Summary
Vi presentiamo un protocollo per la reversione chimica efficiente, alla rinfusa e rapida delle cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato convenzionale (hPSC) in uno stato di preimpianto epiblasto-come pluripotenti ingenuo epigenomically-stable. Questo metodo provoca l'espressione genica in diminuzione di lignaggio-innescato e miglioramento notevole nella differenziazione multilineare diretto attraverso un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee.
Abstract
Cellule staminali pluripotenti umane di ingenuo (N-hPSC) con funzionalità migliorate possono avere un ampio impatto nella medicina rigenerativa. L'obiettivo del presente protocollo è per ripristinare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato, convenzionale (hPSC) mantenute su condizioni sia privo di alimentatore o Alimentatore-dipendente da un ingenuo-come pluripotenza con funzionalità migliorate. Questo metodo di reversione ingenuo chimica impiega il fattore inibitorio di leucemia classica (LIF), GSK3β e MEK/ERK inibizione cocktail (LIF-2i), completati con solo un inibitore di tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i Ripristina hPSC convenzionale a uno stato stabile pluripotenti adottando biochimici, trascrizionale e caratteristiche epigenetiche dell'epiblasto umana pre-impianto. Questo metodo di LIF-3i richiede manipolazione di cultura di cellule minimal ed è altamente riproducibile in un vasto repertorio di cellule staminali embrionali umane (hESC) e linee di cellule staminali (hiPSC) di transgeni umane pluripotenti indotte. Il metodo di LIF-3i non richiede un passaggio ri-adescamento prima la differenziazione; N-hPSC possono essere differenziati direttamente con rendimenti estremamente elevati e mantenere karyotypic e stabilità di epigenomic (tra cui impresso loci). Per aumentare l'universalità del metodo, hPSC convenzionali sono coltivate in primo luogo nel cocktail LIF-3i completati con due altre piccole molecole che potenziare la chinasi di proteina A (forskolin) e segnalazione di sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i). Questo breve passaggio di adattamento LIF-5i significativamente migliora l'iniziale espansione clonale di hPSC convenzionale e permette loro di essere successivamente ingenuo-è ritornato con LIF-3i solo allo stato sfuso, così prevenendo l'esigenza di picking/subcloning rara N-hPSC colonie più tardi. LIF-5i-stabilizzato hPSCs sono mantenute in seguito a LIF-3i da solo senza la necessità di molecole anti-apoptotico. La cosa più importante, LIF-3i reversione contrassegnato migliora la pluripotenza funzionale di un vasto repertorio convenzionale hPSC diminuendo la loro espressione genica innescata lignaggio e cancellando la variabilità di interlinea di differenziazione diretto comunemente osservato tra linee hPSC indipendente. Rappresentante caratterizzazioni di LIF-3i-reverted N-hPSC sono strategie fornite e sperimentale per comparazioni funzionale di hPSC isogeniche nel lignaggio-innescato vs. Stati di tipo ingenuo sono delineati.
Introduction
Il sistema di coltura 2i (inibitore MEK/ERK e GSK3β) è stato originariamente sviluppato per perfezionare culture di cellule staminali embrionali (mESC) eterogenei basati su siero del mouse ad uno stato di terreno uniforme di pluripotenza simile al mouse epiblast preimpianto1. Tuttavia, 2i non supporta il mantenimento stabile della pluripotenti umane della cellula formativa (hPSC) linee2. I vari complessa piccola molecola, fattore di crescita-completati e approcci transgenici recentemente sono stati segnalati per catturare putativamente simili pluripotenti umane ingenuo-come molecolare afferma2. Tuttavia, molti degli Stati "ingenuo-like" creati con questi metodi anche esibito karyotypic instabilità, epigenomic difetti (ad es., perdita globale di parental imprinting genomico), o alterata differenziazione potenziale.
In contrasto, il cocktail di tripla inibizione chimica di GSK3β, ERK e tankyrase della segnalazione e fattore inibitorio di leucemia (LIF-3i) era sufficiente per la reversione ingenuo-come stabile di un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee3. LIF-3i-reverted ingenuo hPSC (N-hPSC) mantenuto i karyotypes normali e aumentato le loro espressioni di geni specifici ingenuo umano preimpianto epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hPSC di reversione conferito anche con una serie di caratteristiche molecolari e biochimiche uniche alla pluripotenza mESC-come ingenuo che comprendeva aumentata fosforilato STAT3 signaling, ha fatto diminuire la fosforilazione di ERK, global 5-metilcitosina CpG ipometilazione, demetilazione CpG genoma alle cellule staminali embrionali (ESC)-promotori di geni specifici e uso di enhancer OCT4 distale dominante. Inoltre, in confronto ad altri ingenui metodi di reversione che ha provocato aberrante ipometilato impresso loci genomici, LIF-3i-reverted N-hPSC erano privi di perdita sistematica di impresso CpG modelli o perdita di espressione di DNA metiltransferasi (per esempio, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.
Una coltura di LIF-3i diretta di una vasta gamma di convenzionale staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) coltivate su alimentatori o E8 privo di alimentatore condizioni raggiunto reversione alla rinfusa e rapida ad uno stato di epiblasto-come ingenuo. Tuttavia, diretto LIF-3i ingenuo reversione può essere inefficiente in alcune linee di hPSC convenzionale instabile dovuto l'inerente variabilità genomica e lignaggio-innescato derivanti dagli sfondi donatore geneticamente diverse.
Così, per ampliare l'utilità del metodo LIF-3i, un'ottimizzazione graduale è stata sviluppata ed è presentata qui, che permette di reversione ingenuo universale con quasi qualsiasi hESC convenzionale o linea di transgeni hiPSC coltivate su alimentatori. Questo metodo di reversione universalizzanti ingenuo impiega un passo di cultura iniziale transitoria in hPSC convenzionale che integrano il cocktail di LIF-3i con due altre piccole molecole (LIF-5i) che rafforzano la chinasi di proteina A (forskolin) e sonic hedgehog (sHH) ( segnalazione di purmorphamine). Un passaggio iniziale di hPSC convenzionale in LIF-5i li adatta a successive stabile LIF-3i reversione allo stato sfuso. Adattamento di LIF-5i iniziale aumenta significativamente la proliferazione clonale di singola cellula iniziale delle convenzionali hPSC coltivate su E8 o alimentatori (prima del loro successivo passaggio stabile, continuo a LIF-3i da solo). HPSC convenzionali linee adattate prima di un passaggio in LIF-5i tollerano successive alla rinfusa clonale passaggio delle cellule naive-reverted in condizioni di LIF-3i, che previene l'esigenza di picking e subcloning di rare colonie stabili, o l'uso di routine molecole anti-apoptotiche o inibitori della Rho-associati proteina chinasi (ROCK).
Il metodo di LIF-3i è stato impiegato con successo per stabile espandere e mantenere un vasto repertorio di > 30 hPSC convenzionale indipendente, geneticamente diverse linee per > 10 – 30 passaggi utilizzando sia metodi di dissociazione non enzimatica o enzimatica, e senza prova di induzione di cromosomiche o anomalie epigenomic, compreso le anomalie alle loci genici impresso. Inoltre, sequenziale LIF-5i/LIF-3i cultura è il metodo di reversione solo ingenuo che finora è stato segnalato che migliora la pluripotenza funzionale di un vasto repertorio di linee convenzionali hPSC diminuendo la loro espressione genica innescata lignaggio e migliorando notevolmente la loro potenza di differenziazione multipotenti. Il LIF-3i ingenuo reversione metodo cancella l'intrinseco interline variabilità di differenziazione delle linee hPSC lignaggio-innescato, convenzionale e avrà una grande utilità dell'applicazione nella medicina rigenerativa e terapie cellulari.
