Summary
여기 선물이 O 모양 배, 궤도 동요와 셀룰러 집계의 현 탁 액 문화에 대 한 전문화를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 가방에 성장 HEK293 세포 형성 더 기존의 문화 혈관 성장 보다 균질 집계.
Abstract
포유류 세포의 현 탁 액 문화는 의료 및 바이오 분야에서 다양 한 응용 프로그램에 필요 합니다. 일회용 가방 기반 방법, 세포의 대량 생산을 위한 가장 간단한 방법 중 하나 이지만 그들은 문화 선박의 하단 중앙에서 수집 하는 때 발생 하는 이상 집계에 대 한 문화를 보호 하지는 않습니다. 이 문제를 해결 하려면 우리 개발 O 모양 접시는 O 모양 가방, 어느 것도 중앙 지역 포함. 집계 중 문화 오 모양의 용기에 재배 현저 하 게 더 획 일 한 크기에 집계 기존의 선박에 성장 보다 있었다. 조직학 분석을 기존의 문화 요리에 집계 했다 가난한 산소 공급에 발생 하는 괴 사 성 코어 포함. 반면, 집계 O 모양 가방, 심지어 그 기존의 문화 요리, 집계에 유사한 직경에서에서 성장 했다 괴 코어를 보여주지 않았다. 이 결과 O 모양 가방 가방 재료의 산소 침투성으로 인해 집계에 충분 한 산소를 제공 합니다 것이 좋습니다. 우리는, 따라서,이 소설 가스 투과성 O 모양의 문화 가방 다양 한 바이오 분야에 있는 필요한 유니폼의 대량 생산에 적합은 제안 합니다.
Introduction
현 탁 액 셀 문화는에 중요 한 역할 재생 의학1 과 재조합 단백질 생산2 셀 생산 최대 규모 및 10 이상7 셀까지 때로는 높은 세포 밀도 달성 하기 쉽습니다 때문에 / mL5. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포3 인간 미 발달 신장 세포 293 (HEK293)4 현 탁 액 문화에서 재배 하 고 있고 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs) 최근 현 탁 액 문화 시스템에서 재배 되어 재생 치료1,,67. 서 스 펜 션 문화를 사용 하 여 미래에 증가 예정 이다.
현 탁 액 문화에서 일부 셀 라인 단일 세포로 성장 수 없습니다 하 고 집계를 형성 해야 합니다, 따라서. 예를 들어 hPSCs 집계를 형성 하지 않고 정지 조건에서 살아남을 수 없다. 그러나, 집계 된 성장에 대 한 이러한 요구 사항을 균일 한 현 탁 액 문화에 대 한 어려움을 선물 한다. 한 어려움 정지 문화8의 효율성을 결정 하는 문화권의 이른 기간에서 균일 한 집계의 형성 이다. 또 다른 어려움은 집계에 영양분의 대량 전송. 특히, 산소 공급 집계의 최대 크기를 제한 하 고 가난한 산소 공급 집계9의 센터에 괴 사를 발생. 따라서, 세포의 현 탁 액 문화는 더 평범한 현 탁 액 문화 보다 얻기 어렵다. 그럼에도 불구 하 고, 현 탁 액 문화는 중요 한 생물 의학 및 생명 공학 응용 프로그램.
궤도 떨고 배 임 펠 러 동요 없이 문화 매체 혼합물을 달성 하는 가장 간단한 현 탁 액 문화 시스템 중 하나입니다. 임 펠 러 및 동적 중간 흐름에서 전단 응력은 세포 손상 원인과 감 별 법 때문에 서 스 펜 션 문화의 주요 문제 이다. 낮은 전단 응력으로 동요를 위해 연구자 및 산업 궤도 떨고 선박 시스템2,10의 다양 한을 개발 했습니다.
그러나, 기존의 문화 혈관은 문화를 떨고 궤도 설계 되지 않았습니다. 궤도 혈관을 떨고, 셀 "아인슈타인의 차 잎 역설"11, 셀의 휘도가 집계를로 알려진 중간 흐름의 형식에 의해 혈관의 센터 밑 쪽으로 몰리는. 문화 매체와 선박, 사이 마찰과는 원심력으로 인 한 순환 흐름으로 센터11,12셀 스윕. 또한, 대량 문화에 대 한 기존의 문화 가방은 사각형 모양의 궤도 동요에 적합 하지 않습니다.
