Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות כלי בצורת O, התמחה במשך תרבויות השעיה של אגרגטים הסלולר, ברעידות מסלולית. התאים HEK293 גדל בתיק הזה יוצרים יותר אגרגטים הומוגנית מאשר אלה גדל בכלי תרבות קונבנציונלי.
Abstract
ההשעיה תרבויות בתרבית של תאים האגרגטים נדרשים לצורך ישומים שונים בתחומי הרפואה, הביו-טכנולוגיה. השיטה מבוססת על התיק חד פעמיות היא אחת מהטכניקות הפשוטה ביותר לייצור המוני של אגרגטים הסלולר, אך זה אינו מגן התרבויות נגד צבירת יתר, אשר מתרחשת כאשר הם מתאספים במרכז התחתון של כלי השיט תרבות. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו צלחת בצורת O ותיק בצורת O, אף לא אחד מהם מכיל אזור מרכזי. אגרגטים גדל גם כלי בצורת O תרבות היו באופן ניכר יותר אחידים בגודלם מאשר אגרגטים גדל בכלי קונבנציונלי ניתוחים היסטולוגית הראה כי אגרגטים במנות תרבות קונבנציונאלי הכיל ליבות עם נמק הנראה כתוצאה של אספקת חמצן המסכן. לעומת זאת, אגרגטים שגודלו בשקית בצורת O, אפילו אלה עם קטרים דומה עד אגרגטים במאכלים תרבות קונבנציונאלי, לא הראה ליבות עם נמק. תוצאות אלו מראים כי השקית בצורת O מספק מספיק חמצן כדי מצרפי בשל החדירות חמצן של החומר בתיק. אנו, לכן, מציע כי התיק תרבות בצורת O גז-חדיר הרומן הזה מתאים לייצור המוני של אגרגטים אחיד הנחוצים במגוון תחומים הביו-טכנולוגיה.
Introduction
תרבית תאים ההשעיה ממלא תפקיד חשוב בייצור תאים עבור רפואה רגנרטיבית1 ו רקומביננטי חלבון ייצור2 כי זה קל קנה המידה של ולהשיג צפיפות גבוהה תא, לפעמים אפילו יותר מ- 107 תאים / מ ל5. אוגר סיני השחלה (CHO) תאים3 , כליות עובריים אנושיים תאים (HEK293) 2934 גדלו בתרבות ההשעיה ואת תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) גדלו לאחרונה במערכות תרבות השעיה על ההתחדשות טיפולים1,6,7. השימוש של תרבויות ההשעיה צפוי להגדיל בעתיד.
בתרבות ההשעיה, כמה שורות תאים לא יכול להתפתח כבני תאים בודדים ויוצרים חייב, לכן, אגרגטים. לדוגמה, hPSCs לא יכול לשרוד בתנאים המתלים ללא ויוצרים אגרגטים. אולם, דרישה זו לצמיחה צבורים מציג קשיים על תרבויות ההשעיה אחיד. קושי אחד הוא היווצרות של אגרגטים אחיד בתקופה המוקדמת של התרבות, הקובע את היעילות של תרבות ההשעיה8. קושי נוסף הוא העברה המונית של חומרים מזינים לתוך אגרגטים. בפרט, אספקת החמצן מגביל את הגודל המרבי של אגרגטים, וגורם אספקת החמצן המסכן נמק במרכז של אגרגטים9. כתוצאה מכך, תרבויות השעיה של התא אגרגטים קשים יותר לקבל יותר קונבנציונאלי ההשעיה תרבויות. למרות זאת, ההשעיה תרבויות מכריעים עבור ביו ויישומים ביוטכנולוגיה.
