Summary
Her præsenterer vi en protokol for at bruge O-formede fartøjer, specialiserede for suspension kulturer af cellulære aggregater med orbital ryster. De HEK293 celler dyrkes i denne taske danne mere homogene aggregater end dem, der dyrkes i traditionelle kultur fartøjer.
Abstract
Suspension kulturer af pattedyr celle aggregater er påkrævet for forskellige applikationer i medicinsk og bioteknologisk felter. Den disponible taske-baseret metode er en af de simpleste teknikker for masseproduktion af cellulære aggregater, men det beskytter ikke kulturer mod overdreven sammenlægning, som opstår, når de samles nederst i midten af kultur fartøj. For at løse dette problem, udviklet vi en O-formede parabol og et O-formet taske, som ikke indeholder en central region. Aggregater dyrkes i enten O-formede kultur fartøj var mærkbart mere ensartede i størrelse end aggregater vokset i konventionelle fartøjer. Histologiske analyser viste, at aggregater i konventionelle kultur retter indeholdt nekrotisk kerner sandsynligvis forårsaget af en dårlig iltforsyning. Derimod udviste aggregeringer, der blev dyrket i O-formet taske, selv dem med lignende diametre til aggregater i konventionelle kultur retter, ikke nekrotisk kerner. Disse resultater tyder på, at den O-formet taske giver tilstrækkelig ilt til aggregater på grund af ilt permeabiliteten af posen materiale. Derfor foreslår vi, at denne roman gas-gennemtrængelige O-formede kultur taske er egnet for masseproduktion af uniform aggregeringer, der er nødvendige i forskellige bioteknologiske områder.
Introduction
Suspension cellekultur spiller en vigtig rolle i celle produktion for regenerativ medicin1 og rekombinant protein produktion2 , fordi det er nemt at skalere op og opnå høje celle tæthed, nogle gange op til mere end 107 celler / mL5. Kinesisk hamster ovarie (CHO) celler3 og menneskelige embryonale nyre celler 293 (HEK293)4 har været dyrket i suspension kultur og humane pluripotente stamceller (hPSCs) har for nylig været dyrket i kultur affjedringssystemer til regenerativ behandlingsformer1,6,7. Brugen af suspension kulturer forventes at stige i fremtiden.
I suspension kultur, nogle cellelinjer kan ikke vokse som enkelt celler og skal derfor danne aggregater. For eksempel, ikke kan hPSCs overleve i suspension betingelser uden at danne aggregater. Men dette krav for samlet vækst præsenterer vanskeligheder for ensartet suspension kulturer. Et problem er dannelsen af uniform aggregeringer i den tidlige periode af den kultur, som bestemmer effektiviteten af suspension kultur8. En anden vanskelighed er den masse overførsel af næringsstoffer i aggregater. Især ilttilførslen begrænser den maksimale størrelse af aggregater, og en dårlig iltforsyning forårsager nekrose i midten af aggregater9. Suspension kulturer af celle aggregater er derfor vanskeligere at opnå end almindeligt affjedringssystem kulturer. Ikke desto mindre suspension kulturer er afgørende for biomedicinske og bioteknologiske applikationer.
Orbital ryster fartøjer er en af de enkleste kultur affjedringssystemer til at opnår næringssubstratet blandinger uden impeller agitation. Shear stress fra løbehjulet og dynamisk medium flow er det store problem med suspension kultur, fordi det medfører celleskader og differentiering. For at opnå agitation med en lavere shear stress, har forskere og industrier udviklet en række forskellige orbital ryster fartøj systemer2,10.
Konventionelle kultur fartøjer er dog ikke beregnet til orbital ryster kulturer. I orbital ryster fartøjer, graviterer celler mod bundafsnit fartoejer af en type af medium flow kendt som "Einsteins te blad paradox"11, som forårsager den inhomogene sammenlægning af celler. Den cirkulære flow, forårsaget af en centrifugalkraft og en friktion mellem substratet og et fartøj, fejer celler i center11,12. Derudover er konventionelle kultur poser til massekultur, firkantet, der er ikke egnet til orbital ryster.
I denne undersøgelse udviklede vi en roman kultur taske egnet til orbital ryster kulturer. Nyhed i denne taske er dens O-form, som ikke har et center område, så celler forhindres indsamling på bunden center region. Vi har også vist håndtering af disse fartøjer med en HEK293 kultur til at demonstrere muligheden for disse poser til bioteknologiske applikationer.
Protocol
1. forberedelse af celler og materialer
- Dyrke HEK293 celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium med en 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% ikke-essentielle aminosyrer. PH-værdien af næringssubstratet til 6,8-7.6.
- Efter dyrkning for 5 til 7 d, adskille celler med en 0,25% trypsin-ethylendiamintetra syre (trypsin-EDTA) og reseed celler på 5.000-10.000 celler/cm2.
2. såning celler i en O-formet taske
- Adskille cellerne, som beskrevet i trin 1.2 og resuspend dem i 2-5 mL af næringssubstratet.
- Filtrere cellesuspension gennem en celle si (40 µm) at indsamle en enkelt cellesuspension.
- Tæller antallet af celler af trypan blå farvning og automatisk celle counter, og klargør derefter 20 mL cellesuspension (2.0 x 105 celler/mL).
- Tilsluttes en fastspændt 50 mL sprøjte uden en stemplet indløb af O-formet taske (figur 1a).
Figur 1: skematisk billeder og billeder af O-formede fartøjer. (a1) Dette er en skematisk afbildning af en O-formet taske. (a2) Dette er et billede af en O-formet taske. (b1) Dette er en skematisk afbildning af en O-formet skål. (b2) Dette er et billede af en O-formet skål. Den ydre og indre diameter af O-formet taske er 90 mm og 20 mm, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Der afpipetteres den forberedte cellesuspension i O-formet taske gennem fastspændt sprøjten.
- Erstatte den første fastspændt sprøjte med en ren sprøjte. Tilføje 55 mL ren luft gennem den ren sprøjte til at udvide posen helt.
- Klemme inlet tube og derefter lukke fjorden. Endelig, fjerne klemmen fra røret.
- Inkuber celler i den O-formet taske ved at ryste dem på 45 rpm i forhold til 37 ° C og 5% CO2.
3. medium forandring (valgfri)
- Overføre cellesuspension til en 50 mL tube gennem fjorden.
- Der centrifugeres det i 2 min på 200 x g ved stuetemperatur, og derefter Aspirér supernatanten.
- Der tilsættes 20 mL af næringssubstratet og resuspend cellerne.
- Tilføje de resuspenderede celler til den O-formet taske af følgende trin 2.4-2.7.
- Inkuber celler i den O-formet taske ved at ryste dem på 45 rpm i forhold til 37 ° C og 5% CO2.
4. indsamling af celler fra posen
- Overføre cellesuspension til en 50 mL tube gennem fjorden.
- Vaske inde i posen med 20 mL af calcium/magnesium-fri phosphat bufferet saltvand [PBS(-), pH = 7,4-7.6] og derefter dræne indholdet ind i et rør til at indsamle de resterende celler fra posen.
- Centrifugeres den indsamlede cellesuspension til 3 min på 200 x g ved stuetemperatur, og derefter Aspirér supernatanten.
- Der tilsættes 10 mL af PBS(-) og vaske aggregater.
- Centrifugeres dem i 3 min på 200 x g ved stuetemperatur, og derefter Aspirér supernatanten for at indsamle aggregaterne.
- Der tilsættes 4 mL PBS og 1 mL af trypsin og inkuberes dem med aggregater i 10 minutter ved 37 ° C at adskille celler for at tælle (valgfrit).
5. forberedelse af en O-formet skål (valgfri)
Bemærk: Se figur 1b for en skematisk afbildning af den O-formede parabol.
- Skåret ud i bunden af en 60 mm eller 35 mm parabol med en varm kniv og bruge det som en indre parabol.
- Sætte 60 mm parabol op og ned på midten af en 100 mm parabol.
Bemærk: En guide ark kan hjælpe til at beslutte placeringen af 60 mm parabol. - Hvis det kræves, skal du sætte viskositet-justeret cyklohexanon på commissure fra indersiden af 60 mm parabol.
- Tør den O-formede parabol for et par dage og sterilisere det af gamma ray eller ethylen oxid gas.
Representative Results
Ifølge vores målinger, havde aggregater vokset i den konventionelle fad varieret diametre efter 5 d af orbital ryster. Derimod havde aggregater vokset i O-formede fartøjer til 5 d meget mere ensartet diameter. Den konventionelle parabol kultur viste lille aggregater (50-200 µm), der henviser til, at kulturer i de O-formede fartøjer ikke indeholder nogen lille aggregater (figur 2a). Ifølge billed-baserede størrelse måling viste den konventionelle parabol kultur to forskellige toppe (figur 2b1), der angiver en bred afvigelse af samlede størrelse. Dette resultat underforstået at aggregater i den konventionelle parabol voksede under to forskellige betingelser i den samme kultur, som kunne resultere i heterogene celle kvalitet. På den anden side aggregater i O-formede fartøjer viste en enkelt peak og mindre afvigelse i diameter end i de konventionelle parabol (figur 2b2 og 2b3), tyder på, at sådanne aggregater kan være af mere ensartet kvalitet.
Figur 2: morfologier og diametre af aggregater vokset i forskellige fartøjer. Disse paneler viser (en) brightfield billeder og (b) histogrammer af aggregater dyrkes i enten (a1 og b1) en konventionel parabol, (a2 og b2) en O-formede parabol, eller (a3 og b3) en O-formet taske. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Hæmatoxylin og eosin pletter af samlede tværsnit viste, at aggregater vokset i den konventionelle fad havde nogle denucleated celler og nekrotisk kerner (figur 3a). Men aggregater vokset i O-formede fartøjer ikke udviste nogen nekrotisk kerner (figur 3b og 3 c). Især aggregater vokset i O-formet taske var så store som dem i den konventionelle parabol endnu havde ikke nogen nekrotisk kerner (figur 3 c). Disse resultater foreslog, at de gas-gennemtrængelige taske medfølger nok ilt til kultur.
Figur 3: tværsnit af aggregater i forskellige fartøjer. Tværsnit er 12 µm tykt og var parate fra frosne prøver. Sektionerne var plettet med hæmatoxylin og eosin at visualisere cellerne. (en) cellen aggregater, dyrket i et almindeligt affjedringssystem kultur viste nekrotisk kerner. Celle aggregater dyrkes i enten (b) en O-formede parabol eller (c) en O-formet taske viste meget lidt nekrose i deres kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Celletal viste, at mere end 85% af cellerne overlevede til 5 d suspension kultur i hvert fartøj (figur 4a). Den sidste celle tæthed var ca 1,5-2,0 x 106 celler/mL. Selv om der var nogen væsentlig forskel, var vækst-forholdet i den O-formet taske højere end i andre fartøjer (figur 4b). Specifik tilvækst af cellerne i den konventionelle parabol, den O-formede parabol og O-formet taske mellem dag 2 og dag 5 var 0.018, 0.025 og 0,020 h-1, henholdsvis.
Figur 4: celle levedygtighed og vækst. Disse paneler viser den (en) celle levedygtighed og (b) celle tæthed af HEK293 celler i forskellige kultur fartøjer efter 2 d af kultur (dag 2) og 5 d kultur (dag 5). Værdierne vist repræsenterer middelværdien af resultaterne fra 3 uafhængige forsøg. Værdierne for hvert eksperiment blev beregnet ud fra trypan blå-farvede celler tælles med en automatisk celle counter. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Bead distribution i 2 forskellige parabol formater i forskellige ryster betingelser. Dette panel viser perle fordelingen under forskellige ryster betingelser (30, 40 og 45 rpm) i en konventionel og O-formet skål. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
I denne undersøgelse, vi udviklet O-formede fartøjer og udført en HEK293 suspension kultur i dem en uniform aggregeringer dannelse og ekspansion. I konventionelle kultur fad produceret en orbital ryster kultur to forskellige diametre af aggregater, der henviser til, at vi observerede uniform aggregeringer i de O-formede fartøjer (figur 1). Ifølge observation af fordelingen af farvede perler i de orbital ryster betingelser samle perler center-nederst i en konventionel kultur parabol. Indsamlingen formentlig forårsaget forskellen i celle tæthed fører til forskellige størrelser af aggregater. Alternativt, perler blev uddelt i den O-formede fad, som ikke har bundafsnit regionen (supplerende figur 1). Denne fordeling forårsager sandsynligvis ensartet størrelse aggregater i O-formede fartøjer. En anden — udbredte — tilgang til at producere uniform aggregeringer er dyrkning i microwells, men denne tilgang har nogle problemer, som i at levere et dyrkningsmedium uden aggregater dropper ud af microwells13. For O-formede fartøjer, kan uniform aggregeringer fremstilles i en simpel suspension kultur.
Orbital ryster kultur er en populær kultur system udnyttede pattedyrsceller. Der findes forskellige kultur metoder til masseproduktion i pattedyrceller, såsom omrørt tank bioreaktor14, bølge-vinkede poser15, og roterende flasker. Orbital ryster kulturer omfatter ikke en indre impeller til omrøring medium, i modsætning til den omrørt tank bioreaktor ikke. Denne funktion er lig den bølge-vinkede tasker og roterende flasker. Disse løbehjul-fri kultur systemer kan undgå cellulære skader fra shear kraft omkring skovlhjul og realisere lave shear stress i suspension kultur. Især, er orbital ryster kultur systemer effektiv for masseproduktion af følsomme celler såsom pattedyrceller på grund af deres høje skalerbarhed og lave shear stress.
O-formede fartøjer kan forbedre de resterende problem af orbital ryster kultur i dannelsen af aggregater. I orbital ryster kultur systemer, vandrer flydende celler til midten og bunden af det fartøj, der er kendt som "Einsteins te blad paradox"11. Denne migration medfører det inhomogene sammenlægning og uensartet samlede produktion i konventionelle orbital ryster fartøjer. I denne undersøgelse forhindret O-formede fartøjer koncentration af celler ind i center-bunden af fartøjer, som er spekuleret som på grund af ensartet sammenlægning i orbital ryster O-formede fartøjer.
Histologiske analyser viste, at aggregater i den konventionelle parabol indeholdt denucleated celler (figur 2a). Derimod denucleated celler vises ikke i aggregater fra O-formede fartøjer (figur 2b og 2 c). Det er muligt, at disse denucleated celler var forårsaget af en mangel på substrater såsom glucose, Glutamin og ilt9. Ifølge målingen størrelse havde aggregater i de O-formede fartøjer homogene diametre lavere end 400 µm. Derimod i en konventionel parabol, nogle aggregater havde en diameter større end 400 µm, og disse aggregater inkluderet denucleated celler. Dette resultat tyder på, at skabe ensartede mellemstore aggregater i O-formede fartøjer er effektiv i at kontrollere kvaliteten af aggregater. Derudover er det også spekuleret på at iltning gennem den gas-gennemtrængelige polyethylenfilm forhindret fremkomsten af denucleated celler i den O-formet taske.
Disse eksperimenter viste muligheden for disse fartøjer, der er O-formet som et simpelt system til at producere uniform aggregeringer. Selv om andre kultur poser til suspension kultur har været udviklede15, disse kultur poser er firkantet, hvilket forhindrer kulturen i effektivt at få blandet i orbital ryster. Taske i denne undersøgelse har en roman runde form egnet til orbital ryste for at producere aggregater med en homogen størrelse. Denne egenskab af fartøjer, der er vigtige for at kontrollere betingelserne og høj reproducerbarhed af celler i masseproduktion. Eventuel anvendelse af den O-formede fartøj er udbredt. Det kan bruges, når producerer rekombinante proteiner fra celler og for regenerativ medicin, når der beskæftiger sig med stamceller.
Afslutningsvis udviklede vi en roman O-formet taske egnet til fremstilling af ensartet celle aggregater med en orbital ryster kultur. Posen viser muligheder for forskellige biomedicinske anvendelser såsom i regenerativ medicin.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning er understøttet af et samarbejde med FUKOKU, Co, Ltd Takao Yoshida fra FUKOKU, Co, Ltd givet idéen om O-formede kultur taske. Takamasa Sato fra FUKOKU, Co, Ltd støttet denne forskning i form af en beregningsmæssige simulering for at udvikle den O-formede kultur taske. Vi vil gerne påskønne den tilsvarende forfatteren nuværende tilhørsforhold, Osaka University, for at lade os arbejde om offentliggørelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
References
- Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).
- Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).
- Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
- Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164 (3879), 555-557 (1969).
- Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
- Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).
- Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).
- Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).
- Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
- Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
- Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).