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Protocol
Tutte le procedure di animali sono state effettuate conformemente agli orientamenti di cura degli animali e protocolli approvati dalla Johns Hopkins School di medicina Istituto di cura degli animali e uso Committee (IACUC).
1. preparazione di fibroblasti embrionali del Mouse (MEF) per alimentatore-dipendente convenzionale (hESC medio/MEF) o ingenuo-ripristinato hPSC (LIF-3i medio/MEF) cultura
-
Acquistare o preparare in casa bassa-passaggio forniture degli alimentatori MEF da CF1 o CF1 x DR4 embrioni di topo E13.5 ibrido seguendo protocolli pubblicati4.
- Crioconservare culture del MEF di passaggio basso (p1-p2) pre-(per conservazione a lungo termine) o dopo (per fino a 6 mesi) irradiazione e conservare in azoto liquido come precedentemente descritto4.
- Irradiare (5.000 rad) espanso MEF sotto p5 utilizzando un γ - o X-ray-irradiatore di massa e preparare aliquote a 1,5 x 106 cellule per flaconcino per lo stoccaggio a breve termine (meno di 6 mesi) a-80 ° C in un congelatore di ultra-bassa temperatura.
- Piastra tra 1.2 x 106 (appena irradiati non crioconservati) e 1,5 x 106 (irradiati crioconservati) MEF per una piastra gelatinizzata 6 pozzetti per la preparazione di colture di alimentatore, come descritto di seguito.
- Preparare rivestite con gelatina sterile 6 pozzetti piastre di coltura del tessuto-trattati con l'aggiunta di 1,5 mL di soluzione di gelatina sterile 0,1% ad ogni pozzetto in una cappa di sicurezza biologica.
- Incubare le piastre rivestite con gelatina a 37 ° C per almeno 1 h o durante la notte in un incubatore da laboratorio CO2 .
- Il giorno successivo, scongelare passaggio basso (ad es., P2 a P4) crioconservati DMSO e irradiata (5.000 rad) MEF seguendo i passaggi indicati di seguito.
Nota: Non irradiati MEF dovrebbe anche essere scongelati, espansa e irradiati immediatamente prima dell'uso. - Trasferire un'aliquota MEF crioconservata in bagnomaria a 37 ° C. Dopo lo scongelamento, sterilizzare il tubo con etanolo e diluire immediatamente il crioprotettore DMSO almeno 10 volte con il mezzo di MEF (tabella 1) all'interno di una cappa di biosicurezza (ad es. trasferimento 1 mL di DMSO-MEF aliquota in 9 mL di terreno di MEF in una sterile 15 mL conica).
- Centrifugare le cellule MEF diluite a 200 x g per 5 min in provette coniche da 15 mL sterile.
- In una cappa di biosicurezza, aspirare e scartare il supernatante senza cellula e risospendere il pellet cellulare in 1 – 2 mL di terreno fresco di MEF.
- Delicatamente scartare la soluzione di gelatina e aggiungere 2 mL di MEF ri-sospese nel mezzo MEF in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti gelatinizzata, come indicato sopra. Le celle del MEF di conteggio e piastra 1.2 x 106 (appena irradiati non crioconservati) o 1.5 x 106 (irradiati crioconservati) MEF per una piastra gelatinizzata 6 pozzetti.
Nota: Tutte le piastre per colture cellulari che vengono trasferite dall'incubatrice di CO2 per la biosicurezza possono essere pulite delicatamente con carta etanolo-spruzzato ma non dovrebbero essere spruzzate direttamente su con soluzione di etanolo 70% per evitare la diffusione di etanolo nei pozzetti. - Incubare MEF piastre a 37 ° C durante la notte in un incubatore da laboratorio CO2 (5% CO2, atmosfera umida) per consentire l'attaccamento, prima dell'uso.
2. stabilizzazione delle culture hPSC convenzionale per successive ingenuo reversione con un passo di adattamento breve LIF-5i di massa
- Convalidare tutte le linee di hPSC convenzionale per il possesso di un karyotype normale dalla G-fascia, prima del ritorno di inizio LIF-5i/LIF-3i.
Nota: LIF-3i reversione delle linee convenzionali hPSC high-passaggio (ad es., P > 40 – 50) dovrebbe essere evitato, poiché queste culture possono già harbor aberrazioni che possono influire negativamente sulla reversione di LIF-3i stabile, efficiente e alla rinfusa di innescato, convetional hPSC linee. - Mantenere ed espandere la culture hPSC convenzionale con i karyotypes normali convalidati in un sistema basato su MEF cultura (come indicato nella sezione 1) o un sistema di coltura privo di alimentatore (secondo la preferenza del ricercatore).
Nota: Entrambi cocultures hPSC/MEF Alimentatore-dipendente (ad es., hESC medium (tabella 1) completate con 4 – 10 ng/mL bFGF) o senza alimentatore (ad es., E8 5 o mTSER 6 media (secondo le istruzioni del produttore su metodi di piastre rivestite con vitronectina) sono compatibili con reversione ingenuo di massa utilizzando il sistema di LIF-5i/LIF-3i/MEF (Figura 1). Metodi non-enzimatici sono preferiti per il passaggio di hPSC convenzionale prima di prepararli per la reversione. LIF-5i e LIF-3i formulazioni di media non contengono antibiotici o antimicotici. Regole di funzionamento standard per la biosicurezza armadietto sterilità e la manutenzione sono tenute a rispettare rigorosamente per evitare qualsiasi contaminazione batterica o fungina. - Per il MEF-basato sistema di cultura, preparare gli alimentatori MEF nella piastra di 6 pozzetti gelatinizzato come descritto nella sezione 1 almeno un giorno prima di passaggio di culture LIF-5i-adattato hPSC convenzionali.
- Dopo convenzionale hPSC culture hanno raggiunto confluency di ~ 50% (cioè, 3 – 5 giorni dopo il placcaggio iniziale), è possibile sostituire il terreno di coltura standard hESC con LIF-5i medio (2 mL / pozzo; Tabella 1).
Nota: Eseguire questi passaggi in una cappa di biosicurezza. - Cultura e mantenere convenzionale hPSC/MEF per fino a 2 giorni in LIF-5i nell'incubatore CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Cambiare il mezzo di LIF-5i giornalmente per adattarle per il loro successivo passaggio e stabile reversione in LIF-3i.
- In alternativa, per le culture senza alimentatore convenzionale (ad esempio, in E8), coltura hPSC in LIF-5i solo pernottamento prima di passaggio la mattina successiva.
Nota: LIF-5i e LIF-3i culture possono entrambi essere mantenute con atmosferico (21% O2) o fisiologico (5% O2) ossigeno livelli nell'incubatore CO2 (5% CO2, atmosfera umida). - Prima del passaggio, posizionare le piastre di coltura in un armadio di sicurezza biologica, lavare hPSC convenzionale LIF-5i-adattato una volta con PBS e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione delle cellule in ciascun pozzetto. Incubare per 5 min a 37 ° C in un incubatore a CO2 e triturare delicatamente con una pipetta in sospensione singola cella torna nella cappa di biosicurezza.