מסלולית כלי חזק הם אחת ממערכות התרבות הפשוטה השעיה זה להשיג תערובות תרבות בינוני בלי עצבנות המדחף. מאמץ גזירה מן את המדחף ואת זרימת בינוני דינמי הוא הבעיה העיקרית של תרבות ההשעיה כיוון שזה גורם נזק לתאים ובידול. כדי להשיג עצבנות תוך מתן דגש הטיה התחתון, חוקרים, תעשיות פיתחו מגוון רחב של אורביטל חזק כלי מערכות2,10.
עם זאת, תרבות קונבנציונאלי כלי לא מיועדים מסלולית רועד תרבויות. במסלולית טלטול כלי, תאים יתלהבו המרכז-התחתון של כלי על ידי סוג של זרימה בינונית המכונה "תה של איינשטיין עלים פרדוקס"11, הגורמת צבירה inhomogeneous של תאים. הזרימה המעגלית, הנגרמת על ידי כוח צנטריפוגלי וחיכוכים בין המדיום תרבות כלי קיבול, מטאטא תאים לתוך מרכז11,12. בנוסף, תרבות קונבנציונאלי שקיות לתרבות המונים הם בצורת ריבוע, אשר אינו מתאים רועד מסלולית.
במחקר זה, פיתחנו תיק תרבות הרומן מתאים מסלולית רועד תרבויות. החידוש של התיק הזה הוא O-צורתו אשר לא קיים אזור המרכז, כך התאים תימנע איסוף בבת-ים התחתון. הראו גם טיפול אלו כלי עם תרבות HEK293 כדי להדגים את האפשרות של השקיות ליישומים הביו-טכנולוגיה.
Protocol
1. הכנת תאים וחומרים
- לטפח HEK293 תאים במדיום נשר שונה של Dulbecco, עם 10% עוברית שור נסיוב (FBS) וחומצות אמינו 1% שאינם חיוניים. להתאים את ה-pH של המדיום תרבות כדי 6.8-7.6.
- לאחר culturing במשך 5 עד 7 d, לנתק את התאים על 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic פתרון חומצה (טריפסין-EDTA), reseed את התאים-5,000-10,000 תאי/ס מ2.
2. זריעת תאי תיק בצורת O
- מביצועם התאים כפי שמתואר בשלב 1.2, resuspend אותם ב 2-5 מ של תרבות בינוני.
- לסנן את המתלים תא דרך מסננת תא (40 מיקרומטר) לאסוף השעיה תא בודד.
- לספור את מספר התאים על ידי צביעת trypan blue מונה אוטומטי תא ולאחר מכן להכין 20 מ"ל של התליה תא (2.0 x 105 תאים/mL).
- להתחבר לים של השקית בצורת O (איור 1 א') מזרק 50 מ ל בחוזקה ללא בוכנה.
איור 1: תמונות של כלי בצורת O ותמונות סכמטי. (a1) זוהי דמות סכמתית של תיק בצורת O. (a2) זה תמונה של תיק בצורת O. (b1) זוהי דמות סכמתית של צלחת בצורת O. (b2) זה תמונה של צלחת בצורת O. הקוטר החיצוני והפנימי של השקית בצורת O הם 90 מ מ, 20 מ מ, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- Pipette התליה תא מוכן לתוך השקית בצורת O דרך המזרק בחוזקה.
- להחליף את המזרק בחוזקה הראשון עם מזרק נקי. הוסף 55 מ של אוויר נקי דרך המזרק נקי כדי להרחיב את התיק לחלוטין.
- מהדק את צינור כניסת ולאחר מכן סגור את הים. בסופו של דבר, להסיר את המלחציים מהצינור.
- דגירה התאים בשקית בצורת O ע י ניעור אותם ב 45 rpm בתנאים של 37 ° C ו 5% CO2.
3. בינוני שינוי (אופציונלי)
- העברת התליה תא לתוך צינור 50 מ ל דרך הים.
- Centrifuge זה למשך 2 דקות ב- 200 גרם x בטמפרטורת החדר ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע.
- הוסף 20 מ של תרבות בינוני, resuspend את התאים.
