Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kemiska återgång av konventionella mänskliga pluripotenta stamceller till en naiv-liknande tillstånd med förbättrad Multilinjärt differentiering potens

Published: June 10, 2018 doi: 10.3791/57921
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar ett protokoll för effektiv, bulk och snabba kemiska återgång av konventionella härstamning-primade mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) in i en epigenomically-stabil naiva preimplantatorisk epiblast-liknande pluripotenta tillstånd. Denna metod resulterar i minskad härstamning-primade genuttryck och markant förbättring i riktad Multilinjärt differentiering över en bred repertoar av konventionella hPSC linjer.

Abstract

Naiva mänskliga pluripotenta stamceller (N-hPSC) med förbättrad funktionalitet kan ha en bred inverkan inom regenerativ medicin. Målet med detta protokoll är att effektivt återställa härstamning-Primas, konventionella mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) underhålls på antingen feeder-fri eller feeder-beroende förhållanden till en naiv-liknande pluripotency med förbättrad funktionalitet. Denna kemiska naiva reversion metod sysselsätter den klassiska leukemi hämmande faktorn (LIF), GSK3β, och MEK/ERK hämning cocktail (LIF-2i), kompletterat med endast en tankyrase hämmare XAV939 (LIF-3i). LIF-3i återgår konventionella hPSC till en stabil pluripotenta staten att anta biokemiska, transkriptionell och epigenetiska funktioner i det mänskliga preimplantatorisk epiblast. LIF-3i metoden kräver minimal cell kultur manipulation och är mycket reproducerbara i en bred repertoar av mänskliga embryonala stamceller (hESC) och transgenens-fri mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) linjer. LIF-3i metoden kräver inte ett nytt priming steg före differentiering; N-hPSC kan göras åtskillnad mellan direkt med extremt hög effektivitet och upprätthålla karyotypic och epigenetisk stabiliteter (inklusive på imprinted loci). För att öka metoden universalitet, konventionella hPSC odlas först i LIF-3i cocktail kompletterat med två extra små molekyler som potentierar proteinkinas en (forskolin) och sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signalering (LIF-5i). Detta kort LIF-5i anpassning steg avsevärt förbättrar den ursprungliga klonal expansionen av konventionella hPSC och tillåter dem att vara därefter naiva-återgått med LIF-3i ensam i stora kvantiteter, därmed undanröja behovet av plockning/subkloning sällsynta N-hPSC kolonierna senare. LIF-5i-stabiliserad hPSCs underhålls därefter i LIF-3i ensam utan behov av anti-apoptotiska molekyler. Viktigast av allt, förbättrar LIF-3i reversion markant den funktionella pluripotency av en bred repertoar av konventionella hPSC genom att minska deras härstamning-primade genuttryck och radera interline variabilityen av riktad differentiering vanligen observerats bland oberoende hPSC linjer. Representativa karakteriseringar av LIF-3i-återgått N-hPSC är ges samt experimentella strategier för funktionella jämförelser av syngena hPSC härstamning-primade vs. naiv-liknande staterna beskrivs.

Introduction

2i (MEK/ERK och GSK3β hämmare) kultur systemet utvecklades ursprungligen för att förfina heterogena serum-baserade mus embryonala stamceller (mESC) kulturer till en enhetlig grundtillståndet hos pluripotency besläktad med musen preimplantatorisk epiblast1. 2i stöder dock inte stabil upprätthållandet av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) linjer2. De olika komplexa liten molekyl, tillväxtfaktor-kompletteras, och transgena metoder har nyligen rapporterats att fånga förment liknande mänskliga naiva-liknande pluripotenta molekylär påstår2. Dock många av de ”naiva-liknande” staterna skapade med dessa metoder också uppvisade karyotypic instabilitet, epigenetisk defekter (t.ex. global förlust av föräldrarnas genomisk prägling) eller nedsatt differentiering potentiella.

I kontrast, cocktailen av triple kemiska hämning av GSK3β, ERK och tankyrase signalering och leukemi hämmande faktor (LIF-3i) var tillräckligt för den stabila naiva-liknande återgången av en bred repertoar av konventionella hPSC rader3. LIF-3i-återgått naiva hPSC (N-hPSC) underhålls normalt karyotypes och ökade deras uttryck av naiva-specifika mänskliga preimplantatorisk epiblast gener (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i återgång också hPSC med en rad molekylära och biokemiska egenskaper som är unika för mESC-liknande naiva pluripotency som inkluderade ökad fosforyleras STAT3 signalering, minskade ERK fosforylering, globala 5-metylcytosin CpG hypometylering, genome-wide CpG demetylering på embryonala stamceller (ESC)-specifik gen promotorer och dominerande distala OCT4 enhancer användning. Dessutom, i jämförelse med andra naiva reversion metoder som resulterade i aberrantly hypometylering präglade genomisk loci, LIF-3i-återgått N-hPSC var saknar systematisk förlust av präglade CpG mönster eller förlust av DNA methyltransferase uttryck (t.ex. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

En direkt LIF-3i kultur av ett brett utbud av konventionella mänskliga embryonala stamceller (hESC) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) odlas på antingen matare eller E8 feeder-fria villkor uppnås snabba och bulk återgång till en naiv epiblast-liknande tillstånd. Direkta LIF-3i naiva återgång kan dock ineffektiv i vissa instabila konventionella hPSC linjer på grund av de inneboende genomisk och härstamning-primas variabilitet som härrör från den genetiskt olika givare bakgrunden.

Således, för att bredda nyttan av metoden LIF-3i, en stegvis optimering utvecklades och presenteras häri, som tillåter universell naiva återgång med nästan alla konventionella hESC eller transgenens-fri hiPSC linje odlade på matare. Denna universalized naiv reversion metod sysselsätter ett övergående initiala kultur steg i konventionella hPSC som kompletterar den LIF-3i cocktailen med två ytterligare små molekyler (LIF-5i) som potentierar proteinkinas en (forskolin) och sonic hedgehog (sHH) ( purmorphamine) signalering. En första passage av konventionella hPSC i LIF-5i anpassar dem till efterföljande stabil LIF-3i återgång i stora kvantiteter. Första LIF-5i anpassning avsevärt förstärker den inledande enda cell klonala spridningen av konventionella hPSC odlas på E8 eller matare (före deras efterföljande stabil, kontinuerlig passage i LIF-3i ensam). Konventionella hPSC linjer anpassas först tolerera till en passage i LIF-5i efterföljande bulk klonal passaging av naiva-återgått celler i LIF-3i villkor, vilket undanröjer behovet av plockning och subkloning av sällsynt stabil kolonierna, eller rutinmässig användning av anti-apoptotiska molekyler eller Rho-associerade (ROCK) proteinkinashämmare.