Nota: Buffer di dissociazione Non enzimatica in alternativa possono essere utilizzati per preparare le celle singole per passaggio. - Raccogliere la sospensione cellulare in hESC medie (almeno 2 volte diluizione) un provette coniche da 15 mL sterile e triturare delicatamente le cellule pipettando per ottenere una sospensione di singola cellula.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min, aspirato/scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 – 2 mL di terreno LIF-5i nella cappa di biosicurezza. Contare le celle utilizzando un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
- Lavare la piastra pre-placcata del MEF due volte con PBS (2 mL per pozzetto in piastre da 6 pozzetti) e distribuire 1 – 2 x 106 cellule (nel mezzo di 2 mL LIF-5i) sul 1 bene della piastra PBS-lavato MEF.
- Regolare e ottimizzare la densità di placcatura iniziale per ogni riga di hPSC individuali essere ripristinato come ingenuo, come ricromatura efficienze può essere altamente variabile. Posizionare la piastra in un incubatore a CO2 (5% CO2, atmosfera umida).
Nota: L'uso sistematico dei reagenti anti-apoptotiche non è consigliato per la maggior parte delle linee hPSC con questo metodo. Il sistema di LIF-5i migliora già significativamente efficienze ri-placcatura clonale di massa iniziale delle linee convenzionali hPSC. Tuttavia, un uso una tantum di inibitore di roccia (5-10 μM Y-27632) possono più ulteriormente migliorare l'iniziale efficienza LIF-5i ri-placcatura clonale delle culture hPSC convenzionale nel primo passaggio per alcune linee di hPSC lignaggio-innescato instabile con la propensione per spontanea differenziazione. - Se a partire da alimentatore-free culture (ad es., E8), direttamente trasferire un pozzetto della dissociata hPSC convenzionale adattato in LIF-5i in uno irradiato MEF-placcato bene (cioè, passaggio 1:1).
- Il giorno successivo, agitare delicatamente la piastra di sollevare tutte le celle non iscritti, aspirare il mezzo (lavaggio con PBS è facoltativo) e sostituire con 2 mL di terreno di LIF-5i. Eseguire questo passaggio in una cappa di biosicurezza al giorno per 3 – 5 giorni o fino a quando le cellule sono 60 – 70% confluenti (Figura 1). Posizionare la piastra in un incubatore a CO2 (5% CO2, atmosfera umida).
3. a lungo termine manutenzione e ampliamento delle N-hPSC nel mezzo di LIF-3i
- A seguito di iniziale adattamento LIF-5i, passaggio stabile LIF-3i successive culture ogni 3 – 4 giorni in una cappa di biosicurezza, o quando culture diventano 60 – 70% confluenti (Figura 1).
Nota: LIF-3i culture richiedono manutenzione rigorosa e consentire alle culture di N-hPSC raggiungere densità alta confluenza/cellulare da coltura prolungata (ad es., > 4 giorni) riduce l'efficienza di ri-placcatura clonale successivo e promuove la spontanea differenziazione. - In una cappa di biosicurezza, scartare il terreno di coltura e lavare ogni bene di LIF-5i/LIF-3i culture delicatamente aggiungere 2 mL di PBS. Scartare la PBS e aggiungere 1 mL di soluzione di distacco delle cellule. Incubare per 5 min a 37 ° C in un incubatore a CO2 (5% CO2, atmosfera umida).
- Raccogliere la sospensione cellulare, aggiungere hESC medio (senza inibitori o fattori di crescita (tabella 1); almeno 2 volte diluizione) per recuperare tutte le hPSC e triturare delicatamente le cellule pipettando per ottenere una sospensione di singola cellula. Trasferire la sospensione in una provetta conica sterile 15 mL.
- Centrifugare a 300 g per 5 min e aspirato/scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in mezzo LIF-3i. Contare le celle utilizzando un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
- Piastra ~ 2 x 105 cellule per pozzetto al MEF irradiati nella piastra di 6 pozzetti gelatinizzata per passaggio sistematico delle culture LIF-3i. Per le culture di LIF-5i-adattato iniziale, piastra un'inizialmente alta densità (4 x 105 cellule/pozzetto) prima del primo passaggio in LIF-3i/MEF.
- Ri-piastra e distribuire hPSC LIF-5i-adattato sul fresco lavate in PBS MEF alimentatore piastre irradiate (preparato il giorno precedente come sopra) nel medium LIF-3i. Sostituire il mezzo di LIF-3i ogni giorno.
- Passaggio N-hPSC per meno massa continuo 4 – 7 passaggi nel LIF-3i medio prima dell'uso di N-hPSC negli studi funzionali o crioconservazione. Registrare il numero di passaggi di N-hPSC in entrambi convenzionali o supporti LIF-3i.
Nota: LIF-3i reversione dell'alta-passaggio (ad es. > p40) linee hPSC lignaggio-innescato, convenzionale non è raccomandato. Uno sforzo dovrebbe essere fatto per ripristinare le linee convenzionali hPSC al passaggio più basso possibile che siano disponibili. Inoltre, l'uso di hPSC LIF-3i-reverted che hanno subito maggiore di 10 passaggi di LIF-3i non è raccomandato per studi funzionali, poiché tali culture N-hPSC possono harbor cloni karyotypically anormali a causa della selezione cultura prolungata delle cellule clonali. Fresco LIF-5i/LIF-3i ritorni delle linee di basso-passaggio hPSC convenzionale devono essere condotta per studi funzionali, se gli stock di N-hPSC con < 10 passaggi in LIF-3i non sono disponibili.
4. crioconservazione e scongelamento di LIF-3i-reverted N-hPSC
- Espandere ripristinato N-hPSC per almeno 5-7 passaggi in LIF-3i, come indicato in precedenza, prima dell'uso in studi funzionali o crioconservazione a lungo termine. Registrare il numero di passaggi in condizioni convenzionali e in condizioni di LIF-3i su ogni flaconcino crioconservato.
Nota: Eccesso LIF-3i-reverted N-hPSC non utilizzato in saggi funzionali possa essere crioconservati ad ogni passaggio, ma gelida di passaggi più bassi di post-reversione (ad es.., < p3) può causare poveri, o efficienze altamente variabile post-disgelo recupero. - In una cappa di biosicurezza, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule in PBS (2 mL per pozzetto), aspirare PBS e dissociare hPSC colonie in singole celle utilizzando la soluzione di distacco delle cellule (1 mL per pozzetto). Posizionare la piastra per 5 min a 37 ° C in un incubatore a CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Diluire la soluzione di distacco delle cellule con il mezzo di LIF-3i (2 volte), raccogliere hPSC in una sterile conica da 15 mL, centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in mezzo LIF-3i (1 – 2 mL / pozzetto-equivalente). Contare il numero di celle utilizzando un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
- Centrifuga N-hPSC nel medium LIF-3i (200 x g per 5 min) e risospendere le cellule in un armadio di sicurezza biologica nella soluzione di congelamento (tabella 2), con una densità di almeno 1 x 106 cellule/mL.
