Summary
السابقين فيفو الدراسات جزيرة البنكرياس تعتبر هامة لأبحاث مرض السكري. التقنيات القائمة لدراسة الجزيرات المزروعة في بهم العمارة 3 الأبعاد الأصلية مضيعة للوقت وغير كفؤة، والمستخدمة بشكل متكرر. ويصف هذا العمل طريقة جديدة وبسيطة وفعالة لتوليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات مثقف كلياً.
Abstract
تجارب باستخدام جزيرات البنكرياس معزولة هاما لأبحاث مرض السكري، ولكن الجزر الصغيرة مكلفة ومحدودة الوفرة. الجزر الصغيرة تحتوي على عدد خلايا مختلطة في هيكل منظم الآثار الدالة والجزيرات البشرية على نطاق واسع متغير في تكوين نوع الخلية. وتشمل الأساليب الحالية المستخدمة بشكل متكرر لدراسة الجزيرات مثقف الجزيئية دراسات أجريت على الجزر كله أو فاعلين جزيرة تباين أنواع الخلايا معا، أو الفحص المجهري أو الدراسات الجزيئية في خلايا الجزيرة الصغيرة المتناثرة، تعطيل العمارة جزيرة ليلى. في فيفو الدراسات جزيرة ليلى، جزءا لا يتجزأ من البارافين البنكرياس تمزيقها تقنية قوية لتقييم النتائج الخاصة بالخلايا في البنكرياس البيئة الأصلية. دراسة ثقافة ما بعد الجزر بتقطيع البارافين سيوفر العديد من المزايا: الكشف عن نتائج متعددة على نفس الجزيرات (يحتمل حتى بالضبط نفس الجزر الصغيرة، باستخدام مقاطع المسلسل) وقياسات خلية-نوع معين، والحفاظ على مواطن جزيرة خلية خلية والخلية-التحتية التفاعلات أثناء التعرض التجريبية والتحليل. ومع ذلك، عزل التقنيات الموجودة لتضمين الجزيرات الثقافة بعد هي غير فعالة، وتستغرق وقتاً طويلاً، وعرضه لفقدان المواد وتنتج عموما المقاطع مع أرقام جزيرة ليلى غير كافية أن تكون مفيدة للتحديد الكمي لنتائج. مرافق إعداد كتلة الخلايا مختبر علم الأمراض السريرية غير قابل للوصول وغير عملي لمختبرات البحوث الأساسية. قمنا بتطوير أسلوب أعلى مقاعد البدلاء المحسنة والمبسطة التي تنشئ المقاطع ذات غلة قوية والتوزيع للجزر الصغيرة. الجزر الصغيرة الثابتة حراكه في الحارة النسيجي [اغروس] هلام وبيبيتيد إلى قرص ثابت على شريحة زجاج قياسية، مثل أن الجزر الصغيرة توزع في طائرة. بعد الجفاف القياسي والتضمين، يمكن قص (10 +) 4-5 ميكرومتر مقاطع متعددة من نفس الكتلة جزيرة ليلى. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن إجراء تحاليل نسيجية وإيمونوفلوريسسينت على الماوس وفار والجزيرات البشرية. هذا نهج فعالة وغير مكلفة وتوفير الوقت لتقييم نتائج الخلية-نوع محدد، وبنية سليمة من الجزيرات المستزرعة.
Introduction
البنكرياس جزر لانجرهانز، المصدر الوحيد لتعميم الأنسولين، أنسجة الحيوية للمحققين يدرسون مرض البول السكري. من أي كائن حي معين، قد الجزيرات حجم متغير وتردد نوع الخلية والهندسة المعمارية1،،من23. الاستراتيجية التقليدية للدراسة في فيفو هيكل وتكوين خلية الغدد الصماء من جزيرات البنكرياس بتقطيع بنكرياس الأنسجة4،5. أن الجزر تشكل سوى جزء صغير من إجمالي المحتوى الخلوية البنكرياس، تجري الدراسات الجزيئية على الجزر الصغيرة المعزولة. السابقين فيفو جزيرة الثقافة التجارب اختبار استجابة للمواد الغذائية، والتحوير الجيني (تعداء، تنبيغ)، أو علاجات تجريبية توفير نظرة ثاقبة آليات تحوير بقاء الخلية الغدد الصماء، والانتشار، ووظيفة هامة 5 , 6.