Metoden LIF-3i har lyckat använts att stabilt expandera och underhålla en bred repertoar av > 30 oberoende, genetiskt-diverse konventionella hPSC linjer för > 10 – 30 passager med antingen icke-enzymatiska eller enzymatisk dissociation metoder, och utan tecken på induktion av kromosomala eller epigenetisk avvikelser, inklusive avvikelser på imprinted gen loci. Dessutom sekventiell LIF-5i/LIF-3i kultur är bara naiv reversion metod som hittills har rapporterats som förbättrar den funktionella pluripotency av en bred repertoar av konventionella hPSC linjer genom att minska deras härstamning-primade genuttryck och dramatiskt förbättra sin multipotenta differentiering potens. LIF-3i naiva reversion metod raderar de inneboende interline variabilitet differentiering av härstamning-Primas, konventionella hPSC linjer, och kommer att ha en stor nytta av ansökan inom regenerativ medicin och cellulära behandlingar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur förfaranden utfördes i enlighet med djurvård riktlinjer och protokoll som godkänts av Johns Hopkins skola av medicin Institutet för djurens vård och användning kommittén (IACUC).

1. beredning av mus embryonala fibroblaster (MEF) för Feeder-beroende konventionella (hESC medium/MEF) eller naiv-återgått (LIF-3i medium/MEF) hPSC kultur

  1. Köpa eller laga egen låg-passage leveranser av MEF matare från CF1 eller CF1 x DR4 hybrid E13.5 musembryon efter publicerade protokoll4.
    1. Frysa låg passage (p1-p2) MEF kulturer före (för långtidslagring) eller efter (för upp till 6 månader) strålning och förvaras i flytande kväve som tidigare beskrivs4.
    2. Bestråla (5.000 rad) bulk utökade MEF under p5 med hjälp av en γ - eller X-stråle-irradiator och förbereda alikvoter 1,5 x 106 celler per injektionsflaska för kortsiktig lagring (mindre än 6 månader) vid-80 ° C i en ultra-låg temperatur frys.
    3. Plåt mellan 1,2 x 106 (nymalen bestrålade icke-i fryst tillstånd) och 1,5 x 106 (bestrålade i fryst tillstånd) MEF per en 6-väl gelatinized platta för att förbereda feeder kulturer, som beskrivs nedan.
  2. Förbereda gelatin-belagd 6-väl steril vävnadsodling-behandlade plattor genom att lägga 1,5 mL steril 0,1% gelatin lösning till varje brunn i biologiska säkerhetsdragskåp.
  3. Inkubera gelatin-belagda plattorna vid 37 ° C i minst 1 tim eller över natten i ett laboratorium CO2 inkubator.
  4. Nästa dag, Tina låg passage (t.ex. P2 till P4) DMSO-i fryst tillstånd och bestrålat (5.000 rad) MEF enligt steg som anges nedan.
    Obs: Icke-bestrålade MEF bör också vara tinade, expanderat och bestrålade omedelbart före användning.
  5. Placera en nedfrysta MEF alikvot i 37 ° C vattenbad. Vid upptining, sterilisera röret med etanol och omedelbart späder den DMSO frysskyddmedel minst 10-faldig med MEF medium (tabell 1) inom en biosäkerhet skåp (e.g. överför 1 mL DMSO-MEF alikvot till 9 mL MEF medium i en steril 15 mL koniska).
  6. Centrifugera utspädda MEF cellerna vid 200 x g i 5 min i steril 15 mL koniska rör.
  7. I en biosäkerhet skåp, aspirera och avlägsna cellfria supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 – 2 mL färsk MEF medium.
  8. Försiktigt kasta gelatin lösningen och tillsätt 2 mL av MEF åter upphängd i MEF medellång till varje brunn gelatinized 6-well platta, som anges ovan. Räkna MEF celler och plattan 1,2 x 106 (nymalen bestrålade icke-i fryst tillstånd) eller 1,5 x 106 (bestrålade i fryst tillstånd) MEF per en 6-väl gelatinized platta.
    Obs: Alla cell kultur plattor som överförs från CO2 inkubatorn till biosäkerhet skåp kan torkas försiktigt med etanol-besprutas papper men bör inte direkt sprutas på med 70% etanol lösningen för att undvika etanol spridning i brunnarna.
  9. Inkubera MEF plattorna vid 37 ° C över natten i ett laboratorium CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär) för att möjliggöra fastsättning, före användning.

2. bulk stabilisering av konventionella hPSC kulturer för efterföljande naiva återgång med en kort LIF-5i anpassning steg