이 연구에서 우리 문화를 흔들어 하는 궤도 대 한 적합 한 새로운 문화 가방을 개발 했다. 이 가방의 참신 없는 센터 지역 셀 하단 센터 지역에서 집회에서 막힌다 그래서 그것의 O 모양입니다. 우리 또한이 가방 바이오 응용 프로그램의 가능성을 입증 하는 HEK293 문화 이러한 혈관의 처리를 설명 했다.
Protocol
1입니다. 세포와 자료의 준비
- 1% 비필수 아미노산 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글 중간에 HEK293 세포 배양. 6.8 7.6을 문화 매체의 pH를 조정 합니다.
- 5-7 d 경작 후 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 성 솔루션 (트립 신-EDTA) 세포 분열 하 고 5000-10, 000 셀/c m2에서 셀을 다시 시드하십시오.
2. 시드 O 모양 가방 셀
- 1.2 단계에서 설명한 대로 셀을 해리 하 고 문화 매체의 2-5 mL에 그들을 resuspend.
- 단일 세포 현 탁 액을 수집 하 셀 스 트레이너 (40 µ m)를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
- Trypan 푸른 얼룩 및 자동 셀 카운터, 셀의 수를 계산 하 고 셀 서 스 펜 션 (105 셀/mL x 2.0) 20 mL를 준비.
- 플런저 없이 채워 50 mL 주사기를 O 모양 가방 (그림 1a)의 입구를 연결 합니다.
그림 1: 회로도 이미지와 사진의 O 모양 혈관. (a1) 이것은 O 모양 가방 회로도 이미지 이다. (a2) 이 O 모양 가방 사진입니다. (b1) 이것은 O 모양 접시의 회로도 이미지 이다. (b2) 이것은 O 모양 접시의 그림입니다. O 모양 가방의 외부 및 내부 직경은 90 밀리미터 및 20 밀리미터, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 클램핑 된 주사기를 통해 O 모양 가방에 준비 된 세포 현 탁 액을 플라스틱.
- 첫 번째 채워 주사기를 깨끗 한 주사기를 바꿉니다. 가방을 완전히 확장 하려면 깨끗 한 주사기를 통해 깨끗 한 공기의 55 mL를 추가 합니다.
- 입구 튜브 클램프 한 다음 입구를 닫습니다. 마지막으로, 튜브에서 클램프를 제거 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2의 조건에서 45 rpm에서 그들을 흔들어 셀 O 모양 가방에 품 어.
3. 매체 변경 (선택 사항)
- 입구를 통해 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
- 실내 온도에, 200 x g에서 2 분 동안 원심 하 고에 상쾌한 발음.
- 문화 매체의 20 mL를 추가 하 고 셀을 resuspend.
- 다음 단계 2.4-2.7 여 O 모양 가방 resuspended 셀을 추가 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2의 조건에서 45 rpm에서 그들을 흔들어 셀 O 모양 가방에 품 어.
4. 가방에서 세포 수집
- 입구를 통해 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
- 칼슘/마그네슘 자유로운 인산 염 버퍼의 20 mL와 가방의 내부 식 염 수 세척 [PBS(-), pH = 7.4-7.6] 다음 내용을 가방에서 나머지를 수집 하는 관으로 배수.
- 실내 온도에, 200g x 3 분에 대 한 수집 된 세포 현 탁 액을 원심 하 고에 상쾌한 발음.
- PBS(-)의 10 mL을 추가 하 고 집계를 세척.
- 실내 온도에, 200 x g에서 3 분 동안 원심 고 수집 집계 상쾌한 발음.
- 4 mL PBS의 고 1 mL의 트립 신을 추가 하 고 계산 (선택 사항)에 대 한 셀을 해리를 37 ° C에서 10 분에 대 한 집계와 함께 그들을 품 어.
5. (선택 사항) O 모양 요리 준비
주: O 모양 접시의 회로도 이미지 그림 1b 를 참조 하십시오.
- 뜨거운 칼으로 60 m m 또는 35 mm 접시의 바닥 고 내부 접시로 활용.
- 거꾸로 100 mm 접시의 중앙에 60 m m 접시를 넣어.
참고: 가이드 시트 60 mm 접시의 위치를 결정을 도울 수 있다. - 필요한 경우 위에 점도 조정 cyclohexanone는 commissure 60 mm 접시의 안쪽에서.
- O 모양 접시 몇 일 동안 말리 고 감마선 또는 에틸렌 산화물 가스에 의해 소독.
