat wil zeggen, met duidelijk kenmerken van moleculaire pluripotent maar functionele differentiatie mogelijkheden ontbreekt). Zimmerlin et al. verder uitgebreid de validatie van de LIF-3i cultuur systeem op te nemen met het analyseren van de moleculaire en functionele pluripotencies van teruggekeerd N-hiPSC afgeleid van verschillende herprogrammering methoden, oftewel een andere bekende vermeende contribuant van functionele variabiliteit tussen pluripotente stelt2.
Dienovereenkomstig, hebben de meeste studies van menselijke naïef cultuur systemen gericht op moleculaire pluripotent van N-hPSC keuring op 1) de epigenetische niveau (bijvoorbeeld Histon merken door sequentiebepaling van ChIP of ChIP-PCR, global methylation van DNA door immunoblots of hele genomic allele-specifieke CpG methylering microarrays, OCT4 versterker overheersende gebruik door verslaggever systemen, bisulfiet sequencing, mondiale bedrijvigheid regelgevende elementen door DNAse ik overgevoeligheid, en herhaal element profileren door RNA-sequentiebepaling), 2) transcriptomic niveau (RNA-sequencing, expressie microarrays en kwantitatieve RT-PCR), eiwit expressie analyse (bv., FACS, immunefluorescentie microscopie en westelijke bevlekken) en 3) via metabole studies (b.v., glycolyse, oxidatieve fosforylatie en nicotinamide metabolisme). Representatieve voorbeelden van immunofluorescentie vlekken en westelijke vlek opsporing van uitdrukking voor de belangrijkste merkers van moleculaire pluripotent staan (Figuur 3B, C). Bijvoorbeeld, zijn wordt weergegeven in figuur 3B geactiveerd gefosforyleerd (phospho) en totale isoforms van STAT3 en ERK1/2, die belangrijke moleculaire stempels van muis ESC-achtige naïef pluripotent. Deze werden waargenomen met behulp van anti-STAT3 en anti-ERK1/2 primaire antilichamen. Bovendien, is functionele pluripotent in Teratoom differentiatie testen aangetoond in conventionele vs. LIF-3i-teruggekeerd hPSC Teratoom weefsels ontleed 10 weken na injectie en vaste in de 4% formaldehyde en paraffine ingesloten (Figuur 3D).
Voorbereiding van LIF-3i/MEF of hESC/MEF/bFGF monsters voor downstream moleculaire analyse dient MEF uitputting. Twee benaderingen zijn hierboven beschreven voor MEF uitputting die met succes zijn tewerkgesteld in ons laboratorium. MEF pre plating is een eenvoudige, betrouwbare, en kosten-efficiënte methode om te elimineren feeders uit N-hPSC monsters voor moleculaire studies is een voorkeur alternatief voor FACS of MACS scheiding (d.w.z., anti-TRA-1-81 of anti-TRA-1-60 antilichaam gebaseerde scheiding ). Bovendien kunnen spontaan-differentiatie van TRA-1-negatieve Adherente cellen in LIF-5i/LIF-3i culturen worden snel geëlimineerd uit LIF-5i/LIF-3i N-hPSC culturen vóór de daaropvolgende LIF-3i passage op verse MEF door vooraf plating de enzymatisch-verteerd afzonderlijke cellen gedurende 1 uur op platen vooraf bedekt met 0,1% gelatine (Figuur 2).
Evaluatie van functionele pluripotent van N-hPSC
De meest stringente bepaling van de functionele pluripotent van PVC is de blastocyst injectie chimera assay, dat beperkt is in het testen van de N-hPSC lijnen om ethische redenen. Als alternatief, verschillende groepen die hebben gemeld dat de generatie van N-hPSC met verschillende andere methoden hebt geprobeerd te genereren van interspecies Chimaera. Echter hebben deze pogingen extreem lage of mislukte bijdrage van gedifferentieerde N-hPSC lineages op lymfkliertest of varkens embryo's, in vergelijking met de chimera-genererende capaciteit van standaardmuis ESC2opgeleverd.