  1. Validera alla konventionella hPSC rader för innehav av en normal karyotyp av G-bandning, före början LIF-5i/LIF-3i återgång.
    Obs: LIF-3i återgång av hög-passage konventionella hPSC linjer (t.ex., P > 40 – 50) bör undvikas, eftersom dessa kulturer redan kan hysa genomiska avvikelser som kan negativt påverka stabil, effektiv och bulk LIF-3i återgång av Primas, convetional hPSC linjer.
  2. Upprätthålla och öka konventionella hPSC kulturer med validerade normala karyotypes i antingen en MEF-baserade kultur (som beskrivs i avsnitt 1), eller feeder-fri kultur filsystem (enligt prövarens preferens).
    Obs: Båda feeder-beroende hPSC/MEF cocultures (t.ex. hESC medium (tabell 1) kompletteras med 4 – 10 ng/mL bFGF) eller feeder-fri (t.ex., E8 5 eller mTSER 6 media (enligt tillverkarens anvisningar på Aktiebolaget Trav & galopp-belagda plattor) metoder är kompatibla med bulk naiva återgång med LIF-5i/LIF-3i/MEF systemet (figur 1). Icke-enzymatiska metoder är att föredra för den passaging av konventionella hPSC före förbereda dem för återgång. LIF-5i och LIF-3i media formuleringar innehåller inte antibiotika eller svampdödande medel. Standarddrift regler för biosäkerhet skåp sterilitet och underhåll förväntas följas strikt för att undvika bakterie- eller svampinfektioner.
  3. För systemets MEF-baserat kultur, förbereda MEF matare i gelatinized 6-väl plattan som beskrivs i avsnitt 1 minst en dag innan passaging av LIF-5i-anpassad konventionell hPSC kulturer.
  4. När konventionella hPSC kulturer har nått ~ 50% konfluens (dvs. 3 – 5 dagar efter inledande plätering), ersätta standard hESC odlingssubstratet med LIF-5i medium (2 mL per väl; (Se tabell 1).
    Obs: Utför dessa steg i en biosäkerhet skåp.
  5. Kultur och upprätthålla konventionella hPSC/MEF för upp till 2 dagar i LIF-5i i CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär). Ändra det LIF-5i-mediet dagligen för att anpassa dem för deras efterföljande passage och stabil återgång i LIF-3i.
  6. Alternativt, för den feeder-fri konventionella kulturer (t.ex., i E8), kultur hPSC i LIF-5i bara över natten innan passaging nästa morgon.
    Obs: LIF-5i och LIF-3i kulturer kan både underhållas med antingen atmosfärisk (21% O2) eller fysiologiska (5% O2) syre nivåer i CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär).
  7. Före passaging, placera kultur plattorna i en biosäkerhet skåp, tvätta LIF-5i-anpassad konventionell hPSC en gång med PBS och tillsätt 1 mL av cell dissociation reagensmedel till varje brunn. Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C i en CO2 inkubator och pulverisera försiktigt med en pipett till en enda cellsuspension tillbaka i biosäkerhet skåp.
    Obs: Icke-enzymatiska dissociation buffertar kan alternativt användas för att förbereda enstaka celler för passaging.
  8. Samla cellsuspensionen i hESC medium (minst 2-faldig utspädning) i en steril 15 mL koniska rör, och försiktigt pulverisera celler genom att hämta en enda cellsuspension med.
  9. Centrifugera vid 300 x g i 5 min, aspirera/Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 – 2 mL av LIF-5i medium i biosäkerhet skåp. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatisk cell räknare.
  10. Tvätta före guldpläterade MEF plattan två gånger med PBS (2 mL per brunn i 6-väl plattor) och fördela 1 – 2 x 106 celler (i 2 mL LIF-5i medium) på 1 väl av PBS-tvättade MEF plattan.
  11. Justera och optimera inledande plätering densiteter för varje enskild hPSC rad vara naiv-återgått, som replating effektivitet kan vara mycket varierande. Placera plattan i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär).
    Obs: Rutinmässig användning av anti-apoptotiska reagenser rekommenderas inte för de flesta hPSC linjer med denna metod. LIF-5i systemet redan avsevärt förbättrar inledande bulk klonal åter bordläggningen effektivitetsvinsterna av konventionella hPSC linjer. Dock en engångsbruk av ROCK-hämmare (5 – 10 μM Y-27632) kan ytterligare effektivisera inledande LIF-5i klonal åter förkromning av konventionella hPSC kulturer i första passage för vissa instabila härstamning-primas hPSC rader med benägenheten för spontana differentiering.
  12. Om start från feeder-fri kulturer (t.ex., E8), direkt överföra en väl av den dissocierade konventionella hPSC anpassas i LIF-5i i bestrålade en MEF-plated väl (dvs., 1:1 passage).
  13. Nästa dag, snurra försiktigt plattan att lyfta alla grupplösa celler, aspirera medium (PBS wash är valfritt) och ersätta med 2 mL av LIF-5i medium. Utför det här steget om du i en biosäkerhet skåp dagligen i 3 – 5 dagar eller tills cellerna är 60 – 70% konfluenta (figur 1). Placera plattan i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär).

3. varaktigt underhåll och utvidgning av N-hPSC i LIF-3i Medium

  1. Efter första LIF-5i anpassning, passage efterföljande stabil LIF-3i kulturer var 3 – 4 dagar i en biosäkerhet skåp eller när kulturer blivit 60 – 70% konfluenta (figur 1).
    Obs: LIF-3i kulturer kräver rigoröst underhåll och låta N-hPSC kulturer att nå hög konfluens/cell densiteten från långvarig kultur (t.ex., > 4 dagar) minskar efterföljande klonal åter bordläggningen effektiviteten, och främjar spontana differentiering.
  2. I en biosäkerhet skåp, kasta odlingsmediet och tvätta vart väl av LIF-5i/LIF-3i kulturer genom att försiktigt tillsätta 2 mL PBS. Kassera PBS och tillsätt 1 mL cell avlossning lösning. Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär).
  3. Samla cellsuspension, lägga till hESC medium (utan hämmare eller tillväxtfaktorer (tabell 1), minst 2-faldig utspädning) att återhämta sig alla hPSC och försiktigt pulverisera celler genom att hämta en enda cellsuspension med. Överför till en steril 15 mL koniska rör.
  4. Centrifugera vid 300 g i 5 min och aspirera/Kassera supernatanten. Återsuspendering cellpelleten i LIF-3i medium. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatisk cell räknare.
  5. Plattan ~ 2 x 105 celler per brunn på de bestrålade MEF i gelatinized 6-väl plattan för rutinmässig passaging av LIF-3i kulturer. För de första LIF-5i-anpassade kulturerna, tallrik en initialt högre densitet (4 x 105 celler per brunn) före första passagen in i LIF-3i/MEF.
  6. Ny plåt och fördela LIF-5i-anpassad hPSC på färska PBS-tvättade bestrålade MEF feeder plattor (förberedd föregående dag som ovan) i LIF-3i medium. Ersätta det LIF-3i mediet dagligen.
  7. Passagen N-hPSC för minst 4 – 7 kontinuerlig bulk passager i den LIF-3i medelstora före användning av N-hPSC i funktionella studier eller frysförvaring. Registrera antalet passager av N-hPSC i antingen konventionell eller LIF-3i media.
    Obs: LIF-3i återgång av hög-passagen (t.ex. > p40) härstamning-Primas, konventionella hPSC linjer rekommenderas inte. Ett försök göras att återgå konventionella hPSC linjer på lägsta möjliga passage att de är tillgängliga. Dessutom rekommenderas inte användning av LIF-3i-återgått hPSC som genomgått större än 10 LIF-3i passager för funktionella studier, eftersom sådana N-hPSC kulturer kan hysa karyotypiskt-onormala kloner på grund av långvarig klonal cellmarkeringen kultur. Färsk LIF-5i/LIF-3i återgångar låg-passage konventionella hPSC linjer bör utföras för funktionella studier, om lager av N-hPSC med < 10 passager i LIF-3i är inte tillgängliga.