- Trasferire le cellule nelle provette criogeniche deposito a lungo termine e collocare in un contenitore di congelamento lento. Consentire ai campioni di congelare durante la notte in un congelatore a-80 ° C.
- Il giorno successivo, trasferire il cryovials in un congelatore di azoto liquido per stoccaggio a lungo termine.
- Per lo scongelamento, collocare il flaconcino di congelati in bagnomaria a 37 ° C per ~ 2 min. sterilizzare il flaconcino (cioè, spruzzo di etanolo), trasferire hPSC in una sterile conica da 15 mL e diluire lentamente le cellule 10 volte in hESC supplementato (tabella 1) con 5 μM di Inibitore di chinasi (ROCK) Rho-collegata della proteina Y-27632 all'interno di una cappa di sicurezza biologica sterile mobile.
- Centrifuga a 200 x g per 5 min. In una cappa di biosicurezza, gettare senza cellula supernatante e risospendere il pellet cellulare in LIF-3i medium (1 – 2 mL) completate con inibitore di 5 μM ROCK Y-27632.
Nota: L'esclusione di Y-27632 si tradurrà in scarsa efficienza di recupero post-scongelamento (Figura 2). - Trasferire le cellule scongelate risospese in LIF-3i/ROCK inibitore sulla PBS-lavato MEF-placcato pozzetti. Crioconservare LIF-3i culture ad una densità di 1 x 106 cellule per flaconcino. Ciascuna di queste fiale su alimentatori in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti gelatinizzato scongelare.
- Il giorno successivo, avviare regolari LIF-3i media espansione senza inibitore della Rho-chinasi.
5. alimentatore rimozione per la raccolta di campioni di N-hPSC
- Per preparare le colture di campioni da LIF-3i/MEF (o hESC/MEF convenzionale) (cioè, per l'espressione genica (ad es., RT-PCR quantitativa, microarrays) o analisi di proteine (ad es., Western blot), impoveriscono LIF-3i culture da alimentatori MEF utilizzando Magnetico attivato Cell Sorting (MACS) con l'anticorpo anti-TRA-1-81 rivestito microsfere secondo il protocollo del produttore.
- In alternativa, utilizzare il seguente metodo semplice pre-placcatura per esaurire culture di alimentatori, come descritto di seguito.
- In una cappa di sicurezza biologica sterile armadietto, scartare il supernatante senza cellula, lavare la pallina con 2 mL di PBS sterile per pozzetto. Staccare aderente culture LIF-3i/MEF utilizzando soluzione di distacco delle cellule (1 mL/pozzetto). Incubare per 5 min in un incubatore a CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Raccogli hPSC in una sterile conica da 15 mL. Lavare 2 volte hESC in mezzo, cellule di trasferimento nella sterile 15 mL conica e centrifugare a 200 x g per 5 min.
- In una cappa di biosicurezza, Risospendere ciascun pozzetto delle cellule LIF-3i/MEF dissociato in 2 mL di terreno LIF-3i e trasferire direttamente su un nuovo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti che è stato appena rivestito con 0,1% di gelatina.
- Incubare le cellule di hPSC LIF-3i/MEF per 1h a 37 ° C in un incubatore a CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Raccogliere le cellule non-aderenti con una pipetta in un nuovo tubo conico. Delicatamente aggiungere 2 mL di terreno hESC in ciascun pozzetto e agitarlo per raccogliere le cellule rimanenti non aderente.
Nota: La maggior parte del MEF irradiati attribuirà alla piastra gelatinizzata in 1h, lasciando la maggior parte della hPSC in sospensione. - Combinare e centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min lavaggio in PBS. Il pellet cellulare di snap-congelamento in azoto liquido dopo la centrifugazione, o in alternativa risospendere il pellet in un buffer di lisante che è compatibile con l'analisi di proteine o acidi nucleici a valle (Figura 2B).
- Eseguire caratterizzazioni di LIF-3i hPSC linee con un corrispondente controllo convenzionale hPSC isogeniche innescata.
Nota: A causa della intrinseca variabilità tra e all'interno di culture innescate, i controlli pertinenti vengono preparati ad un determinato timepoint corrispondente nella cultura o prima della reversione ingenuo. Protocolli dettagliati e materiali per bioimmagini immunofluorescente a valle, flusso cytometry, Western blotting, espressione genica (analisi di RT-PCR e microarrays), studi di metilazione (dot blot, microarray di metilazione di CpG), OCT4 prossimale e distale enhancer predominanza reporter saggi e segnalazione inibitore saggi sono disponibili altrove3.
6. post ingenuo reversione: convalida dell'integrità genomica e ritenzione di impronte parentale di LIF-3i-reverted N-hPSC prima dell'uso in saggi funzionali
- Schermo le culture partenza hPSC innescata e convenzionale per il possesso di un cariotipo normale (ad esempio, con analisi della colorazione Giemsa-fascia usando metodi pubblicati 7) prima dell'inizio della reversione LIF-5i/LIF-3i.
Nota: Si tratta di eliminare popolazioni hPSC convenzionale che possono harbor anormali alterazioni genomiche che possono guidare il vantaggio di sopravvivenza selettiva artefactual in condizioni di LIF-3i clonale. - Per risultati ottimali, appena ripristinare convenzionale hPSC culture a uno stato ingenuo-simile con LIF-3i diverse settimane prima di loro uso negli studi funzionali o diretto di differenziazione.
Nota: La Routine prolungato cultura 'manutenzione' in condizioni di LIF-3i per più di 10 passaggi seguenti ingenuo reversione non è raccomandato. Espansione di routine e la manutenzione di linee hESC e hiPSC deve essere eseguite utilizzando sistemi di coltura convenzionale (ad esempio, in E8, o MEF/hESC medie con bFGF). - Valutare post-ripristinato N-hPSC linee per il mantenimento del normale karyotypes 5 – 7 passaggi dopo reversione LIF-3i (ad es., con analisi colorazione di Giemsa-banda7o qualsiasi altro metodo di scelta).
- Valutare tutte le linee N-hPSC ripristinate per ritenzione di impronte genomiche parentale normale di un'analisi di metilazione del DNA di scelta (ad es., protocolli per analisi di CpG DNA microarray di impronte parentale in LIF-3i-reverted N-hPSC sono forniti altrove3 ) dopo 5 – 10 passaggi di reversione LIF-3i.
7. post ingenuo reversione: Disegno sperimentale linee guida per le analisi quantitativa differenziazione diretto usando N-hPSC LIF-3i-reverted
- Utilizzare direttamente LIF-3i N-hPSC nei protocolli di differenziazione diretto stabilito senza manipolazioni di cultura di cellule supplementari.
Nota: Re-innesco (cioè, riconversione N-hPSC condizioni convenzionali innescate prima del loro uso nelle analisi di differenziazione diretto) non è necessario con il metodo di LIF-3i e non è raccomandato. - Per controllare per gli impatti del dosaggio e interline variabilità nel collaudo funzionale di linee individuali hPSC, Croce-convalidare le potenze di stirpe-specific differenziazione impiegando protocolli di differenziazione indipendente con almeno tre hPSC linee derivate da ambiti di provenienza genetici indipendenti (cioè, più hiPSC donatore-derivati e hESC).