Bijkomende functionele studies hebben onderzocht gestuurde in vitro differentiatie van vermeende N-hPSC afgeleid via verschillende methoden, maar vooringenomen, defect of verminderde multilineage differentiatie capaciteit, met de daarmee gepaard gaande is gebleken herbergen van epigenetische afwijkingen2,,13. Vergelijkbare aberraties van de epigenomic, vooral bij ingeprinte loci, zijn opgetreden in muis ESC na langdurige blootstelling aan de cocktail van LIF-2i14. Interessant, sommige terugkeer cultuur systemen hebben gemeld globale verbetering van specifieke kenmerken van functionele pluripotent van PVC zoals de verbeterde capaciteit voor in vivo trophectoderm bijdrage2,15 .
Met behulp van een brede verzameling onafhankelijk afkomstige LIF-3i-teruggekeerd hPSC, werkzaam Zimmerlin et al. multilineage differentiatie testen om te laten zien dat het systeem LIF-3i dramatisch de functionele pluripotent van conventionele hPSC lijnen verbetert 3. Hierdoor systematische analyse van conventionele vs LIF-3i hPSC lijnen in isogene paren te elimineren interline-afhankelijke variaties (Figuur 4). LIF-3i-teruggekeerd hPSC regels vereisen niet een opnieuw aanzuigende stap vóór EB differentiatie. LIF-3i hPSC vermenigvuldigen echter tot een aanzienlijk hoger klonale niveau dan isogene cellen uitgebreid in E8, en dus, eerste lagere plating dichtheden moeten worden aangepast om elke cultuur tot samenvloeiing op een soortgelijke timepoint.
Onderzoekers moeten routinematig gebruik maken van meerdere tests om aan te tonen van de verbeterde functionaliteit van LIF-3i-teruggekeerd hPSC waarin niet alleen de in vivo Teratoom testen, maar ook in vitro geregisseerd differentiatie testen op neurale, definitieve endoderm en hematovascular lineages3 met behulp van meerdere testen (bijvoorbeeld, 2D APEL3,16 en 3D embryoid lichaamssystemen17,,18 ). Om te controleren voor assay-afhankelijke reproduceerbaarheid, ten minste twee verschillende differentiatie methoden dient te worden uitgevoerd in repliceren voor elk isogene paar primer/LIF-3i hPSC culturen (BV, Figuur 4, APEL, embryoid lichaam differentiatie protocollen). De proefopzet moet bevatten een robuuste nummer (bijvoorbeeld> 3 – 5) primer/LIF-3i isogene paren van hPSC lijndiensten tussen meerdere, onafhankelijke donor genetische achtergronden (Figuur 4).