4. frysförvaring och upptining av LIF-3i-återgått N-hPSC

  1. Expandera reverted N-hPSC för minst 5-7 passager i LIF-3i, enligt ovan, före användning i funktionella studier eller långsiktiga frysförvaring. Registrera antalet passager i konventionella villkor och i LIF-3i villkor på injektionsflaska nedfrysta.
    Obs: Överskott LIF-3i-återgått N-hPSC inte används i funktionella analyser kan vara nedfrysta på varje passage, men frysning av lägre efter återgång passager (e.g., < p3) kan resultera i dålig eller mycket varierande efter blidvädret återhämtning effektivitetsvinster.
  2. I en biosäkerhet skåp, aspirera odlingsmediet, tvätta cellerna i PBS (2 mL per brunn), aspirera PBS och separera hPSC kolonier i enstaka celler använder cell avlossning lösning (1 mL per brunn). Placera plattan i 5 minuter vid 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär). Späd cell avlossning lösningen med LIF-3i medium (2-faldigt), samla hPSC i en steril 15 mL konisk, Centrifugera celler vid 200 x g i 5 min och återsuspendera cellpelleten i LIF-3i medium (1 – 2 mL per brunn-ekvivalenter). Räkna antalet celler som använder en hemocytometer eller en automatisk cell räknare.
  3. Centrifugera N-hPSC i LIF-3i medium (200 x g för 5 min) och resuspendera cellerna i ett biosäkerhet skåp i frysning lösningen (tabell 2), med en täthet på minst 1 x 106 celler/mL.
  4. Överföra celler in i långsiktig lagring kryogen rören och placera i en långsam frysning behållare. Kan proverna att frysa över natten i-80 ° C frys.
  5. Nästa dag, över cryovials till en flytande kväve frys för långsiktig lagring.
  6. För upptining, Placera injektionsflaskan fryst i 37 ° C vattenbad för ~ 2 min. Sterilize injektionsflaskan (dvs etanol spray), överför hPSC i en steril 15 mL koniska och långsamt späd cellerna 10-faldig i hESC medium (tabell 1) kompletteras med 5 μM av Rho-associerade (ROCK) proteinkinashämmare Y-27632 inom en steril biologisk säkerhet huva skåp.
  7. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter. I en biosäkerhet skåp, kassera cellfria supernatanten och återsuspendera cellpelleten i LIF-3i medium (1 – 2 mL) kompletteras med 5 μM ROCK hämmare Y-27632.
    Obs: Uteslutning av Y-27632 kommer att resultera i dålig efter upptining återhämtning effektivitetsvinster (figur 2).
  8. Överföra de upptinade celler resuspended i LIF-3i/ROCK-hämmare på PBS-tvättade MEF-plated brunnarna. Frysa LIF-3i kulturer med en täthet på 1 x 106 celler per injektionsflaska. Tina var och en av dessa flaskor på matare i en väl gelatinized 6-bra platta.
  9. Nästa dag starta regelbundna LIF-3i medium expansion utan Rho tyrosinkinashämmare.

5. mataren borttagning för N-hPSC provtagning

  1. Att förbereda prover från LIF-3i/MEF (eller hESC/MEF konventionella) kulturer (dvs.för genernas uttryck (t.ex. kvantitativ RT-PCR, microarrays) eller protein (t.ex. Western blot) analyser, bryter ned LIF-3i kulturer från MEF matare med hjälp Magnetiska aktiverad Cell sortering (Mac) med anti-TRA-1-81 antikropp belagd mikrokulor enligt tillverkarens protokollet.
  2. Alternativt kan du utnyttja följande enkla före plätering metod för att tömma kulturer matare, som beskrivs nedan.
  3. I en steril biologisk säkerhet huva skåp, Kassera supernatanten cellfria, tvätta pelleten med 2 mL steril PBS per brunn. Lossa fastsittande LIF-3i/MEF kulturer använder cell avlossning lösning (1 mL per brunn). Inkubera i 5 min i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär). Samla hPSC i en steril 15 mL konisk. Tvätta 2 gånger i hESC medium, överföring celler in i sterila 15 mL koniska och centrifugera vid 200 x g under 5 minuter.
  4. I en biosäkerhet skåp, återsuspendering varje brunn av LIF-3i/MEF separerade celler i 2 mL av LIF-3i medium och direkt överföra till en ny brunn 6-well platta som har varit färska belagd med 0,1% gelatin.
  5. Inkubera LIF-3i/MEF hPSC celler för 1 h vid 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfär). Samla in icke-anhängare celler med en pipett i en ny konisk tub. Försiktigt och tillsätt 2 mL av hESC medium till varje brunn och snurra för att samla in de återstående icke-anhängare cellerna.
    Obs: Majoriteten av de bestrålade MEF fäster vid gelatinized plattan i 1 h, lämnar majoriteten av hPSC i suspension.
  6. Kombinera och centrifugera celler vid 300 x g i 5 min. tvätta i PBS. Snapin-frysa cellpelleten i flytande kväve efter centrifugering eller alternativt återsuspendering pellets i en lysing buffert som är kompatibel med nedströms protein eller nukleinsyra analysen (figur 2B).
  7. Utföra karakteriseringar av LIF-3i hPSC linjer med en matchande konventionella primade syngena hPSC kontroll.
    Obs: På grund av inneboende variabilitet mellan och inom primade kulturer, relevanta kontroller är beredda på en matchande tidpunkt i kultur eller före naiva återgång. Detaljerade protokoll och material för nedströms Immunofluorescerande bioimaging, flow flödescytometri, Western blotting, genuttryck (RT-PCR-analyser och microarrays), metylering studier (dot blot, CpG metylering microarray), OCT4 proximala och distala enhancer predominance reporter analyser och signalering hämmare analyser tillhandahålls någon annanstans3.

6. bokför naiva återgång: validering av genomisk integritet och Retention av föräldrars avtryck av LIF-3i-återgått N-hPSC före användning i funktionella analyser

  1. Skärmen start grundmålade, konventionella hPSC kulturerna för innehav av en normal karyotyp (t.ex., med Giemsa-band färgning analys använder publicerade metoder 7) innan du inleder LIF-5i/LIF-3i återgång.
    Obs: Detta är att eliminera konventionella hPSC populationer som kan hysa onormal genomiska förändringar som kan driva tingsliga selektiv överlevnadsfördel i klonal LIF-3i villkor.
  2. För optimalt resultat, nymalen återgå konventionella hPSC kulturer till en naiv-liknande tillstånd med LIF-3i flera veckor före deras användning i funktionella studier eller regi differentiering.
    Obs: Rutin långvarig '' underhållskultur i LIF-3i villkor för mer än 10 passager följande naiva återgång inte rekommenderas. Rutinmässiga utbyggnad och underhåll av hESC och hiPSC linjer bör utföras med konventionella kultur system (t.ex. i E8 eller MEF/hESC medium med bFGF).
  3. Bedöma efter reverted N-hPSC linjer för bibehållande av normal karyotypes 5 – 7 passager efter LIF-3i återgång (t.ex., med Giemsa-band färgning analys7eller någon annan metod för val).
  4. Bedöma alla reverted N-hPSC rader för bevarande av normal faderlig genomisk avtryck av en DNA-metylering analys av val (t.ex., protokoll för CpG DNA microarray-analys av föräldrars avtryck i LIF-3i-återgått N-hPSC tillhandahålls någon annanstans3 ) efter 5 – 10 passager av LIF-3i reversion.