Representative Results
우리의 측정 집계 전통적인 접시에서 성장 궤도 동요의 5 d 후 직경 변화 했다. 반면, 집계 5 d O 모양 혈관에서 성장 했다 훨씬 더 균일 한 직경. 기존의 요리 문화 문화 O 모양 혈관에 어떤 작은 집계 (그림 2a)을 포함 하지 않은 반면 작은 집계 (50 ~ 200 µ m), 보였다. 이미지 기반 크기 측정에 따라 기존의 요리 문화 집계 크기의 넓은 편차를 나타내는 두 개의 다른 봉우리 (그림 2b1), 보였다. 이 결과 집계 전통적인 접시에서 이기종 셀 품질에서 발생할 수 있는 동일한 문화에서 2 개의 다른 조건 성장 했다 암시. 다른 한편으로, 집계 단일 피크를 보여 O 모양 혈관에 편차 (그림 2b2 와 2b3), 기존의 요리 보다는 직경에서 더 적은 제안 더 균일 한 품질의 이러한 집계 될 수 있습니다.
그림 2: 형태학 및 다양 한 용기에 재배의 직경. O 모양의 접시, 또는 (a3 및 b3)이이 패널 (는) 명시 이미지와 집계는 전통적인 접시 (a2 , b2) 중 하나 (a 1 과 b1)에서 재배의 (b) 히스토그램 표시 O 모양의 가방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
되며 오신 집계 횡단면의 얼룩 보여주었다 집계 전통적인 접시에서 성장 했다 몇 가지 denucleated 세포와 괴 코어 (그림 3a). 그러나, 집계 O 모양 혈관 성장 (그림 3b 와 3c) 어떤 괴 코어를 보여주지 않았다. 특히, 집계 O 모양 가방에서 성장 했다 전통적인 접시에 그 만큼 큰 아직 어떤 괴 코어 (그림 3c) 하지 않은. 이러한 결과 가스 침투성 가방 문화에 충분 한 산소 공급을 제안 했다.
그림 3: 다양 한 선박에 집계의 횡단면. 횡단면 12 µ m 두께 이며 냉동된 샘플에서 준비 했다. 섹션은 hematoxylin와 셀 시각화에 오신 얼룩이 있었다. 재래식 서 스 펜 션 문화에서 성장 하는 (한) 셀 집계 괴 코어를 보여주었다. 셀 집계를 O 모양 접시 또는 (c) O 모양 가방 중 (b)에서 재배 그들의 코어에서 아주 작은 괴 사를 보여주었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
셀 계산의 각 선박 (그림 4a)에 현 탁 액 문화 5 d 셀의 85% 이상 살아 보여주었다. 마지막 셀 밀도 약 1.5-2.0 x 106 셀/mL 이었다. 비록 큰 차이, O 모양 가방에서 성장 비율 (그림 4b) 다른 선박에 비해 더 높은 했다. 기존의 요리, 오 모양 접시에 2 일과 5 일 사이의 O 모양 가방 셀의 특정 성장 속도 각각 0.018, 0.025, 0.020 h-1했다.
그림 4: 세포 생존 및 성장. 문화 (주 2)의 2 d 후 다양 한 문화 혈관이이 패널 표시 (한) 셀 생존 및 (b) 세포의 밀도 HEK293 세포와 문화 (5 일)의 5 d. 표시 된 값에서 3 독립적인 실험 결과의 평균을 나타냅니다. 각 실험에 대 한 값은 trypan 블루 스테인드 세포를 자동 셀 카운터 계산에서 계산 했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 다양 한 진동 조건에서 2 다른 접시 형태로 배포 구슬. 이 패널은 전통과 O 모양 접시에 다양 한 진동 조건 (30, 40, 그리고 45 rpm) 동안 구슬 배포를 보여줍니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 연구에서 우리 O 모양 혈관을 개발 하 고 균일 한 집계 형성 및 확장에 대 한 그들의 HEK293 서 스 펜 션 문화를 수행. 기존의 문화 접시에 문화를 떨고는 궤도 유니폼 집계 O 모양 혈관 (그림 1)에서 관찰 하는 반면 집계의 두 개의 다른 직경 생산. 궤도 떨고 조건에 얼룩진된 구슬의 분포의 관찰에 따라 구슬 기존의 문화 접시의 중앙 하단에 모입니다. 그 집회는 아마도 셀 밀도의 다양 한 크기에 선도에 차이 발생 합니다. 또는, 비즈 센터 하단 영역 (보충 그림 1) 없는 O 모양 접시에 배 부 되었다. 이 배포는 아마 O 모양 혈관에 균일 하 게 크기의 집계를 발생합니다. 또 다른-널리-유니폼 집계 생산 접근 microwells에서 경작 하지만이 이렇게 몇 가지 문제가 있다와 같은 집계 microwells13에서 떨어지는 없이 문화 매체를 제공. O 모양 혈관의 경우 균일 한 집계는 간단한 현 탁 액 문화에서 생산 수 있습니다.