Figuur 1: Een stapsgewijze overgang van conventionele, lineage-primer hPSC culturen aan naïef-achtige omstandigheden met de LIF-3i-methode. (A) Schema van protocollen voor stapsgewijze LIF-3i terugkeer. (Top schematische) Een algemene methode voor de overgang van primer, conventionele hPSC LIF-3i culturen. (Onderste schema's) Twee samengevatte strategieën voor LIF-3i naïef terugkeer van conventionele (primer) hPSC gekweekt op feeder (dat wil zeggen, Primed/MEF aan LIF-3i/MEF) of feeder-vrij voorwaarden (dwz, Primed/E8 aan LIF-3i/MEF). (B) menselijke PVC morphologies. Weergegeven zijn representatieve photomicrographs van hPSC tijdens LIF-3i terugkeer met behulp van een commercieel beschikbare menselijke episomal iPSC lijn (6.2). Weergegeven zijn de overgangen waargenomen tussen eerste conventionele plat enkelgelaagde kolonies en de daaropvolgende koepel-vormige clonogenic kolonies die zich voordoen na passage in de tussenliggende LIF-5i en stabiele LIF-3i cultuuromstandigheden. Schaal bars = 200 µm. (C) vertegenwoordiger stroom cytometrische analyses van pluripotent oppervlakte markers. TRA-1-81 en SSEA-4 oppervlak expressies in conventionele hPSC lijn 6.2 (p40) uitgebreid in E8, de eerste passage in LIF-5i/MEF en volgende 1 tot en met 9 passages (P1-P9) wordt getoond zijn in LIF-3i voorwaarden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Cryopreservatie van N-hPSC en bereiding van de monsters door MEF pre beplating. (A) voorbeeld van een vorst/dooi cyclus van LIF-3i/MEF culturen. De conventionele koord bloed-afgeleide niet-geïntegreerde, transgenic-vrije human iPSC lijn E5C3 was afgeleid en uitgebreid op MEF feeders in hESC medium aangevuld met 4ng/mL bFGF voor 18 passages. Conventionele, lineage-primer E5C3 werden aangepast in LIF-5i (links) en overgestapt naar LIF-3i medium voor 3 gangen (midden). De cellen van de E5C3 LIF-3i weergegeven in het midden paneel waren cryopreserved met behulp van DMSO gebaseerde cryoprotectant medium (tabel 2; 1 x 106 cellen per flacon) en opgeslagen in vloeibare stikstof). Één flacon een maand later was ontdooid en E5C3 cellen werden overgebracht in een feeder-gecoate goed van een 6-well plaat (rechts). Herstel van de cel kan worden verbeterd door haar aan te vullen de LIF-3i medium met 5 µM Y-27632 zijn voor slechts één dag na dooi. Schaal bars = 200 µm. (B) verwijdering van MEF (en ook aanhangend TRA-negatieve gedifferentieerde cellen) in LIF-3i/MEF hPSC culturen door de pre plating-methode. Weergegeven zijn stroom cytometrische analyses voor en na de pre beplating van PE-geconjugeerde anti-TRA-1-81 en TRA-1-60 antilichamen, SSEA-4 APC-geconjugeerde antilichamen en SSEA-1/CD15 antistoffen aantonen van uitputting van TRA-1 antigeen negatieve en MEF cellen met behulp van de één uur durende pre plating methode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Karakterisering van pluripotent in LIF-3i/MEF N-hPSC culturen. (A) oppervlak en nucleaire pluripotent markeringen. Expressie van pluripotent factor NANOG in de dezelfde (isogene) TRA-1-81+SSEA4+ conventionele, primer koord bloed afkomstige hiPSC lijn E5C3 (p39) uitgebreid in primer (E8) of naïef LIF-3i (+ p8 in LIF-3i/MEF) voorwaarden. Immunefluorescentie vlekken van representatieve hPSC culturen op kamer dia's bleek de expressie van het uniform, nucleaire van de kern pluripotent factor NANOG in SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC gekweekte in primer, conventionele (E8 medium) of LIF-3i/MEF voorwaarden. Schaal bar = 100 µm. (B) westelijke vlekkenanalyse. STAT3 (links), ERK (midden) en bèta-ACTINE eiwit expressie voor een representatieve hPSC (lijn hESC/m H9) in conventionele (E8 medium) of LIF-3i/MEF voorwaarden (3i). (C) uitdrukking van naïeve pluripotent-geassocieerde transcriptiefactoren. STELLA/DPPA3, NR5A2 en TFCP2L1 getoond zijn met immunofluorescentie in een representatieve LIF-3i/MEF cultuur (koord bloed afkomstige hiPSC lijn E5C3 bij p33 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Schaal bar = 100 µm. (D) Teratoom testen van conventionele en LIF-3i-reverted hPSC. Validatie van functionele pluripotent in een isogene vertegenwoordiger hiPSC lijn (koord bloed afkomstige E32C6) gekweekt in beide E8 (p9) of LIF-3i/MEF (+ p12) door Teratoom assay. 