7. post naiva återgång: Experimentell Design riktlinjer för kvantitativa riktad differentiering analyser med LIF-3i-återgått N-hPSC

  1. Direkt utnyttja LIF-3i N-hPSC i etablerade riktad differentiering protokoll utan ytterligare cell kultur manipulationer.
    Obs: Nytt priming (dvs konvertera N-hPSC tillbaka till konventionella primade villkor innan deras användning i riktad differentiering analyser) är inte nödvändigt med metoden LIF-3i och rekommenderas inte.
  2. Att kontrollera för effekterna av analysen och interline variabilitet i funktionsprovning av enskilda hPSC linjer, cross-validera de härstamning-specifika differentiering potenser genom att anställa oberoende differentiering protokoll med minst tre hPSC linjer härrör från oberoende genetiska bakgrunder (dvs flera givare-härledda hiPSC och hESC).
  3. För funktionella jämförelser, ställa in syskon kulturer, motsvarande passage nummer, och från samma (syngena) hPSC linje parallellt med de konventionella härstamning-primade och LIF-3i-återgått hPSC kulturer. Upprätthålla primas/naiv syskon syngena hPSC kulturer i deras respektive media (t.ex., E8 vs. LIF-3i), och samtidigt skilja använda identiska differentiering protokoll och material, för att eliminera någon experimentella bias (figur 4).
  4. För syngena primas jämfört naiv hPSC jämförelser, justera och optimera inledande plätering densiteter för varje individuell differentiering assay.
    Obs: Detaljerade protokoll för neurala stamceller, slutgiltiga endoderm och hemato-endothelial riktad differentiering av LIF-3i-återgått N-hPSC tillhandahålls någon annanstans 3. LIF-3i-återgått N-hPSC har mer robust proliferation och differentiering kapacitet i riktad differentiering analyserna än konventionella hPSC. N-hPSC kräver vanligtvis en lägre inledande plätering koncentration än den konventionella hPSC, och till skillnad från deras konventionella primade hPSC motsvarigheter, kräver inte användning av anti-apoptotiska reagenser till förbättra deras klonal överlevnad efter enzymatisk rötning i differentiering analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll optimerar effektiv naiva-liknande återgång med LIF-3i i båda feeder-beroende och oberoende av mataren härstamning-primade konventionella hPSC kulturer (figur 1). Det detaljerade protokollet, beskrivs häri, konturer sekventiell anpassning till LIF-3i start från antingen feeder-beroende eller feeder-fri konventionella hPSC villkor (t.ex. E8 medium).

Representativa resultat för LIF-3i återgången av flera konventionella hESC och transgenens-fri hiPSC linjerna presenteras i figurerna 1 – 3. Dessa typiska resultat kan valideras med kommersiellt tillgängliga hESC linjen H9, eller med en kommersiellt tillgänglig transgenens-fri, sladd blod-derived episomal hiPSC linje (6,2) härrör i Zambidis laboratorium8,9. Införandet av ett första LIF-5i anpassning steg tillåter högeffektiva efterföljande, bulk klonala förökningen av konventionella hPSC kulturer i LIF-3i, och kräver inte anti-apoptotiska agenter eller ROCK-hämmare10 (figur 1A, B ). Flera plåtar av naiva-liknande hPSC prover kan tas snabbt för nedströms analyser eller multilineage regi differentiering bara efter 5 – 7 passager i LIF-3i. Alternativt, LIF-3i kulturer kan förvaras i fryst tillstånd framtida tillämpningar. Efter upptining cell återhämtning kan vara förbättrad (figur 2) via införandet av en ROCK-hämmare i frysförvaring och efter Tina media11.

Bestämningsfaktorerna av molekylära och funktionella pluripotens, både in vitro- och i embryot var nyligen granskade2. Dessa faktorer inkluderar genetiska bakgrund, kultur-associerade förvärv av mutationer för viktig utvecklingsmässiga gener, och skillnader i hESC och hiPSC härledning och kultur metoder. Som tillhandahålls nedan är en sammanfattning av standardanalyser som kan användas för karakterisering och validering av den fenotypiska, molekylära och funktionella pluripotencies av LIF-3i-återgått hPSC.

Kolonin morfologi
Övergången mellan Primas, konventionella och LIF-3i-återgått kultur system åtföljs av tydliga fysiska förändringar i hPSC koloni morfologi (figur 1B). Konventionella hPSC celler föröka så platt, bred enskiktslager kolonier som expanderar snabbt från småcellig klumpar (på MEF eller feeder-fria villkor), men dåligt som enstaka celler. Exponering av konventionella hPSC linjer för LIF-3i främjar tillväxt och expansion och av mindre, tätt packad och kupolformade kolonier som uppstår klonalt från enstaka celler. Dessa morfologiska förändringar är reversibelt och LIF-3i-återgått kupolformade kolonier kan spontant övergå till en konventionell enskiktslager morfologi om LIF-3i dras och celler odlas igen i standard konventionella hESC medium kompletteras med bFGF. Dessutom expansion av LIF-3i-återgått celler vid höga konfluenta tätheter (eller långvarig kultur utan täta passaging) resulterar i den spontana återlåsning platt, konventionella morfologi med reducerad klonal effektivitet. betonar behovet av flitiga underhåll och skötsel av LIF-3i-återgått hPSC (t.ex., < 40 – 60% confluence).

Bor immunofluorescens färgning och flow flödescytometrisk analys av surface pluripotency markörer
Utvärdering av pluripotency markörer under övergången från konventionell till en naiv-liknande tillstånd följande kontinuerlig LIF-3i kultur kan vara övervakade icke-invasivt med levande antikroppen färgning utan att upptäcka eventuella negativa effekter på LIF-3i/MEF expansion ( t.ex., live-färgning fluorokrom-konjugerade antikroppar mot TRA-1-81, TRA-1-60 och SSEA4).

Lagring av pluripotency under LIF-3i återgång kan också övervakas rutinmässigt av flöde flödescytometrisk analys av pluripotency-associerade ytan markör uttryck för TRA-1 och SSEA antigener under enda cell passaging (figur 1C) eller immunofluorescens av intakt, fast kolonier i situ (figur 3). Även om dessa markörer inte diskriminera mellan konventionella och LIF-3i staterna, deras nivåer korrelerar omvänt med frekvensen av spontana differentiering som kan uppstå i hPSC när övergår från konventionell hPSC till LIF-3i villkor. Ytterligare ytantigenerna som kan mer specifikt märke mänskliga naiva-liknande stater in vitro-2,12,13 kan också användas för att upptäcka effektivt LIF-3i hPSC återgång.

Validering av molekylär pluripotency av N-hPSC
Eftersom den genetiska bakgrunden av hPSC linjer har karaktäriserats som en starkt bidragande orsak till interline variabilitet, är det viktigt att noggrant bedöma syngena kulturer på matchande kultur tidpunkter när jämföra hPSC kultur system (figur 4). Eftersom vissa av dessa system har redan visat sig generera hPSC populationer med avvikande genomisk och epigenetiska konfigurationer2, bör någon naiv reversion metod analyseras med ett antal N-hPSC av oberoende genetiska bakgrunder, på ett sätt som är tillräcklig för att validera biologiska reproducerbarhet och utesluta icke-utvecklingsmässigt relevanta ”pseudo-pluripotenta” stater (dvs, med uppenbara kännetecken för molekylär pluripotency men saknar funktionell differentiering förmågor). Zimmerlin et al. utvidgades ytterligare validering av LIF-3i kultur systemet att inkludera testmetoder den molekylära och funktionella pluripotencies av reverted N-hiPSC härrör från olika omplanering metoder, som är en annan känd förmodad bidragsgivaren av funktionella variabilitet har2mellan pluripotenta.

