Summary
وهنا يقدم بروتوكول لاستخدام السفن على شكل س والمتخصصة للثقافات تعليق المجاميع الخلوية، مع الهز المداري. تشكل الخلايا HEK293 تزرع في هذه الحقيبة أكثر مجاميع متجانسة من تلك التي نمت في سفن الثقافة التقليدية.
Abstract
الثقافات تعليق خلية الثدييات المجاميع مطلوبة من أجل تطبيقات مختلفة في المجالات الطبية والتكنولوجيا الحيوية. الأسلوب القائم على حقيبة المتاح واحد من أبسط أساليب الإنتاج الضخم للمجاميع الخلوية، ولكن أنها لا تحمي الثقافات ضد التراكم المفرط، الذي يحدث عندما يجتمعون في وسط أسفل السفينة الثقافة. لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير طبق على شكل O وحقيبة على شكل س، أي من الذي يحتوي على منطقة وسط. المجاميع التي نمت في السفينة على شكل س الثقافة أما كانت ملحوظة أكثر توحيدا في الحجم من المجاميع التي نمت في السفن التقليدية. تحاليل نسيجية أظهرت أن المجاميع في أطباق الثقافة التقليدية الواردة النوى نخرية على الأرجح سبب إمدادات الأوكسجين فقيرة. وفي المقابل، لم تظهر المجاميع التي كانت تزرع في كيس على شكل س، حتى تلك ذات أقطار مشابهة للمجاميع في أطباق الثقافة التقليدية، النوى نخرية. وتوحي هذه النتائج أن الحقيبة على شكل س يوفر الأكسجين كافية للمجاميع بسبب نفاذية الأكسجين من المواد حقيبة. لذلك، نقترح أن هذه الحقيبة رواية الغاز نفاذية الثقافة على شكل س مناسبة لإنتاج كميات كبيرة من المجاميع الموحدة التي ضرورية في مختلف المجالات الحيوية.
Introduction
تعليق خلية الثقافة تلعب دوراً هاما في إنتاج الخلية للطب التجديدي1 والمؤتلف البروتين الإنتاج2 لأنه من السهل الارتقاء وتحقيق كثافات عالية الخلية، أحياناً ما يصل إلى أكثر من 107 خلايا/ مل5. خلايا مبيض الهمستر الصيني (شو)3 وقد نمت خلايا الكلي الجنينية البشرية 293 (HEK293)4 في الثقافة تعليق الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) قد نمت مؤخرا في أنظمة الثقافة التعليق للتجدد العلاجات1،،من67. ومن المتوقع استخدام الثقافات تعليق زيادة في المستقبل.
في الثقافة، وتعليق بعض خطوط الخلايا لا تنمو كخلايا مفردة ويجب، لذلك، تشكل المجاميع. على سبيل المثال، هبسكس لا يمكن البقاء على قيد الحياة في ظروف تعليق دون تشكيل المجاميع. ومع ذلك، صعوبات هذا الشرط للنمو مجمعة للثقافات التعليق الموحد. إحدى الصعوبات هو تشكيل المجاميع الموحدة في الفترة المبكرة من الثقافة، الذي يحدد كفاءة الثقافة تعليق8. وهناك صعوبة أخرى هو نقل أسلحة من المغذيات في المجاميع. على وجه الخصوص، الإمداد بالأكسجين حدود الحد الأقصى لحجم المجاميع، وإمدادات الأوكسجين فقيرة يسبب نخر في وسط المجاميع9. ونتيجة لذلك، تعليق الثقافات المجاميع الخلية أكثر صعوبة للحصول على من الثقافات التقليدية تعليق. ومع ذلك، تعليق الثقافات حاسمة بالنسبة للطب الأحيائي وتطبيقات التكنولوجيا الأحيائية.