문화를 떨고 궤도 포유류 세포에 대 한 활용 대 중 문화 시스템 이다. 흔들된 탱크 생물14, 파 놓 가방15, 같은 포유류 세포의 대량 생산을 위한 다양 한 문화 방법 병을 회전. 궤도 떨고 문화 매체 교 반에 대 한 내부 임 펠 러를 포함 하지 않습니다, 그리고 흔들된 탱크와는 달리 생물. 이 기능은 파 놓 가방과 회전 병 비슷합니다. 이 임 펠 러 무료 문화 체계는 날개를 둘러싼 전단 력에서 세포 손상을 방지 하 고 현 탁 액 문화에서 낮은 전단 응력을 실현 수 있습니다. 특히, 궤도 떨고 문화 시스템은 그들의 높은 확장성과 낮은 전단 응력 때문에 포유류 세포와 같은 중요 한 세포의 대량 생산에 대 한 효과적입니다.
O 모양 혈관의 형성에서 궤도 떨고 문화의 나머지 문제를 개선할 수 있습니다. 궤도 문화 시스템을 떨고, 떠 있는 세포 센터와 "아인슈타인의 차 잎 역설"11라고 그릇의 하단을 마이그레이션합니다. 이 마이그레이션 기존의 궤도 배를 흔들어에 휘도가 집계 및 비균일 집계 생산을 발생 합니다. 이 연구에서 O 모양 혈관 센터-하단에는 혈관의 궤도 떨고 오 모양의 혈관에 균일 한 집계의 원인으로 추측 되는 세포의 농도 방지.
조직학 분석 denucleated 셀 (그림 2a) 전통적인 접시에 집계에 포함 된 것으로 나타났다. 대조적으로, denucleated 세포 O 모양 혈관 (그림 2b 와 2c)에서 집계에 나타나지 않았다. 이 denucleated 세포 포도 당, 글루타민, 및 산소9같은 기판의 부족에 의해 발생 했다 가능 하다. 크기 측정 집계 O 모양 혈관에서 균질 직경 400 µ m 보다 낮은 했다. 대조적으로, 전통적인 접시에서 일부 집계 했다 400 µ m 보다 큰 직경 하 고 이러한 집계 포함 denucleated 셀 키를 누릅니다. 이 결과 집계의 품질 제어에 효과적입니다 오 모양의 혈관에서 동종 크기의 집계를 만드는 제안 합니다. 또한, 그것은 또한 가스 침투성 폴 리 에틸렌 필름을 통해 산소 O 모양 가방에서 denucleated 셀의 모양을 방지 추측 이다.
이러한 실험 유니폼 집계 생성을 위한 간단한 시스템으로 이러한 O 모양 혈관의 가능성을 보여주었다. 서 스 펜 션 문화에 대 한 다른 문화 가방 개발 된15왔다, 하지만 그 문화 부 대는 사각 모양, 어떤 궤도 흔들어 혼합 효과적으로 점점에서 문화를 방지. 이 연구에 가방 모양 균질 크기 집계를 생산 궤도 떨고 적합 라운드 소설이 있다. 혈관의이 특성은 조건 및 대량 생산에 전지의 높은 재현성을 제어 하기 위한 중요 합니다. O 모양 그릇의 가능한 응용 프로그램은 광범위 한. 그것은 줄기 세포를 다룰 때 재생 의학 및 세포에서 재조합 단백질을 생산 하는 경우 사용할 수 있습니다.
결론적으로, 우리가 개발 소설 O 모양 가방 균일 한 셀 집계를 궤도 동요 문화 생산에 적합. 가방 재생 의학에서와 같은 다양 한 생물 의학 응용 프로그램에 대 한 가능성을 보여줍니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 주식회사 FUKOKU 다카오 요시다 FUKOKU, (주) 문화 O 모양 가방의 아이디어를 제공와 협력에 의해 지원 됩니다. FUKOKU, (주)에서 타 사토 문화 O 모양의 가방을 개발 하기 위한 전산 시뮬레이션 측면에서이 연구를 지원 합니다. 우리는 해당 작가 현재 제휴, 오사카 대학, 우리는 게시 작업을 수 있도록 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