Följaktligen har de flesta studier av mänskliga naiva kultur system fokuserat på testmetoder molekylär pluripotency av N-hPSC på 1) den epigenetiska nivån (t.ex. Histon märken av ChIP sekvensering eller ChIP-PCR, global DNA-metylering av immunoblots eller hela genomisk bisulfite sekvensering, allel-specifika CpG metylering microarrays, OCT4 enhancer dominerande användning av reporter systems globala aktivitet vid föreskrivande element av DNAS jag överkänslighet och upprepa element profilering av RNA-sekvensering), 2) transcriptomic nivå (RNA-sekvensering, uttryck microarrays och kvantitativ RT-PCR), protein uttryck analys (t.ex., FACS, Immunofluorescerande mikroskopi och Western blotting) och 3) via metabola studier (t.ex. glykolys, oxidativ fosforylering och nikotinamid metabolism). Representativa exempel på immunofluorescens fläckar och Western blot upptäcka uttryck för viktiga markörer för molekylär pluripotency visas (figur 3B, C). Till exempel är visas i figur 3B aktiverat fosforyleras (fosfor) och totala isoformer av STAT3 och ERK1/2, vilka är viktiga molekylära kännetecknen för mus ESC-liknande naiva pluripotency. Dessa upptäcktes med hjälp av anti-STAT3 och anti-ERK1/2 primära antikroppar. Dessutom demonstreras funktionella pluripotency teratoma differentiering analyser i konventionella vs. LIF-3i-återgått hPSC teratoma vävnader dissekeras 10 veckor efter injektion och fasta i 4% formaldehyd och paraffin inbäddade (figur 3D).

Beredning av LIF-3i/MEF eller hESC/MEF/bFGF prover för nedströms molekylär analys bör omfatta MEF utarmning. Två metoder finns beskrivna ovan för MEF utarmning som har använts framgångsrikt i vårt laboratorium. MEF före plätering är en enkel, tillförlitlig och kostnadseffektiv metod för att eliminera matare från N-hPSC prover för molekylära studier och är en rekommenderad alternativ till FACS eller Mac-datorer separation (dvs, anti-TRA-1-81 eller anti-TRA-1-60 antikroppsbaserade separation ). Dessutom kan spontant-göra åtskillnad mellan TRA-1-negativ vidhäftande celler i LIF-5i/LIF-3i kulturer snabbt elimineras från LIF-5i/LIF-3i N-hPSC kulturer före efterföljande LIF-3i passage på färska MEF genom före plätering av enzymatiskt spjälkas enstaka celler för 1 h på tallrikar före belagd med 0,1% gelatin (figur 2).

Utvärdering av funktionell pluripotency av N-hPSC
Den mest rigorösa haltbestämningen av funktionella pluripotency av PSC är blastocystan injektion chimera analysen, som är begränsade för testning av N-hPSC linjer av etiska skäl. Alternativt har flera grupper som har rapporterat generationen av N-hPSC med olika andra metoder försökt att generera mellan arterna chimärer. Dessa försök har dock gett extremt låg eller misslyckade bidrag av differentierade N-hPSC härstamningar murina eller svin embryon, i jämförelse med vanlig mus ESC2chimera-generera kapacitet.

Ytterligare funktionella studier har undersökt riktad i vitro differentiering av förmodad N-hPSC härstammar via olika metoder, men har avslöjat partisk, defekt eller minskad Multilinjärt differentiering kapacitet, med samtidig härbärgerat epigenetiska avvikelser2,13. Liknande epigenetisk avvikelser, särskilt på imprinted loci, har upptäckts i mus ESC efter långvarig exponering för LIF-2i cocktail14. Intressant, vissa återgång kultur system har rapporterat globala förbättringar i specifika attribut av funktionella pluripotency av PSC såsom förbättrad kapacitet för i vivo trophectoderm bidrag2,15 .

Med en bred samling av självständigt-derived LIF-3i-återgått hPSC, anställd Zimmerlin et al. Multilinjärt differentiering analyser visar att LIF-3i systemet dramatiskt förbättrar den funktionella pluripotency av konventionella hPSC rader 3. Detta tillåter systematisk analys av konventionella vs LIF-3i hPSC linjer syngena parvis till eliminera interline-beroende variationer (figur 4). LIF-3i-återgått hPSC linjerna kräver inte ett nytt priming steg före EB differentiering. Men LIF-3i hPSC föröka på betydligt högre klonal priser än syngena celler expanderat i E8, och således inledande lägre plätering tätheter kräver justering så att varje kultur att nå sammanflödet på en liknande tidpunkt.

Utredare ska rutinmässigt använda flera analyser för att påvisa förbättrad funktionalitet för LIF-3i-återgått hPSC som inkluderar inte bara i vivo teratoma analyser utan även in vitro- regisserad differentiering analyser till neurala, slutgiltiga endoderm och hematovascular härstamningar3 använda flera analyser (t.ex., 2D APEL3,16 och 3D embryoid kropp17,18 system). För att styra för analys-beroende reproducerbarhet, bör minst två olika differentiering metoder utföras i replikat för varje syngena primas/LIF-3i hPSC kulturer (t.ex. figur 4, APEL, embryoid kropp differentiering-protokoll). Experimentell design bör omfatta en robust nummer (t.ex., > 3 – 5) primas/LIF-3i syngena parar av hPSC linjer från flera oberoende givare genetiska bakgrunder (figur 4).