سفن تهز المدارية هي واحدة من أبسط أنظمة الثقافة التعليق أن تحقيق الخلائط المتوسطة الثقافة دون الانفعالات المكره. إجهاد القص من المكره وديناميكية تدفق المتوسط هو المشكلة الرئيسية للثقافة تعليق لأنه يسبب تلف الخلايا وتمايزها. لتحقيق الإثارة مع إجهاد القص السفلي، الباحثين والصناعات قد وضعت مجموعة متنوعة من نظم السفينة تهتز المداري2،10.
ومع ذلك، سفن الثقافة التقليدية ليست مصممة للمدارى تهز الثقافات. في المداري تهز السفن، الخلايا تنجذب نحو المركز أسفل للسفن من نوع من التدفق المتوسط المعروف باسم "مفارقة ورقة الشاي اينشتاين"11، الذي يسبب تجميع متنافرة من الخلايا. تدفق دائري، بسبب قوة الطرد المركزي ومن احتكاك بين المتوسط الثقافة وسفينة، والاحتلالات الخلايا إلى11،مركز12. وبالإضافة إلى ذلك، الثقافة التقليدية وأكياس للثقافة الجماهيرية على شكل مربع، التي لا تصلح للهز المداري.
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير حقيبة ثقافة رواية مناسبة للمدارى تهز الثقافات. الجدة من هذه الحقيبة هو شكله س التي لا تحتوي على منطقة مركز، حيث يمنع الخلايا من التجمع في منطقة مركز القاع. قد أثبتنا أيضا التعامل مع هذه السفن مع ثقافة HEK293 لإثبات إمكانية هذه الأكياس لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية.
Protocol
1. إعداد الخلايا والمواد
- زراعة الخلايا HEK293 في تعديل النسر المتوسطة دولبيكو مع مصل بقرى الجنين 10% (FBS) والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%. ضبط الأس الهيدروجيني للمتوسط الثقافة إلى 6.8-7.6.
- بعد استزراع لمد 5 إلى 7، فصل الخلايا مع حمض حل التربسين-الإيثيلين (التربسين-يدتا) 0.25% وريسيد الخلايا في 5,000-10,000 الخلايا/سم2.
2-زرع الخلايا في حقيبة على شكل O
- فصل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1، 2 وريسوسبيند عليها في 2-5 مل من الثقافة المتوسطة.
- تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية (40 ميكرومتر) جمع تعليق خلية مفردة.
- حساب عدد الخلايا تلطيخ تريبان الأزرق وعداد تلقائي الخلية، ثم قم بإعداد 20 مل تعليق خلية (2.0 × 105 خلايا/مل).
- قم بتوصيل مدخل الكيس على شكل س (الشكل 1a) حقنه فرضت 50 مل دون المكبس.
رقم 1: صور تخطيطية وصور من السفن على شكل س. (a1) هذه صورة تخطيطية لوجود حقيبة على شكل س. (a2) وهذا صورة عن وجود حقيبة على شكل س. (b1) هذه صورة تخطيطية طبق على شكل س. (b2) هذه صورة طبق على شكل س. القطر الخارجي والداخلي للحقيبة على شكل س هي 90 و 20 ملم، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- "الماصة؛" تعليق خلية استعداد في كيس على شكل س عن طريق المحاقن فرضت.
- استبدال المحاقن فرضت الأولى بحقنه نظيفة. إضافة 55 مل هواء النظيف عن طريق المحاقن النظيفة لتوسيع الحقيبة تماما.
- المشبك أنبوب مدخل ثم قم بإغلاق المدخل. وأخيراً، قم بإزالة المشبك من الأنبوب.
- احتضان الخلايا في كيس على شكل س طريق تهتز لها لفة في الدقيقة 45 في ظروف من شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
3-متوسط التغير (اختياري)
- نقل تعليق خلية في أنبوب 50 مل من خلال المدخل.
- الطرد المركزي من أجل 2 دقيقة في 200 غ س في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم نضح المادة طافية.
- إضافة 20 مل من الثقافة المتوسطة وريسوسبيند الخلايا.
- إضافة الخلايا ريسوسبينديد إلى كيس على شكل O بالخطوات التالية 2.4-2.7.