- להוסיף את התאים resuspended לשקית בצורת O על ידי 2.4 השלבים הבאים-2.7.
- דגירה התאים בשקית בצורת O ע י ניעור אותם ב 45 rpm בתנאים של 37 ° C ו 5% CO2.
4. איסוף התאים התיק
- העברת התליה תא לתוך צינור 50 מ ל דרך הים.
- לשטוף את החלק הפנימי של התיק עם 20 מ של סידן/מגנזיום ללא פוספט buffered מלוחים [PBS(-), pH = 7.4-7.6] ולאחר מכן לרוקן את התוכן לתוך צינור כדי לאסוף את התאים הנותרים מתוך התיק.
- Centrifuge התליה תא שנאספו במשך 3 דקות ב- 200 גרם x בטמפרטורת החדר ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע.
- להוסיף 10 מ של PBS(-), לשטוף מצרפי.
- Centrifuge אותם למשך 3 דקות ב- 200 גרם x בטמפרטורת החדר ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע לאסוף מצרפי.
- מוסיפים 4 מ"ל של PBS ו 1 מ"ל של טריפסין, דגירה אותם עם מצרפי 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מביצועם התאים עבור ספירה (אופציונלי).
5. הכנת צלחת בצורת O (אופציונלי)
הערה: ראה איור 1b עבור דמות סכמתית של המנה בצורת O.
- לגזור בתחתית צלחת 60 מ מ או 35 מ מ עם סכין חם ולנצל אותו כמו צלחת הפנימי.
- לשים את הצלחת 60 מ מ הפוך במרכז צלחת 100 מ מ.
הערה: גיליון מדריך יכול לעזור לקבוע את המיקום של המנה 60 מ מ. - אם נדרש, לשים מנוכים צמיגות cyclohexanone על commissure מבפנים של מאכל 60 מ מ.
- יבש את הצלחת בצורת O לכמה ימים, לעקר אותה על ידי גמא או אתילן אוקסיד גז.
Representative Results
על פי המידות שלנו, אגרגטים גדל לתוך המנה המקובלת היו מגוונות קטרים אחרי 5 d של טלטול מסלולית. לעומת זאת, אגרגטים גדל בכלי בצורת O עבור 5 d היה קטרים אחיד הרבה יותר. התרבות המנה המקובלת הראה אגרגטים קטנים (50-200 מיקרומטר), ואילו התרבויות של כלי בצורת O אינה מכילה שום אגרגטים קטנים (איור 2 א). לפי המדידה מבוססת תמונה בגודל, התרבות המנה המקובלת הראה שתי הפסגות שונים (איור 2b1), המעידים על סטייה רחב בגודל צבירה. תוצאה זו משתמעת אגרגטים המנה המקובלת צמחו תחת שני תנאים שונים בתרבות זהה, אשר יכול לגרום איכות התא הטרוגנית. מצד שני, אגרגטים בכלי בצורת O הראה לשיא יחיד ופחות סטייה בקוטר יותר מאלו של המנה המקובלת (איור 2b2 ו- 2b3), רומז כי אגרגטים כזה עשוי להיות באיכות אחידה יותר.
איור 2: מורפולוגיות, קטרים של אגרגטים גדלו ב ספינות שונות. לוחות אלה להראות תמונות brightfield () ו- (b) היסטוגרמות האגרגטים גדל או (a1 ו- b1) קונבנציונאלי מאכל, (a2 ו- b2) בצורת O צלחת, או (a3 ו- b3) תיק בצורת O. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Hematoxylin ואאוזין מכתים של חתכים צבירה הראו שיש אגרגטים גדל לתוך המנה המקובלת כמה תאים denucleated, נמק ליבות (איור 3 א). עם זאת, אגרגטים גדל בכלי בצורת O לא הראה כל הליבות נמק (איור 3b ו- 3 c). בפרט, אגרגטים גדל בשקית בצורת O הם כל כך גדולים כמו אלה לתוך המנה המקובלת עדיין לא היה כל הליבות נמק (איור 3 c). תוצאות אלה הציע כי השקית גז-חדיר סיפק מספיק חמצן אל התרבות.