السابقين فيفو تجارب جزيرة صغيرة غالباً ما يتم تحليل استخدام الدراسات الجزيئية للجزر كله أو دراسات نسيجية أو الجزيئية للخلايا جزيرة متناثرة نمت في أحادي الطبقة5،6. التحليل الجزيئي للجزر كله يدخل التحذير الشديد من تمازج أنواع الخلايا، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة أو إيجابية كاذبة عند استقراء لأي نوع من الخلايا الفردية. تشتت الخلية على كوفيرسليبس للثقافة بعد انتهاء الفحص المجهري يتيح قياس نتائج الخلية-نوع معين، ولكن يعطل العمارة جزيرة ليلى، والتي قد تغير استجابة للتدخل، ويحول دون تحديد النتائج المتعلقة بالهندسة المعمارية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس عموما من التوصل إلى نتيجة واحدة فقط؛ على سبيل المثال، تحتاج تجربتين منفصلتين لقياس انتشار الخلايا بيتا وموت الخلايا بيتا نفس الظروف، التي يتعين القيام بها. وأيضا هذه النهج الأعمى لتقلب بين جزيرة ليلى، مجال يحظى باهتمام متزايد في المجال. فرز الخلايا جزيرة ليلى بالتدفق الخلوي للدراسات الجزيئية الخليوي-نوع معين، أو دراسات الحمض النووي الريبي خلية واحدة أنيقة لكنها محدودة، مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، بوفرة الأنسجة، القضاء على الهندسة المعمارية، وليست ملائمة تماما لتحليلات ثقافة الخلية الروتينية 5 , 7-تصوير [كنفوكل] من الجزيرات الجامع-جبل إيمونوستينيد ويقدم بيانات سليمة هندسة عالية الجودة، ولكن كثيفة العمالة، والبيانات التي تم الحصول عليها من كل عينة محدودة إلى نتائج يمكن تحديدها في إيمونوستينينج واحدة8.
القدرة على توليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات كله الثقافة بعد انتهاء سيتناول العديد من هذه الشواغل. جزيرة عالية التكلفة، ومنخفضة-وفرة الأنسجة من النماذج الوراثية الفريدة أو من الجهات المانحة الجهاز البشري، أو الجزر حالة وظيفة فيفو في أو في المختبر التجريبي التلاعب، الثمينة. الحصول على عدة مقاطع البارافين من الجزيرات نفس سيسمح تحليل الخلية-نوع محدد، وبنية سليمة متعددة من نفس التجربة.
التقنيات القائمة على توليد الكريات جزيرة ليلى لتمزيقها ناقصة. هو محسن لعلم الأنسجة [اغروس] هلام مائي نقطة انصهار منخفضة يستخدم على نطاق واسع في تجهيز عينات نسيجية والخلوية بما في ذلك عينات الأنسجة الصغيرة أو المجزأة التي يصعب عملية9. جزيرة واحدة تضمين نهج هو تعليق الجزر الصغيرة في [اغروس] في أنبوب ميكروسينتريفوجي، والطرد المركزي لبيليه بالمواد، واسترداد المكونات أجار، ثم عملية وتضمين لتقطيع10،11. استخراج عينة طدت من الجزء السفلي من الأنبوب وقتاً طويلاً وصعبا، مما أدى إلى تجزئة العينة العرضية وخطر الإصابة الشخصية. الجزر الصغيرة تتركز في غيض المكونات، مما يؤدي إلى توزيع جزيرة ليلى غير كافية في الأجزاء التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب. جولة أسفل المكونات تعقيد التضمين مثل أنه قد قدم في منطقة ايميا-الفقراء لتمزيقها. وعموما، هذا الأسلوب يؤدي إلى منخفضة الغلة وتوزيع جزيرة تحبب خفيف في الأقسام الناتجة.
هذا الأسلوب الجديد نهج مبسطة ومحسنة للتحضير لأقسام جزيرة ليلى. الجزر الصغيرة تتركز في حجم صغير وثم وضعت على سطح أملس لشريحة المجهر شكل قرص صغير، مع الجزر في طائرة واحدة. تتم معالجة القرص هيستوجيل-جزيرة لاحقاً البارافين التضمين في تقصير الجفاف وبروتوكول تسلل زيلين نفط. ويتم أيضا النهج السابق، الذي يركز الجزر الصغيرة في الجزء السفلي من أنبوب [ميكروفوج]، على سبيل مقارنة. هذا الأسلوب الجديد يحسن عائد الجزيرات كل قسم، توزيع الجزر الصغيرة في كل قسم، ووقتاً أقل لنقل كتل جزيرة ليلى إلى أشرطة الكاسيت. هذا الأسلوب مفيد لعلماء الأحياء جزيرة ليلى أو غيره من العلماء الذين يدرسون قطع صغيرة من الأنسجة الراغبين في تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية استخدام الأنسجة وفرة منخفضة بقياس نتائج متعددة في عينة واحدة في هندسة الأنسجة الأصلية به.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات UMass المدرسة المؤسسية الحيوان الرعاية الطبية واستخدام اللجنة. دراسات جزيرة البشرية كانت يحددها المجلس استعراض المؤسسية UMass لعدم التأهل لاستعراض الكندي أو الإعفاء نظراً لأنها لا تنطوي على استخدام البشر.
1-جزيرة العزلة والثقافة
- عزل الجزر الصغيرة وفصل عن تلويث أنسجة إفرازات والأقنية استخدام أسلوب اختيارك.
ملاحظة: هذا الأسلوب الأمثل باستخدام الجزر الصغيرة المعزولة إينسوفليشن الأقنية كولاجيناز وفيكل الفصل12 (القوارض) أو الجزر بعد الشحن من "برنامج توزيع جزيرة المتكاملة" (إييدب13؛ الإنسان). كانت اختارته الجزر الصغيرة مع ميكروبيبيتي P200. - لتحسين أمثلية مورفولوجيا جزيرة ليلى، السماح للجزر الصغيرة لاسترداد بين عشية وضحاها في 10 مل جزيرة كاملة المتوسطة (ربمي مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين الجلوكوز 5.5 مليمول/لتر) في دائرة هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2 في 37 درجة مئوية. على الرغم من أن هذه الخطوة غير مطلوب للحصول على مقاطع، الجزر الصغيرة لا أكثر على حالها بعد فترة استرداد (انظر الشكل 2).
2-جزيرة التثبيت
- استخدام تلميح P200 ملزمة منخفضة، handpick حوالي 250 جزيرة مكافئات (إيك)13 استخدام شبكة معايرة تحت ستيريوميكروسكوبي في أنبوب [ميكروفوج] ملزمة منخفضة 1.5 مل. نصائح ملزمة منخفضة وأنابيب تقليل الخسائر في جزيرة ليلى.
- السماح للجزر الصغيرة تسوية إلى الأسفل [ميكروفوج] أنابيب. إزالة معظم المادة طافية مع تلميح بيبيت P200، مع الحرص على عدم إزالة أي الجزر الصغيرة.
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الأنبوب في جهاز الطرد مركزي دلو يتأرجح حتى السرعة تصل إلى 200 x ز ووقف ثم الدوران. إزالة المادة طافية. كرر يغسل برنامج تلفزيوني، ليصبح مجموع يغسل اثنين.
- إضافة 500 ميليلتر من محلول الفورمالين 10% أو 4% طازجة بارافورمالدهيد. إصلاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لنتائج اختبار باستخدام هذا الأسلوب، كانت هذه أساليب التثبيت يمكن تمييزها. كما قد يكون التثبيت أقصر ممكنة؛ من المستحسن لتحسين مدة التثبيت للنتيجة المرجوة.
- إزالة مثبت مع تلميح P200.
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الأنبوبة حتى السرعة تصل إلى 200 x ز ووقف ثم الدوران. إزالة المادة طافية. كرر يغسل برنامج تلفزيوني، ليصبح مجموع يغسل اثنين.
- الشروع فورا في الخطوة التالية.
3-إعداد القرص جزيرة ليلى (الشكل 1)
- عند أول استخدام، تذوب الهلام (مثلاً، هيستوجيل) في 70 درجة مئوية وجعل مختبرين في 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب للتخزين على المدى الطويل. حجم الكوة ليست حاسمة، حيث يمكن إعادة استخدام مختبرين.
- الحارة الهلام (حوالي 100 ميليلتر كل عينة) في 70 درجة مئوية عن طريق وضع [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على قاسمة جل في كتلة حرارة تعيين إلى 70 درجة مئوية.
- نقل الخرز الأزرق [اغروس] (10 ميليلتر لكل عينة) في أنبوب نظيف [ميكروفوج] 1.5 مل. دقة ريسوسبيند الخرز قبل بيبيتينج.
ملاحظة: تمتزج الخرز الأزرق مع الجزر الصغيرة للمساعدة في التعرف البصري للمواد المضمنة في الزر [اغروس] وكتلة البارافين. عدد الخرز الأزرق المستخدمة ليست حاسمة بالنسبة للنتيجة، ولكن تجنب الخرز المفرط (> 5 x العدد من الجزر الصغيرة) للسماح بالتوزيع الأمثل للجزر الصغيرة في الفروع. - أغسل الخرز الأزرق مع 1 مل برنامج تلفزيوني، مرتين. لكل غسل، تدور الخرز 1 دقيقة في ز 800 x. بعد الغسيل الثاني، ريسوسبيند الخرز في (n+ 2) × 10 ميليلتر PBS، حيث n هو عدد أنابيب العينات؛ على سبيل المثال، سيكون حجم برنامج تلفزيوني إضافة إلى الخرز لأنابيب العينة 2، 40 ميليلتر.
- الطرد المركزي [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على الجزر (تدور موجزة إلى 200 س ز) وإزالة معظم المادة طافية. قطع غيض من تلميح ميكروبيبيتي 10 ميليلتر مع مقص أو شفرة وإضافة 10 ميليلتر من حبات لكل أنبوبة جزيرة ليلى، باستخدام تلميح نظيفة لكل عينة. لا تخلط (لتجنب فقدان الجزر الصغيرة).
- الطرد المركزي الجزر الصغيرة والخرز (تدور موجزة إلى 200 س ز). قم بإزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن مع نصيحة ميكروبيبيتي 10 ميليلتر تقطيعه.
- التسمية شرائح المجهر لتحديد هوية العينة. يمكن إعداد العينات اثنين إلى ثلاثة في كل شريحة. ضع الشريحة على مقاعد البدلاء قرب كتلة الحرارة مع هلام دافئة. النصائح من ثلاث إلى خمس قطع 20 ميليلتر ملزمة منخفضة ميكروبيبيتي نصائح كل عينة بشفرة حلاقة أو مقص. تحميل اثنين P20 ميكروبيبيتيس مع قطع نصائح للسماح بسرعة التحول من واحدة إلى أخرى.
- باستخدام ميكروبيبيتي أول، إضافة 15-20 ميليلتر من هلام الحارة للجزر الصغيرة/حبات [ميكروفوج] أنابيب؛ مزيج فورا، تجنب الفقاعات؛ وتنطبق على الشريحة بشكل خليط أجار/الجزر/حبات السائل < القرص قطرها 1 سم. ضع القرص القرب من الحافة من الشريحة، تاركاً مساحة للطوق الخارجي هلام (الخطوة التالية). انقر فوق الشريحة بلطف عدة مرات لتسوية الجزر الصغيرة والخرز.
- استخدام ميكروبيبيتي ثانية، إضافة 20 ميليلتر من هلام الحارة إلى أنبوب عينة. استخدام ميكروبيبيتي أول، مزيج هلام جديد مع أي المتبقية الجزيرات/الخرز، إعادة الاحترار في كتلة الحرارة إذا ما بدأ أن يصلب، ثم تطبيق هذا الخليط على الشريحة، المحيطة بالقرص الأصلي. كرر حسب الضرورة، باستخدام نصائح قبل قطع إضافية، حتى يصبح القرص بالحجم المطلوب وسمك.
ملاحظة: التعامل مع القرص تبلور أسهل إذا كان خارج الحلبة قليلاً أكثر ثخانة. 3 x 20 ميليلتر من جل عادة كافية. هذه الخطوة يقلل من فقدان للجزر الصغيرة التي يغسل أنبوب ويضيف [اغروس] جزيرة فقيرة إلى خارج القرص لتسهيل معالجة القرص. - إعداد القرص كل على حدة، وتتبع دقيق للأمر عينة إذا وضع أقراص متعددة على كل شريحة.
- ضع الشرائح على سطح مستو من الجليد الرطب، مع غطاء، لمدة 10 دقائق أو حتى يتصلب الهلام. من الصعب أكثر الشرائح القرص قبالة الزجاج إذا يجف.
- قم بتسمية خزعة تجهيز/تضمين أشرطة الأنسجة مع قلم رصاص، واحد لكل عينة. الجاف للجزء الخلفي الشريحة لتفادي ترطيب الورقة الزرقاء.
- برفق باستخدام حافة شفرة حلاقة حادة، دفع القرص في كل اتجاه تحريرها من الزجاج. عند ذلك الشرائح بسهولة، ببطء دفع القرص من الشريحة المجهر على المناديل الورقية الزرقاء. ضع القرص وجانب شقة أسفل، مباشرة على الورق.
- حفظ القرص مسطحة، طي الورقة حول القرص لمنع الحركة، ضع القرص في ورقة مطوية في الكاسيت، وأغلق الكاسيت. إذا كان القرص لا شريحة نظيفة قبالة الزجاج، إضافة هلام أكثر و/أو إرجاع الشريحة للجليد لبضع دقائق إضافية.
- تغرق في الكاسيت في برنامج تلفزيوني في كوب. عملية البارافين التضمين في نفس اليوم مورفولوجية الأمثل.
4-البارافين التضمين
ملاحظة: عملية أقراص هلام جزيرة ليلى إلى كتل البارافين باستخدام سلسلة جفاف مختصر كما هو موضح أدناه. هذا الأسلوب الأمثل باستخدام معالج الآلي، ولكن المعالجة اليدوية وينبغي أن تسفر عن نتائج مماثلة.
- تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 85% لمدة 15 دقيقة.
- تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 95% لمدة 15 دقيقة.
- تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 100% لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين لما مجموعة ثلاث يغسل.
- تزج أشرطة الكاسيت في زيلين نفط لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين لما مجموعة ثلاث يغسل.
- تزج أشرطة الكاسيت في البرافين المنصهر لمدة 10 دقائق.
- نقل الأشرطة إلى البرافين المنصهر الطازجة لمدة 10-30 دقيقة.
- فتح الكاسيت وبسط الورقة الزرقاء بعناية. إزالة القرص هلام، تتبع من سطح مستو الذي اعترض على الورقة. تضمين القرص في العفن صغيرة، مع السطح (المحتوية على جزيرة ليلى) أسفل، موازية لسطح القطع. لسد العجز، بعناية إزالته من الكاسيت وتضمين ذلك في قالب صغير بطرف لافتاً نحو سطح القطع.
5-البارافين تمزيقها وتلطيخ
- قم بتسمية الشرائح تسلسلياً إذا كانت مطلوبة من مقاطع المسلسل.
- وقد 5 مقاطع البارافين ميكرومتر قطع طريق هيستوتيتشنولوجيست ذوي خبرة. لتعظيم العائد، حفظ كافة المقاطع التي تحتوي على المواد. وبصفة عامة، يسمح تجميع الأقسام 20 القبض على معظم المواد.
- تخزين المقاطع في درجة حرارة الغرفة. أقسام قابلة للبقع النسيجي الروتينية (مثل H & E) والفلورة (مثل الأنسولين والجلوكاجون و DAPI). تحسين التثبيت لمولدات المضادات الأخرى، إذا لزم الأمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تخطيطي يتضح من خطوات لإعداد القرص جل يرد في الشكل 1. هذا جل القرص نتائج الأسلوب في البارافين المقاطع التي تحتوي على عدد كاف من الجزر الصغيرة الموزعة في طائرة واحدة للسماح بمعنى القياس الكمي لنتائج. ويبين الشكل 2 الصور المنخفضة-التكبير من الأقسام الناتجة لتوضيح العدد من الجزر الصغيرة القبض على كل قسم. وبصفة عامة، > الجزر 35 كانت مرئية في كل مقطع عندما استخدمت إيك 250 لهذا الإجراء، و > أقسام 10 (4-5 ميكرومتر) التي تحتوي على الجزر الصغيرة التي تم الحصول عليها من كل عينة. زيادة العدد من الجزر الصغيرة المستخدمة للإجراء زيادة في العدد من الجزر الصغيرة في الفروع. الجزر الصغيرة في الأقسام المختلفة هيكلياً وذات أحجام مختلفة، دعم هذا المفهوم الجديد ومثيرة للاهتمام البيانات يمكن الحصول عليها باستخدام المقاطع بدلاً من تقنيات المكفوفين للاختلافات بين جزيرة ليلى. عملت الطريقة متساوية جيدا للقوارض الجزر الصغيرة المعزولة في المختبر (فأر، الماوس) والجزيرات البشرية تلقاها في إييدب بعد الشحن. وكان الجزيرات القوارض مورفولوجيا سليمة ملحوظ أكثر بعد الانتعاش بعد انتهاء العزلة بين عشية وضحاها في جزيرة متوسطة، مع سطح أملس مستدير وضغط كروية الشكل (الشكل 2أ). مورفولوجيا الإنسان جزيرة ليلى مماثل عند مضمن في يوم الوصول أو مضمنة بعد الانتعاش بعد الشحن بين عشية وضحاها، ربما لأن الجزر الصغيرة استعادت فعلا من الإجهاد عزلة قبل الشحن. الأسلوب microtube أسفرت عن منطقة مستعرضة أصغر أنسجة، مع الجزر الصغيرة أقل من كل قسم، والمزدحمة الجزر الصغيرة والخرز (الشكل 2ب). الصور microtube هو مبين في الشكل 2ب كانت أفضل كنا قادرين على الحصول على هذا الأسلوب؛ وكان أحد النماذج ليتم إرسالها مرة أخرى إلى قطع المزيد من المقاطع لأنه تم العثور على لا الجزر الصغيرة في أول مجموعة من المقاطع.
هذا الأسلوب بإنشاء أقسام جزيرة عالية الجودة لغذائها والفلوره تلطيخ (الشكل 3). وأظهرت الأنسولين والجلوكاجون تلطيخ تشكيلة متنوعة والتباين في العمارة جزيرة ليلى. المقاطع لخص وضوح الاختلافات المعمارية المعروفة بين الإنسان، اختلطت الجزيرات الماوس وفار، مع الجزر البشرية تتألف من خلايا α وفيرة مع خلايا بيتا، بينما أظهرت الجزيرات الماوس وفار بنية مماثلة مع نواة خلية بيتا وخلايا ألفا في الهامش. مقاطع المسلسل تم الحصول عليها؛ تظهر اللوحات في الشكل 3 مقاطع المسلسل نفس جزيرة الملون ح & ه (يسار) والفلوره (يمين).
الشكل 1 . شكل توضيحي لخطوات حاسمة لجعل القرص جل جزيرة ليلى. هلام استعد إلى 70 درجة مئوية في كتلة حرارة (A) يتم نقلها إلى ملزمة منخفضة [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على جزيرة ليلى/حبة بيليه (ب). الجزر هي حراكه في جل الحارة ونقلها إلى شريحة زجاجية، نشر المواد في شكل قرص (ج-د). يتم نقل جل نظيفة إضافية إلى [ميكروفوج] أنابيب، ثم إزالة جميع المواد المتبقية وينتشر circumferentially الأولى جزيرة ليلى/حبة-التي تحتوي على القرص على الشريحة الزجاجية (ه-و). بعد التبلور على الجليد، هو القرص الجانب المنقول، شقة أسفل، ورقة علم الأنسجة (ز)، التي يتم طيها ووضعها في كاسيت (ح) للمعالجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. مقاطع البارافين هلام أقراص تحتوي على عدد كبير من الجزر الصغيرة الموزعة جيدا. (أ) التكبير المنخفض الألواح (40 X، 3 × 3 صور مخيط معا، مع تداخل 15 ٪) من الماوس، تظهر الفئران أو أقسام جزيرة البشرية ملطخة H & ه أن العديد من الجزر الصغيرة تكون مرئية في كل قسم. إظهار insets التكبير عالية (200 س) الجزيرات الممثل. لوحات اليسرى تظهر المقاطع من الجزيرات مضمن مباشرة بعد عزلة (الماوس وفار) أو شحن (البشري)؛ تظهر لوحات حق الجزيرات مضمنة بعد الانتعاش بين عشية وضحاها في الثقافة. هي دوائر زرقاء باهتة ينظر في 40 X صور الخرز المدرجة للتصور خلال التضمين وتمزيقها. هذه العينات خاصة هي من الماوس C57BL/6N (1 سنة) وبدر الفئران (4 أسابيع)، الجزيرات معزول بواسطة حقن كولاجيناز الأقنية وفصل فيكل والجزيرات T2D البشرية الواردة من إييدب. (ب) إيك 250 من الجزيرات البشرية المضمنة كل تقنية قديمة [ميكروفوج] أنابيب، للمقارنة. انخفاض لوحات التكبير (40 X؛ وواحد الصورة أونستيتشيد القبض على جميع المواد) وإظهار insets ماج عالية (200 س) المقاطع التمثيلية. وكان متوسط الثقافة ربمي مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين الجلوكوز 5.5 مليمول/لتر. أشرطة مقياس للوحات التكبير المنخفض هي 1000 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس للوحات عالية التكبير هي 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . الممثل histochemical والفلوره تلطيخ على جزيرة ليلى المسلسل المقاطع. المضمنة أقسام الماوس وفار، والجزيرات البشرية بعد الملون ح & ه الثقافة بين عشية وضحاها وتصويرها بالفحص المجهري برايتفيلد (200 X؛ واليسار). قسما مجاورة كان الملون للأنسولين (أحمر)، الجلوكاجون (الأخضر)، التي شنت في الوسائط التي تحتوي على DAPI (أزرق) وتصويرها باستخدام مجهر فلوري (200 X؛ وحق). تغيير حجم أشرطة: 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر هذا الأسلوب التضمين معدلة هلام-المستندة إلى قرص بسيطة وغير مكلفة، وطريقة فعالة لتوليد عائد عالية من الجزيرات كل قسم. بناء القرص جل على سطح زجاج مسطح يسهل انتشار الجزر إلى توزيع حتى على مساحة محددة تحديداً جيدا. نشر الجزيرات في قرص ثابت يوفر ميزة وضع العديد من الجزر الصغيرة في طائرة الباب وتحسين الغلة والسماح للجزر الصغيرة أقل لاستخدامها. سمك القرص يمكن تعديلها لتلبية احتياجات المحققين. حيث يمكن الحصول على عدة أقسام، يمكن تحليل مقاطع المسلسل من الجزر نفسها، زيادة عدد النتائج المتميزة التي يمكن قياسها في نفس العينة التجريبية. على الرغم من أن أمثل هنا جزيرات البنكرياس، يمكن تطبيق التقنية للمواد المنخفضة-وفرة الأخرى، بما في ذلك مع قطع صغيرة أو طبيعة قابلة للتفتيت أو عينات اللزجة التي وإلا سيكون من الصعب لعملية. هذا الأسلوب هو الأمثل للجزر الصغيرة الطازجة--ثابت ولم يتم اختباره لأنواع أخرى من المواد، مثل الجزر الصغيرة المجمدة سابقا. قد يكون من المفيد لفحوصات التهجين في الموقع للكشف عن الحمض النووي الريبي أو أيضا هذه المقاطع. إضافة جل إضافي يخدم غرضين: تحقيق أقصى قدر من جمع جزيرة ليلى وحماية مركز القرص الغنية بجزيرة ليلى من تعطل أثناء مناولة/نقل. القرص جل رقيقة يتصلب بسرعة ويسمح الجفاف مختصرة وزيلين نفط تسلل خطوات لتضمين البارافين. تشكيل القرص على سطح مستو وليس في حاوية ثانوي ([ميكروفوج] أنابيب أو الثقافة لوحة جيدا) يجعل من السهل فعلياً نقل القرص إلى كاسيت للمعالجة. بالمقارنة مع نتائج تقنية القرص، تقنية microtube قد انخفض محصول جزيرة ليلى وتجمعت التوزيع جزيرة ليلى، وعلى الرغم من أن هذا الترتيب غير مستو الأنسجة يمكن أن تولد عددا أكبر من التي تحتوي على جزيرة ليلى المقاطع.
وتشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول الأنسجة التثبيت، تكوين القرص هلام، البارافين التضمين، وتمزيقها. فيما يتعلق بالتثبيت، كما تم اختبارها قبل H & E والفلورة للأنسولين والجلوكاجون، تم الكشف عن لا الفرق بين منهاج عمل بيجين والفورمالين، أو تثبيت مدة تتراوح بين 10-30 دقيقة (غير معروضة). ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل التثبيت كثافة ومدة لاحتياجات المستخدم النهائي. الابتكار الرئيسي الوارد في هذا البروتوكول هو إعداد القرص جزيرة جل؛ ويرد في الشكل 1خطوات حاسمة. وتشمل الخطوات الرئيسية باستخدام كمية صغيرة من هلام التركيز الأنسجة في منطقة صغيرة وتشكيل القرص على سطح مستو لترتيب الأنسجة في طائرة واحدة لتمزيقها. يحسن استخدام ملزمة منخفضة [ميكروفوج] أنابيب ونصائح ودلو يتأرجح أجهزة الطرد مركزي لدوران كل الأنسجة الغلة؛ الجزر الصغيرة تتمسك بالبلاستيك بعد التثبيت. وتساعد إضافة الخرز مرئية بسهولة مع تكوين القرص، والتضمين وتمزيقها. إزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن قبل إضافة أمر بالغ الأهمية لتجنب إضعاف [اغروس] الهلام، الأمر الذي يؤدي إلى التصلب الفقيرة وصعوبة نقل القرص إلى الورقة. إبقاء القرص رقيقة سليمة في حين ينزلق من الشريحة الزجاجية للورقة يمكن أن تكون صعبة. في حالة حدوث تجاعيد في القرص، السماح لها بالعودة إلى الموقع الأصلي، وإضافة جل أكثر وإعادة تشيل الشريحة. فيما يتعلق بتضمين البارافين، من المهم تضمين القرص مسطحة-الجانب الأسفل وموازية لطائرة القطع. هيستوتيتشنولوجيست من ذوي الخبرة مع قطع مقاطع البارافين أمر ضروري لنجاح هذا الإجراء، نظراً للمواد التي يتركز في الحافة الأمامية للكتلة. مواجهة المفرط للخروج من الكتلة قد يؤدي إلى فقدان للعينة. من المستحسن للبدء في جمع المقاطع حالما الخرز الأزرق مرئية.
ينبغي أن يكون الأمثل التثبيت كثافة ومدة للأنسجة المحددة واحتياجات المستخدم النهائي. يمكن تعديل العدد من الجزر الصغيرة المستخدمة لكل عينة إذا لزم الأمر؛ ومع ذلك، الحد من انطلاق المواد يولد الأقسام مع الجزر الصغيرة أقل. يمكن إنشاء أقراص سمكا أو أكبر باستخدام هذه التقنية؛ الجفاف والخطوات تسلل زيلين نفط قد تحتاج إلى أن تطول، وينبغي أن يكون الأمثل. إذا الأقسام الناتجة تحتوي على شكل قرص جزئية فقط، النظر في إمكانية أن القرص ليس مضمن مواز لسطح القطع. إذا كان يتم الحصول على مقاطع قليلة جداً، قد فقدت تقني المواد أثناء إعداد كتلة الأولى.
هذا الأسلوب ينشئ الأقسام التي تحتوي على الأنسجة جزيرة ثابتة، وعلى هذا النحو، يمكن أن تستخدم فقط لنتائج النسيجي. للحصول على عدد كبير من الجزر الصغيرة كل قسم، إيك 200-250 ابتداء من مواد استخدمت، الذي يمثل تحديا لتوليد لبعض أنواع التجربة. مقاطع عالية الجودة التي تعتمد على وجود هيستوتيتشنولوجيست ذوي خبرة.
القدرة على توليد 10 + المقاطع التي تحتوي على العديد من الجزر الصغيرة من شرط تجريبي واحد سيتيح القياس الكمي لنتائج متعددة على نفس المواد، تحسين كفاءة التجريبية. التحليل الروتيني من الجزيرات سليمة يؤدي إلى التقدم في فهم في عدم تجانس النسيج، ليس فقط على مستوى خلوي، ولكن أيضا على مستوى الجزيرة، حول فيها سوى القليل من المفهوم حاليا. تطبيق هذه التقنية على عينات الأنسجة وفرة محدودة أخرى قد تقدم فوائد للحقول الأخرى، وكذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.
Acknowledgments
ونعترف مع الامتنان المجموعة بيولوجيا الخلية بيتا في مركز التميز السكري UMass لنصائح مفيدة ومناقشات. وقدمت جزيرات البنكرياس البشرية بالممول نيدك المتكاملة جزيرة ليلى توزيع البرنامج (إييدب) في مدينة الأمل. تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة/نيدك: R01-DK114686 (LCA)، R01-DK105837 (CY)، 2UC4DK098085 (إييدب)، ومن "الرابطة الأمريكية لمرض السكري" منحة #1-15-بكالوريوس-003 (LCA) بالتعاون مع النظام القطيفة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