- احتضان الخلايا في كيس على شكل س طريق تهتز لها لفة في الدقيقة 45 في ظروف من شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
4-جمع الخلايا من الكيس
- نقل تعليق خلية في أنبوب 50 مل من خلال المدخل.
- يغسل داخل الكيس مع 20 مل فوسفات الكالسيوم/المغنيسيوم-الحرة مخزنة المالحة [PBS(-)، ودرجة الحموضة = 7.4-7.6] وثم تصب المحتويات في أنبوب لجمع الخلايا المتبقية من الحقيبة.
- الطرد المركزي من تعليق الخلية التي تم جمعها لمدة 3 دقيقة في 200 غ س في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم نضح المادة طافية.
- أضف 10 مل PBS(-) وتغسل المجاميع.
- الطرد المركزي لهم لمدة 3 دقيقة في 200 غ س في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم نضح المادة طافية على جمع المجاميع.
- إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني و 1 مل من التربسين واحتضانها لهم مع المجاميع لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية فصل الخلايا للعد (اختياري).
5-إعداد طبق على شكل س (اختياري)
ملاحظة: انظر الشكل 1b لصورة تخطيطية للطبق على شكل س.
- قطع الجزء السفلي من صحن 60 ملم أو 35 ملم بسكين ساخنة والاستفادة منه كطبق داخلية.
- وضعت الطبق 60 ملم رأسا في وسط صحن 100 مم.
ملاحظة: يمكن أن تساعد ورقة دليل تحديد موقف الطبق 60 ملم. - إذا لزم الأمر، وضع cyclohexanone ضبط اللزوجة على كوميسوري من داخل صحن 60 ملم.
- الجاف للطبق على شكل س لبضعة أيام وتعقيم أنه بغاز أكسيد الإيثيلين أو أشعة غاما.
Representative Results
وفقا لقياسات لدينا، قد تختلف المجاميع التي نمت في الطبق التقليدية أقطار بعد 5 د الهز المداري. وفي المقابل، كان المجاميع التي نمت في السفن على شكل س د 5 أقطار موحدة أكثر بكثير. أظهر الثقافة التقليدية صحن المجاميع الصغيرة (50-200 ميكرومتر)، بينما الثقافات في الأوعية الدموية على شكل س لم تتضمن أي المجاميع الصغيرة (الشكل 2a). وفقا لقياس حجم المستند إلى الصور، أظهر الثقافة التقليدية صحن قمم مختلفة اثنين (الرقم 2b1)، مما يشير إلى انحراف واسعة من المساحة الإجمالية. هذه النتيجة تعني أن المجاميع في الطبق التقليدية كانت تنمو تحت ظروف مختلفة في الثقافة نفسها، مما قد يؤدي إلى نوعية الخلية غير متجانسة. من ناحية أخرى، المجاميع في السفن على شكل س أظهر ذروة واحدة وأقل انحراف في قطر من تلك في الطبق التقليدية (الشكل 22 و 2b3)، مما يوحي بأن هذه المجاميع قد تكون من نوعية موحدة أكثر.
رقم 2: مورفولوجيس وأقطار من المجاميع التي نمت في سفن مختلفة. هذه اللوحات إظهار الصور برايتفيلد () و (ب) رسوم بيانية للمجاميع التي نمت في أما (a1 و b1) التقليدية صحن (a2 و b2)، على شكل س الطبق، أو (a3 و b3) كيس على شكل س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
توضع وتلطيخ ويوزين تجميع المقاطع العرضية أظهر أن المجاميع التي نمت في الطبق التقليدية بعض الخلايا دينوكليتيد والنوى نخرية (الشكل 3a). ومع ذلك، لم تظهر المجاميع التي نمت في السفن على شكل س أي النوى نخرية (الشكل 3 و 3 ج). على وجه الخصوص، المجاميع التي نمت في كيس على شكل س كانت كبيرة مثل تلك التي في الطبق التقليدية حتى الآن لم يكن أي النوى نخرية (الشكل 3 ج). واقترحت هذه النتائج أن الحقيبة الغاز نفاذية توفير ما يكفي من الأوكسجين إلى الثقافة.
