Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att använda O-formade fartyg, specialiserade för suspension kulturer av cellulära aggregat, med orbital skakar. HEK293 cellerna odlas i denna väska bilda mer homogent aggregat än de som odlas i konventionella odlingskärl.
Abstract
Suspension kulturer av däggdjursceller aggregat krävs för olika applikationer i medicinska och biotekniska områden. Disponibel påse-baserade metoden är en av de enklaste teknikerna för massproduktion av cellulära aggregat, men det skyddar inte kulturerna mot alltför aggregering, som uppstår när de samlas längst ned i mitten av kultur fartyget. För att lösa problemet, utvecklat vi en O-formade maträtt och en O-formad påse, varken som innehåller en central region. Aggregat som odlas i antingen O-formade kultur fartyget var märkbart mer enhetlig i storlek än aggregat odlas i konventionella fartyg. Histologiska analyser visade som aggregerar i konventionella kultur rätter innehöll nekrotisk kärnor mest troligt orsakat av en dålig syretillförsel. Aggregat som odlades i O-formad påse, även de med liknande diametrar aggregat i konventionella kultur rätter, visade däremot inte nekrotisk kärnor. Dessa resultat tyder på att O-formade påsen ger tillräckligt med syre till aggregaten på grund av syre permeabiliteten i påsen materialet. Därför föreslår vi, att denna roman gas-permeable O-formade kultur väska är lämplig för massproduktion av enhetliga aggregat som är nödvändiga i olika biotekniska områden.
Introduction
Suspension cellkultur spelar en viktig roll i den cellproduktionen för regenerativ medicin1 och rekombinant protein produktion2 eftersom det är lätt att skala upp och uppnå hög cell tätheter, ibland upp till mer än 107 celler / mL5. Från kinesisk hamster (CHO) celler3 mänskliga embryonala njure celler 293 (HEK293)4 har odlats i suspension kultur och mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) har nyligen odlats i kultur upphängningssystem för regenerativ terapier1,6,7. Användning av suspension kulturer förväntas öka i framtiden.
I suspension kultur, vissa cellinjer kan inte växa som enstaka celler och därför måste bilda aggregat. Till exempel kan inte hPSCs överleva i suspension förhållanden utan att bilda aggregat. Detta krav för aggregerad tillväxt presenterar emellertid svårigheter för enhetlig suspension kulturer. En svårighet är bildandet av enhetliga aggregat i tidig sortperioden av kultur, som bestämmer effektiviteten av suspension kultur8. En annan svårighet är Massöverföringen av näringsämnen in i aggregat. I synnerhet syretillförseln begränsar den maximala storleken på aggregat och en dålig syretillförsel orsakar nekros i mitten av aggregat9. Följaktligen, suspension kulturer av cell aggregat är svårare att få än konventionell fjädring kulturer. Suspension kulturer är dock avgörande för biomedicinsk och biotekniska tillämpningar.
Orbital skakningar fartyg är en av de enklaste kultur fjädringssystem som uppnå odlingsmedium blandningar utan pumphjulet agitation. Skjuvspänningen från impellern och dynamiska medium flödet är det stora problemet med fjädring kultur eftersom det orsakar cellskador och differentiering. För att uppnå agitation med en lägre skjuvspänning, har forskare och industrier utvecklat en mängd orbital skakningar fartyget system2,10.
Konventionella odlingskärl är dock inte utformade för orbital skakar kulturer. I orbitalen skaka fartyg, dras celler mot center-botten av fartyg av en typ av medium flöde kallas ”Einsteins te blad paradox”11, som orsakar inhomogena sammanläggning av celler. Cirkulära flödet, orsakas av en centrifugalkraft och en friktion mellan odlingssubstrat och ett fartyg, sveper celler i den center11,12. Dessutom är konventionella kultur väskor för masskultur fyrkantig, som inte är lämplig för orbital skakning.
I denna studie har vi utvecklat en ny kultur påse lämplig för orbital skakar kulturer. Nyhet av denna väska är O-formen som inte har en center-region, så cellerna är förhindrade samling vid regionen nedre center. Vi har också visat hanteringen av dessa fartyg med en HEK293 kultur att demonstrera möjligheten att dessa väskor för biotekniska tillämpningar.
Protocol
1. beredning av celler och material
- Odla HEK293 celler i Dulbeccos modifierade Eagle medium med en 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% icke-essentiella aminosyror. Justera pH odlingssubstrat till 6,8-7,6.
- Efter odling för 5 till 7 d, dissociera cellerna med en 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyra syralösning (trypsin-EDTA) och Reseeda cellerna på 5 000-10 000 celler/cm2.
2. sådd cellerna i en O-formade påse
- Separera celler som beskrivs i steg 1.2 och resuspendera dem i 2-5 mL odlingsmedium.
- Filtrera cellsuspensionen genom en cell sil (40 µm) att samla in en enda cellsuspension.
- Räkna antalet celler av trypan blå färgning och automatisk cell counter och sedan förbereda 20 mL cellsuspension (2,0 x 105 celler/mL).
- Anslut inloppet av O-formade påsen (figur 1a) till en klamma 50 mL spruta utan kolv.
Figur 1: Schematisk bilder och bilder av O-formade fartyg. (a1) Detta är en schematisk bild av en O-formade påse. (a2) Detta är en bild av en O-formade påse. (b1) Detta är en schematisk bild av en O-formade maträtt. (b2) Detta är en bild av en O-formade maträtt. O-formade påsen yttre och inre diameter är 90 mm och 20 mm, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Pipettera beredda cellsuspensionen i O-formade påsen genom fastsatta sprutan.
- Ersätt första fastsatta sprutan med en ren spruta. Tillsätt 55 mL ren luft genom ren sprutan att expandera påsen helt.
- Klämma inlopp röret och stäng sedan inloppet. Slutligen, ta bort klämman från röret.
- Inkubera cellerna i O-formade påsen genom att skaka dem vid 45 rpm i villkoren i 37 ° C och 5% CO2.
3. medium förändring (tillval)
- Över cellsuspensionen till en 50 mL tub genom inloppet.
- Centrifugera det i 2 min vid 200 x g i rumstemperatur och sedan Aspirera supernatanten.
- Tillsätt 20 mL odlingsmedium och resuspendera cellerna.
- Lägga till återsuspenderade cellerna på O-formade påse genom följande steg 2,4-2,7.
- Inkubera cellerna i O-formade påsen genom att skaka dem vid 45 rpm i villkoren i 37 ° C och 5% CO2.
4. samla cellerna från påsen
- Över cellsuspensionen till en 50 mL tub genom inloppet.
- Tvätta insidan av påsen med 20 mL av kalcium/magnesium-free fosfatbuffrad saltlösning [PBS(-), pH = 7.4-7,6] och sedan Töm innehållet i en tub att samla in de återstående cellerna från påsen.
- Centrifugera insamlade cellsuspensionen i 3 min vid 200 x g i rumstemperatur och sedan Aspirera supernatanten.
- Tillsätt 10 mL av PBS(-) och tvätta aggregaten.
- Centrifugera dem i 3 min vid 200 x g i rumstemperatur och sedan Aspirera supernatanten för att samla in aggregaten.
- Tillsätt 4 mL PBS och 1 mL av trypsin och inkubera dem med aggregaten under 10 minuter vid 37 ° C att separera celler för inventering (valfritt).
5. beredning av en O-formade maträtt (tillval)
Obs: Se figur 1b för en schematisk bild av O-formade skålen.
- Skär ut botten på en 60 mm eller 35 mm maträtt med en varm kniv och använda det som ett inre skålen.
- Sätta 60 mm skålen upp och ner på mitten av en 100 mm maträtt.
Obs: En guide-ark kan bidra till att bestämma positionen för 60 mm skålen. - Om så krävs, pålagt viskositet-justerade cyklohexanon commissure från insidan av 60 mm maträtt.
- Torr O-formade skålen för ett par dagar och sterilisera den i gamma ray eller eten oxid gas.
Representative Results
Enligt våra mätningar, hade aggregat odlas i konventionella skålen varierande diametrar efter 5 d av orbital skakar. Däremot hade aggregat odlas i O-formade fartyg för 5 d mycket mer enhetlig diametrar. Den konventionella maträtt kulturen visade små mängder (50-200 µm), medan kulturerna i O-formade fartyg inte innehöll några små aggregat (figur 2a). Enligt den bildbaserade storlek mätningen, den konventionella maträtt kulturen visade två olika toppar (figur 2b1), vilket indikerar en bred avvikelse av sammanlagda storlek. Detta resultat innebar att aggregaten i konventionella skålen växte under två olika förutsättningar i samma kultur, vilket kan resultera i heterogena cell kvalitet. Å andra aggregat i O-formade fartyg visade en enkel topp och mindre avvikelse i diameter än i konventionella skålen (figur 2b2 och 2b3), tyder på att sådana aggregat kan vara av mer enhetlig kvalitet.
Figur 2: morfologier och diametrar av aggregat som odlas i olika kärl. Dessa paneler visar (en) brightfield bilder och (b) histogrammen för aggregat som odlas i antingen (a1 och b1) en konventionell maträtt (a2 och b2) en O-formade skålen, eller (a3 och b3) en O-formade påse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Hematoxylin och eosin färgning av sammanlagda tvärsnitt visade att aggregat odlas i konventionella skålen hade några denucleated celler och nekrotisk kärnor (figur 3a). Aggregat som odlas i O-formade fartyg visade dock inte någon nekrotisk kärnor (figur 3b och 3 c). I synnerhet aggregat odlas i O-formade påsen var lika stor som i konventionella skålen ännu hade inte någon nekrotisk kärnor (figur 3 c). Dessa resultat föreslog att gas-permeable påsen levererat tillräckligt med syre till kulturen.
Figur 3: tvärsnitt av aggregat i olika kärl. Ottomotorer är 12 µm tjock och var beredda från frysta prover. Avsnitten var färgas med hematoxylin och eosin att visualisera cellerna. (en) cellen aggregat som vuxit i en konventionell fjädring kultur visade nekrotisk kärnor. Cell aggregat odlas i antingen (b) en O-formade maträtt eller (c), en O-formade påse visade väldigt lite nekros i deras kärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Blodkroppar visade att mer än 85% av cellerna överlevde för 5 d av suspension kultur i varje kärl (figur 4a). Sista cell densiteten var ungefär 1,5-2,0 x 106 celler/mL. Även om det fanns ingen signifikant skillnad, var tillväxt i O-formade påsen högre än i andra fartyg (figur 4b). De specifika tillväxten av cellerna i den konventionella maträtt, O-formade skålen och O-formade väskan mellan dag 2 och dag 5 var 0,018, 0,025 och 0,020 h-1, respektive.
Figur 4: Cell viabilitet och tillväxt. Dessa paneler visar (en) cell livskraft och (b) cell densiteten av HEK293 celler i olika odlingskärl efter 2 d kultur (dag 2) och 5 d i kultur (dag 5). De värden som visas representerar medelvärdet av resultaten från 3 oberoende experiment. Värdena för varje experiment beräknades från trypan blå-färgade celler räknade med en automatisk cell räknare. Felstaplar visar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: Bead distribution i 2 olika maträtt format i olika skakningar villkor. I denna panel visas pärla fördelningen under olika skakningar villkor (30, 40 och 45 rpm) i en konventionell och O-formade maträtt. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
I denna studie vi utvecklade O-formade fartyg och utfört en HEK293 suspension kultur i dem för en enhetlig aggregat bildandet och expansion. I konventionella kultur skålen producerade en orbital skakar kultur två olika diametrar av aggregat, medan vi observerade enhetliga aggregat i de O-formade kärl (figur 1). Enligt observation av fördelningen av färgade pärlor i orbital skakningar förhållanden samla pärlor i center-botten av en konventionell kultur maträtt. Att samla orsakade förmodligen skillnaden i cell densiteten leder till olika storlekar av aggregat. Alternativt, distribuerades pärlor i O-formade skålen som inte har regionen center-botten (kompletterande Figur1). Denna fördelning orsakar förmodligen enhetligt medelstora aggregaten i O-formade fartyg. En annan — utbredda — metod för att producera enhetliga aggregat är odling i mikrobrunnar, men detta tillvägagångssätt har vissa problem, som leverera ett odlingsmedium utan aggregat hoppar av mikrobrunnarna13. När det gäller O-formade fartyg, kan enhetlig aggregat produceras i en enkel upphängning kultur.
Orbitalen skakar kultur är en populär kultur system utnyttjas för däggdjursceller. Det finns olika kultur metoder för massproduktion av däggdjursceller, såsom stirred tank bioreaktor14våg-vinkade väskor15, och roterande flaskor. Orbital skakningar kulturer inkluderar inte en inre impeller för omrörning mediet, till skillnad från den stirred tanken bioreaktor gör. Den här funktionen liknar den våg-vinkade väskor och roterande flaskor. Dessa impeller-fri kultur system kan undvika cellulära skador från tvärkraften kring Fläkthjulen och inse låg skjuvspänning i suspension kultur. Särskilt, är orbital skakningar kultur system effektiva för massproduktion av ljuskänsliga celler såsom däggdjursceller för sin hög skalbarhet och låg skjuvspänning.
O-formade fartyg kan förbättra det återstående problemet med orbital skakningar kultur i bildandet av aggregat. I orbitalen skakar kultur system, migrera flytande celler till center och botten av fartyget, som är känd som ”Einsteins te blad paradox”11. Denna migration orsakar inhomogena sammanläggning och icke-enhetlig samlade produktionen i konventionella orbital skaka fartyg. I denna studie förhindrade O-formade fartyg koncentrationen av celler i center-botten av fartygen, som spekuleras som orsak av enhetliga aggregation i orbital skakar O-formade fartyg.
Histologiska analyser visade att aggregaten i den konventionella maträtt innehöll denucleated celler (figur 2a). Däremot denucleated celler visas inte i aggregaten från O-formade fartyg (figur 2b och 2 c). Det är möjligt att dessa denucleated celler orsakades av en brist på substrat såsom glukos, glutamin och syre9. Enligt storlek mätning hade aggregat i O-formade fartyg homogen diametrar lägre än 400 µm. Däremot i en konventionell maträtt, vissa aggregat hade en diameter större än 400 µm, och dessa aggregat med denucleated celler. Detta resultat tyder på att skapa homogena och medelstora aggregat i O-formade fartyg är effektiva i att kontrollera kvaliteten på aggregat. Dessutom, spekuleras det även att syresättningen genom gas-permeable polyetylenfilm förhindrat tillkomsten av denucleated celler i O-formade påse.
Dessa experiment visade möjligheten att dessa O-formade fartyg som ett enkelt system för att producera enhetliga aggregat. Även andra kultur väskor för suspension kultur varit utvecklade15, är dessa kultur-väskor fyrkantig, som förhindrar kulturen att få effektivt blandas i orbital skakar. Väskan i denna studie har en roman runda form passar orbital skakar för att producera aggregat med en homogen storlek. Detta kännetecken av fartyg är viktigt för att kontrollera villkoren och hög reproducerbarhet av celler i massproduktion. Eventuell tillämpning av O-formade fartyget är utbredd. Det kan användas vid framställning av rekombinanta proteiner från celler och regenerativ medicin när det gäller stamceller.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en roman O-formade påse lämplig för att producera enhetliga cell aggregat med en orbital skakningar kultur. Väskan visar möjligheter för olika biomedicinska tillämpningar såsom inom regenerativ medicin.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av ett samarbete med FUKOKU, CO., Ltd. Takao Yoshida från FUKOKU, CO., Ltd. som idén om O-formade kultur påsen. Takamasa Sato från FUKOKU, CO., Ltd. stöds denna forskning när det gäller en computational simulering för att utveckla O-formade kultur påsen. Vi skulle vilja uppskatta motsvarande upphovsmannens nuvarande tillhörighet, Osaka University, möjligt för oss att arbeta på publikationen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