- Per i confronti funzionali, impostare LIF-3i-reverted hPSC culture e culture di pari livello, al numero di equivalenti di passaggio e della stessa linea di hPSC (isogeniche) in parallelo con il convenzionale lignaggio-innescato. Mantenere le culture di hPSC isogeniche innescato/ingenuo di pari livello nei loro rispettivi media (ad es., E8 vs. LIF-3i) e contemporaneamente differenziare utilizzando protocolli di differenziazione identici e materiali, per eliminare ogni pregiudizio sperimentale (Figura 4).
- Per isogeniche innescato vs ingenuo hPSC comparazioni, regolare e ottimizzare la densità di placcatura iniziale per ogni analisi di differenziazione individuale.
Nota: Protocolli dettagliati per progenitrici neurali, endoderma definitivo e differenziazione hemato-endoteliale diretto di LIF-3i-reverted N-hPSC sono forniti altrove 3. LIF-3i-reverted N-hPSC hanno più robusta capacità proliferativa e differenziazione nelle analisi di differenziazione diretto di hPSC convenzionali. N-hPSC richiede in genere una minore concentrazione di placcatura iniziale rispetto la hPSC convenzionali, e a differenza loro convenzionale hPSC innescato controparti, non richiedono l'uso di reagenti anti-apoptotici per migliorare la loro sopravvivenza clonale seguendo enzimatica digestione in saggi di differenziazione.
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Representative Results
Questo protocollo consente di ottimizzare efficiente reversione ingenuo-come con LIF-3i in entrambe le culture hPSC convenzionale lignaggio-innescato alimentatore-dipendenti e indipendenti dell'alimentatore (Figura 1). Il protocollo dettagliato, ivi descritto contorni adattamento sequenziale per LIF-3i a partire da entrambi condizioni hPSC Alimentatore-dipendente o senza alimentatore convenzionale (es. E8 medio).
Rappresentante risultati per la reversione di LIF-3i di parecchi hESC convenzionale e linee hiPSC transgeni sono presentati nella figure 1 – 3. Questi risultati tipici possono essere convalidati con la linea di commercialmente disponibile hESC H9, o con un commercialmente disponibili transgeni, cavo linea emoderivati episomal hiPSC (6.2) derivata nel laboratorio Zambidis8,9. Introduzione di un procedimento di adattamento LIF-5i iniziale consente altamente efficiente propagazione clonale successivi, alla rinfusa delle culture hPSC convenzionale nel LIF-3i e non richiede agenti anti-apoptotici o ROCK inibitori10 (Figura 1A, B ). Più piastre di hPSC ingenuo-come i campioni possono essere rapidamente raccolti per analisi successive o multilineage diretto differenziazione solo dopo 5 – 7 passaggi nel LIF-3i. In alternativa, LIF-3i culture possono essere crioconservate per future applicazioni. Post-scongelamento recupero delle cellule può essere migliorata (Figura 2) tramite l'inclusione di un inibitore ROCK in crioconservazione e post-disgelo media11.
I fattori determinanti della pluripotenza molecolare e funzionali, entrambi in vitro e nell'embrione erano recentemente rivisto2. Questi fattori includono il background genetico, cultura-collegata acquisizione di mutazioni di geni chiave dello sviluppo e le differenze nelle hESC e di derivazione hiPSC e di metodologie di cultura. Fornito di seguito è riportato un riepilogo di analisi standard che possono essere impiegati per la caratterizzazione e convalida di fenotipica, molecolari e funzionali pluripotencies di hPSC LIF-3i-reverted.
Morfologia di Colonia
La transizione tra sistemi di coltura innescato, convenzionale e LIF-3i-ripristinato è accompagnata da cambiamenti fisici distinti nella morfologia di hPSC Colonia (Figura 1B). HPSC convenzionale cellule proliferano come piatto, colonie di vasta monostrato che si espandono rapidamente da ciuffi di piccole cellule (il MEF o circostanze senza alimentatore), ma scarsamente come singole cellule. L'esposizione delle linee convenzionali hPSC a LIF-3i promuove la crescita e l'espansione e dei più piccoli, fitto, colonie a forma di cupola che clonally derivano da cellule singole. Questi cambiamenti morfologici sono completamente reversibili e LIF-3i-reverted colonie a forma di cupola spontaneamente possono transizione torna a una morfologia monostrato convenzionale se LIF-3i è ritirato e cellule sono ri-coltivate in medium hESC convenzionale standard completati con bFGF. Inoltre, espansione di cellule LIF-3i-ritornato alle alte densità confluenti (o coltura prolungata senza passaggio frequente) provoca la riacquisizione spontanea della morfologia piatta, convenzionale con ridotta efficienza clonale; sottolineando la necessità di manutenzione diligente e cura hPSC LIF-3i-ripristinato (ad es., < 40 – 60% confluenza).
Vivere a immunofluorescenza e analisi citofluorimetrica dei marcatori di pluripotenza superficie
Valutazione di marcatori di pluripotenza durante la transizione da convenzionale a uno stato ingenuo-simile cultura LIF-3i continua seguente possono essere monitorati utilizzando modo non invasivo dal vivo anticorpo che macchia senza rilevare effetti negativi su LIF-3i/MEF espansione ( ad es., live-macchiatura di anticorpi coniugati fluorocromo contro TRA-1-81, TRA-1-60 e SSEA4).
Mantenimento della pluripotenza durante LIF-3i reversione anche può essere regolarmente monitorata da analisi cytometric di flusso dell'espressione dei marker di superficie pluripotenza-collegata di TRA-1 e gli antigeni SSEA durante singola cella passaggio (Figura 1C) o immunofluorescenza di intatto, risolto colonie in situ (Figura 3). Anche se questi indicatori non discriminano tra convenzionale e Stati LIF-3i, i loro livelli correlano inversamente con la frequenza di differenziazione spontanea che può verificarsi in hPSC durante la transizione da hPSC convenzionali alle condizioni LIF-3i. Gli antigeni di superficie aggiuntivi che più specificamente contrassegno stati ingenui-come umani in vitro2,12,13 maggio possono essere impiegati anche per rilevare efficace LIF-3i hPSC reversione.
Convalida della pluripotenza molecolare di N-hPSC
Perché i precedenti genetici di hPSC linee sono stato caratterizzato come un forte contributo alla variabilità di interline, è importante valutare rigorosamente isogeniche culture al matching punti temporali cultura quando si confrontano sistemi di coltura hPSC (Figura 4). Poiché alcuni di questi sistemi hanno già dimostrati di generare hPSC popolazioni con configurazioni genomica ed epigenetici aberrante2, qualsiasi metodo di reversione ingenuo deve essere analizzato con un numero di N-hPSC degli ambiti di provenienza genetici indipendenti, in modo che è sufficiente per convalidare riproducibilità biologica ed escludere gli Stati non-inerente allo sviluppo rilevanti "pseudo-pluripotenti" (cioè, con evidenti caratteristiche di pluripotenza molecolare ma manca la capacità di differenziazione funzionale). Zimmerlin et al. ulteriormente esteso la convalida del sistema cultura LIF-3i per includere diluire il pluripotencies molecolare e funzionale di ripristinato N-hiPSC derivato da vari metodi di riprogrammazione, che è un altro contributore conosciuto putativo di variabilità funzionale tra pluripotenti afferma2.