الشكل 3: المقاطع العرضية للمجاميع في سفن مختلفة. المقاطع العرضية 12 ميكرومتر سميكة وكانوا مستعدين من العينات المجمدة. كانت ملطخة المقاطع توضع وثم تصور الخلايا. () الخلية المجاميع التي نمت في ثقافة تقليدية تعليق أظهرت النوى نخرية. وأظهرت المجاميع الخلية التي نمت في أما (ب) الطبق على شكل س أو (ج) وجود حقيبة على شكل س نخر القليل جداً بهم النوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
عدد خلايا أظهر أن أكثر من 85% الخلايا نجا د 5 تعليق الثقافة في كل سفينة (الشكل 4 أ). وكانت كثافة الخلية النهائية حوالي 1.5-2.0 × 106 خلايا/مل. على الرغم من أنه لا فرق كبير، كانت نسبة النمو في كيس على شكل س أعلى من تلك الموجودة في السفن الأخرى (الشكل 4 باء). وكانت معدلات نمو محددة من الخلايا في الطبق التقليدية وطبق على شكل س والحقيبة على شكل س بين اليوم الثاني واليوم 5 0.018 و 0.025 ح 0.020-1، على التوالي.
الشكل 4: خلية بقاء ونمو. إظهار هذه الألواح () خلية السلامة) و (ب) خلية كثافة الخلايا HEK293 في مختلف الثقافة السفن بعد 2 (د) الثقافة (اليوم 2) و 5 د للثقافة (اليوم الخامس). وتمثل القيم المعروضة متوسط النتائج من 3 التجارب المستقلة. القيم الخاصة بكل تجربة حسبت من الخلايا الملون الأزرق تريبان عدها مع عداد خلايا تلقائية. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: حبة التوزيع في تنسيقات مختلفة طبق 2 في مختلف الظروف تهز. هذا الفريق يوضح توزيع حبة خلال مختلف الظروف تهز (في الدقيقة 30 و 40 و 45) في صحن التقليدية وعلى شكل س. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
في هذه الدراسة، وضع السفن على شكل س، ويؤديها ثقافة تعليق HEK293 فيها لتشكيل المجاميع موحدة والتوسع. في الطبق الثقافة التقليدية، أنتجت المداري الهز الثقافة أقطار مختلفة اثنين من المجاميع، بينما لاحظنا المجاميع موحدة في الأوعية الدموية على شكل س (الشكل 1). وفقا لمراقبة توزيع الخرز الملون في ظروف تهز المداري، جمع الخرز في وسط أسفل صحن الثقافة التقليدية. بسبب هذا التجمع المفترض أن الفرق في كثافة الخلية مما يؤدي إلى أحجام مختلفة من المجاميع. وبدلاً من ذلك، وزعت الخرز في الطبق على شكل س الذي ليس لديه منطقة وسط-أسفل (تكميلية الشكل 1). ربما يؤدي هذا التوزيع المجاميع الحجم موحد في السفن على شكل س. آخر — المستخدمة على نطاق واسع-نهج لإنتاج المجاميع موحدة يتم استزراع في ميكروويلس، ولكن هذا النهج له بعض المشاكل، كما هو الحال في توفير وسيلة الثقافة دون المجاميع يتركون ميكروويلس13. وفي حالة السفن على شكل س، يمكن أن تنتج المجاميع موحدة في ثقافة تعليق بسيط.
المدارية تهز الثقافة نظام ثقافة شعبية تستخدم في خلايا الثدييات. هناك أساليب مختلفة من الثقافة لإنتاج كميات كبيرة من خلايا الثدييات، مثل الدبابات المقلبة مفاعل حيوي14،15من أكياس أشير الموجه، وتدوير الزجاجات. الثقافات تهز المدارية لا تقم بتضمين المكره داخلية لإثارة المتوسطة، على عكس المقلبة خزان مفاعل حيوي لا. هذه الميزة مماثلة لأشير موجه أكياس وزجاجات الدورية. يمكن تجنب الأضرار الخلوية من قوة القص المحيطة الضواغط هذه النظم ثقافة خالية من المكره وتحقيق منخفضة الإجهاد القص في الثقافة تعليق. خاصة، نظم الثقافة تهز المداري فعالة لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا الحساسة مثل خلايا الثدييات بسبب قابلية عالية ومنخفضة الإجهاد القص.
يمكن تحسين السفن على شكل س المشكلة المتبقية الثقافة تهز المداري في تشكيل المجاميع. المداري تهز أنظمة الثقافة، تهاجر الخلايا العائمة للوسط والسفلي للسفينة، والذي يعرف باسم "مفارقة ورقة الشاي اينشتاين"11. هذه الهجرة يؤدي تجميع متنافرة والإنتاج الكلي غير موحدة في المداري التقليدية التي تهز السفن. في هذه الدراسة، ومنعت السفن على شكل س تركيز الخلايا في وسط أسفل السفن، التي تكهنت كسبب التراكم موحدة في السفن على شكل س تهز المداري.
وأظهرت تحاليل نسيجية أن المجاميع في الطبق التقليدية الواردة دينوكليتيد الخلايا (الشكل 2a). وفي المقابل، لم تظهر الخلايا دينوكليتيد في المجاميع من السفن على شكل س (الشكل 2 و 2 ج). فمن الممكن أن هذه الخلايا دينوكليتيد سببها نقص في ركائز مثل الجلوكوز، الجلوتامين، والأكسجين9. وفقا لقياس حجم، قد المجاميع في الأوعية الدموية على شكل س أقطار متجانسة أقل من 400 ميكرون. وفي المقابل، في صحن تقليدية، بعض المجاميع قد يبلغ قطرها أكبر من 400 ميكرون، وهذه المجاميع تشمل الخلايا دينوكليتيد. هذه النتيجة تشير إلى أن إنشاء مجاميع متجانسة الحجم في السفن على شكل س فعال في السيطرة على نوعية المجاميع. وبالإضافة إلى ذلك، هناك أيضا تكهنات تمنع الأوكسجين من خلال فيلم البولي إيثيلين الغاز نفاذية مظهر الخلايا دينوكليتيد في كيس على شكل س.
وأظهرت هذه التجارب إمكانية هذه السفن على شكل س كنظام بسيط لإنتاج المجاميع موحدة. رغم الأخرى للثقافة تعليق الأكياس الثقافة المتقدمة15، تلك الثقافة الأكياس على شكل مربع، مما يمنع الثقافة من الحصول على فعالية مختلطة في الهز المداري. الحقيبة في هذه الدراسة قد رواية مستديرة الشكل مناسب للهز المداري لإنتاج المجاميع مع حجم متجانسة. هذه الخاصية من سفن مهم للسيطرة على الأوضاع وفي إمكانية تكرار نتائج عالية من الخلايا في الإنتاج الضخم. إمكانية تطبيق السفينة على شكل س على نطاق واسع. يمكن استخدامه عند إنتاج البروتينات المؤتلف من الخلايا والطب التجديدي عند التعامل مع الخلايا الجذعية.
وفي الختام، قمنا بتطوير رواية س-على شكل حقيبة مناسبة لإنتاج المجاميع خلية موحدة مع ثقافة هز مداري. الحقيبة يظهر الإمكانيات للتطبيقات الطبية الحيوية المختلفة كما هو الحال في الطب التجديدي.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ويدعم هذا البحث بتعاون مع فوكوكو، المحدودة تاكاو يوشيدا من فوكوكو، المحدودة المقدمة فكرة حقيبة الثقافة على شكل س. تاكاماسا ساتو من فوكوكو، المحدودة دعمت هذه البحوث من حيث محاكاة الحاسوبية لوضع كيس على شكل س الثقافة. أننا نود أن نقدر انتماء صاحب المقابلة الحالية، جامعة أوساكا، على السماح لنا بالعمل على النشر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