10 x 106 cellen van isogene parallel-gekweekte conventionele, primer vs LIF-3i-teruggekeerd hPSC waren subcutaan geïnjecteerd in de ledematen van immunodeficiëntie NSG muizen. De Haematoxyline en eosine vlekken van Teratoom microsections geopenbaard robuuste differentiatie in alle drie lagen van de kiem met gestructureerde ectoderm (neurale rozet: NR, retinale gepigmenteerde epitheliam: RPE), mesoderm (chondroblasts: Ch), en endoderm (klierweefsel weefsel: GI) geslachten. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Vergelijking van functionele pluripotent tussen isogene primer en naïef. (A) schematische van strategie voor de beoordeling van de functionele pluripotent uit verschillende pluripotente Staten in isogene conventionele vs. LIF-3i gekweekte hPSC in onafhankelijke differentiatie protocollen. Weergegeven zijn twee hemato-vasculaire voorlopercellen differentiatie systemen (APEL enkelgelaagde en 3D embryoid (EB) lichaamssystemen) die eerder werkten te beoordelen van de potentie van de differentiatie van conventionele vs. LIF-3i-teruggekeerd in dezelfde lijn (isogene) hPSC gekweekt in parallelle post LIF-3i terugkeer met dezelfde passage nummers. LIF-3i-teruggekeerd hPSC lijnen vereisen geen een opnieuw aanzuigende stap vóór EB differentiatie en zijn onderworpen aan het differentiatie-protocol direct. (B) EB vasculaire voorlopercellen (VP) differentiatie systeem. Het EB 3D differentiatie systeem werkzaam voor deze studie was eerder beschreven17,18. De representatieve resultaten weergegeven zijn op dag 10 van EB differentiatie (linker panelen) voor isogene culturen van de dezelfde navelstrengbloed (CB)-afgeleid E5C3 hPSC lijn9, gekweekt in een conventionele hESC/MEF (Primed / MEF) voorwaarden of LIF-3i/MEF naïef voorwaarden. Stroom cytometry analyse van deze cellen EB Toon dramatische stijgingen van CD31+CD146+ VP populaties na LIF-3i terugkeer van de lijn van de E5C3 voorafgaand aan de differentiatie. Het histogram geeft de gemiddelde ±SD van CD31+CD146+ VP cel percentages ving op dag 10 in deze EB-systeem met behulp van drie isogene paren van onafhankelijke hPSC lijnen (dat wil zeggen, twee CB-hiPSC en een volwassene fibroblast afkomstige hiPSC, gestippelde lijnen verbinden isogene paren). Resultaten tonen aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de differentiatie van de VP in de EB-systeem over genetische achtergronden van meerdere hPSC lijnen. (C) APEL enkelgelaagde vasculaire voorlopercellen differentiatie systeem. Conventionele (primer E8) en LIF-3i-teruggekeerd hPSC kunnen rechtstreeks gedifferentieerde met dezelfde kweekomstandigheden, groeifactoren, cytokines en kleine moleculen van de stapsgewijze APEL endothelial differentiatie protocol 3, 16. getoond zijn onafhankelijke APEL differentiatie experimenten met behulp van de E5C3 koord bloed afkomstige hiPSC lijn, en het percentage van CD31+CD146+ vasculaire voorlopercellen risicopopulaties dag 7 van APEL differentiatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De LIF-3i-systeem geldt een gewijzigde versie van de klassieke lymfkliertest 2i naïef terugkeer cocktail1 voor menselijke pluripotente stamcellen. De zelf-vernieuwing van hPSC (die kan niet uitbreiden in 2i alleen) is gestabiliseerd in LIF-2i beogen deze cocktail met XAV939 van de tankyrase-remmer. LIF-3i cultuur kunt bulk en efficiënte terugkeer van de conventionele hPSC naar een toestand van de pluripotente die lijkt op de menselijke voor inplanting epiblast3. Hoewel de mechanismen van de actie van XAV939 in hPSC waarschijnlijk complex zijn en synergetische met 2i, ze waarschijnlijk ook op een minimum, een belangrijk stabilisatie en vergroting van hPSC zelf-vernieuwing via WNT signaling pathways3.
Conventionele hPSC culturen nemen normaal een spectrum van pluripotente Staten met een zeer variabele lineage-primer gene uitdrukkingen en na implantatie epiblast epigenetische merken dat leiden inconsistente of verminderde functionele pluripotent2 tot kunnen . Dit inherente lineage priming van conventionele hPSC culturen kan ook interfereren met de succesvolle terugkeer van de LIF-3i van sommige hPSC lijnen2. Echter de opneming van de eerste LIF-5i aanpassing stap (tabel 1) in de LIF-3i-methode universeel verruimt de efficiëntie van LIF-3i terugkeer onder een veelheid van hPSC lijnen en bevordert bulk naïef terugkeer van conventionele hPSC lijnen op een wijze die omzeilt vervelend plukken en het subcloning van zeldzame naïef-teruggekeerd kolonies, of de noodzaak voor het gebruik van routine anti-apoptotic moleculen te stabiliseren hun levensvatbaarheid.
De LIF-5i/LIF-3i naïef terugkeer methode is in een breed scala aan hESC en hiPSC lijnen kunnen worden gereproduceerd. Het vereist minimale opleiding met fundamentele cel cultuur vaardigheid. Zimmerlin et al. deze sequentiële strategie om terug te keren met succes werkzaam > 30 onafhankelijke hESC en hiPSC transgenic-vrije lijnen uit een brede waaier van donoren 3. Één passage in LIF-5i (Figuur 1) is voldoende voor de meeste hPSC lijnen te ondergaan efficiënte naïef terugkeer in bulk hPSC culturen, en verder hun latere stabiele onderhoud en de uitbreiding in LIF-3i alleen.
Bovendien, de LIF-3i/MEF systeem ondersteunt robuuste bulk klonale uitbreiding efficiëntie gedurende alle de stappen tussen conventionele hPSC lineage-primer cultuur helemaal tot voltooide naïef-achtige hPSC terugkeer (dwz., aanpassing, overgang en uitbreiding voor 7 – 10 passages in LIF-3i/MEF alleen). Hoewel de huidige formulering van deze cultuur systeem feeder steun vereist, is een eenvoudige en betaalbare methode om afbrekende feeders door de techniek van de pre beplating voor analyse van LIF-3i culturen (Figuur 2) gepresenteerd.
Meerdere andere cultuur systemen zijn ook gemeld om conventionele hPSC aan soortgelijke naïef-achtige pluripotente stelt2. Hoewel deze hPSC cultuur systemen hebben ook vertrouwd over het gebruik van de klassieke muis naïef 2i voorwaarden, in de meeste gevallen deze passaging methodes van eencellige ook vereist extra chemische modulatie voor het stabiliseren van een inherent unstable / metastabiele menselijke naïef staat. Nog belangrijker is, de meeste van deze andere methoden aangetoond dat verminderde functionele pluripotent na differentiatie en/of verworven abnormale epigenomic stempelt of karyotypes2. Hoewel de opkomst van abnormale karyotypes binnen de conventionele primer hPSC culturen al goed is gedocumenteerd19, verlengd, enzymatische eencellige passaging methoden die regelmatig werkzaam zijn in de meeste naïef terugkeer methoden. Dit is ook aangetoond dat het versterken van de generatie van abnormale chromosomale configuraties20,21; meer gevoelige technieken (bijvoorbeeld kopie aantal variaties, single nucleotide polymorphism) kunnen aanvullende wijzigingen22,23openbaren.
In tegenstelling, een breed repertoire van LIF-3i-teruggekeerd hPSC lijnen werden bevestigd te bezitten van de normale karyotypes op laag-medium passages (bijvoorbeeld p5-p15), en ook bij hoge passage getallen (bijv., > p30) na LIF-3i cultuur3. Bovendien werden epigenomic opdrukken in LIF-3i-teruggekeerd hPSC reproducibly normale en intact gevonden bij 5 – 10 passages post LIF-3i terugkeer2. Met behulp van de gevoelige allele-specifieke commerciële methylering matrix platform, werd eerder aangetoond dat CpG methylering merken ingeprinte loci voor een breed repertoire van LIF-3i-teruggekeerd hPSC lijnen (de volgende 4 – 7 passages in LIF-3i) bleken te zijn grove normal in structuur1. Aangezien abnormale genomic opdrukken en karyotypes kunnen uiteindelijk afbreuk doen aan de functionele capaciteit van hPSC, werden vereiste richtsnoeren geschetst in dit protocol dat onderzoekers stimuleert te valideren hPSC culturen vóór en na de naïeve terugkeer, using zulks methode evenals anderen.
De methode LIF-3i verbeterd functionele pluripotent over kiem lagen in een groot repertoire van hESC en niet-transgene hiPSC lijnen (Figuur 3). In tegenstelling tot andere naïef terugkeer protocollen, de LIF-3i methode doet niet vergen een opnieuw aanzuigende stap voor verdere differentiatie van N-hPSC (dat wil zeggen, N-hPSC terug omzetten in conventionele primer voorwaarden voorafgaandelijk aan het gebruik ervan in regie differentiatie testen). LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC aanzienlijk efficiënter differentiatie capaciteiten dan hun tegenhangers isogene conventionele hPSC weergeven in zowel Teratoom assays (Figuur 3D), en geregisseerd differentiatie protocollen van lineages van alle drie lagen van de kiem2. Als gevolg van assay-afhankelijke en interline variaties in functionele testen van conventionele hPSC, geslacht-specifieke differentiatie moet worden geëvalueerd aan de hand van onafhankelijke gestuurde differentiatie protocollen en hPSC afgeleid van meerdere genetische achtergronden. Met behulp van zorgvuldige experimenteel design, een breed scala aan hPSC lijnen naar verwachting een aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van hun multilineage differentiatie ten opzichte van hun isogene conventionele tegenhangers na 4-10 passages in LIF-3i voorwaarden.
Kortom, deze methode snel en klonaal breidt het aantal menselijke PSC, verbetert de efficiency van hun downstream differentiatie, verhoogt de bloedlijn-begaan progenitor cel nummers na differentiatie en dalingen interline variabiliteit onder conventionele, lineage-primer hPSC lijnen. Deze N-hPSC met verbeterde functionaliteit wellicht verder een brede uitstraling voor hun potentiële bijdrage van functionele tissues aan een zich ontwikkelende embryo. Stabiele N-hESC kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor het ontwikkelen van transplanteerbare organen en volwassen stamcellen in het ontwikkelen van dierlijke Chimaera, of voor het genereren van gehumaniseerd gen-gerichte diermodellen van ziekte. De verdere optimalisering van deze tankyrase-remmer-met behulp van LIF-3i methode in gedefinieerd feeder-vrije GMP-conforme kweekomstandigheden vergemakkelijkt efficiënte klinisch nuttig generatie van een breed scala aan functionele en engraftable celtypes voor therapeutisch gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Onder een licentie-overeenkomst tussen de technologieën van het leven en de Johns Hopkins University (JHU), heeft Dr. Zambidis recht op een deel van de royalty's, ontvangen door de Universiteit voor licentiëring van stamcellen. De bepalingen van deze overeenkomst worden beheerd door JHU overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling. Dit neemt niet weg dat de naleving van de auteurs dagboek beleid over het delen van gegevens en materialen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland stamcel onderzoeksfonds (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award en de Moseley Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
References
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
- Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
- Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
- Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
- Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
- Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
- Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
- Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
- Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
