Summary
Her presenterer vi en protokoll for bruk O-formet fartøy, spesialisert for suspensjon kulturer av mobilnettet aggregat, med orbital risting. De HEK293 cellene vokst i denne vesken danner mer homogen aggregater enn de dyrket i tradisjonell kultur fartøy.
Abstract
Suspensjon kulturer av pattedyr celle aggregater kreves for forskjellige programmer i medisinsk og bioteknologisk. Disponibel bag-baserte metoden er en av de enkleste teknikkene for masseproduksjon av mobilnettet aggregater, men det beskytter ikke kulturer mot over aggregering, som oppstår når de samle midten nederst på kultur fartøyet. For å løse dette problemet, utviklet vi en O-formet rett og en O-formet bag, verken som inneholder en sentral-regionen. Aggregater dyrket i enten O-formet kultur fartøyet var merkbart mer ensartet i størrelse enn aggregater dyrket i konvensjonelle fartøy. Histologiske analysene viste som samler i tradisjonell kultur retter inneholdt nekrotisk kjerner mest sannsynlig forårsaket av en dårlig oksygentilførsel. Derimot vise sammendrag som ble dyrket i O-formet posen, selv de med lignende diameter til aggregat i tradisjonell kultur retter, ikke nekrotisk kjerner. Disse resultatene tyder på at O-formet vesken gir tilstrekkelig oksygen til aggregat på grunn av oksygen permeabiliteten av posen materialet. Vi foreslår derfor at denne romanen gass permeabel O-formet kultur vesken er egnet for masseproduksjon av uniform aggregater som kreves i ulike bioteknologisk.
Introduction
Suspensjon cellekultur spiller en viktig rolle i celleproduksjon for regenerativ medisin1 og rekombinant protein produksjon2 fordi det er lett å skalere opp og oppnå høyt tettheter, noen ganger opptil mer enn 107 celler / mL5. Kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler3 menneskelige embryonale nyre celler 293 (HEK293)4 har blitt dyrket i suspensjon kultur og menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs) har nylig blitt dyrket i kultur bæresystem for regenerativ terapi1,6,7. Bruk av suspensjon kulturer forventes å øke i fremtiden.
I suspensjon kultur, noen linjer kan ikke vokse som enkeltceller og må derfor danner aggregat. For eksempel ikke kan hPSCs overleve i suspensjon forhold uten danner aggregat. Men presenterer dette kravet for samlet vekst vanskeligheter for uniform suspensjon kulturer. Det er dannelsen av uniform aggregater i den tidlige perioden av kultur, som avgjør effektiviteten av suspensjon kultur8. En annen vanskelighet er masse overføring av næringsstoffer i aggregat. Spesielt oksygentilførsel begrenser den maksimale størrelsen av aggregater, og en dårlig oksygentilførsel fører nekrose i midten av aggregater9. Følgelig er suspensjon kulturer av cellen aggregater vanskeligere å få enn konvensjonelle suspensjon kulturer. Likevel suspensjon kulturer er avgjørende for biomedisinsk og bioteknologi programmer.
Orbital risting fartøy er en av de enkleste kultur bæresystem som oppnå kultur medium blandinger uten impeller agitasjon. Skjæring stress fra pumpehjulet og dynamisk middels flyten er det store problemet med suspensjon kultur fordi det forårsaker celleskader og differensiering. For å oppnå omrøring med en lavere skjæring stress, har forskere og industri utviklet en rekke orbital risting fartøyet systemer2,10.
Men er konvensjonelle kultur fartøy ikke utformet for orbital risting kulturer. I orbital risting fartøy, bevege celler mot center-bunnen av fartøyene etter en middels flyt kjent som "Einsteins te blad paradox"11, som fører til ikke-homogen aggregering av celler. Sirkelflyt, forårsaket av en sentrifugalkraften og en friksjon mellom kultur medium og et fartøy, feier celler i center11,12. Konvensjonelle kultur poser for masse kultur er i tillegg firkant-formet, som er ikke egnet for orbital risting.
I denne studien utviklet vi en ny kultur bag egnet for orbital risting kulturer. Nyheten av denne vesken er O-formen som ikke har en midten regionen, så celler hindres samling på bunnen midten regionen. Vi har også vist håndtering av disse fartøyene med en HEK293 kultur å demonstrere muligheten for disse posene for bioteknologisk programmer.
Protocol
1. forberedelse av celler og materialer
- Dyrke HEK293 celler i Dulbeccos endret Eagle medium med en 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% ikke-essensielle aminosyrer. Justere pH i kultur medium til 6,8 – 7,6.
- Etter dyrking for 5 til 7 d, distansere cellene med en 0,25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic sur løsning (trypsin-EDTA) og reseed cellene på 5000-10.000 celler/cm2.
2. seeding cellene i en O-formet Bag
- Dissociate cellene som beskrevet i trinn 1.2 og resuspend dem i 2-5 mL kultur medium.
- Filtrere celle suspensjon gjennom en celle sil (40 µm) å samle en enkeltcelle suspensjon.
- Teller antall celler ved trypan blå flekker og automatisk celle counter, og deretter forberede 20 mL celle suspensjon (2,0 x 105 celler/mL).
- Koble mengden av O-formet posen (figur 1a) til festet 50 mL sprøyter uten en stempelholderen.
Figur 1: skjematisk bilder og bilder av O-formet fartøy. (a1) Dette er en skjematisk bilde av en O-formet bag. (a2) Dette er et bilde av en O-formet bag. (b1) Dette er en skjematisk bilde av en O-formet rett. (b2) Dette er et bilde av en O-formet rett. Ytre og indre diameter av O-formet posen er 90 mm og 20 mm, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Pipetter forberedt celle suspensjon i O-formet posen gjennom festet sprøyten.
- Erstatt første festet sprøyten med en ren sprøyte. Legge til 55 mL av ren luft gjennom ren sprøyten å utvide posen helt.
- Klemme innløp røret og Lukk innløpet. Til slutt Fjern klemmen fra røret.
- Inkuber cellene i O-formet posen ved å riste dem på 45 rpm i forhold til 37 ° C og 5% CO2.
3. medium endring (valgfritt)
- Overføre celle suspensjon i en 50 mL røret innløpet.
- Sentrifuge det i 2 minutter ved 200 x g ved romtemperatur, og deretter Sug opp nedbryting.
- Legg til 20 mL kultur medium og resuspend celler.
- Legge til resuspended cellene til O-formet posen ved følgende trinn 2.4-2.7.
- Inkuber cellene i O-formet posen ved å riste dem på 45 rpm i forhold til 37 ° C og 5% CO2.
4. samle cellene fra posen
- Overføre celle suspensjon i en 50 mL røret innløpet.
- Vasker innsiden av posen med 20 mL kalsium magnesium-fri fosfat bufret saltvann [PBS(-), pH = 7,4-7.6] og deretter tømme innholdet i et rør for å samle de gjenværende cellene fra posen.
- Sentrifuge samlet celle suspensjon for 3 min 200 x g ved romtemperatur, og deretter Sug opp nedbryting.
- Tilsett 10 mL av PBS(-) og vaske aggregatene.
- Sentrifuge dem for 3 min 200 x g ved romtemperatur, og deretter Sug opp nedbryting for å samle aggregatene.
- Legg 4 mL PBS og 1 mL av trypsin og ruge dem med aggregat for 10 min på 37 ° C til å distansere celler for telling (valgfritt).
5. utarbeidelse av en O-formet rett (valgfritt)
Merk: Se figur 1b for en skjematisk bilde av O-formet parabolen.
- Skjær ut i bunnen av en 60 mm eller 35 mm rett med en varm kniv og utnytte det som en indre rett.
- Sette 60 mm rett opp ned på midten av en 100 mm rett.
Merk: En guide ark kan bidra til å bestemme plasseringen av 60 mm parabolen. - Eventuelt sette viskositet-justert cyclohexanone på commissure fra innsiden av 60 mm parabolen.
- Tørr O-formet parabolen for et par dager og steriliseres ved gamma ray eller ethylene oksid gass.
Representative Results
Ifølge våre målinger, hadde aggregater dyrket i konvensjonelle parabolen variert diameter etter 5 d av orbital risting. Derimot hadde aggregater dyrket i O-formet fartøy for 5 d mye mer ensartet diameter. Konvensjonelle parabolen kulturen viste små mengder (50-200 µm), mens kulturer i O-formet fartøyene ikke inneholder noen små mengder (figur 2a). Ifølge bildebasert størrelse måling, konvensjonelle parabolen kulturen viste to forskjellige topper (figur 2b1), som angir et stort avvik i samlede størrelsen. Dette resultatet underforstått at mengdefunksjoner i konvensjonelle parabolen vokste under to ulike forhold i samme kultur, som kan resultere i heterogene celle kvalitet. Derimot, tyder aggregater O-formet fartøy viste en enkelt topp og mindre avvik i diameter enn konvensjonelle parabolen (figur 2b2 og 2b3), på at slike aggregater kan være mer jevn kvalitet.
Figur 2: Morphologies og diameter av aggregater dyrket i ulike fartøy. Disse skjermbildene viser (en) brightfield bilder og (b) histogrammer av aggregater dyrket i enten (a1 og b1) en konvensjonell parabolen (a2 og b2) en O-formet rett, eller (a3 og b3) en O-formet bag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Hematoxylin og eosin flekker av samlet tverrsnitt viste at aggregater dyrket i konvensjonelle parabolen hadde noen denucleated celler og necrotic kjerner (figur 3a). Aggregater dyrket i O-formet fartøy viste imidlertid ikke noen nekrotisk kjerner (figur 3b og 3 c). Spesielt aggregater vokst i O-formet posen var så stor som konvensjonelle parabolen ennå har ikke noen nekrotisk kjerner (Figur 3 c). Disse resultatene antydet at gass permeabel posen leveres nok oksygen til kultur.
Figur 3: tverrsnitt av aggregater i ulike fartøy. Tverrsnitt er 12 µm tykk og var forberedt fra frosne prøvene. Delene var farget med hematoxylin og eosin å visualisere cellene. (en) cellen aggregater vokst i en konvensjonell suspensjon kultur viste nekrotisk kjerner. Cellen aggregater dyrket i enten (b) en O-formet parabol eller (c) en O-formet bag viste lite nekrose i sine kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Celletall viste at mer enn 85% av cellene overlevde for 5 d suspensjon kultur i hver fartøy (figur 4a). Den siste celle tettheten var ca 1.5-2,0 x 106 celler/mL. Selv om det var ingen vesentlig forskjell, var vekst forholdet i O-formet posen høyere enn i andre skip (figur 4b). De spesifikke vekstrater cellene i konvensjonelle parabolen, O-formet rett og O-formet posen mellom dag 2 og dag 5 var 0.018, 0.025 og 0.020 h-1, henholdsvis.
Figur 4: levedyktighet og vekst. Disse skjermbildene viser (en) cellen levedyktighet og (b) cellen tettheten av HEK293 celler i ulike kultur fartøy etter 2 d kultur (dag 2) og 5 d kultur (dag 5). Verdiene som vises representerer gjennomsnittet av resultatene fra 3 uavhengige eksperimenter. Verdiene for hvert eksperiment ble beregnet fra trypan blå-farget celler telles med en automatisk celle teller. Feilfeltene angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: perle distribusjon i 2 ulike parabol formater i ulike risting forhold. Dette panelet viser perle fordelingen under ulike risting forhold (30, 40 og 45 rpm) i konvensjonelle og O-formet parabol. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
I denne studien vi utviklet O-formet fartøy og utført en HEK293 suspensjon kultur i dem for en ensartet aggregater dannelse og ekspansjon. Konvensjonelle kultur fatet produsert en orbital risting kultur to forskjellige diametere av aggregater, mens vi observerte uniform mengdefunksjoner i O-formet fartøyene (figur 1). Ifølge observasjon av fordelingen av fargede perler i orbital risting forhold samle perler center-nederst en tradisjonell kultur parabol. At samlingen antagelig forårsaket forskjellen i cellen tetthet fører til ulike størrelser av aggregater. Alternativt ble perler distribuert i O-formet parabolen som ikke har regionen center bunn (supplerende figur 1). Denne fordelingen fører trolig jevnt størrelse aggregater i O-formet fartøy. En annen-brukte-tilnærming til å produsere uniform aggregater er dyrking i microwells, men dette har noen problemer, som leverer en kultur medium uten aggregater slippe ut av de microwells13. I tilfelle av O-formet fartøy, kan uniform aggregater produseres i en enkel suspensjon kultur.
Orbital risting kultur er en populærkultur benyttes for pattedyrceller. Det finnes ulike kultur metoder for masseproduksjon av pattedyrceller, som de rørt tank bioreactor14, bølge-vinket poser15, og roterende flasker. Orbital risting kulturer inneholder ikke en indre impeller for røring medium, i motsetning til rørt tanken bioreactor gjør. Denne funksjonen ligner bølge-vinket vesker og roterende flasker. Systemene pumpehjulet-fri kultur kan unngå cellular skade fra skjær styrke rundt i ulyd og realisere lav skjæring stress i suspensjon kultur. Orbital risting kultur systemer er spesielt effektivt for masseproduksjon av sensitive celler som pattedyrceller på grunn av deres høy skalerbarhet og lav skjæring stress.
O-formet fartøy kan forbedre gjenværende problemet med orbital risting kultur i dannelsen av aggregater. I orbital risting kultur systemer, overføre flytende celler i midten og bunnen av fartøyet, som er kjent som "Einsteins te blad paradox"11. Dette migrasjon fører ikke-homogen aggregering og ikke-uniform samlede produksjon i konvensjonelle orbital risting fartøy. I denne studien forhindret O-formet fartøy konsentrasjonen av celler i center-bunnen av fartøyene, hvilke er spekulere som grunnen til uniform samling i orbital risting O-formet fartøy.
Histologiske analysene viste at mengdefunksjoner i konvensjonelle parabolen inneholdt denucleated celler (figur 2a). Derimot vises denucleated celler ikke i aggregater fra O-formet fartøy (figur 2b og 2 c). Det er mulig at disse denucleated cellene ble forårsaket av en mangel på underlag som glukose, glutamin og oksygen9. Ifølge størrelse måling hadde mengdefunksjoner i O-formet fartøyene homogen diameter lavere enn 400 µm. Derimot en konvensjonell parabol, noen aggregater hadde en diameter større enn 400 µm, og disse aggregater inkludert denucleated celler. Dette resultatet antyder at opprette homogene størrelse aggregater i O-formet fartøy er effektiv i å kontrollere kvaliteten av aggregater. I tillegg er det også spekulert at oksygenering gjennom gass permeabel polyetylen filmen hindret utseendet på denucleated celler i O-formet posen.
Disse viste at disse O-formet fartøy som et enkelt system for å produsere uniform aggregat. Selv om andre kultur vesker for suspensjon kultur har vært utviklet15, er de kultur posene firkant-formet, som hindrer at kulturen effektivt blandes i orbital risting. Vesken i denne studien har en roman runde figuren egnet for orbital riste å produsere aggregat med en homogen størrelse. Denne karakteristiske av fartøy er viktig for å kontrollere forholdene og den høye reproduserbarhet celleområde i masseproduksjon. Mulig bruk av O-formet fartøyet er utbredt. Den kan brukes når produsere rekombinante proteiner fra celler og regenerativ medisin når behandling med stamceller.
I konklusjonen, utviklet vi en roman O-formet bag som er egnet for produksjon av uniform celle aggregat med en orbital risting kultur. Posen viser mulighetene for ulike biomedisinsk applikasjoner som i regenerativ medisin.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen er støttet av et samarbeid med FUKOKU, co, Ltd Takao Johnsen fra FUKOKU, co, Ltd ga ideen om O-formet kultur posen. Takamasa Sato fra FUKOKU, co, Ltd støtter denne forskningen i en beregningsformelen simulering utvikler O-formet kultur posen. Vi ønsker å verdsette tilsvarende forfatterens gjeldende tilhørighet, Osaka University, for å arbeide med publikasjonen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