Di conseguenza, maggior parte degli studi dei sistemi di coltura umana ingenuo sono concentrati su analizzante pluripotenza molecolare di N-hPSC a 1) il livello epigenetico (ad es., marchi dell'istone di sequenziamento di ChIP o ChIP-PCR, metilazione globale del DNA immunoblots o intero genomica del bisolfuro, allele-specifico CpG metilazione microarrays, OCT4 enhancer predominante utilizzo di sistemi reporter, attività globale a elementi regolatori di dnasi ho ipersensibilità e ripetere elemento profilatura mediante sequenziamento di RNA), 2) trascrittomica livello (RNA-sequenziamento, espressione microarrays e RT-PCR quantitativa), analisi di espressione di proteine (ad es., FACS, microscopia di immunofluorescenza e Western blotting) e 3) tramite gli studi metabolici (ad es., glicolisi, ossidativo metabolismo di fosforilazione e la nicotinammide). Esempi rappresentativi delle macchie di immunofluorescenza e Western blot rilevamento di espressione per gli indicatori chiavi della pluripotenza molecolare sono mostrati (Figura 3B, C). Ad esempio, mostrato in figura 3B sono attivata fosforilata (fosfo) e totale isoforme di STAT3 ed ERK1/2, che sono caratteristiche chiave molecolare del mouse ESC-come ingenuo pluripotenza. Questi sono stati rilevati usando gli anticorpi primari anti-STAT3 e anti-ERK1/2. Inoltre, pluripotenza funzionale nelle analisi di differenziazione di teratoma è dimostrata in convenzionale vs. LIF-3i-reverted hPSC teratoma tessuti dissecati 10 settimane dopo l'iniezione e fissa in 4% formaldeide e paraffina embedded (Figura 3D).
Preparazione di LIF-3i/MEF o hESC/MEF/bFGF campioni per analisi molecolari a valle dovrebbe includere lo svuotamento MEF. Due approcci sono descritti sopra per lo svuotamento di MEF che sono stati impiegati con successo nel nostro laboratorio. Pre-placcatura MEF è un semplice, affidabile e conveniente metodo per eliminare gli alimentatori da N-hPSC campioni per gli studi molecolari ed è un alternativa preferita alla separazione di FACS o Mac (cioè, anti-TRA-1-81 o anti-TRA-1-60 anticorpo-ha basato la separazione ). Inoltre, spontaneamente-differenziante di cellule aderenti TRA-1-negative in LIF-5i/LIF-3i culture possono essere rapidamente eliminate da LIF-5i/LIF-3i N-hPSC culture prima del successivo passaggio di LIF-3i sul MEF fresco da pre-placcatura enzimaticamente digerito cellule singole per 1h su piastre pre-rivestite con gelatina di 0,1% (Figura 2).
Valutazione della pluripotenza funzionale di N-hPSC
Il test più rigoroso della pluripotenza funzionale di PSC è l'analisi di chimera iniezione blastocisti, che è limitata nella sperimentazione delle linee N-hPSC per motivi etici. In alternativa, diversi gruppi che hanno segnalato la generazione di N-hPSC con vari altri metodi hanno tentato di generare chimere interspecie. Tuttavia, questi tentativi hanno dato i contributo estremamente basso o negativo di differenziata N-hPSC lignaggi agli embrioni murini o suini, in confronto la capacità di generazione di chimera di mouse standard ESC2.
Ulteriori studi funzionali hanno studiato diretto in vitro differenziazione dei presunti N-hPSC derivato mediante vari metodi, ma hanno rivelato la capacità di differenziazione di multilineage tendenziose, difettoso o diminuita, con concomitante che harboring le anomalie epigenetiche2,13. Simili aberrazioni di epigenomic, soprattutto ai loci impressi, sono state rilevate in mouse ESC dopo l'esposizione prolungata al cocktail LIF-2i14. È interessante notare che, alcuni sistemi di coltura di reversione sono segnalati miglioramenti di attributi specifici di pluripotenza funzionale del PSC come ad esempio la capacità migliorata per in vivo delle cellule trofoblastiche contributo2,15 .
Utilizzando una vasta collezione di derivato in modo indipendente LIF-3i-reverted hPSC, Zimmerlin et al. impiegati dosaggi di differenziazione di multilineage per mostrare che il sistema di LIF-3i migliora drammaticamente la pluripotenza funzionale delle linee convenzionali hPSC 3. questo permette l'analisi sistematica di convenzionale vs LIF-3i hPSC linee a isogeniche coppie per eliminare le variazioni di interline-dipendente (Figura 4). LIF-3i-reverted hPSC linee non richiedono un passaggio ri-adescamento prima differenziazione di EB. Tuttavia, LIF-3i hPSC proliferano a tassi significativamente più alti clonali di cellule isogeniche ampliato in E8, e così, iniziale più bassa densità di placcatura richiedono regolazione per consentire ogni cultura raggiungere confluenza ad un determinato timepoint simili.
Gli investigatori ordinariamente dovrebbero utilizzare saggi multipli per dimostrare la funzionalità migliorata di hPSC LIF-3i-reverted che include non solo in vivo teratoma saggi, ma anche in vitro diretto differenziazione saggi per neurale, definitivo endoderma e hematovascular lignaggi3 utilizzando saggi multipli (per esempio, 2D APEL3,16 e sistemi di17,18 3D embryoid body). Per controllare per la riproducibilità del dosaggio-dipendente, devono essere eseguite almeno due metodi diversi di differenziazione in replica per ogni coppia isogeniche di hPSC innescato/LIF-3i culture(ad esempio, nella figura 4, APEL, embryoid body protocolli di differenziazione). Il disegno sperimentale dovrebbe includere un numero di robusto (ad es., > 3 – 5) innescato/LIF-3i isogeniche paia di hPSC linee da sfondi genetici multipli, donatore indipendente (Figura 4).
Figura 1: Una graduale transizione dalle culture di hPSC convenzionale, lignaggio-innescato all'ingenuo-come le circostanze con il metodo di LIF-3i. (A) Schema di protocolli per la graduale LIF-3i reversione. (Top schematica) Un metodo generale per la transizione di innescato, hPSC convenzionale a culture LIF-3i. (Schemi di fondo) Due strategie riepilogati per LIF-3i ingenuo reversione del convenzionale (primer) hPSC coltivati su alimentatore (cioè, Primed/MEF per LIF-3i/MEF) oppure alimentatore senza condizioni (cioè, Primed/E8 di LIF-3i/MEF). Morfologie di PSC umano (B) . Vengono mostrati rappresentante microfotografie di hPSC durante LIF-3i reversione utilizzando una riga di iPSC episomal umano disponibile in commercio (6.2). Indicato sono le transizioni osservate fra colonie iniziali monostrato piatto convenzionale e le colonie successive clonogenic a forma di cupola che sorgono seguente passaggio intermedio LIF-5i e stabili condizioni di coltura LIF-3i. Scala bar = 200 µm. (C) rappresentante analisi cytometric di flusso degli indicatori della superficie pluripotenza. Vengono mostrati TRA-1-81 e SSEA-4 superficie espressioni in linea convenzionale hPSC 6.2 (p40) espanse in E8, il passaggio iniziale nel LIF-5i/MEF e seguente i passaggi da 1 a 9 (P1-P9) in condizioni di LIF-3i. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Crioconservazione degli N-hPSC e preparazione del campione di pre-placcatura MEF. (A) esempio di un ciclo di congelamento/scongelamento delle culture LIF-3i/MEF. La linea di iPSC derivate dal sangue, non integrato, transgeni umano convenzionale cavo E5C3 è stato derivato e ampliato su alimentatori MEF in hESC supplementato con bFGF 4ng/mL per 18 passaggi. E5C3 convenzionale, lignaggio-innescato erano adattati in LIF-5i (a sinistra) e la transizione in mezzo LIF-3i per 3 passaggi (centro). Le cellule di E5C3 LIF-3i mostrate nel pannello centrale cryopreserved usando DMSO-based crioprotettore medium (tabella 2; 1 x 106 cellule per flaconcino) e conservati in azoto liquido). Un flaconcino è stato scongelato un mese più tardi e le cellule E5C3 sono state trasferite in un alimentatore rivestite bene di una piastra a 6 pozzetti (a destra). Recupero delle cellule può essere migliorata arricchendo il terreno di LIF-3i con 5 µM Y-27632 per post-disgelo di solo un giorno. Scala bar = 200 µm. (B) eliminazione del MEF (e anche le cellule aderenti differenziato TRA negativo) in colture di hPSC LIF-3i/MEF dal metodo pre-placcatura. Indicato è flusso cytometric analisi prima e dopo pre-placcatura di PE-coniugato anti-TRA-1-81 e anticorpi TRA-1-60, gli anticorpi coniugati APC SSEA-4 e SSEA-1/CD15 anticorpi dimostrando lo svuotamento dell'antigene TRA-1 negativo e cellule MEF utilizzando il Metodo di pre-placcatura di un'ora. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Caratterizzazione della pluripotenza in LIF-3i/MEF N-hPSC culture. (A) marcatori di pluripotenza superficiale e nucleare. Espressione del fattore di pluripotenza NANOG nella (isogeniche) stesso del TRA-1-81+SSEA4+ convenzionale, innescato cavo emoderivati hiPSC linea E5C3 (p39) espanso in innescato (E8) o ingenuo LIF-3i (+ p8 in LIF-3i/MEF) condizioni. Le macchie immunofluorescente delle culture hPSC rappresentante su diapositive di camera hanno rivelato l'espressione del fattore di pluripotenza core NANOG in SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC coltivate in innescato, convenzionale (E8 medio) o LIF-3i/MEF uniforme, nucleare condizioni. Barra della scala = 100 µm. (B) analisi di Western blot. STAT3 (a sinistra), ERK (centro) e controllo l'espressione della proteina beta-actina per una rappresentante hPSC (linea hESC H9) in condizioni di LIF-3i/MEF (3i) o convenzionale (E8 medio). (C) l'espressione di fattori di trascrizione di pluripotenza-collegata di ingenuo. Vengono mostrati STELLA/DPPA3, NR5A2 e TFCP2L1 dall'immunofluorescenza in una cultura di LIF-3i/MEF rappresentativa (cavo emoderivati hiPSC linea E5C3 a p33 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Barra della scala = 100 µm. Teratoma (D) le analisi di hPSC convenzionale e LIF-3i-ripristinato. Convalida della pluripotenza funzionale in una linea di hiPSC rappresentante isogeniche (cavo E32C6 emoderivati) coltivate in entrambi E8 (p9) o LIF-3i/MEF (+ p12), dall'analisi di teratoma. 10 x 106 cellule di hPSC LIF-3i-reverted isogeniche vs convenzionale, innescato parallelo-coltivati sono state iniettate per via sottocutanea nelle membra dei topi immunodeficienti NSG. Le macchie dell'eosina e di teratoma microsezioni ha rivelato robusta differenziazione in tutti i tre strati di germe con ben strutturato ectoderma (Rosetta neurale: NR, epitheliam pigmentato retinico: RPE), mesoderma (condroblasti: Ch) ed endoderma (ghiandolare tessuto: GI) lignaggi. Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto di pluripotenza funzionale tra Stati isogeni innescati e ingenuo. (A) schematica della strategia per la valutazione funzionale pluripotenza, stati distinti pluripotenti in isogeniche convenzionale vs hPSC LIF-3i coltivate nei protocolli di differenziazione indipendente. Indicato sono due progenitrici emato-vascolare differenziazione sistemi (APEL monostrato e sistemi del corpo embryoid 3D (EB)) che in precedenza sono stati impiegati per valutare la potenza di differenziazione di convenzionale vs LIF-3i-ripristinato nella stessa linea hPSC (isogeniche) coltivate in parallelo reversione LIF-3i con stessi numeri di passaggio. LIF-3i-reverted hPSC linee non richiedono una fase di ri-adescamento prima differenziazione EB e sono sottoposti al protocollo di differenziazione direttamente. (B) sistema di differenziazione vascolare progenitrici (VP) EB. Il sistema di differenziazione 3D EB impiegato per questo studio è stato descritto in precedenza17,18. Vengono mostrati i risultati rappresentativi al giorno 10 di differenziazione EB (pannelli a sinistra) per isogeniche culture del sangue cordonale stesso (CB)-derivato E5C3 hPSC linea9, coltivate in entrambi convenzionali hESC/MEF (Primed / MEF) condizioni o ingenuo LIF-3i/MEF condizioni. Analisi di citometria a flusso di queste cellule EB mostrano aumenti drammatici di CD31+CD146+ VP popolazioni seguendo LIF-3i reversione della linea E5C3 prima della differenziazione. L'istogramma visualizza la media ± SD di CD31+CD146+ VP cella percentuali recuperate al giorno 10 in questo sistema EB utilizzando isogeniche tre coppie di linee indipendenti hPSC (cioè, due CB-hiPSC e un adulto del fibroblasto-derivato hiPSC, linee tratteggiate collegare isogeniche coppie). Risultati dimostrano il significativo miglioramento delle efficienze di differenziazione VP nel sistema EB attraverso ambiti di provenienza genetici di linee multiple di hPSC. (C) sistema di differenziazione di APEL monostrato vascolari del progenitore. Convenzionali (innescato E8) e LIF-3i-reverted hPSC può essere direttamente differenziate utilizzando le stesse condizioni di coltura, fattori di crescita, citochine e piccole molecole della graduale differenziazione endoteliale APEL protocollo 3, 16. vengono mostrati esperimenti indipendenti di differenziazione di APEL utilizzando la linea di hiPSC derivate dal sangue del cordone E5C3 e la percentuale di CD31+CD146+ popolazioni di progenitrici vascolari a giorno 7 di differenziazione di APEL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il sistema di LIF-3i si applica una versione modificata del classico 2i murino ingenuo reversione cocktail1 a cellule staminali pluripotenti umane. L'auto-rinnovamento di hPSC (che non può espandersi in 2i da solo) è stabilizzato in LIF-2i completando questo cocktail con l'inibitore di tankyrase XAV939. LIF-3i cultura permette alla rinfusa e reversione efficiente della hPSC convenzionale ad uno stato pluripotenti che assomiglia l' epiblasto preimpianto umano3. Anche se i meccanismi di azione di XAV939 in hPSC probabile complesso e sinergico con 2i, essi probabilmente sono al minimo, un importante stabilizzazione e l'aumento di hPSC auto-rinnovamento via WNT segnalazione vie3.