איור 3: חתכי רוחב של אגרגטים בכלי שונים. חתכים בעובי 12 מיקרומטר, התכוננו מדגימות קפוא. הסעיפים היו מוכתמים hematoxylin ואאוזין להמחיש את התאים. () התא אגרגטים גדלו בתרבות המקובלת ההשעיה הראה ליבות עם נמק. אגרגטים תא גדל גם (b) של צלחת בצורת O או (ג) תיק בצורת O הראה נמק מעט מאוד ליבות שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
תא ספירת הראה כי יותר מ-85% מהתאים שרד במשך 5 d תרבות השעיית כל כלי (איור 4a). צפיפות התא האחרון היה כ 1.5-2.0 x 106 תאים למ"ל. למרות שהיה הבדל משמעותי, היחס צמיחה בשקית בצורת O היה גבוה יותר מאשר אלו בכלי אחרים (איור 4b). שיעורי צמיחה ספציפיים של התאים המנה המקובלת, המנה בצורת O ו השק בצורת O בין יום 2 יום 5 היו 0.018 0.025, 0.020 h-1, בהתאמה.
איור 4: תא הכדאיות וצמיחה. אלה מראות () תא הכדאיות ו- (b) תא צפיפות של תאים HEK293 בכלי תרבות שונים לאחר 2 d של תרבות (יום 2) ו 5 d של תרבות (יום 5). הערכים המוצגים מייצגים הממוצע של התוצאות של ניסויים עצמאית 3. הערכים עבור ניסוי חושבו מתאי trypan blue מוכתמת החשבת מונה הניתן תא אוטומטית. קווי השגיאה מציינות סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1: חרוז הפצה 2 תבניות מאכל שונים בתנאים שונים חזק. לוח זה מציג את התפלגות חרוז בתקופת התנאים השונים חזק (30, 40 ו 45 rpm) תבשיל קונבנציונאלי בצורת O. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
במחקר זה, אנחנו פיתח כלי בצורת O וביצע תרבות הבולם HEK293 בהם היווצרות אגרגטים אחיד, הרחבה. בצלחת תרבות המקובלת, אורביטל רועד תרבות הפיק שני קטרים שונים של אגרגטים, ואילו הבחנו אגרגטים אחיד בכלי בצורת O (איור 1). על-פי התצפית של ההתפלגות של חרוזים מוכתם בתנאים חזק מסלולית, חרוזים לאסוף ב המרכז-התחתית לצלחת תרבות קונבנציונלי. איסוף זה נגרם ככל הנראה ההפרש בצפיפות תא שמוביל גדלים שונים של אגרגטים. לחלופין, חרוזים הופצו בצלחת בצורת O אשר אין אזור מרכז-התחתון (משלימה איור 1). הפצה זו כנראה גורם מצרפי בגודל אחיד בכלי בצורת O. אחר — בשימוש נרחב — גישה לייצור אגרגטים אחיד היא culturing ב microwells, אבל גישה זו יש כמה בעיות, כמו למשל באספקת מדיום תרבות ללא אגרגטים נושרת microwells13. במקרה של כלי בצורת O, אגרגטים אחיד יכול להיות מיוצר בתרבות התליה פשוטה.