Figure 1
Figur 1: En stegvis övergång av konventionella, härstamning-primas hPSC kulturer att naiva-liknande förhållanden med LIF-3i-metoden. (A) schemat för protokoll för stegvis LIF-3i återgång. (Överst Schematisk) En allmän metod för övergången av Primas, konventionella hPSC till LIF-3i kulturer. (Botten scheman) Två summerade strategier för LIF-3i naiva återgång av konventionella (primade) hPSC odlade på antingen feeder (dvs Primed/MEF till LIF-3i/MEF) eller feeder-fria villkor (dvs, Primed/E8 till LIF-3i/MEF). (B) mänskliga PSC morfologier. Visas representativa mikrofotografier av hPSC under LIF-3i återgång med hjälp av en kommersiellt tillgängliga mänskliga episomal iPSC (6.2). Visas är övergångarna observerats mellan första konventionella platta enskiktslager kolonier, och de efterföljande kupolformad clonogenic kolonierna som uppstår efter passage i mellanliggande LIF-5i och stabil LIF-3i odlingsbetingelser. Skala barer = 200 µm. (C) representativa flödescytometrisk flödesanalyser av pluripotency yta markörer. Visas är TRA-1-81 och SSEA-4 yta uttryck i konventionella hPSC linje 6,2 (p40) expanderade i E8, inledande passagen i LIF-5i/MEF och följande 1 till 9 passager (P1-P9) i LIF-3i villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Frysförvaring av N-hPSC och provberedning av MEF före plätering. (A) exempel på en frysning/upptining cykel av LIF-3i/MEF kulturer. Konventionella sladd blod-derived, icke-integrerade, transgenens-fri mänskliga iPSC linjen E5C3 var härlett och expanderat på MEF matare i hESC medium kompletteras med 4ng/mL bFGF för 18 passager. Konventionella, härstamning-primas E5C3 var anpassat i LIF-5i (vänster) och övergick till LIF-3i medium för 3 passager (center). E5C3 LIF-3i cellerna visas i panelen center var fryst tillstånd använda DMSO-baserade frysskyddmedel medium (tabell 2, 1 x 106 celler per injektionsflaska) och lagras i flytande kväve). En injektionsflaska var tinade en månad senare och E5C3 celler överfördes i en feeder-belagda väl av en 6-well platta (höger). Cell återhämtning kan förbättras genom att komplettera det LIF-3i-mediet med 5 µM Y-27632 för bara en dag efter tjällossningen. Skala barer = 200 µm. (B) eliminering av MEF (och även vidhäftande TRA-negativ differentierade celler) i LIF-3i/MEF hPSC kulturer av metoden före plätering. Visas är flödet flödescytometrisk analyser före och efter före plätering av PE-konjugerad anti-TRA-1-81 och TRA-1-60 antikroppar, APC-konjugerad SSEA-4 antikroppar och SSEA-1/CD15 antikroppar visar utarmning av TRA-1-antigen negativa och MEF celler med hjälp av den en timme före plätering metod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Karakterisering av pluripotency i LIF-3i/MEF N-hPSC kulturer. (A) yta och nukleära pluripotency markörer. Uttryck för pluripotens faktor NANOG i den samma (syngena) TRA-1-81+SSEA4+ konventionella, primas sladd blod-derived hiPSC line E5C3 (p39) expanderade i antingen primas (E8), eller naiva LIF-3i (+ p8 i LIF-3i/MEF) villkor. Immunofluorescerande fläckar av representativa hPSC kulturer på avdelningen bilder avslöjade uniform, nukleära uttrycket av core pluripotency faktorn NANOG i SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC odlade i Primas, konventionella (E8 medium) eller LIF-3i/MEF villkor. Skalstapeln = 100 µm. (B) Western blot analys. STAT3 (vänster), ERK (mitten) och kontroll beta-AKTIN proteinuttryck för en representativ hPSC (linje hESC H9) i konventionella (E8 medium) eller LIF-3i/MEF villkor (3i). (C) uttryck för naiva pluripotency-associerade transkriptionsfaktorer. Visas är STELLA/DPPA3, NR5A2 och TFCP2L1 genom immunofluorescens i en representativ LIF-3i/MEF-kultur (sladd blod-derived hiPSC line E5C3 på p33 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Skalstapeln = 100 µm. (D) Teratoma analyser av konventionella och LIF-3i-återgått hPSC. Validering av funktionella pluripotency i en syngena representativa hiPSC linje (sladd blod-derived E32C6) odlade i antingen E8 (p9) eller LIF-3i/MEF (+ p12) av teratoma assay. 10 x 106 celler av syngena parallell-odlade konventionellt, grundmålade vs LIF-3i-återgått hPSC injicerades subkutant in lemmar nedsatt immunförsvar NSG möss. Hematoxylin och eosin fläckar av teratoma microsections avslöjade robust differentiering i alla tre groddar lager med väl strukturerad ektoderm (neurala rosett: NR, retinal pigmenterad epitheliam: RPE), mesoderm (chondroblasts: Ch), och endoderm (glandular vävnad: GI) härstamningar. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Jämförelse av funktionella pluripotency mellan syngena primas och naiva stater. (A) Schematisk av strategi för att bedöma funktionella pluripotency från distinkta pluripotenta påstår i syngena konventionella vs LIF-3i odlade hPSC i oberoende differentiering protokoll. Visas är två hemato-vaskulär stamceller differentiering system (APEL enskiktslager och 3D embryoid (EB) kroppssystem) som var tidigare anställda att bedöma differentiering potensen av konventionella vs LIF-3i-återgått i samma (syngena) hPSC linje odlade i parallella inlägg LIF-3i återgång med samma passage nummer. LIF-3i-återgått hPSC linjer kräver inte ett nytt priming steg före EB differentiering och utsätts för protokollet differentiering direkt. (B) system för differentiering i EB vaskulär stamceller (VP). Det EB 3D differentiering som används för denna studie var tidigare beskrivna17,18. Visas är de representativa resultat på dag 10 EB differentiering (vänster paneler) för syngena kulturer av samma sladd blod (CB)-härledda E5C3 hPSC linje9, odlade i antingen konventionell hESC/MEF (Primed / MEF) villkor eller LIF-3i/MEF naiva villkor. Flödesanalys flödescytometri av dessa EB celler visar dramatiska ökningar av CD31+CD146+ VP populationer efter LIF-3i återgång av E5C3 linjen före differentiering. Histogrammet visar det medelvärde ±SD av CD31+CD146+ VP cell procentsatser återfanns på dag 10 i detta EB system använder tre syngena par oberoende hPSC linjer (dvs. två CB-hiPSC och en vuxen fibroblast-derived hiPSC, streckade linjerna Anslut syngena par). Resultaten visar signifikant förbättring av VP differentiering effektivitetsvinster i EB systemet över genetiska bakgrunder av flera hPSC rader. (C) APEL enskiktslager vaskulär stamceller differentiering system. Konventionella (primade E8) och LIF-3i-återgått hPSC kan vara direkt differentierade använder samma odlingsbetingelser, tillväxtfaktorer, cytokiner och små molekyler av stegvis APEL endothelial differentieringen protokoll 3, 16. visas är oberoende APEL differentiering experiment med E5C3 sladd blod-derived hiPSC linjen, och andelen CD31+CD146+ vaskulär stamceller populationer på dag 7 av APEL differentiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LIF-3i systemet gäller en modifierad version av den klassiska murina 2i naiva reversion cocktail1 mänskliga pluripotenta stamceller. Self-förnyelse av hPSC (som inte kan expandera i 2i ensam) stabiliseras i LIF-2i genom att komplettera denna cocktail med tankyrase-hämmaren XAV939. LIF-3i kultur kan bulk och effektiv återgång av den konventionella hPSC till pluripotenta tillstånd som liknar den mänskliga preimplantatorisk epiblast3. Även om verkningsmekanismer av XAV939 i hPSC är sannolikt komplex och synergistiskt med 2i, de sannolikt även vid ett minimum, en viktig stabilisering och förstärkning av hPSC självförnyelse via WNT signalering vägar3.

Konventionella hPSC kulturer anta normalt ett spektrum av pluripotenta stater med mycket varierande härstamning-primade genuttryck och post-implantationsförluster epiblast epigenetiska märken som kan leda till inkonsekvent eller minskade funktionella pluripotency2 . Denna inneboende härstamning priming av konventionella hPSC kulturer kan också störa den framgångsrika LIF-3i återgången av vissa hPSC linjer2. Men införandet av LIF-5i anpassning initsteget (tabell 1) i metoden LIF-3i universellt breddar effektiviteten av LIF-3i reversion bland en mängd hPSC linjer och främjar bulk naiva återgång av konventionella hPSC linjer på ett sätt som kringgår tråkiga plocknings- och subkloning av sällsynt naiv-återgått kolonier eller behovet för användning av rutinmässiga anti-apoptotiska molekyler att stabilisera deras livskraft.

LIF-5i/LIF-3i naiva reversion metoden är reproducerbara i ett brett utbud av hESC och hiPSC linjer. Det kräver minimal utbildning med grundläggande cell kultur skicklighet. Zimmerlin et al. anställd framgångsrikt denna sekventiella strategi att återställa > 30 oberoende hESC och transgenens-fri hiPSC linjer från ett brett utbud av givare 3. En enda passage i LIF-5i (figur 1) är tillräckligt för de flesta hPSC linjer att genomgå effektiva naiva återgång i bulk hPSC kulturer och vidareutveckla deras efterföljande stabil underhåll och utvidgning i LIF-3i ensam.

Dessutom LIF-3i/MEF systemet stöder robust bulk klonal expansion effektivitetsvinster i hela alla stegen mellan härstamning-primade konventionella hPSC kultur ända till färdiga naiva-liknande hPSC återgång (dvs., anpassning, övergång och expansion för 7 – 10 passager i LIF-3i/MEF ensam). Även om den aktuella formuleringen av detta kultur-system kräver feeder stöd, presenteras en enkel och prisvärd metod att tömma matare med före plätering teknik för analys av LIF-3i kulturer (figur 2).

Flera andra kultur system har också rapporterats att främja konventionella hPSC till liknande naiva-liknande pluripotenta påstår2. Även om dessa hPSC kultur system har också åberopat utilizationen av klassiskt mus naiva 2i villkor, dessa encelliga passaging metoder i de flesta fall också krävs ytterligare kemiska modulering för att stabilisera en till sin natur instabila / metastabilt mänskliga naiva staten. Ännu viktigare, de flesta av dessa andra metoder visat nedsatt funktionell pluripotency efter differentiering eller förvärvade onormal epigenetisk imprints karyotypes2. Även om uppkomsten av onormal karyotypes inom konventionell primade hPSC kulturer är redan väl dokumenterad19, förlängd, enzymatisk encelliga passaging metoder som används rutinmässigt i de flesta naiva reversion metoder. Detta har också visat att potentiera generationen av onormal kromosomala konfigurationer20,21. mer känsliga tekniker (t.ex. kopiera antal variationer, enda nukleotid polymorfism) kan avslöja ytterligare förändringar22,23.

Däremot en bred repertoar av LIF-3i-återgått hPSC linjer bekräftades för att inneha normala karyotypes på låg-medium passager (t.ex. p5-p15), och även vid hög passage-nummer (t.ex., > p30) efter LIF-3i kultur3. Dessutom hittades epigenetisk avtryck i LIF-3i-återgått hPSC reproducibly normal och intakt på 5 – 10 passager post LIF-3i återgång2. Med hjälp av känsliga allel-specifika kommersiella metylering array plattformen, visades det tidigare att CpG metylering märken på imprinted loci av en bred repertoar av LIF-3i-återgått hPSC linjer (följande 4 – 7 passager i LIF-3i) konstaterades vara grovt normal struktur1. Eftersom avvikande genomisk avtryck och karyotypes kan slutligen försämra den funktionella kapaciteten hos hPSC, skisserades nödvändiga riktlinjer i detta protokoll som uppmuntrar forskarna att validera hPSC kulturer före och efter naiv återgång, använder detta metod samt andra.

LIF-3i metoden förbättrade funktionella pluripotency olika groddar lager i en stor repertoar av hESC och icke-transgena hiPSC linjer (figur 3). Till skillnad från andra naiva reversion protokoll, den LIF-3i metoden gör inte kräva ett nytt priming steg för efterföljande differentiering av N-hPSC (dvs. konvertera N-hPSC tillbaka till konventionella primade villkor innan deras användning i regi differentiering-analyser). LIF-3i-återgått N-hPSC Visa betydligt mer effektiv differentiering kapacitet än motsvarigheterna syngena konventionella hPSC i båda teratoma analyser (figur 3D) och riktade differentiering protokoll av härstamningar av alla tre groddar lager2. På grund av assay-beroende och interline variationer i funktionsprovning av konventionella hPSC, härstamning-specifika differentiering bör utvärderas med hjälp av oberoende riktad differentiering protokoll och hPSC som härrör från flera olika genetiska bakgrunder. Med noggrann experimentell design, kan ett brett utbud av hPSC linjer förväntas avsevärt förbättra deras Multilinjärt differentiering effektivitetsvinster jämfört med deras syngena konventionella motsvarigheter efter 4 – 10 passager i LIF-3i villkor.

Sammanfattningsvis, denna metod snabbt och klonalt expanderar numrerar av mänskliga PSC, förbättrar deras nedströms differentiering effektivitet, ökar den härstamning-begått progenitor cell nummer efter differentiering och minskar interline variabilitet bland konventionella, härstamning-primas hPSC linjer. Dessa N-hPSC med förbättrad funktionalitet kanske ytterligare en bred inverkan för deras möjligheter att bidra funktionella vävnader till en växande embryo. Stabil N-hESC kan till exempel användas för att utveckla transplanterbara organ och adulta stamceller utveckla djur chimärer, eller för att generera humaniserad gen-riktade djurmodeller av sjukdom. Ytterligare optimering av denna tankyrase hämmare-utnyttja LIF-3i metod i definierade feeder-fri GMP-kompatibla odlingsbetingelser kommer att underlätta effektiv kliniskt användbar generering av ett brett utbud av funktionella och engraftable celltyper för terapeutisk användning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Enligt ett licensavtal mellan Life Technologies och Johns Hopkins University (JHU) rätt Dr Zambidis till en andel av royalty som mottagits av universitetar för licensiering av stamceller. Villkoren i detta avtal förvaltas av JHU i enlighet med dess intressekonflikt politik. Detta ändrar inte författarnas adherencen till tidning politik utbyte av data och material.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award och The Moseley Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 136 naiva pluripotens mänskliga pluripotenta stamceller differentiering tankyrase hämning liten molekyl epiblast
Kemiska återgång av konventionella mänskliga pluripotenta stamceller till en naiv-liknande tillstånd med förbättrad Multilinjärt differentiering potens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, T. S., Zimmerlin, L.,… More

Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter