Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kjemisk hjemfall til konvensjonelle menneskelige Pluripotent stamceller til en naiv-lignende tilstand med forbedret Multilineage differensiering styrke

Published: June 10, 2018 doi: 10.3791/57921
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en protokoll for effektiv, bulk og rask kjemiske hjemfall til konvensjonelle avstamning-primet menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) i en epigenomically-stabil naive preimplantation epiblast-lignende pluripotent tilstand. Denne metoden resulterer i redusert avstamning-primet genuttrykk og markert forbedring i regissert multilineage differensiering over et bredt repertoar av konvensjonelle hPSC linjer.

Abstract

Naive menneskelige pluripotent stamceller (N-hPSC) med forbedret funksjonalitet kan ha en bred innflytelse i regenerativ medisin. Målet med denne protokollen er effektivt gå avstamning-primet, konvensjonell menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) vedlikeholdes på enten mater-fri eller mater-avhengige betingelser som en naiv som pluripotency med forbedret funksjonalitet. Denne kjemiske naiv hjemfall metoden bruker den klassiske leukemi hemmende faktoren (LIF), GSK3β, og MEK/ERK hemming cocktail (LIF-2i), med bare en tankyrase hemmer XAV939 (LIF-3i). LIF-3i tilbakestilles konvensjonelle hPSC til en stabil pluripotent tilstand vedta biokjemiske, transcriptional og epigenetic funksjoner av den menneskelige før implantasjon epiblast. Denne LIF-3i metoden krever minimal celle kultur manipulasjon og er svært reproduserbare i et bredt repertoar av menneskelige embryonale stamcelleforskningen (hESC) og transgene uten menneskelig indusert pluripotent stamceller (hiPSC) linjer. Metoden LIF-3i krever ikke et nytt grunning skritt før differensiering; N-hPSC kan være differensiert direkte med ekstremt høy effektivitet og opprettholde karyotypic og epigenomic stabilitet (inkludert på trykt loci). For å øke universalitet metoden, konvensjonelle hPSC er første kultivert i LIF-3i cocktail med to flere små molekyler som forsterke protein kinase en (forskolin) og soniske pinnsvin (SSH) (purmorphamine) signalering (LIF-5i). Dette korte LIF-5i tilpasning trinnet vesentlig forbedrer første klonal ekspansjon av konvensjonelle hPSC og tillater dem å være senere naiv-tilbake med LIF-3i alene i bulkmengder, så obviating behovet for plukking/subcloning sjeldne N-hPSC kolonier senere. LIF-5i-stabilisert hPSCs vedlikeholdes senere i LIF-3i alene uten behovet av anti-apoptotisk molekyler. Viktigst, forbedrer LIF-3i hjemfall markert den funksjonelle pluripotency av et bredt repertoar av konvensjonelle hPSC ved å redusere deres slektslinje-primet genuttrykk og slette interline variasjon av rettet differensiering vanligvis observert blant uavhengige hPSC linjer. Representant characterizations av LIF-3i-vende N-hPSC er angitt, og eksperimentell strategier for funksjonell sammenligninger av isogenic hPSC i avstamning-primet vs. naive som stater er beskrevet.

Introduction

2i (MEK/ERK og GSK3β inhibitor) kultur-systemet ble opprinnelig utviklet for å avgrense heterogene serum-baserte mus embryonale stamceller (mESC) kulturer til en jevn bakken tilstand av pluripotency som musen preimplantation epiblast1. 2i støtter imidlertid ikke stabil vedlikehold av menneskelig pluripotent stamceller (hPSC) linjer2. De ulike komplekse små molekyl, vekst faktor-supplert, og transgene tilnærminger har nylig rapportert å fange åpenbart ligner menneskelige naiv som pluripotent molekylær sier2. Men mange av "naive-like" delstater som er opprettet med disse også utstilt karyotypic ustabilitet, epigenomic feil (f.eks globale tap av foreldrenes genomisk preging) eller svekket differensiering potensielle.

I kontrast, cocktail av trippel kjemiske hemming av GSK3β, ERK og tankyrase signalene og leukemi hemmende faktor (LIF-3i) var tilstrekkelig for den stabile naiv som hjemfall av et bredt repertoar av konvensjonelle hPSC linjene3. LIF-3i-vende naive hPSC (N-hPSC) beholdt normale karyotypes og økt deres uttrykk av naiv-spesifikke menneskelig preimplantation epiblast gener (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hjemfall også gitt en hPSC med et utvalg av molekylære og biokjemiske egenskaper som er unike for mESC-lignende naiv pluripotency som inkludert økt fosforylert STAT3 signalnettverk, redusert ERK fosforylering, globale 5-methylcytosine CpG hypomethylation, genomet hele CpG demethylation på embryonale stamcelleforskningen (ESC)-spesifikke genet arrangører og dominerende distale OCT4 enhancer bruk. Videre i forhold til andre naiv hjemfall metoder som resulterte i aberrantly hypomethylated trykt genomisk loci, LIF-3i-vende N-hPSC ble blottet for systematisk tap av trykt CpG mønstre eller tap av DNA methyltransferase uttrykk (f.eks DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

En direkte LIF-3i kultur for et bredt spekter av konvensjonelle menneskelige embryonale stamceller (hESC) og menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSC) dyrket på matere eller E8 mater-gratis forhold oppnådd rask og bulk hjemfall til en naiv epiblast-lignende tilstand. Direkte LIF-3i naiv hjemfall kan imidlertid være ineffektiv i noen ustabil konvensjonelle hPSC linjer på grunn av de iboende genomisk og avstamning-fylt variabilities som oppstår fra genetisk ulike donor bakgrunn.

Dermed for å utvide nytten av metoden LIF-3i, en gradvis optimalisering utviklet og presenteres her, som gjør universell naiv hjemfall med nesten alle konvensjonelle hESC eller transgene-fri hiPSC linje kultivert på matere. Denne universalized naiv hjemfall metoden bruker et forbigående første kultur skritt i konvensjonelle hPSC som supplerer LIF-3i cocktail med to flere små molekyler (LIF-5i) som forsterke protein kinase en (forskolin) og () soniske pinnsvin (SSH) purmorphamine) signalering. En første passering av konvensjonelle hPSC i LIF-5i tilpasser dem til etterfølgende stabil LIF-3i hjemfall i bulkmengder. Første LIF-5i tilpasning betydelig forsterker første enkelt celle klonal spredning av konvensjonelle hPSC dyrket på E8 eller matere (før deres påfølgende stabil, sammenhengende passasje i LIF-3i alene). Konvensjonelle hPSC linjer tilpasset først tolerere til en passasje i LIF-5i påfølgende bulk klonal passaging naiv-vende celler i LIF-3i forhold, som obviates behovet for plukking og subcloning av de sjeldne stabile koloniene eller rutinemessig bruk av anti-apoptotisk molekyler eller Rho-assosiert protein kinase (ROCK) hemmere.

Metoden LIF-3i har vært vellykket ansatt stabilt utvide og vedlikeholde et bredt repertoar av > 30 uavhengig, genetisk ulike konvensjonelle hPSC linjer for > 10-30 passasjer med enten ikke-enzymatisk eller enzymatisk dissosiasjon metoder og uten bevis for induksjon av chromosomal eller epigenomic avvik, inkludert unormalt på trykt genet loci. I tillegg sekvensiell LIF-5i/LIF-3i kultur er bare naiv hjemfall metoden som hittil er rapportert som forbedrer den funksjonelle pluripotency av et bredt repertoar av konvensjonelle hPSC linjer ved å redusere deres slektslinje-primet genuttrykk og dramatisk forbedrer deres multipotent differensiering styrke. LIF-3i naiv hjemfall metoden sletter iboende interline variasjon av avstamning-primet, konvensjonell hPSC linjer, og har en stor nytte av programmet i regenerativ medisin og mobilnettet terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjer for dyr omsorg og protokoller som er godkjent av Johns Hopkins skolen av medisin Institutt for dyr omsorg og bruk Committee (IACUC).

1. forberedelse av mus embryonale fibroblaster (MEF) til mater-avhengige Conventional (hESC medium/MEF) eller naiv-tilbake (LIF-3i medium/MEF) hPSC kultur

  1. Kjøpe eller forberede in-house lav-passasjen forsyninger av MEF feeders fra CF1 eller CF1 x DR4 hybrid E13.5 mouse embryoer følgende publiserte protokoller4.
    1. Cryopreserve lav passasje (p1-p2) MEF kulturer før (for langsiktig lagring) eller etter (for opptil 6 måneder) bestråling og lager i flytende nitrogen som tidligere beskrevet4.
    2. Irradiate (5000 rad) bulk utvidet MEF under p5 bruker en γ - eller X-ray-irradiator og forberede dele på 1,5 x 106 celler per medisinglass kortsiktige lagring (mindre enn 6 måneder) ved-80 ° C i en ultra lav temperatur fryseren.
    3. Tallerkenen mellom 1.2 x 106 (fersk bestrålt ikke-cryopreserved) og 1,5 x 106 (bestrålt cryopreserved) MEF per en 6-vel gelatinized plate for å forberede mater kulturer, som beskrevet nedenfor.
  2. Forberede gelatin belagte 6-vel sterilt vev kultur-behandlet plater ved å legge til 1,5 mL steril 0,1% gelatin løsning i hver brønn i en biologisk sikkerhet regjering.
  3. Inkuber gelatin belagte plater ved 37 ° C i minst 1 time eller over natten i et laboratorium CO2 inkubator.
  4. På den neste dagen, tine lav passasje (f.eks P2 til P4) DMSO-cryopreserved og bestrålt (5000 rad) MEF i henhold til fremgangsmåten som er oppgitt nedenfor.
    Merk: Ikke-bestrålt MEF bør også være tint, utvidet og bestrålt umiddelbart før bruk.
  5. Plass en cryopreserved MEF-aliquot i et vannbad 37 ° C. Tine, sterilisere røret med etanol og umiddelbart fortynne den DMSO kryoprotektant minst 10 ganger med MEF medium (tabell 1) innen en biosafety kabinett (f.eks overføring 1 mL DMSO-MEF aliquot til 9 mL MEF medium i et sterilt 15 mL konisk).
  6. Sentrifuge utvannet MEF cellene på 200 x g i 5 min i sterilt 15 mL konisk rør.
  7. I en biosafety skap, Sug opp og kaste cellen uten nedbryting og resuspend celle pellet i 1-2 mL frisk MEF medium.
  8. Forsiktig kaste gelatin løsningen og legge 2 mL MEF re suspendert i MEF medium i hver brønn av en gelatinized 6-vel plate, som angitt ovenfor. Antall MEF celler og plate 1.2 x 106 (fersk bestrålt ikke-cryopreserved) eller 1,5 x 106 (bestrålt cryopreserved) MEF per en 6-vel gelatinized plate.
    Merk: Alle celle kultur platene som overføres fra CO2 inkubator til biosikkerhet regjering kan tørkes forsiktig med etanol sprayet papir, men bør ikke være direkte sprayet på med 70% etanol løsning å unngå etanol spredning i brønnene.
  9. Inkuber MEF plater på 37 ° C over natten i et laboratorium CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære) for å tillate vedlegg, før å bruke.

2. bulk stabilisering av konvensjonelle hPSC kulturer for påfølgende naiv hjemfall med en kort LIF-5i tilpasning steg

  1. Valider alle konvensjonelle hPSC linjer for andre en normal karyotype av G-banding, før begynnelsen LIF-5i/LIF-3i hjemfall.
    Merk: LIF-3i hjemfall høy-passasjen konvensjonelle hPSC linjer (f.eks., P > 40-50) bør unngås, siden disse kulturene kan allerede havn genomisk avvik som kan negativt påvirke stabil, effektiv og bulk LIF-3i hjemfall av primet, convetional hPSC linjene.
  2. Opprettholde og utvide konvensjonelle hPSC kulturer med godkjente normale karyotypes i et MEF-baserte kultur-systemet (som beskrevet i del 1), eller en mater-fri kultur-systemet (i henhold det etterforsker preferanse).
    Merk: Begge mater-avhengige hPSC/MEF cocultures (f.eks hESC medium (tabell 1) med 4-10 ng/mL bFGF) eller mater-fri (f.eks., E8 5 eller mTSER 6 medier (i henhold til produsentens instruksjoner om vitronectin-belagt plater) metoder er kompatible med bulk naiv hjemfall bruker LIF-5i/LIF-3i/MEF systemet (figur 1). Ikke-enzymatisk metoder er foretrukket for passaging av konvensjonelle hPSC før forberede dem for hjemfall. LIF-5i og LIF-3i media formuleringer inneholder ikke antibiotika eller soppdrepende midler. Standardoperasjon regler for biosikkerhet CAB sterilitet og vedlikehold forventes å følges strengt for å unngå eventuelle bakterier og sopp forurensning.
  3. For MEF-baserte kultur systemet, forberede MEF matere i gelatinized 6-og platen som beskrevet i del 1 minst en dag før passaging LIF-5i-tilpasset konvensjonelle hPSC kulturer.
  4. Når konvensjonelle hPSC kulturer har nådd ~ 50% confluency (dvs. 3-5 dager etter første plating), erstatte standard hESC kultur medium med LIF-5i medium (2 mL per bra; Tabell 1).
    Merk: Disse trinnene i en biosafety kabinett.
  5. Kultur og vedlikeholde konvensjonelle hPSC/MEF for opptil 2 dager i LIF-5i CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære). Endre LIF-5i mediet daglig for å tilpasse dem for senere avsnitt og stabil hjemfall i LIF-3i.
  6. Alternativt, for mater-fri konvensjonelle kulturer (f.eksi E8), kultur hPSC i LIF-5i bare overnatting før passaging neste morgen.
    Merk: LIF-5i og LIF-3i kulturer kan både vedlikeholdes atmosfæriske (21% O2) eller fysiologiske (5% O2) oksygen nivåer i CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære).
  7. Før passaging, plassere kultur platene i et biosikkerhet skap, vask LIF-5i-tilpasset konvensjonelle hPSC gang med PBS og tilsett 1 mL av cellen dissosiasjon reagens hver brønn. Inkuber i 5 min på 37 ° C i en CO2 inkubator, og forsiktig triturate med en pipette i en enkeltcelle suspensjon i biosikkerhet kabinett.
    Merk: Ikke-enzymatisk dissosiasjon buffere kan også brukes for å forberede enkeltceller for passaging.
  8. Samle celle suspensjon i hESC medium (minst 2-fold fortynning) i et sterilt 15 mL konisk rør, og forsiktig triturate celler av pipettering for å få en enkeltcelle suspensjon.
  9. Sentrifuge på 300 x g i 5 min leveringstanken/forkaste nedbryting og resuspend celle pellet i 1-2 mL LIF-5i mediet i biosikkerhet kabinett. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisk celle teller.
  10. Vask pre belagt MEF platen to ganger med PBS (2 mL per brønn i 6-vel plater) og distribuere 1-2 x 106 celler (i 2 mL LIF-5i medium) på 1 godt av PBS-vasket MEF plate.
  11. Justere og optimalisere første plating tettheter for hver individuelle hPSC linje være naiv-tilbake, som replating effektivitet kan være svært variabel. Plass platen i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære).
    Merk: Rutinemessig bruk av anti-apoptotisk reagenser er ikke anbefalt for de fleste hPSC linjer med denne metoden. LIF-5i systemet forbedrer allerede betydelig innledende bulk klonal re plating effektiviteten av konvensjonelle hPSC linjer. Men en gangs bruk av ROCK hemmer (5-10 μM Y-27632) kan forbedre første LIF-5i klonal re plating effektiviteten av konvensjonelle hPSC kulturer i første passering for noen ustabil linje-fylt hPSC linjer med tilbøyelighet for spontane differensiering.
  12. Hvis starter fra mater-fri kulturer (f.eksE8), direkte overføre en brønn av den avstand konvensjonelle hPSC tilpasset i LIF-5i i bestrålt en MEF-belagt godt (dvs., 1:1 passasje).
  13. Neste dag, forsiktig swirl plate å løfte alle ikke-tilknyttede celler, Sug opp mediet (PBS vask er valgfritt) og erstatte med 2 mL LIF-5i medium. Utføre dette trinnet i en biosafety kabinettet daglig i 3-5 dager eller til celler er 60 – 70% confluent (figur 1). Plass platen i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære).

3. langsiktig vedlikehold og utvidelse av N-hPSC i LIF-3i Medium

  1. Etter innledende LIF-5i tilpasning, passasje etterfølgende stabil LIF-3i kulturer hver 3-4 dager i en biosafety skap, eller når kulturer blir 60-70% confluent (figur 1).
    Merk: LIF-3i kulturer krever strenge vedlikehold og slik at N-hPSC kulturer å nå høy confluency/cell tetthet fra langvarig kultur (f.eks., > 4 dager) reduserer påfølgende klonal re plating effektivitet og fremmer spontane differensiering.
  2. I en biosafety skap, forkaste kultur medium og vaske hver brønn av LIF-5i/LIF-3i kulturer ved forsiktig å legge 2 mL PBS. Forkaste PBS og tilsett 1 mL av cellen avdeling løsning. Inkuber i 5 min på 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære).
  3. Samle celle suspensjon, legger hESC medium (uten hemmere, eller vekst faktorer (tabell 1); minst 2-fold fortynning) å komme seg alle hPSC og forsiktig triturate celler av pipettering for å få en enkeltcelle suspensjon. Overføre suspensjon slik konisk sterilt 15 mL.
  4. Sentrifuge 300 g i 5 min og leveringstanken/forkaste nedbryting. Nytt avbryte celle pellet LIF-3i medium. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisk celle teller.
  5. Plate ~ 2 x 105 celler per brønn på bestrålt MEF i gelatinized 6-vel plate for rutinemessig passaging LIF-3i kulturer. For de første LIF-5i-tilpasset kulturene, plate en opprinnelig høyere tetthet (4 x 105 celler/vel) før første passering i LIF-3i/MEF.
  6. Nytt plate og distribuere LIF-5i-tilpasset hPSC på fersk PBS-vasket bestrålt MEF mater plater (forberedt forrige dag som ovenfor) i LIF-3i medium. Erstatte LIF-3i mediet daglig.
  7. Passasjen N-hPSC for minst 4 – 7 kontinuerlig bulk passasjer i LIF-3i middels før bruk av N-hPSC i funksjonelle studier eller kryonisk bevaring. Registrere antall passeringer av N-hPSC i enten tradisjonell eller LIF-3i.
    Merk: LIF-3i hjemfall av høy-passasje (f.eks > p40) linje-primet, konvensjonell hPSC linjer er ikke anbefalt. Et forsøk bør gjøres tilbakestille konvensjonelle hPSC linjer på lavest mulig passasjen at de er tilgjengelige. I tillegg, er bruk av LIF-3i-tilbake hPSC som har gjennomgått større enn 10 LIF-3i passasjer ikke anbefalt for funksjonell studier, siden slike N-hPSC kulturer kan havn karyotypically unormal kloner på grunn av langvarig klonal kultur celleutvalget. Frisk LIF-5i/LIF-3i reversions lav-passasjen konvensjonelle hPSC linjer skal utføres for funksjonell studier, hvis aksjer av N-hPSC med < 10 passasjer i LIF-3i er ikke tilgjengelige.

4. kryonisk bevaring og tiner LIF-3i-vende N-hPSC

  1. Utvid tilbakestilles N-hPSC for minst 5-7 passasjer i LIF-3i, som angitt ovenfor, før bruk i funksjonelle studier eller langsiktig kryonisk bevaring. Registrere antall passeringer i konvensjonell forhold og i LIF-3i på hvert cryopreserved hetteglass.
    Merk: Overflødig LIF-3i-vende N-hPSC ikke brukes i funksjonelle analyser kan være cryopreserved på hver passage, men frysing av lavere etter hjemfall passasjer (f.eks., < p3) kan føre til dårlig eller svært variabel etter Tin utvinning effektivitet.
  2. I en biosafety skap, Sug opp kultur medium, vaske celler i PBS (2 mL per brønn), Sug opp PBS og dissociate hPSC kolonier i enkeltceller bruker celle avdeling løsning (1 mL per brønn). Plass platen i 5 min på 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære). Fortynne celle avdeling løsningen med LIF-3i mediet (2-fold), samle hPSC i et sterilt 15 mL koniske, sentrifuge cellene på 200 x g i 5 min og resuspend celle pellet LIF-3i medium (1-2 mL per godt tilsvarende). Tell antall celler med en hemocytometer eller en automatisk celle teller.
  3. Sentrifuge N-hPSC i LIF-3i medium (200 x g i 5 min) og resuspend celler i en biosafety regjering frysing løsningen (tabell 2), på en tetthet på minst 1 x 106 celler/mL.
  4. Overføre celler til langsiktig lagring kryogene rør og plasser i en langsom frysepunktet beholder. Tillate prøvene å fryse overnatting i-80 ° C fryser.
  5. Neste dag, overføre cryovials i flytende nitrogen fryser for langtidslagring.
  6. For tining, plassere frosne ampullen i en 37 ° C vannbad i ~ 2 min. Sterilize ampullen (dvs. etanol spray), overføre hPSC i et sterilt 15 mL koniske og sakte fortynne celler 10 ganger i hESC mediet (tabell 1) med 5 μM av Rho-assosiert protein kinase (ROCK) hemmer Y-27632 i sterilt biologiske sikkerhetskabinett hette kabinett.
  7. Sentrifuger 200 x g i 5 min. I en biosafety skap, forkaste cellen uten nedbryting og resuspend celle pellet LIF-3i medium (1-2 mL) med 5 μM ROCK hemmer Y-27632.
    Merk: Utelukkelse av Y-27632 fører til dårlig etter tiner utvinning effektivitet (figur 2).
  8. Overføre tinte cellene resuspended i LIF-3i/ROCK hemmer på PBS-vasket MEF-belagt brønnene. Cryopreserve LIF-3i kulturer på en tetthet 1 x 106 celler per medisinglass. Tine hver av disse ampuller på matere i en godt av en gelatinized 6-vel-plate.
  9. Neste dag, starte vanlige LIF-3i middels utvidelse uten Rho kinase inhibitor.

5. mater fjerning for innsamling av N-hPSC prøver

  1. Å forberede prøver fra LIF-3i/MEF (eller hESC/MEF konvensjonelle) kulturer (dvs.for genuttrykk (f.eks kvantitative RT PCR, microarrays) eller protein (f.eks Western blot) analyser, tømmes LIF-3i kulturer fra MEF matere bruke Magnetisk aktivert celle sortering (Mac) med anti-TRA-1-81 antistoff belagt microbeads i henhold til produsentens protokollen.
  2. Alternativt bruke følgende enkle før plating metode for å tømme kulturer av feeders, som beskrevet nedenfor.
  3. I sterilt biologiske sikkerhetskabinett hette skap, forkaste cellen uten nedbryting, vask pellets med 2 mL steril PBS per brønn. Koble tilhenger LIF-3i/MEF kulturer bruker celle avdeling løsning (1 mL/vel). Inkuber i 5 minutter i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære). Samle hPSC i et sterilt 15 mL konisk. Vask 2-fold i hESC medium, overføring celler i sterilt 15 mL koniske og sentrifuge 200 x g for 5 min.
  4. I en biosafety skap, å suspendere hver brønn LIF-3i/MEF dissosiert celler i 2 mL LIF-3i mediet og direkte overføre til en ny brønn av en 6-vel plate som nylig har vært belagt med 0,1% gelatin.
  5. Inkuber LIF-3i/MEF hPSC celler 1t på 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fuktig atmosfære). Samle ikke-tilhenger celler med en pipette i en ny konisk tube. Forsiktig legge 2 mL hESC medium i hver brønn og virvel for å samle de gjenværende ikke-tilhenger cellene.
    Merk: Fleste bestrålt MEF vil legge til gelatinized plate 1 h, forlater fleste av hPSC i suspensjon.
  6. Kombiner og sentrifuge cellene på 300 x g for 5 min. vask i PBS. Snapin-fryse celle pellet i flytende nitrogen etter sentrifugering, eller alternativt å avbryte pellets lysing bufferen som er kompatibel med nedstrøms protein eller nukleinsyre analyse (figur 2B).
  7. Utføre karakteristikkene LIF-3i hPSC linjer med en tilsvarende konvensjonell primet isogenic hPSC kontroll.
    Merk: På grunn av iboende variasjon mellom og innen primet kulturer, relevante kontroller er forberedt på en tilsvarende timepoint i kultur eller før naiv hjemfall. Detaljert protokoller og materialer for nedstrøms immunofluorescent bioimaging, flow cytometri, vestlige blotting, genuttrykk (RT PCR analyser og microarrays), metylering studier (dot blot, CpG metylering microarray), OCT4 proksimale og distale enhancer overvekt reporter analyser og signalnettverk hemmer Analyser tilbys andre steder3.

6. legge naiv hjemfall: validering av genomisk integritet og oppbevaring av foreldrenes avtrykk av LIF-3i-vende N-hPSC før bruk i funksjonelle analyser

  1. Skjermen Start primet, konvensjonell hPSC kulturer for besittelse av en vanlig karyotype (f.eksGiemsa-bandet flekker analyse bruker publiserte metoder 7) før du starter LIF-5i/LIF-3i hjemfall.
    Merk: Dette er å eliminere konvensjonelle hPSC populasjoner som kan havn unormal genomisk endringer som kan kjøre artefactual selektiv overlevelse fordel klonal LIF-3i forhold.
  2. For best mulig resultat, fersk tilbake konvensjonelle hPSC kulturer til en naiv-lignende tilstand med LIF-3i flere uker før bruk i funksjonelle studier eller rettet differensiering.
    Merk: Rutinen langvarig "vedlikehold" kultur i LIF-3i betingelser for mer enn 10 ganger følgende naiv hjemfall ikke anbefales. Rutinemessig ekspansjon og vedlikehold av hESC og hiPSC skal utføres ved hjelp av konvensjonelle kultur systemer (f.eks E8 eller MEF/hESC medium med bFGF).
  3. Vurdere etter tilbakestilles N-hPSC linjer for oppbevaring av normal karyotypes 5-7 passeringer etter LIF-3i hjemfall (f.eks., med Giemsa-bandet flekker analyse7eller noen annen metode for valg).
  4. Vurdere alle tilbakestilles N-hPSC linjer for oppbevaring av normal foreldrenes genomisk avtrykk av en DNA metylering analyse av valg (f.eksprotokoller for CpG DNA microarray analyse av foreldrenes avtrykk i LIF-3i-vende N-hPSC tilbys andre steder3 ) etter 5-10 ganger LIF-3i slikt.

7. innlegget naiv hjemfall: Eksperimentell Design retningslinjer for kvantitative rettet differensiering analyser bruker LIF-3i-vende N-hPSC

  1. Direkte bruke LIF-3i N-hPSC i etablerte rettet differensiering protokoller uten ekstra celle kultur manipulasjoner.
    Merk: Nytt grunning (dvs. konvertere N-hPSC tilbake til konvensjonelle primet betingelser før bruk i rettet differensiering analyser) er ikke nødvendig med metoden LIF-3i og anbefales ikke.
  2. Kontrollere for virkningene av analysen og interline variasjon i funksjonell testing av personlige hPSC linjer, cross-validere slektslinje kundespesifikk differensiering potencies av ansette uavhengig differensiering protokoller med minst tre hPSC linjer avledet fra uavhengige genetisk bakgrunn (dvs. flere donor-avledet hiPSC og hESC).
  3. For funksjonelle sammenligninger, definere søsken kulturer, tilsvarende passasje nummer, og fra samme (isogenic) hPSC linje parallelt med den konvensjonelle avstamning-primet og LIF-3i-tilbake hPSC kulturer. Opprettholde primet/naiv søsken isogenic hPSC kulturer i sine respektive medier (f.eks., E8 vs. LIF-3i), og samtidig skille med identiske differensiering protokoller og materialer, fjerne skjevheter eksperimentelle (Figur 4).
  4. For isogenic primet vs naive hPSC sammenligninger, justere og optimalisere første plating tettheter for hver individuelle differensiering analysen.
    Merk: Detaljert protokoller for nevrale, definitiv endoderm og hemato-endothelial rettet differensiering av LIF-3i-vende N-hPSC tilbys andre steder 3. LIF-3i-vende N-hPSC har mer robust proliferativ og differensiering kapasitet i rettet differensiering analyser enn konvensjonelle hPSC. N-hPSC krever vanligvis en lavere første plating konsentrasjon enn den konvensjonelle hPSC, og i motsetning til sine konvensjonelle primet hPSC kolleger, krever ikke bruk av anti-apoptotisk reagenser å forbedre deres klonal overlevelse etter enzymatisk fordøyelsen i differensiering analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen optimaliserer effektiv naiv som hjemfall med LIF-3i i begge mater-avhengige og mater-uavhengig avstamning-primet konvensjonelle hPSC kulturer (figur 1). Detaljert protokollen, beskrevet heri, skisserer sekvensiell tilpasning til LIF-3i fra enten mater-avhengige eller mater-fri konvensjonelle hPSC betingelser (f.eks E8 medium).

Representant resultater for LIF-3i hjemfall av flere konvensjonelle hESC og transgene-fri hiPSC linjer presenteres i tallene 1-3. Disse typiske resultater kan valideres med kommersielt tilgjengelig hESC linje H9, eller med en kommersielt tilgjengelig transgene-fri, ledningen blod-avledet episomal hiPSC linje (6.2) stammer i Zambidis laboratorium8,9. Innføring av et første LIF-5i tilpasning trinn tillater svært effektiv påfølgende, bulk klonal spredning av konvensjonelle hPSC kulturer i LIF-3i, og krever ikke anti-apoptotisk agenter eller ROCK hemmere10 (figur 1A, B ). Flere plater naiv som hPSC prøver kan bli raskt samlet for nedstrøms analyser eller multilineage rettet differensiering etter 5-7 passasjer i LIF-3i. Alternativt kan LIF-3i kulturer være cryopreserved for framtidige applikasjoner. Etter tining celle utvinning kan være forbedret (figur 2) via inkludering av en ROCK hemmer i kryonisk bevaring og etter thaw media11.

Determinantene av molekylære og funksjonelle pluripotency, både i vitro og fosteret var nylig gjennomgått2. Disse faktorene omfatter genetiske bakgrunn, kultur-assosiert oppkjøpet av mutasjoner for viktige utviklingsmessige gener og forskjeller i hESC og hiPSC avledning og kultur metoder. Gitt nedenfor er et sammendrag av standard analyser som kan brukes for karakterisering og validering av fenotypiske, molekylær og funksjonelle pluripotencies av LIF-3i-tilbake hPSC.

Kolonien morfologi
Overgangen mellom primet, konvensjonelle og LIF-3i-vende systemer er ledsaget av forskjellige fysiske endringer i hPSC koloni morfologi (figur 1B). Så flat sprer konvensjonelle hPSC celler bredt monolayer koloniene som utvide raskt fra småcellet klumper (på MEF eller mater-gratis forhold), men dårlig som enkeltceller. Eksponering for konvensjonelle hPSC linjer LIF-3i fremmer vekst og ekspansjon og mindre, tett-pakket, kuppelformede kolonier som oppstår clonally single celler. Endringene morfologiske er fullstendig reversibel, og LIF-3i-vende kuppel-formet kolonier kan spontant gå tilbake til en tradisjonell monolayer morfologi om LIF-3i trekkes og celler er nytt kultivert i standard konvensjonelle hESC medium supplert med bFGF. I tillegg expansion LIF-3i-vende celler ved høy confluent tettheter (eller langvarig kultur uten hyppige passaging) resultater i den spontane reacquisition av flat, konvensjonelle morfologi med redusert klonal effektivitet; understreker behovet for flittig vedlikehold og pleie av LIF-3i-tilbake hPSC (f.eks., < 40-60% samløpet).

Live immunofluorescence flekker og flow cytometric analyse av overflaten pluripotency markører
Evaluering av pluripotency merkene under overgangen fra konvensjonell til en naiv-lignende tilstand følgende kontinuerlig LIF-3i kultur kan overvåkes ikke-invasively bruker live antistoff flekker uten oppdage noen negative effekter på LIF-3i/MEF ekspansjon ( f.eks., lever flekker fluorochrome-konjugerte antistoffer mot TRA-1-81, TRA-1-60 og SSEA4).

Oppbevaring av pluripotency under LIF-3i hjemfall kan også rutinemessig overvåkes av flyt cytometric analyse av pluripotency-assosiert overflaten markør uttrykk for TRA-1 og SSEA antigener i én celle passaging (figur 1C) eller immunofluorescence av intakt, fast kolonier i situ (Figur 3). Selv om disse markørene ikke diskriminerer mellom konvensjonelle og LIF-3i stater, nivåene omvendt samsvarer med frekvensen av spontane differensiering som kan oppstå i hPSC når overgangen fra konvensjonelle hPSC LIF-3i forhold. Ekstra overflaten antigener som kan mer spesifikt merke menneskelige naiv som stater i vitro2,12,13 kan også brukes til å finne effektive LIF-3i hPSC hjemfall.

Validering av molekylære pluripotency av N-hPSC
Fordi den genetisk bakgrunnen for hPSC linjer har blitt karakterisert som en sterk bidragsyter til interline variasjon, er det viktig å nøye vurdere isogenic kulturer på matchende kultur timepoints når man sammenligner hPSC kultur systemer (Figur 4). Siden noen av disse systemene har allerede vist seg å generere hPSC populasjoner med avvikende genomisk og epigenetic konfigurasjoner2, bør alle naiv hjemfall metoden være assayed med en rekke N-hPSC av uavhengige genetisk bakgrunner, på en måte Det er tilstrekkelig å validere biological reproduserbarhet og ekskludere ikke-developmentally relevante "pseudo-pluripotent" stater (dvs. med tilsynelatende kjennetegner molekylær pluripotency men mangler funksjonelle differensiering evner). Zimmerlin et al. ytterligere utvidet validering av LIF-3i kultur systemet med assaying den molekylære og funksjonelle pluripotencies av tilbakestilles N-hiPSC fra forskjellige reprogramming metoder, som er en annen kjent antatte bidragsyter av funksjonelle variasjon mellom pluripotent sier2.

Følgelig de fleste studier av menneskelig naiv kultur systemer har fokusert på assaying molekylær pluripotency av N-hPSC 1) epigenetic nivået (f.eks histone merker av ChIP sekvensering eller ChIP PCR, globale DNA metylering immunoblots eller hele genomisk bisulfite sekvensering, allel-spesifikke CpG metylering microarrays, OCT4 enhancer dominerende bruk av reporteren systems, global aktivitet på regulatoriske elementer av DNAse jeg overfølsomhet og gjenta element profilering av RNA-sekvensering), 2) transcriptomic nivå (RNA-sekvensering uttrykk microarrays og kvantitative RT PCR), protein uttrykk analyse (f.eks., FACS, immunofluorescent mikroskopi og vestlige blotting) og 3) via metabolske studier (f.eks Glykolysen, oksidativt fosforylering og nikotinamid metabolisme). Eksemplene immunofluorescence flekker og Western blot påvisning av uttrykk for viktige indikatorer for molekylær pluripotency vises (Figur 3B, C). For eksempel er vises i figur 3B aktivert fosforylert (phospho) og total isoformene STAT3 og ERK1/2, som er viktige molekylær kjennetegner musen ESC-lignende naiv pluripotency. Dette ble oppdaget ved hjelp av anti-STAT3 og anti-ERK1/2 primære antistoffer. I tillegg er funksjonelle pluripotency i teratoma differensiering analyser demonstrert i konvensjonelle vs. LIF-3i-tilbake hPSC teratoma vev dissekert 10 ukene etter injeksjon og løst i 4% formaldehyd parafinen innebygd (Figur 3D).

Utarbeidelse av LIF-3i/MEF eller hESC/MEF/bFGF prøver for nedstrøms molekylær analyse bør inkludere MEF uttømming. Metodene er beskrevet ovenfor for MEF nedbryting som har vært vellykket ansatt i vårt laboratorium. MEF før plating er en enkel, pålitelig, og kostnadseffektiv metode for å eliminere feeders fra N-hPSC prøver for molekylære studier og et foretrukket alternativ til FACS eller Mac separasjon (dvs. anti-TRA-1-81 eller anti-TRA-1-60 antistoff-baserte separasjon ). I tillegg kan spontant skille TRA-1-negativ tilhenger celler i LIF-5i/LIF-3i kulturer raskt elimineres fra LIF-5i/LIF-3i N-hPSC kulturer før påfølgende LIF-3i passasje på fersk MEF ved Pre-Kontaktflate enzymatisk fordøyd enkeltceller 1t på plater pre-belagt med 0,1% gelatin (figur 2).

Evaluering av funksjonelle pluripotency av N-hPSC
Strengeste analysen av funksjonelle pluripotency av PSC er blastocysten injeksjon chimera analysen, som er begrenset i testing av N-hPSC linjer etiske grunner. Eventuelt har flere grupper som har rapportert generasjonen av N-hPSC med ulike andre metoder forsøkt å generere interspecies chimeras. Men har disse forsøkene gitt svært lav eller mislykket bidrag av differensiert N-hPSC overleveringslinjer til murine eller svin embryoer, i forhold til chimera-generering kapasiteten til standardmus ESC2.

Ekstra funksjonelle studier har undersøkt rettet i vitro differensiering av antatte N-hPSC avledet via ulike metoder, men har åpenbart partisk, defekt eller redusert multilineage differensiering kapasitet, med samtidig skjuler epigenetic unormalt2,13. Lignende epigenomic avvik, spesielt på trykt loci, har blitt oppdaget i musen ESC etter langvarig eksponering for LIF-2i cocktail14. Interessant, noen hjemfall kultur systemer rapportert globale forbedringer i bestemte attributter av funksjonelle pluripotency av PSC som forbedret kapasitet for i vivo trophectoderm bidrag2,15 .

Bruker en bred samling av uavhengig-avledet LIF-3i-tilbake hPSC, ansatt Zimmerlin et al. multilineage differensiering analyser vise at LIF-3i systemet dramatisk forbedrer den funksjonelle pluripotency konvensjonelle hPSC linjer 3. Dette gjør systematisk analyse av konvensjonelle vs LIF-3i hPSC linjer i isogenic par å eliminere interline-avhengige variasjoner (Figur 4). LIF-3i-tilbake hPSC linjer krever ikke et nytt grunning skritt før EB differensiering. Imidlertid LIF-3i hPSC spredning til betydelig høyere klonal priser enn isogenic celler utvidet E8, og dermed første lavere plating tettheter krever justering slik at hver kultur til samløpet på en lignende timepoint.

Etterforskerne bør rutinemessig bruker flere analyser for å demonstrere LIF-3i-tilbake hPSC som inkluderer ikke bare i vivo teratoma analyser, men også i vitro rettet differensiering analyser til nevrale, forbedret funksjonalitet definitive endoderm og hematovascular linjene3 bruker flere analyser (f.eks, 2D APEL3,16 og 3D embryoid kroppen17,18 systemer). Bestemme for analysen-avhengige reproduserbarhet, skal minst to forskjellige differensiering metoder utføres i replikere for hvert isogenic par primet/LIF-3i hPSC kulturer (f.eks Figur 4, APEL, embryoid kroppen differensiering protokoller). Eksperimentell design bør inkludere et robust tall (f.eks> 3 – 5) primet/LIF-3i isogenic par hPSC linjer fra flere uavhengige donor genetisk bakgrunn (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: En gradvis overgang av konvensjonelle, avstamning-fylt hPSC kulturer naiv-lignende forhold med metoden LIF-3i. (A) skjemaet for protokoller for gradvis LIF-3i hjemfall. (Topp skjematisk) En generell metode for overgangen til primet, konvensjonelle hPSC LIF-3i kulturer. (Bunnen skjematisk) To summerte strategier for LIF-3i naiv hjemfall for konvensjonelle (primet) hPSC kultivert på enten mater (dvs. Primed/MEF til LIF-3i/MEF) eller mater uten betingelser (i.ePrimed/E8 til LIF-3i/MEF). (B) Human PSC morphologies. Vises representant photomicrographs av hPSC under LIF-3i hjemfall bruke en kommersielt tilgjengelig menneskelige episomal iPSC (6.2). Vises er overgangene observert mellom første konvensjonelle flat monolayer koloniene, og senere kuppel-formet clonogenic koloniene som oppstår etter passasje i mellomliggende Insertion-5i og stabile LIF-3i kultur forhold. Skalere barer = 200 µm. (C) representant flyt cytometric analyser av pluripotency overflate markører. Vises TRA-1-81 og SSEA-4 overflate uttrykk i konvensjonelle hPSC linje 6.2 (p40) i E8, første passering i LIF-5i/MEF og følgende 1 til 9 passasjer (P1-P9) i LIF-3i forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Kryonisk bevaring av N-hPSC og utvalg av MEF før plating. (A) eksempel en fryse/tine syklus av LIF-3i/MEF kulturer. Den konvensjonelle ledning blod-avledet, ikke-integrerte, transgene uten menneskelig iPSC linjen E5C3 var avledet og utvidet på MEF matere i hESC medium med 4ng/mL bFGF for 18 passasjer. Konvensjonelle, avstamning-fylt E5C3 var tilpasset i LIF-5i (venstre) og overført i LIF-3i medium for 3 passasjer (midten). E5C3 LIF-3i cellene i midtseksjon var cryopreserved ved hjelp av DMSO-baserte kryoprotektant medium (tabell 2, 1 x 106 celler per medisinglass) og lagret i flytende nitrogen). En flaske ble tint en måned senere og E5C3 celler ble i en mater-belagt godt av en 6-vel plate (høyre). Celle utvinning kan styrkes ved supplere LIF-3i mediet med 5 µM Y-27632 for bare en dag etter tine. Skalere barer = 200 µm. (B) eliminering av MEF (og også tilhenger TRA-negativ differensierte celler) i LIF-3i/MEF hPSC kulturer av metoden før plating. Vist er flyt cytometric analyser før og etter før plating av PE-konjugerte anti-TRA-1-81 og TRA-1-60 antistoffer, APC-konjugerte SSEA-4 antistoffer og SSEA-1/CD15 antistoffer demonstrere uttømming av TRA-1 antigenet negative og MEF celler ved hjelp av den én time før plating metode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Karakterisering av pluripotency i LIF-3i/MEF N-hPSC kulturer. (A) overflate og kjernefysiske pluripotency markører. Uttrykk for pluripotency faktor NANOG i den samme (isogenic) TRA-1-81+SSEA4+ konvensjonelle, primet ledningen blod-avledet hiPSC linje E5C3 (p39) utvidet i enten primet (E8) eller naiv LIF-3i (+ p8 i LIF-3i/MEF) betingelser. Immunofluorescent flekker representant hPSC kulturer i kammeret lysbilder avslørt uniform, kjernefysisk uttrykket av kjernen pluripotency faktor NANOG i SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC kulturperler på primet, konvensjonelle (E8 medium) eller LIF-3i/MEF forhold. Skala bar = 100 µm. (B) Western blot analyse. STAT3 (venstre), ERK (midten) og kontroll beta-utgangen protein uttrykk for en representant hPSC (linje hESC H9) i konvensjonelle (E8 medium) eller LIF-3i/MEF betingelser (3i). (C) uttrykk for naiv pluripotency-assosiert transkripsjonsfaktorer. Vises STELLA/DPPA3, NR5A2 og TFCP2L1 av immunofluorescence i en representant LIF-3i/MEF kultur (ledningen blod-avledet hiPSC linje E5C3 ved p33 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Skala bar = 100 µm. (D) Teratoma analyser av konvensjonelle og LIF-3i-tilbake hPSC. Validering av funksjonelle pluripotency i en isogenic representative hiPSC linje (ledningen blod-avledet E32C6) kultivert i enten E8 (p9) eller LIF-3i/MEF (+ p12) av teratoma analysen. 10 x 106 celler med isogenic parallell-kulturperler konvensjonelle, primet vs LIF-3i-tilbake hPSC ble injisert subcutaneously inn i lemmer av immunodeficient NSG mus. Hematoxylin og eosin flekker av teratoma microsections avslørt robust differensiering i alle tre bakterie lag med velstrukturert ektoderm (nevrale rosett: NR, netthinnen pigmentert epitheliam: RPE), mesoderm (chondroblasts: Ch), og endoderm (glandular vev: GI) overleveringslinjer. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning av funksjonelle pluripotency mellom isogenic primet og naiv. (A) skjematisk av strategi for å vurdere funksjonelle pluripotency fra forskjellige pluripotent stater i isogenic konvensjonelle vs LIF-3i kultivert hPSC i uavhengige differensiering protokoller. Vises to hemato-vaskulær stamfar differensiering systemer (APEL monolayer og 3D embryoid kroppen (EB) systemer) som var tidligere ansatt å vurdere styrke differensiering av konvensjonelle vs LIF-3i-tilbake i samme (isogenic) hPSC linje kultivert i parallell innlegg LIF-3i hjemfall med samme passasje tall. LIF-3i-tilbake hPSC krever ikke et nytt grunning skritt før EB differensiering og er utsatt for differensiering-protokollen direkte. (B) EB vaskulær stamfar (VP) differensiering system. EB 3D differensiering systemet ansatt for denne studien var tidligere beskrevet17,18. Vist er representativt resultatene på dag 10 i EB differensiering (venstre panel) for isogenic kulturer av samme ledningen blod (CB)-avledet E5C3 hPSC linje9, kultivert i enten konvensjonelle hESC/MEF (Primed / MEF) betingelser eller LIF-3i/MEF naiv forhold. Flow cytometri analyse av disse EB cellene Vis dramatisk økning av CD31+CD146+ VP bestander etter LIF-3i hjemfall av E5C3 linjen før differensiering. Histogrammet viser den gjennomsnittlige ±SD av CD31+CD146+ VP celle prosenter gjenopprettet på dag 10 i EB systemet bruker tre isogenic parene av uavhengige hPSC linjer (dvs. to CB-hiPSC og en voksen fibroblast-avledet hiPSC, prikkete kobler isogenic par). Resultatene viser betydelig forbedring av VP differensiering effektivitet i EB systemet over genetisk bakgrunn av flere hPSC linjer. (C) APEL monolayer vaskulære stamfar differensiering system. Konvensjonell (primet E8) og LIF-3i-tilbake hPSC kan være direkte differensiert bruker samme oppdrettsforholdene, vekstfaktorer, cytokiner og små molekyler med gradvis APEL endothelial differensieringen protokollen 3, 16. vises uavhengig APEL differensiering eksperimenter ved hjelp av E5C3 ledningen blod-avledet hiPSC linjen og andelen CD31+CD146+ vaskulære stamfar befolkninger på dag 7 av APEL differensiering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LIF-3i systemet bruker en modifisert versjon av den klassiske murine 2i naiv hjemfall cocktail1 menneskelige pluripotent stamceller. Self-fornyelse av hPSC (som ikke utvide i 2i alene) stabiliseres i LIF-2i ved supplere denne cocktail med tankyrase hemmer XAV939. LIF-3i kultur kan bulk og effektiv hjemfall til den konvensjonelle hPSC til en pluripotent tilstand ligner menneskelige preimplantation epiblast3. Selv om virkningsmekanismer av XAV939 i hPSC er sannsynlig komplekse synergistisk med 2i, de sannsynligvis inneholder på et minimum, en viktig stabilisering og styrking av hPSC selvtillit fornyelse via WNT signalnettverk trasé3.