אורביטל רועדת התרבות היא מערכת התרבות הפופולרית מנוצל עבור בתרבית של תאים. קיימות שיטות שונות תרבות עבור ייצור המוני של בתרבית של תאים, כמו טנק מנוער ביוריאקטור14, שקיות גל-רמז15, וסיבוב בקבוקים. מסלולית תרבויות חזק אינם כוללים את המדחף הפנימי עבור ערבוב של המדיום, בניגוד לטנק מנוער ביוריאקטור עושה. תכונה זו דומה שקיות גל-רמז ובקבוקים מסתובב. מערכות התרבות ללא המדחף אלה ניתן למנוע נזק תאי מהמשטרה ההטיה המקיף את המדחפים ולממש גזירה נמוכה בתרבות ההשעיה. במיוחד, מערכות התרבות חזק מסלולית יעילים לייצור המוני של תאים רגישים כגון בתרבית של תאים בגלל שלהם מדרגיות גבוהה, גזירה נמוכה.
כלי בצורת O יכול לשפר את הבעיה הנותרים של תרבות חזק מסלולית להיווצרות של אגרגטים. במסלולית רועד מערכות התרבות, העברת תאים צף למרכז ואת התחתון של הספינה, אשר מכונה "התה של איינשטיין העלה פרדוקס"11. העברה זו גורמת צבירה inhomogeneous בין הייצור צבירה לא אחידה המקובלת מסלולית טלטול כלי. במחקר זה, כלי בצורת O מנעו את הריכוז של תאים המרכז-החלק התחתון כלי הדם, אשר speculated כסיבה של צבירה במדים מסלולית כלי חזק בצורת O.
ניתוחים היסטולוגית הראה כי מצרפי בצלחת קונבנציונלי כולל תאים denucleated (איור 2 א). לעומת זאת, תאים denucleated אינה מופיעה מצרפי מכלי בצורת O (איור 2b ו- 2 c). זה אפשרי כי תאים denucleated אלה נגרמו על ידי מחסור של סובסטרטים כגון גלוקוז, גלוטמין ו חמצן9. על פי גודל המדידה, אגרגטים של כלי בצורת O היה נמוך יותר מאשר מיקרומטר 400 הומוגנית קטרים. לעומת זאת, בקערה קונבנציונאלי, אגרגטים כמה היה בקוטר גדול יותר 400 מיקרומטר, אגרגטים אלה כללו תאים denucleated. תוצאה זו עולה כי יצירת הומוגניות בגודל אגרגטים בכלי בצורת O הוא יעיל בשליטה האיכות של אגרגטים. בנוסף, זה גם הוא העריך, כי חמצון דרך הסרט פוליאתילן גז-חדיר למנוע את הופעת תאים denucleated בשקית בצורת O.
הניסויים הראו את האפשרות של אלו כלי בצורת O כמערכת פשוטה לייצור אגרגטים אחיד. אמנם שאר התיקים תרבות לתרבות ההשעיה כבר מפותחת15, תרבות השקיות האלו בצורת ריבוע, והדבר מונע התרבות של מקבל ביעילות מעורבות לוחצים מסלולית. השקית במחקר זה יש רומן מתאים רועד מסלולית לייצר אגרגטים עם גודל הומוגנית צורה עגולה. מאפיין זה של כלי חשוב עבור שליטה התנאים של הפארמצבטית גבוהה של תאים בייצור המוני. היישום אפשרי של כלי השיט בצורת O נפוצה. ניתן להשתמש בעת הפקת חומרים מתאי ו עבור רפואה רגנרטיבית בהתמודדות עם תאי גזע.
לסיכום, פיתחנו רומן בצורת O תיק מתאים לייצור אגרגטים תא אחיד עם תרבות חזק מסלולית. השקית מציג אפשרויות שונות ביו יישומים כגון רפואה רגנרטיבית.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי שיתוף פעולה עם יושידה הטאקאו FUKOKU ושות', בע מ מ- FUKOKU, בע מ, סיפק את הרעיון של השקית בצורת O תרבות. סאטו Takamasa של FUKOKU ושות', בע מ תמיכה במחקר זה במונחים של סימולציה חישובית לפתח השקית בצורת O תרבות. ברצוננו להעריך השתייכות הנוכחי של המחבר המקביל, באוניברסיטת אוסקה, עבור המאפשר לנו לעבוד על הפרסום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