HPSC convenzionale culture normalmente adottano uno spettro degli Stati pluripotenti con espressioni geniche di lignaggio-innescato altamente variabile e post-impianto epiblasto epigenetici contrassegni che possono provocare la pluripotenza funzionale incoerente o diminuita2 . Questo innesco inerente lignaggio delle culture hPSC convenzionali può interferire con la reversione di LIF-3i successo di alcune linee di hPSC2. Tuttavia, l'inclusione del passo iniziale di adattamento LIF-5i (tabella 1) nel metodo LIF-3i universalmente allarga l'efficienza di reversione LIF-3i tra una moltitudine di linee hPSC e promuove la massa ingenuo reversione delle linee convenzionali hPSC in maniera che aggira noioso picking e subcloning di rare ingenuo-reverted colonie, o la necessità di impiego di molecole di routine anti-apoptotici per stabilizzare la loro sopravvivenza.
Il metodo di reversione ingenuo LIF-5i/LIF-3i è riproducibile in un'ampia varietà di linee di hESC e hiPSC. Esso richiede un addestramento minimo con abilità di cultura di base delle cellule. Zimmerlin et al. impiegato con successo questa strategia sequenza per ripristinare > 30 indipendente hESC e linee hiPSC transgeni da una vasta gamma di donatori 3. Un singolo passaggio in LIF-5i (Figura 1) è sufficiente per la maggior parte delle linee hPSC subiscono reversione ingenuo efficiente nelle culture hPSC alla rinfusa, e promuovere ulteriormente la loro successiva manutenzione stabili ed espansione in LIF-3i da solo.
Inoltre, il sistema di LIF-3i/MEF supporta efficienze di espansione clonale robusta massa durante tutti i passaggi tra la cultura di lignaggio-innescato hPSC convenzionale fino a completata ingenuo-come hPSC reversione (cioè., adattamento, transizione ed espansione per 7 – 10 passaggi in LIF-3i/MEF da solo). Anche se l'attuale formulazione di questo sistema di coltura richiede supporto alimentatore, un metodo semplice e conveniente per vuotare gli alimentatori mediante la tecnica di pre-placcatura per l'analisi delle culture LIF-3i è presentato (Figura 2).
Più altri cultura sistemi inoltre sono stati segnalati per promuovere hPSC convenzionale a simili pluripotenti ingenuo-come afferma2. Anche se questi sistemi di coltura hPSC hanno contato anche sull'utilizzazione delle condizioni del mouse classico ingenuo 2i, nella maggior parte dei casi questi metodi passaging unicellulare richiesto anche modulazione chimica supplementare per stabilizzare un intrinsecamente instabile / stato metastabile ingenuo umano. D'importanza, la maggior parte di questi altri metodi hanno dimostrato compromissione funzionale pluripotenza seguendo la differenziazione e/o acquisite epigenomic anormale imprime o karyotypes2. Anche se l'emersione dei karyotypes anormali all'interno delle culture di hPSC innescato convenzionale è già ben documentato19, prolungato, unicellulare passaggio metodi enzimatici che ordinariamente sono impiegati nella maggior parte dei metodi di reversione ingenuo. Ciò è stato dimostrato anche in grado di potenziare la generazione di anomalie cromosomiche configurazioni20,21; tecniche più sensibili (ad esempio, variazioni del numeri di copie, polimorfismo a singolo nucleotide) possono rivelare ulteriori alterazioni22,23.
Al contrario, un ampio repertorio di LIF-3i-reverted hPSC linee sono stati confermati per possedere i karyotypes normali a bassa-media passaggi (ad es., p5-p15) e anche a numeri di passaggio alto (ad es., > p30) seguendo LIF-3i cultura3. Inoltre, epigenomic impronte nella LIF-3i-reverted hPSC trovate riproducibile normale e intatto al posto di 5 – 10 passaggi LIF-3i reversione2. Utilizzando la piattaforma di matrice sensibile allele-specifico commerciale metilazione, è stato precedentemente dimostrato che segni di metilazione di CpG ai loci impressi di un vasto repertorio di LIF-3i-reverted hPSC linee (4 – 7 passaggi seguenti LIF-3i) sono stati trovati per essere grossolanamente normale in struttura1. Poiché i karyotypes e anormale impronte genomiche in ultima analisi, possono compromettere la capacità funzionale di hPSC, linee guida dei prerequisiti sono state delineate nel presente protocollo che incoraggia i ricercatori a convalidare hPSC culture prima e dopo reversione ingenuo, usando questo Metodo così come gli altri.
Il metodo di LIF-3i migliorato pluripotenza funzionale attraverso strati di germe in un vasto repertorio di hESC e linee hiPSC non transgenica (Figura 3). A differenza di altri protocolli di reversione ingenuo, il metodo di LIF-3i non non richiedono una fase di ri-autoadescante per successiva differenziazione di N-hPSC (cioè, riconversione N-hPSC condizioni convenzionali innescate prima del loro utilizzo in diretto saggi di differenziazione). LIF-3i-reverted N-hPSC visualizzare significativamente più efficiente capacità di differenziazione rispetto alle loro controparti isogeniche hPSC convenzionale in entrambe le analisi teratoma (Figura 3D) e diretto protocolli di differenziazione dei lignaggi di tutti tre strati di germe2. A causa di dosaggio-dipendente e interline variazioni di collaudo funzionale di hPSC convenzionale, differenziazione di lineage-specifici dovrebbe essere valutata utilizzando protocolli di differenziazione diretto indipendente e hPSC derivato da più ambiti di provenienza genetici. Utilizzando un'attenta progettazione sperimentale, una vasta gamma di linee di hPSC può essere previsto per migliorare significativamente la loro efficienza di multilineage differenziazione rispetto alle loro controparti convenzionali isogeniche seguendo 4 – 10 passaggi in condizioni di LIF-3i.
In sintesi, questo metodo rapidamente e clonally espande il numero di umani PSC, migliora l'efficienza di differenziazione a valle, aumenta i numeri di cellule progenitrici lignaggio-commesso successivi differenziazione e diminuzioni interline variabilità tra le linee convenzionali, lignaggio-innescato hPSC. Questi N-hPSC con funzionalità migliorate ulteriormente può avere un ampio impatto per il loro potenziale contribuire tessuti funzionali a un embrione di sviluppo. Ad esempio, N-hESC stabile può essere impiegato per lo sviluppo di organi trapiantabili umani e cellule staminali adulte nello sviluppo animale chimere, o per la generazione di umanizzato gene targeting modelli animali della malattia. L'ulteriore ottimizzazione di questo metodo di LIF-3i inibitore-utilizzando tankyrase in definito privo di alimentatore secondo GMP condizioni di coltura faciliterà la generazione efficiente clinicamente utile di una vasta gamma di tipi di cellule funzionali ed engraftable per uso terapeutico.
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Disclosures
Con un accordo di licenza tra Life Technologies e la Johns Hopkins University (JHU), Dr. Zambidis è diritto a una quota di royalty ricevute dall'Università per le licenze delle cellule staminali. I termini di questo accordo sono gestiti da JHU secondo le proprie politiche di conflitto di interessi. Questo non altera l'adesione degli autori alle politiche di giornale sulla condivisione di dati e materiali.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH/nia (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award e la Fondazione di Moseley.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
References
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