Summary
Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.
Abstract
Experimenten met behulp van geïsoleerde alvleesklier eilandjes zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes, maar eilandjes zijn duur en van beperkte overvloed. Eilandjes bevatten een gemengde celpopulatie in een gestructureerde architectuur invloed op functie en menselijke eilandjes zijn wijd variabele in cel type samenstelling. Huidige veelgebruikte methoden om te studeren van gekweekte eilandjes omvatten moleculaire onderzoeken uitgevoerd op hele eilandjes, eerste ongelijksoortige islet celtypes samen, of microscopie moleculaire studies over verspreide eilandjecellen, verstoren het eilandje platform. Voor in vivo islet studies is paraffine-ingebedde alvleesklier segmenteren een krachtige techniek om te beoordelen van cel-specifieke resultaten in de oorsprong van de alvleesklier. Studeren na cultuur eilandjes door paraffine afdelen zou bieden verschillende voordelen: detectie van meerdere resultaten op de dezelfde eilandjes (mogelijk zelfs de exacte dezelfde eilandjes, met behulp van seriële secties), cel-type-specifieke metingen en handhaving native eilandje cel-cel en cel-substraat interacties tijdens de experimentele blootstelling zowel voor analyse. Maar geïsoleerde bestaande technieken voor het insluiten van eilandjes na cultuur zijn inefficiënt, tijdrovend en gevoelig voor verlies van materiaal, en in het algemeen produceren secties met onvoldoende islet nummers nuttig voor het kwantificeren van de resultaten. Klinische pathologie laboratoriumfaciliteiten cel blok voorbereiding zijn ontoegankelijk en onpraktisch voor fundamenteel onderzoekslaboratoria. We hebben een betere, vereenvoudigde methode van bench-top dat secties met robuuste opbrengst en verdeling van de eilandjes genereert ontwikkeld. Vaste eilandjes zijn geresuspendeerde in warme histologische agarose gel en afgepipetteerde in een platte schijf op een standaard glasplaatje, zodanig dat de eilandjes worden gedistribueerd in een vliegtuig. Na standaard uitdroging en insluiten, kunnen meerdere (10 +) 4-5 µm secties worden gesneden uit hetzelfde islet blok. Met deze methode kunnen histologische en immunefluorescentie analyses worden uitgevoerd op de muis, rat en menselijke eilandjes. Dit is een effectieve, goedkope, tijdbesparende aanpak om te beoordelen van de resultaten van de cel-type-specifieke, intact-architectuur van gekweekte eilandjes.
Introduction
Pancreas: eilandjes van Langerhans, de enige bron van het Circulerend insuline, zijn een kritische weefsel voor onderzoekers bestuderen van diabetes mellitus. Van een bepaald organisme hebben eilandjes variabele grootte, cel type frequentie en het platform1,2,3. De conventionele strategie om te studeren in vivo structuur en samenstelling van de endocriene cellen van de alvleesklier eilandjes is door de alvleesklier weefsel4,5te segmenteren. Aangezien de eilandjes vormen slechts een klein deel van de alvleesklier cellulaire totaalgehalte, worden moleculaire studies uitgevoerd op geïsoleerde eilandjes. Ex vivo islet cultuur experimenten, testen van de reactie op de voedingsstoffen, bieden gene modulatie (transfectie, transductie) of experimentele behandelingen belangrijk inzicht verschaffen in de mechanismen moduleren van overleving van de endocriene cel proliferatie en functie 5 , 6.
Ex vivo islet experimenten worden vaak geanalyseerd met behulp van moleculaire studies van hele eilandjes of histologische of moleculaire studies van verspreide eilandjecellen gegroeid in enkelgelaagde5,6. Moleculaire analyse van hele eilandjes introduceert de ernstige waarschuwing van vermenging celtypes, die vals-negatieve of vals-positieve resultaten wanneer geëxtrapoleerd naar elk afzonderlijke celtype kan produceren. Cel dispersie op coverslips voor microscopie na cultuur staat van cel-type-specifieke resultaten meting, maar verstoort islet architectuur, die reactie op interventie kan wijzigen en zich verzet tegen de identificatie van het platform-gerelateerde resultaten. Daarnaast, worden in het algemeen slechts een enkel resultaat uitgedrukt; bijvoorbeeld, voor het meten van beta celproliferatie en beta celdood onder dezelfde voorwaarden, twee aparte experimenten moeten worden uitgevoerd. Deze benaderingen zijn ook blind voor inter islet variabiliteit, een ruimte van toenemende belangstelling voor het veld. Sorteer eilandjecellen door stroom cytometry voor cel-type-specifieke moleculaire studies of eencellige RNA studies zijn elegant maar duur, tijdrovend, beperkt door weefsel overvloed, uitroeiing van het platform, en niet geschikt zijn voor routinematige cel cultuur analyses 5 , 7. confocal beeldvorming van geheel-mount immunostained eilandjes levert kwalitatief hoogwaardige intact-architectuur gegevens, maar is arbeidsintensief, en gegevens die zijn verkregen van elk monster is beperkt tot resultaten identificeerbare in een enkele immunokleuring8.
De mogelijkheid voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van de hele eilandjes na cultuur zou kunnen veel van deze zorgen worden aangepakt. Hoge kosten, lage-overvloed islet weefsel van unieke genetische modellen of uit menselijke orgaandonoren of eilandjes status bericht in vivo of in vitro experimentele manipulatie, zijn kostbaar. Verkrijgen van meerdere paraffine secties van de dezelfde eilandjes zou meerdere cel-type-specifieke, intact-architectuur analyses van hetzelfde experiment.
Bestaande technieken voor het genereren van islet pellets voor afdelen zijn onvolmaakt. Histologie-geoptimaliseerde agarose is een waterige laag smeltpunt gel die veel gebruikt wordt bij de verwerking van histologische en cytologische specimens, met inbegrip van kleine en gefragmenteerde weefselsteekproeven die moeilijk te proces9. Een eilandje aanpak te embedding is naar de eilandjes in de agarose in de buis van een microcentrifuge op te schorten, centrifugeer pellet van het materiaal, ophalen van de agar stekker, dan verwerken en embed voor afdelen10,11. Het uitpakken van het gestolde monster uit de onderkant van de buis is tijdrovend en moeilijk, wat leidt tot occasionele fragmentatie van het monster en risico van lichamelijk letsel. De eilandjes zijn geconcentreerd in het uiteinde van de stekker, leiden tot onvoldoende islet verdeling in secties die deze methode verkregen. De ronde onderkant van de stekker compliceert insluiten zodat een eilandje-arme regio kan worden aangeboden voor het segmenteren. Globaal, is deze methode leidt tot lage rendement en geklonterd islet distributie in de resulterende secties.
Deze nieuwe methode is een vereenvoudigde en verbeterde aanpak voor de voorbereiding van de secties van het eilandje. Eilandjes zijn geconcentreerd in een klein volume en vervolgens geplaatst op het gladde oppervlak van een microscoopglaasje vormen een kleine schijf, met de eilandjes in een enkel vliegtuig. De Histogel-islet schijf wordt vervolgens verwerkt voor paraffine insluiten in een verkorte uitdroging en xyleen infiltratie protocol. De vorige benadering, die zich de eilandjes in de bodem van een microfuge buis concentreert, wordt ook uitgevoerd als een vergelijking. Deze nieuwe techniek verbetert het rendement van eilandjes per sectie, de verdeling van de eilandjes in elke sectie en kost minder tijd om de islet blokken naar cassettes. Deze techniek is handig voor islet biologen of andere wetenschappers bestuderen van kleine stukjes weefsel productieve willen maximaliseren van het gebruik van een lage-overvloed weefsel door het meten van meerdere resultaten op een monster in de architectuur van het oorspronkelijke weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren zijn door de UMass Medical School institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd. Menselijke islet studies waren door de UMass institutionele Review Board vastbesloten niet in aanmerking voor IRB review of vrijstelling omdat zij niet hebben betrekking op het gebruik van menselijke proefpersonen.
1. islet isolatie en cultuur
- Isoleren van eilandjes en scheiden van contaminerende exocrine en ductaal weefsel met behulp van de methode van uw keuze.
Opmerking: Deze methode is geoptimaliseerd met behulp van eilandjes geïsoleerd door collagenase ductaal toediening en densiteitgradiënt scheiding12 (knaagdieren) of na verzending eilandjes van de geïntegreerde Islet distributie programma (IIDP13; mens). Eilandjes werden uitgekozen met een P200-micropipet. - Om te optimaliseren islet morfologie, toestaan eilandjes te herstellen 's nachts in 10 mL volledige islet medium (RPMI met 10% FBS, penicilline/streptomycine en glucose van 5,5 mmol/L) in een bevochtigde cupje met 5% CO2 bij 37 ° C. Hoewel deze stap niet vereist is voor het verkrijgen van secties, de eilandjes zijn meer intact na een herstelperiode (Zie Figuur 2).
2. islet fixatie
- Met behulp van een lage-bindende P200 tip, handpick ongeveer 250 islet equivalenten (IEQ)13 met behulp van een gekalibreerde raster onder een stereomicroscoop in een 1,5 mL lage bindende microfuge buis. Low-bindende tips en buizen verminderen islet verlies.
- Het toestaan van eilandjes om af te wikkelen naar de onderkant van de microfuge buis. Verwijder de meeste bovendrijvende vloeistof met een P200 Pipetteer tip, zorg niet te verwijderen elke eilandjes.
- Voeg 1 mL PBS. Centrifugeer buis in een swingende emmer centrifuge, totdat de snelheid 200 x g bereikt en dan stoppen de spin. Verwijder het supernatant. Herhaal PBS wassen, voor een totaal van twee wasbeurten.
- Voeg 500 µL van 10% formaline-oplossing of 4% vers gemaakte paraformaldehyde. Voor 30 minuten bij kamertemperatuur vast. Voor de resultaten in deze methode getest, waren deze fixatie methoden niet te onderscheiden. Kortere fixatie kan ook mogelijk zijn; het is aanbevolen om het optimaliseren van fixatie duur voor het gewenste resultaat.
- Verwijder de fixeer met een P200-tip.
- Voeg 1 mL PBS. Centrifugeer buis, totdat de snelheid 200 x g bereikt en dan stoppen de spin. Verwijder het supernatant. Herhaal PBS wassen, voor een totaal van twee wasbeurten.
- Ga direct naar de volgende stap.
3. bereiding van Islet Disc (Figuur 1)
- Bij het eerste gebruik, de gel (bijvoorbeeld Histogel) bij 70 ° C smelten en maak aliquots in 1,5 mL microfuge buizen voor lange termijn opslag. Volume van de hoeveelheid is niet kritisch, aangezien aliquots hergebruikt worden kunnen.
- De gel (ongeveer 100 µL per monster) bij 70 ° C warm door het plaatsen van microfuge buis met de gel aliquot in een blok van de warmte ingesteld op 70 ° C.
- Pipetteer agarose blauwe kralen (10 µL voor elk monster) in een 1,5 mL schoon microfuge buis. Resuspendeer de kralen grondig voordat pipetteren.
Opmerking: Blauwe kralen worden vermengd met de eilandjes om te helpen bij de visuele identificatie van het ingesloten materiaal in de agarose knop en het blok van paraffine. Het aantal blauwe kralen gebruikt is niet essentieel voor het resultaat, maar het vermijden van buitensporige kralen (> 5 x het aantal eilandjes) om de optimale verdeling van kleine eilandjes in secties. - De blauwe kralen met 1mL PBS, twee keer wassen. Voor elke wassen, draai de parels 1 min op 800 x g. Na de tweede wash, resuspendeer de kralen in (n+ 2) x 10 µL PBS, waarbij n staat voor het aantal monster buizen; bijvoorbeeld, voor 2 monster buizen zou het PBS-volume toe te voegen aan de kralen 40 µL.
- Centrifugeer de microfuge buis met eilandjes (korte spin tot 200 x g) en allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Het puntje van een 10 µL micropipet tip afgesneden met schaar of een mes en voeg 10 µL van parels aan elke islet buis, met behulp van een schone tip voor elk monster. Meng geen (om te voorkomen dat verliezen eilandjes).
- Centrifugeer eilandjes en kralen (korte spin tot 200 x g). Verwijder zo veel PBS mogelijk met een Onbesneden 10 µL micropipet tip.
- Label de Microscoop dia's voor de identificatie van het monster. Twee tot drie monsters kunnen worden voorbereid op elke dia. Plaats de dia op de Bank in de buurt van het blok van de warmte met de verwarmde gel. Snijd de toppen van drie tot vijf 20 µL lage bindende micropipet tips per monster met een scheermesje of schaar. Laden van twee P20 micropipetten met gesneden tips om snel over te schakelen van de ene naar de andere.
- 15-20 µL van warme gel met behulp van de eerste micropipet, toevoegen aan de eilandjes/kralen microfuge buis; onmiddellijk meng, vermijden van bubbels; en het vloeibare mengsel van de agar/eilandjes/kralen toepassen op de dia te vormen een < 1 cm diameter schijf. Plaats de disc in de buurt van de rand van de dia, verlaten ruimte voor de buitenste gel-ring (volgende stap). Tik zachtjes een paar keer op de dia te vestigen de eilandjes en kralen.
- Met behulp van een tweede micropipet, 20 µL van warme gel aan het monsterbuisje toevoegen. Met behulp van de eerste micropipet, de nieuwe gel mix met eventuele resterende eilandjes/kralen, opnieuw opwarming van de aarde in de warmte blok als het begint te stollen, mag dit mengsel vervolgens toepassen op de dia, rondom de oorspronkelijke schijf. Herhaal indien nodig, met behulp van extra voorgesneden tips, totdat de schijf de gewenste grootte en dikte is.
Opmerking: De gegeleerde cd Handling is gemakkelijker als de buiten ring iets dikker is. 3 x 20 µL van gel is meestal voldoende. Deze stap verlies van eilandjes minimaliseert door buis wast en islet-armen agarose voegt aan de buitenkant van de schijf schijf verwerking vlotter verloopt. - Bereiden van elke schijf afzonderlijk en zorgvuldig bijhouden van monster bestelling als meerdere schijven op elke dia plaatst.
- Plaats de dia's op een vlakke ondergrond van nat ijs, met een deksel, gedurende 10 minuten of totdat de gel stolt. Het is moeilijker te glijden van de schijf uit het glas als het droogt uit.
- Label biopsie verwerking/sluiten weefsel cassettes met potlood, één per monster. Droog de achterkant van de dia te vermijden bevochtiging van het Blauwboek.
- Met de botte rand van een scheermesje, duw voorzichtig de schijf in elke richting om uit het glas. Wanneer het glijdt gemakkelijk, langzaam de schijf uit het microscoopglaasje op het Blauwe tissue papier te duwen. Plaats de schijf, de platte kant naar beneden, rechtstreeks op het papier.
- Het bijhouden van de schijf plat, vouw het papier rond de schijf om verkeer te voorkomen, plaats de schijf in gevouwen papier in de cassette en sluiten van de cassette. Als de schijf niet netjes het glas glijden doet, toevoegen meer gel en/of retourneren van de dia aan ijs voor een paar minuten.
- Het onderdompelen van de cassette in PBS in een bekerglas. Proces voor paraffine insluiten van dezelfde dag voor optimale morfologie.
4. paraffine insluiten
Opmerking: Proces de gel-islet schijven naar paraffineblokken met behulp van een verkorte uitdroging serie zoals hieronder beschreven. Deze techniek werd geoptimaliseerd met behulp van een geautomatiseerde processor, maar handmatige verwerking moet vergelijkbare resultaten geven.
- Cassettes in 85% ethanol onderdompelen gedurende 15 minuten.
- Cassettes in 95% ethanol onderdompelen gedurende 15 minuten.
- Cassettes in 100% ethanol onderdompelen gedurende 15 minuten. Herhaal tweemaal voor een totaal van drie wast.
- Cassettes in xyleen onderdompelen gedurende 15 minuten. Herhaal tweemaal voor een totaal van drie wast.
- Cassettes in gesmolten paraffine onderdompelen gedurende 10 minuten.
- Cassettes: Transfer naar verse gesmolten paraffine voor 10-30 minuten.
- Voorzichtig open de cassette en uitpakken van het Blauwboek. Verwijder de schijf gel, het bijhouden van het platte oppervlak dat was tegen het papier. De schijf in een kleine schimmel, insluiten met het platte (islet-bevattende) oppervlak neer, parallel aan het snijvlak. Voor de plug, zorgvuldig verwijderen uit de cassette en insluiten in een kleine schimmel met de tip die wijst naar het snijvlak.
5. de paraffine segmenteren en kleuring
- Label dia's opeenvolgend als seriële secties vereist zijn.
- Heb 5 µm paraffine secties gesneden door een ervaren histotechnologist. Het maximaliseren van rendement, slaat u alle secties die materiaal bevatten. In het algemeen, het verzamelen van de 20 secties kunt vangen van het merendeel van het materiaal.
- Secties bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Secties zijn vatbaar voor routinematige histologische vlekken (bijvoorbeeld H & E) en immunofluorescentie (bijvoorbeeld insuline, glucagon en DAPI). Fixatie voor andere antigenen, optimaliseren indien nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een geïllustreerde schematische voorstelling van de stappen ter voorbereiding van de gel-schijf wordt weergegeven in Figuur 1. Deze gel disc methode resulteert in paraffine secties met een voldoende aantal eilandjes verspreid in een enkel vliegtuig dat zinvolle kwantificering van resultaten. Figuur 2 toont beelden van de lage-vergroting van de resulterende secties om te illustreren het aantal eilandjes gevangen per sectie. In het algemeen > 35 eilandjes zichtbaar waren in elke sectie toen 250 IEQ werden gebruikt voor de procedure, en > 10 secties (4-5 µm) met eilandjes werden verkregen van elk monster. Verhoging van het aantal eilandjes gebruikt voor de procedure steeg het aantal eilandjes in de secties. Eilandjes in secties waren structureel divers en van verschillende groottes, ondersteunen het concept dat nieuwe en interessante gegevens kan worden verkregen met behulp van secties in plaats van technieken blind voor inter islet verschillen. De methode werkt even goed voor knaagdieren eilandjes geïsoleerd in het laboratorium (rat, muis) en voor menselijke eilandjes ontvangen na verzending door de IIDP. Knaagdier eilandjes had aanzienlijk meer intact morfologie nadat herstel na isolatie overnachting in islet medium, met een glad oppervlak van de afgeronde en compacte bolvorm(Figuur 2). Menselijke islet morfologie was vergelijkbaar wanneer ingebed op de dag van aankomst of wanneer ingesloten na na verzending herstel 's nachts, misschien omdat de eilandjes was al hersteld van isolatie stress vóór de verzending. De methode microtube leverde een kleinere weefsel oppervlakte van de dwarsdoorsnede, met minder eilandjes per sectie en dichtbevolkte verpakt eilandjes en kralen (Figuur 2B). De beelden van de microtube afgebeeld in Figuur 2B waren de beste die we konden krijgen met deze methode; een van de monsters moest worden teruggestuurd naar meer secties gesneden omdat geen eilandjes werden gevonden in de eerste set van secties.
Deze techniek genereert hoge kwaliteit islet secties voor histologisch en immunofluorescentie kleuring (Figuur 3). Insuline en glucagon kleuring toonde de gevarieerde samenstelling en de heterogeniteit van het eilandje platform. De secties gerecapituleerd duidelijk bekend het platform verschillen tussen mens, muis en rat eilandjes, met menselijke eilandjes bestaat uit overvloedige α-cellen vermengd met beta cellen, overwegende dat muis en rat eilandjes hebben aangetoond vergelijkbare architectuur met een kern van beta cel en alpha cellen in de periferie. Seriële secties waren verkrijgbaar; de panelen in Figuur 3 tonen seriële secties van de dezelfde islet gekleurd voor H & E (links) en immunofluorescentie (rechts).
Figuur 1 . Illustratie van de kritische stappen voor het maken van de islet gel schijf. Gel opgewarmd tot 70 ° C in een blok van de warmte (A) wordt overgebracht naar de lage bindende microfuge buis met de islet/kraal pellet (B). De eilandjes zijn geresuspendeerde in warme gel en overgebracht naar een glasplaatje, verspreiden van het materiaal in de vorm van een schijf (C-D). Extra schone gel wordt overgedragen aan de microfuge buis, dan al het overige materiaal is verwijderd en omtrek verspreid over de eerste islet/kraal-houdende disc op het glasplaatje (E-F). Na gelerend op ijs, is de disc overgedragen, platte kant naar beneden, naar histologie papier (G), die is gevouwen en geplaatst in een cassette (H) voor verwerking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Paraffine secties van gel schijven bevatten een groot aantal goed verspreide eilandjes. (A) lage vergroting panelen (40 X, 3 x 3 beelden, gestikt samen met 15% overlap) van muis, rat of menselijke islet secties gekleurd met H & E laten zien dat veel eilandjes zichtbaar in elke sectie zijn. Hoge vergroting inzetstukken (200 X) Toon representatieve eilandjes. Linker panelen Toon secties van eilandjes ingesloten onmiddellijk na-isolatie (muis, rat) of verzending (menselijke); rechts panelen tonen eilandjes ingebed na overnachting herstel in cultuur. Bleke blauwe cirkels zien in 40 X beelden zijn de parels opgenomen voor visualisatie tijdens insluiten en segmenteren. Deze bijzondere monsters zijn van een C57BL/6N muis (1 jaar oud) en BBDR rat (4 weken oud), eilandjes geïsoleerd door ductaal collagenase injectie en densiteitgradiënt scheiding, en menselijke T2D eilandjes van de IIDP ontvangen. (B) 250 IEQ van menselijke eilandjes ingesloten per de oude microfuge buis techniek, voor de vergelijking. Lage vergroting panelen (40 X; een honkslag unstitched opname gemaakt alle materiaal) en hoge mag inzetstukken (200 X) vertegenwoordiger secties tonen. Kweekmedium was RPMI met 10% FBS, penicilline/streptomycine en 5,5 mmol/L glucose. Schaal bars voor lage vergroting panelen zijn 1000 µm; schaal bars voor hoge vergroting panelen zijn 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Vertegenwoordiger histochemische en immunofluorescentie kleuring op seriële islet secties. Secties van muis, rat en menselijke eilandjes ingesloten na overnachting cultuur werden gekleurd voor H & E en beeld door helderveld microscopie (200 X; links). Een aangrenzende sectie was gekleurd voor glucagon insuline (rood), (groen), gemonteerd in de DAPI-bevattende media (blauw) en beeld met behulp van fluorescentie microscopie (200 X; rechts). Schaal bars: 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze gewijzigde gel schijf-gebaseerde insluiten methode biedt een eenvoudige, goedkope en efficiënte manier voor het genereren van een hoog rendement van eilandjes per sectie. Bouw van de gel-schijf op een plat glazen oppervlak vergemakkelijkt verspreiden eilandjes in een gelijkmatige verdeling over een welomschreven gebied. Verspreiding van de eilandjes in een platte schijf biedt het voordeel van het plaatsen van de vele eilandjes in het langsvlak van deel, optimaliseren van rendement en waardoor minder eilandjes worden gebruikt. De schijfdikte kan onderzoekers behoeften worden aangepast. Aangezien meerdere secties kunnen worden verkregen, kunnen seriële secties van de dezelfde eilandjes worden geanalyseerd, toename van de verschillende resultaten die op hetzelfde experimentele monster kan worden gemeten. Hoewel geoptimaliseerd hier voor alvleesklier eilandjes, kan de techniek worden toegepast op andere lage-overvloed-materiaal, met inbegrip van die met kleine stukjes, brokkelige aard of visceuze monsters die anders moeilijk om proces zijn zou. Deze methode is geoptimaliseerd voor vers-vaste eilandjes en is niet getest voor andere soorten materiaal, zoals eerder bevroren eilandjes. Deze secties kunnen ook nuttig zijn voor in situ hybridisatie assays DNA of RNA op te sporen. De toevoeging van extra gel dient twee doeleinden: om te maximaliseren islet collectie en het eilandje-rijke CD center beschermen tegen verstoring tijdens behandeling/overzetten. De dunne gel schijf snel stolt en verkorte uitdroging en xyleen infiltratie stappen voor het insluiten van paraffine. Vorming van de schijf op een vlakke ondergrond in plaats van in een secundaire container (microfuge buis of cultuur plaat goed) maakt het makkelijker om de schijf fysiek naar de cassette voor verwerking. Wanneer vergeleken met de resultaten van de techniek schijf, de microtube techniek had afgeboekt islet rendement en worden samengeklonterd islet distributie, hoewel de regeling niet-vlakke weefsel tot een hoger aantal islet-bevattende leiden kan secties.
De kritische stappen van het protocol bevatten weefsel fixatie, vorming van de gel-schijf, paraffine insluiten, en segmenteren. Met betrekking tot fixatie, zoals getest door H & E en immunofluorescentie voor insuline en glucagon, werd geen verschil ontdekt tussen PFA en formaline of fixatie duur variërend van 10-30 minuten (niet afgebeeld). Fixatie intensiteit en duur moeten echter worden geoptimaliseerd voor de behoeften van de eindgebruiker. De belangrijkste vernieuwing in dit protocol vervatte is de voorbereiding van het gel islet frictieplaat; kritische stappen worden samengevat in Figuur 1. Belangrijke stappen zijn met behulp van een kleine hoeveelheid gel te concentreren van weefsel in een klein gebied en de vorming van de schijf op een vlakke ondergrond te regelen van het weefsel in een enkel vliegtuig voor segmenteren. Gebruik van lage-bindende microfuge buizen en tips en een swingende emmer centrifuge voor alle spins verbetert weefsel opbrengst; eilandjes vasthouden aan kunststof na fixatie. Toevoeging van goed zichtbare kralen assisteert bij de formatie van de schijf, insluiten en segmenteren. Zoveel PBS mogelijk verwijderen voordat u toevoegt dat de gel is van cruciaal belang om te voorkomen dat de agarose verdunnen, wat leidt tot slechte stolling en moeite de schijf overbrengen naar de papier. De dunne schijf houden intact terwijl het glijden van de glasplaatje op het papier uitdagende worden kan. Als een rimpel in de schijf optreedt, laat het terug naar de oorspronkelijke positie, toevoegen meer gel en opnieuw de dia chill. Met betrekking tot paraffine insluiten is het belangrijk dat de schijf plat-zijde naar beneden en parallel met het deurvlak snijden worden ingebed. Een histotechnologist ervaren met paraffine secties snijden is essentieel voor het succes van deze procedure, aangezien het materiaal geconcentreerd op de voorrand van het blok is. Buitensporige gerichte off van het blok kan leiden tot verlies van het monster. Het is raadzaam om te beginnen met het verzamelen van secties, zodra de blauwe kralen zichtbaar zijn.
Fixatie intensiteit en duur moeten worden geoptimaliseerd voor de specifieke weefsel en de behoeften van de eindgebruiker. Het aantal eilandjes gebruikt per monster kan worden gewijzigd indien nodig; vermindering van de grondstof genereert echter secties met minder eilandjes. Dikkere of grotere schijven kunnen worden gegenereerd met behulp van deze techniek; uitdroging en xyleen infiltratie stappen wellicht worden verlengd en moeten worden geoptimaliseerd. Als de resulterende secties bevatten alleen de vorm van een gedeeltelijke schijf, kunt u overwegen de mogelijkheid dat de schijf niet was ingesloten parallel aan het snijvlak. Als te weinig secties worden verkregen, kan de technoloog kan materiaal tijdens eerste blok voorbereiding hebben verloren.
Deze methode genereert secties met vaste islet weefsel en kan als zodanig alleen worden gebruikt voor histologische resultaten. Om het verkrijgen van een groot aantal eilandjes per sectie, 200-250 IEQ werd grondstof gebruikt, die is een uitdaging om te genereren voor bepaalde typen experiment. Hoge kwaliteit secties zijn afhankelijk van het hebben van een ervaren histotechnologist.
De mogelijkheid voor het genereren van 10 + secties met vele eilandjes van een enkele experimentele voorwaarde zal toestaan dat kwantificering van meerdere resultaten op hetzelfde materiaal, verbetering van de experimentele efficiëntie. Routinematige analyse van intacte eilandjes kan leiden tot vooruitgang in het begrip in weefsel heterogeniteit, niet alleen op een cellulair niveau, maar ook op het niveau van het eilandje, over welke weinig zich momenteel voordoet. Deze techniek toe te passen op andere weefselmonsters van limited-overvloed kan bieden voordelen op andere velden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren.
Acknowledgments
Wij erkennen dankbaar de bèta cel biologie-groep bij de UMass Diabetes Center of Excellence voor nuttige adviezen en discussies. Menselijke alvleesklier eilandjes werden verstrekt door de NIDDK gefinancierde geïntegreerde Islet distributie programma (IIDP) bij stad van hoop. Dit werk werd gefinancierd door de NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) en door de American Diabetes Association verleent #1-15-BS-003 (LCA) in samenwerking met de volgorde van de Amarant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