Konvensjonelle hPSC kulturer vedta vanligvis et spekter av pluripotent stater med svært variabel avstamning-primet genet uttrykk og etter implantasjon epiblast epigenetic merker som kan føre til inkonsekvent eller redusert funksjonelle pluripotency2 . Dette iboende avstamning fylling av konvensjonelle hPSC kulturer også kan påvirke den vellykkede LIF-3i hjemfall noen hPSC linjer2. Men inkludering av det første LIF-5i tilpasning trinnet (tabell 1) i metoden LIF-3i universelt utvider effektiviteten LIF-3i slikt blant en rekke hPSC linjer og fremmer bulk naiv hjemfall konvensjonelle hPSC linjer på en måte som omgår kjedelig plukke og subcloning av sjeldne naiv-vende kolonier, eller behovet for bruk av rutinemessig anti-apoptotisk molekyler å stabilisere sin levedyktighet.

Metoden LIF-5i/LIF-3i naiv hjemfall er reproduserbare i en rekke hESC og hiPSC. Det krever minimal opplæring med grunnleggende celle kultur dyktighet. Zimmerlin et al. ble ansatt denne sekvensielle strategien gå > 30 uavhengige hESC og transgene-fri hiPSC linjer fra et bredt spekter av givere 3. Et enkelt avsnitt i LIF-5i (figur 1) er tilstrekkelig for de fleste hPSC linjer å gjennomgå effektiv naiv hjemfall i bulk hPSC kulturer, og videre før deres påfølgende stabil vedlikehold og ekspansjon i LIF-3i alene.

Videre LIF-3i/MEF systemet støtter robust bulk klonal ekspansjon effektivitet gjennom alle trinnene mellom avstamning-primet konvensjonelle hPSC kultur helt til fullført naiv-lignende hPSC hjemfall (dvs., tilpasning, overgang og utvidelse for 7 – 10 passasjer i LIF-3i/MEF alene). Selv om gjeldende utformingen av dette kultur-systemet krever mater støtte, presenteres en enkel og rimelig metode for å tømme matere av før plating teknikken for analyse av LIF-3i kulturer (figur 2).

Flere andre kultur systemer er også rapportert å fremme konvensjonelle hPSC til lignende naiv som pluripotent sier2. Selv om disse hPSC kultur systemer også avhengig utnyttelsen av klassisk musen naiv 2i betingelsene, i de fleste tilfeller metodene encellede passaging også kreves flere kjemiske modulering for stabilisere iboende ustabile / metastable menneskelig naiv tilstand. Viktigst, de fleste av disse andre metodene vist svekket funksjonelle pluripotency etter differensiering og/eller ervervet unormal epigenomic forlagene eller karyotypes2. Selv om fremveksten av unormal karyotypes innen konvensjonelle primet hPSC kulturer er allerede godt dokumentert19, forlenget enzymatisk encellede passaging metoder som er rutinemessig ansatt i de fleste naiv hjemfall metoder. Dette har også blitt vist å forsterke generasjonen av unormal chromosomal konfigurasjoner20,21; mer følsomme teknikker (f.eks kopi nummer variasjoner, single nukleotid polymorfisme) kan avdekke flere endringer22,23.

Derimot et bredt repertoar av LIF-3i-tilbake hPSC linjer ble bekreftet for å ha normal karyotypes på lav-middels passasjer (f.eks p5-p15), og også på høy passasje tall (f.eks., > p30) etter LIF-3i kultur3. I tillegg ble epigenomic avtrykk i LIF-3i-tilbake hPSC funnet reproduserbar normal og intakt på 5-10 ganger post LIF-3i hjemfall2. Ved hjelp av følsomme allel-spesifikke kommersielle metylering matrise plattformen, var det tidligere vist at CpG metylering markerer trykt loci av et bredt repertoar av LIF-3i-tilbake hPSC linjer (følgende 4 – 7 passasjer i LIF-3i) ble funnet for å være grovt Normal i strukturen1. Siden unormal genomisk forlagene og karyotypes forlengelsesslanger til slutt den funksjonelle kapasiteten til hPSC, ble nødvendige retningslinjer skissert i denne protokollen som oppmuntrer forskere til å validere hPSC kulturer før og etter naiv hjemfall, benytter denne metoden så vel som andre.

Metoden LIF-3i forbedret funksjonelle pluripotency over bakterie lag i et stort repertoar av hESC og ikke-transgene hiPSC linjer (Figur 3). I motsetning til andre naiv hjemfall protokoller, metoden LIF-3i gjør ikke krever et nytt grunning skritt for påfølgende differensiering av N-hPSC (dvs. konvertere N-hPSC tilbake til konvensjonelle primet betingelser før bruk i regissert differensiering analyser). LIF-3i-vende N-hPSC viser betydelig mer effektiv differensiering kapasiteter enn sine isogenic konvensjonelle hPSC kolleger på begge teratoma analyser (Figur 3D), og rettet differensiering protokoller av linjene fra alle tre bakterie lag2. På grunn av analysen-avhengige og interline variasjoner i funksjonstesting av konvensjonelle hPSC, slektslinje kundespesifikk differensiering bør vurderes uavhengig rettet differensiering protokoller og hPSC fra flere genetiske bakgrunner. Bruker forsiktig eksperimentell design, kan en rekke hPSC linjer forventes å forbedre deres multilineage differensiering effektivitet sammenlignet med sine isogenic konvensjonelle kolleger etter 4-10 passasjer i LIF-3i forhold.

I sammendraget, denne metoden raskt og clonally utvider antallet menneskelige PSC, forbedrer deres nedstrøms differensiering effektivitet, øker avstamning forpliktet stamfar celle tall etter differensiering og reduserer interline variasjon blant konvensjonelle, avstamning-fylt hPSC linjene. Disse N-hPSC med forbedret funksjonalitet kan videre ha bredt konsekvenser for deres potensielle bidra funksjonelle vev til et utviklingsland fosteret. Stabil N-hESC kan for eksempel brukes for å utvikle transplantable organer og voksne stamceller i utviklingen av dyr chimeras eller humanized genet målrettede dyr modeller av sykdom. Ytterligere optimalisering av denne tankyrase hemmer-utnytte LIF-3i metoden i definert mater-fri GMP-kompatibel oppdrettsforholdene vil lette effektivt klinisk nyttig generasjon av en rekke funksjonelle og engraftable celletyper for terapeutisk bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Under en lisensavtale mellom Life Technologies og Johns Hopkins University (JHU), har Dr. Zambidis rett til en andel av royalty mottatt av universitetet for lisensiering av stamceller. Vilkårene i denne ordningen administreres av JHU i samsvar med sin interessekonflikt politikk. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til journalen politikk på deling av data og materialer.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, den Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award og Moseley stiftelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 136 naiv pluripotency menneskelige pluripotent stamceller differensiering tankyrase hemming små molekyl epiblast
Kjemisk hjemfall til konvensjonelle menneskelige Pluripotent stamceller til en naiv-lignende tilstand med forbedret Multilineage differensiering styrke
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, T. S., Zimmerlin, L.,… More

Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter