Summary
Ex vivo bukspyttkjertelen Holme studier er viktig for diabetes forskning. Eksisterende teknikker å studere kulturperler holmer i sin opprinnelige 3-dimensjonale arkitektur er tidkrevende, ineffektive og sjelden brukt. Dette verket beskriver en ny, enkel og effektiv metode for å generere høy kvalitet parafinsnitt av hele kulturperler holmer.
Abstract
Eksperimenter ved hjelp av isolerte bukspyttkjertelen småøyer er viktig for diabetes forskning, men holmer er dyrt og begrensede overflod. Holmer inneholder en mikset-celle befolkningen i en strukturert arkitektur som påvirker funksjonen menneskelige holmer er mye variabel i celle type komposisjon. Gjeldende brukte metoder å studere kulturperler holmer inkluderer molekylære studier utført på hele holmer, lumping ulike Holme celletyper sammen, eller mikroskopi eller molekylære studier på spredt Holme celler, forstyrre Holme arkitektur. For i vivo Holme studier er parafin-embedded bukspyttkjertelen snitting en kraftfull teknikk for å vurdere celle-spesifikke resultater i sine opprinnelige bukspyttkjertelen omgivelser. Studere etter kultur holmer av parafin snitting vil gi flere fordeler: påvisning av flere resultater på samme holmer (potensielt også nøyaktig samme øyene, bruker serielle deler), celle-spesifikk målinger og opprettholde opprinnelig Holme celle-celle og celle-undergrunnen interaksjoner både under eksperimentelle eksponering og for analyse. Men isolerte eksisterende teknikker for innebygging holmer etter kultur er ineffektiv, tidkrevende, utsatt for tap av materiale, og generelt produsere deler med utilstrekkelig Holme tall å være nyttig for kvantifisere resultater. Klinisk patologi er laboratorium cellen blokk forberedelse utilgjengelig og upraktisk for grunnleggende forskningslaboratorier. Vi har utviklet en forbedret, forenklet benk toppen metoden som genererer seksjoner med robust avkastning og distribusjon av holmer. Fast holmer er resuspended i varme histologiske agarose gel og pipetted i en flat plate på en standard objektglass, slik at øyene er distribuert i et fly. Etter standard dehydrering og innebygging, kan 4-5 µm inndelingene (10 +) bli kuttet fra samme Holme blokk. Bruker denne metoden, kan histologiske og immunofluorescent analyser utføres på mus, rotte og menneskelige holmer. Dette er en effektiv, rimelig, tidsbesparende å vurdere celle spesifikk, intakt-arkitektur resultatene fra kulturperler holmer.
Introduction
Bukspyttkjertelen holmer Langerhans, den eneste kilden til sirkulerende insulin, er en kritisk vev for etterforskere studere diabetes mellitus. Fra noen gitt organisme har holmer variabel størrelse, celle type frekvens og arkitektur1,2,3. Den konvensjonelle strategien å studere i vivo struktur og endokrine celle sammensetning av bukspyttkjertelen holmer er ved snitting bukspyttkjertelen vev4,5. Siden holmer utgjør bare en brøkdel av bukspyttkjertelen mobilnettet innholdet, utføres molekylære studier på isolerte småøyer. Ex vivo Holme cellekulturer eksperimenter testing respons på næringsstoffer, gi gene modulering (hva, signaltransduksjon) eller eksperimentelle behandlinger viktig innsikt i mekanismer modulerende endokrine celle overlevelse, spredning og funksjon 5 , 6.
Ex vivo Holme eksperimenter er ofte analysert ved hjelp av molekylære studier av hele holmer eller histologiske eller molekylære studier av spredt Holme celler dyrket i monolayer5,6. Molekylær analyse av hele holmer introduserer den alvorlige påminnelse blander celletyper, som kan gi falsk negativt eller falske positive resultater når extrapolated til en enkelt celle type. Celle spredning på coverslips for post kultur mikroskopi tillater celle spesifikk utfallet måling, men forstyrrer Holme arkitektur, som kan endre svar til intervensjon og utelukker identifikasjon av arkitektur-relaterte resultater. Dessuten, kan vanligvis bare en enkelt utfall måles; for eksempel for å måle beta-celle spredning og beta-celledød under samme vilkår, må to separate forsøk utføres. Disse metodene er også blind for Inter Holme variasjon, et område av økende interesse i feltet. Sortering Holme celler av flowcytometri for celle spesifikk molekylære studier eller encellede RNA studier er elegant men dyre, tidkrevende, begrenset av vev overflod, arkitektur-utrydde, og ikke godt egnet til rutinemessig celle kulturanalyser 5 , 7. AC confocal imaging av hele-mount immunostained holmer gir høy kvalitet intakt-arkitektur data, men er arbeidsintensiv, og data fra hvert utvalg er begrenset til resultater identifiserbar i en enkelt immunostai-8.
Muligheten til å generere høy kvalitet parafinsnitt av etter kultur hele holmer ville ta mange av disse bekymringene. Høye kostnader, lav-overflod Holme vev fra unik genetisk modeller eller menneskelig orgel givere eller holmer status innlegg i vivo eller i vitro eksperimentelle manipulasjon, er dyrebare. Få flere parafinsnitt fra samme øyene ville tillate flere celle spesifikk, intakt-arkitektur analyser fra samme eksperiment.
Eksisterende teknikker for å generere Holme pellets snitting er ufullkomne. Histology-optimalisert agarose er en vandig lavt Smeltepunkt gel som er mye brukt i behandling av histologiske og fargemaskin prøver inkludert lite eller for fragmentert vevsprøver som er vanskelige å prosessen9. En Holme innebygging tilnærming er å suspendere øyene i agarose i et microcentrifuge rør, virvel å pellets materialet, hente agar pluggen, deretter behandle og legge til snitting10,11. Utdrager befestet prøven fra bunnen av røret er tid forbruker og vanskelig, fører til sporadisk fragmentering av prøven og risiko for personskader. Øyene er konsentrert i spissen av pluggen, fører til utilstrekkelig Holme distribusjon i delene fra denne metoden. Rundt bunnen av kompliserer innebygging slik at en Holme-fattig region kan bli presentert snitting. Total, denne metoden fører til lav avkastning og klumpet seg Holme fordelingen i de resulterende delene.
Denne nye metoden er en forenklet og forbedret tilnærming for utarbeidelse av Holme deler. Holmer er konsentrert i små og deretter plassert på glatte overflaten av en microscope skyve å danne en liten plate, med øyene et enkelt fly. Histogel-Holme platen behandles deretter for parafin innebygging i en forkortet dehydrering og xylen infiltrasjon protokollen. Den forrige fremgangsmåten, som konsentrerer øyene bunnen av et microfuge rør, utføres også som en sammenligning. Denne nye teknikken forbedrer avkastningen av holmer per seksjon, distribusjon av holmer i hver del, og tar mindre tid å overføre Holme blokkene til kassetter. Denne teknikken er nyttig for Holme biologer eller andre forskere studere små biter av vev som ønsker å maksimere produktiv bruk av en lav-overflod vev ved å måle flere resultater på en enkelt prøve i sin innfødt vev arkitektur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av UMass medisinsk skolen institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Menneskelige Holme studier ble fastsatt av UMass institusjonelle gjennomgang styret å ikke kvalifiserer IRB eller fritak fordi de ikke involverer bruk av mennesker.
1. Holme isolasjon og kultur
- Isolere holmer og separat fra forurensende exocrine og ductal vev ved hjelp av metoden du velger.
Merk: Denne metoden var optimalisert ved hjelp av holmer isolert av collagenase ductal insufflation og Ficoll separasjon12 (gnagere) eller etter forsendelse holmer fra integrert Holme distribusjon programmet (IIDP13, human). Holmer ble håndplukket P200 brønnene med. - For å optimalisere Holme morfologi, tillate holmer gjenopprette overnatting i 10 mL komplett Holme medium (RPMI med 10% FBS, penicillin/streptomycin og 5.5 mmol/L glukose) i en fuktet kammer som inneholder 5% CO2 på 37 ° C. Selv om dette trinnet ikke er nødvendig å få deler, øyene er mer intakt etter en restitusjonsperiode (se figur 2).
2. Holme fiksering
- Bruker en lav-bindende P200 tips, håndplukke ca 250 Holme ekvivalenter (IEQ)13 med et kalibrert rutenett under en stereomicroscope i en 1,5 mL lav bindende microfuge tube. Lav-bindende tips og rør redusere Holme tap.
- Tillate holmer å bosette til bunnen av microfuge røret. Fjerne de fleste nedbryting med P200 Pipetter tips, ta vare ikke for å fjerne noen holmer.
- Legg 1 mL av PBS. Sentrifuge rør i en svingende bøtte sentrifuge til hastigheten når 200 x g og deretter stoppe spinn. Fjerne nedbryting. Gjenta PBS vask, for totalt to vasker.
- Legg til 500 µL av 10% formalin løsning eller 4% nystekte paraformaldehyde. Fikse ved romtemperatur i 30 minutter. Resultatet som er testet i denne metoden, var metodene fiksering utvisket. Kortere fiksering kan også være mulig; Det anbefales å optimalisere fiksering varigheten for ønsket utfall.
- Fjerne bindemiddel med P200 tips.
- Legg 1 mL av PBS. Sentrifuge rør til hastigheten når 200 x g og deretter stoppe spinn. Fjerne nedbryting. Gjenta PBS vask, for totalt to vasker.
- Fortsett rett til neste trinn.
3. forberedelse Holme plate (figur 1)
- Ved førstegangsbruk, smelte gel (f.eks Histogel) på 70 ° C og gjøre dele i 1,5 mL microfuge rør for langtidslagring. Aliquot volumet er ikke kritisk, siden dele kan brukes på nytt.
- Varme gel (ca 100 µL per prøve) på 70 ° C ved å plassere microfuge tube med gel aliquot i en blokk på varme til 70 ° C.
- Overføre agarose blå perler (10 µL for hver prøve) til en 1,5 mL ren microfuge tube. Grundig resuspend perler før pipettering.
Merk: Blå perlene er blandet med øyene å bistå i visuell identifikasjon av innebygde materiale i knappen agarose og parafin blokken. Antall blå perler brukt er ikke avgjørende for resultatet, men unngå overdreven perler (> 5 x antall holmer) som tillater optimal fordeling av holmer i deler. - Vask blå perlene med 1mL PBS, to ganger. For hver vask, spinne perlene 1 min 800 x g. Etter andre vask, resuspend perlene i (n2) x 10 µL PBS, der n er antallet eksempel rør; for eksempel, for 2 eksempel rør, ville PBS volumet legge til perlene være 40 µL.
- Sentrifuge microfuge røret som inneholder holmer (kort spin til 200 x g) og fjerne det meste av nedbryting. Kuttet spissen av en 10 µL brønnene tips med saks eller et blad og legge 10 µL av perler til hver Holme rør, bruke en ren tips for hvert utvalg. Ikke bland (for å unngå å miste holmer).
- Sentrifuge holmer og perler (kort spin til 200 x g). Fjerne PBS så mye som mulig med en uklippet 10 µL brønnene tips.
- Etiketten objektglass for eksempel identifikasjon. To til tre eksempler kan være forberedt på hvert lysbilde. Plass lysbildet på benken nær varme blokken med varmet gel. Kuttet tips av tre til fem 20 µL lav bindende brønnene tips per prøve med et barberblad eller saks. Legg to P20 Mikropipetter kuttet tips du kan raskt bytte fra den ene til den andre.
- Bruker den første brønnene, legge til 15-20 µL av varm gel holmer/perler microfuge røret; umiddelbart blande, unngå bobler; og bruke flytende agar/holmer/perler blandingen på lysbildet å danne en < 1 cm diameter plate. Plasser platen nær kanten av lysbildet avstand for ytre gel ringen (neste trinn). Tapp lysbildet forsiktig noen ganger for å avgjøre holmer og perler.
- Bruke andre brønnene, legge til 20 µL av varm gel til eksempel røret. Den første brønnene, blanding nye gel med eventuelle gjenværende holmer/perler, nytt oppvarming i varme blokken hvis det begynner å stivne, så bruk denne blandingen på lysbildet rundt den opprinnelige platen. Gjenta etter behov, bruke flere pre-cut tips, til platen er ønsket størrelse og tykkelse.
Merk: Håndtering gelled platen er lettere hvis utenfor ringen er litt tykkere. 3 x 20 µL av gel er vanligvis tilstrekkelig. Dette trinnet minimerer tap av holmer av rør vasker og legger Holme-fattige agarose utenpå platen til rette plate håndtering. - Forberede hver plate individuelt og holde nøye oversikt over eksempel ordre om å plassere flere plater på hvert lysbilde.
- Plass lysbildene på en flat overflate av våt is, med en cover, i 10 minutter eller til gel stivner. Det er vanskeligere å skyve platen av glass hvis det tørker.
- Etiketten biopsi behandling/embedding vev kassetter med blyant, ett per eksempel. Tørr bak på lysbildet å unngå tisse på blått papir.
- Bruker sløv kanten av en razor blad, skyv platen i hver retning å frigjøre den fra glasset. Når det glir lett, sakte skyve platen fra microscope skyve på blått papir. Plass platen, med flate siden ned, rett på papiret.
- Holde platen flat, falser du papiret rundt å hindre bevegelse inn falsede papiret i kassetten og lukke kassetten platen. Hvis platen ikke Skyv rent av glass, legge mer gel og/eller returnere lysbildet til is i noen minutter.
- Senk kassetten i PBS i et beaker. Prosess for parafin innebygging samme dag for optimal morfologi.
4. parafininnstøper
Merk: Prosessen Holme gel plater til parafin blokker med en forkortet dehydrering serie som beskrevet nedenfor. Denne teknikken var optimalisert med en automatisert prosessor, men manuell behandling bør produserer lignende resultater.
- Fordype kassetter i 85% etanol i 15 minutter.
- Fordype kassetter i 95% etanol i 15 minutter.
- Fordype kassetter i 100% etanol i 15 minutter. Gjenta to ganger for totalt tre vasker.
- Fordype kassetter i xylen i 15 minutter. Gjenta to ganger for totalt tre vasker.
- Fordype kassetter i flytende parafin i 10 minutter.
- Overføre kassetter til frisk flytende parafin i 10-30 minutter.
- Nøye åpne kassetten og pakke av blått papir. Fjerne gel platen, holde orden på den flate overflaten som var imot til papiret. Bygge inn platen i en liten form, med flat (Holme inneholder) overflaten ned, parallelt med skjæring overflate. For pluggen, nøye fjerne den fra kassetten og legge den i en liten form spissen peker mot skjæring overflate.
5. parafin snitting og flekker
- Merk lysbildene sekvensielt hvis føljetong deler som er nødvendige.
- Har 5 µm parafinsnitt kuttet av en erfaren histotechnologist. For å maksimere avkastning, lagre alle avsnitt som inneholder materiale. Generelt, samle 20 deler kan fangst av de fleste av materialet.
- Lagre inndelinger ved romtemperatur. Delene er mottakelig for rutinemessig histologiske flekker (f.eks H & E) og immunofluorescence (f.eks insulin, glukagon og DAPI). Optimalisere fiksering for andre antigener, om nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustrert skjematisk av trinnene for å klargjøre platen gel er vist i figur 1. Denne gel plate metoden resulterer i parafinsnitt som inneholder et tilstrekkelig antall holmer distribuert i et enkelt fly å tillate meningsfull kvantifisering av resultater. Figur 2 viser lav-forstørrelse bilder av de resulterende delene å illustrere antall holmer fanget per seksjon. Generelt > 35 holmer var synlig i hver inndeling når 250 IEQ ble brukt for prosedyren, og > 10 deler (4-5 µm) som inneholder holmer ble innhentet fra hver prøve. Øke antall holmer brukes fremgangsmåten for økt antall holmer i delene. Holmer i delene var strukturelt varierte og av ulik størrelse, støtter konseptet at nye og interessante data kan oppnås ved hjelp av deler i stedet for teknikker blind for Inter Holme forskjeller. Metoden fungerte like godt for gnager holmer isolert i laboratoriet (rat, musen) og menneskelige holmer mottatt etter levering av IIDP. Gnager holmer hadde merkbart mer intakt morfologi etter etter isolasjon overnatting i Holme medium, med en glatt avrundet overflate og kompakt sfærisk form (figur 2A). Menneskelige Holme morfologi var lik når innebygd på ankomstdagen eller innebygd etter post forsendelse utvinning over natten, kanskje fordi øyene hadde allerede fikset isolasjon stress før levering. Metoden microtube gitt et mindre vev tverrsnittsstudier område, med færre holmer per seksjon, og tett pakket holmer og perler (figur 2B). Microtube bildene som vises i figur 2B var best vi kunne få med denne metoden. en av prøvene måtte sendes tilbake til kutte flere inndelinger fordi ingen holmer ble funnet i det første settet av delene.
Denne teknikken genererer høy kvalitet Holme seksjoner for histologiske og immunofluorescence flekker (Figur 3). Insulin og glukagon flekker viste ulike sammensetning og heterogenitet Holme arkitektur. Delene tydelig recapitulated kjente arkitektur forskjeller mellom menneske, musen og rotten holmer, med menneskelige holmer består av rikelig α-celler blandet med beta celler, mens musen og rotten holmer viste lignende arkitektur med en beta-celle kjerne og alfa celler i periferien. Seriell delene var oppnåelig; panelene i Figur 3 viser føljetong deler samme Holme farget h & E (venstre) og immunofluorescence (høyre).
Figur 1 . Illustrasjon av de viktige skritt for making Holme gel platen. Gel varmet opp til 70 ° C i en varme blokk (A) overføres til lav bindende microfuge røret som inneholder Holme/perle pellet (B). Øyene er resuspended i varme gel og overført til et glass lysbilde, sprer materialet i en plate figur (C-D). Ekstra ren gel overføres til microfuge røret, og alle gjenværende materialet er fjernet og spre circumferentially rundt første Holme/perle-inneholder platen av objektglass (E-F). Etter gelling på is, er platen overført, flat side ned til histology papir (G), som er foldet og plassert i en kassett (H) for behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Parafinsnitt gel plater inneholder en rekke godt distribuert holmer. (A) lav forstørrelse paneler (40 X, 3 x 3 bilder stitched sammen, med 15% overlapping) mus, rotte eller menneskelig Holme inndelinger med H & E Vis at mange holmer vises i hver del. Forstørring insets (200 X) viser representant holmer. Venstre panel vise deler av holmer innebygd umiddelbart etter isolasjon (mus, rotte) eller forsendelse (human); høyre panel viser holmer innebygd etter overnatting utvinning i kultur. Blek blå sirkler i 40 X bilder er perlene inkludert for visualisering under innebygging og snitting. Disse spesielle prøvene er fra C57BL/6N mus (1 år) og BBDR rat (4 uker gamle), holmer isolert av ductal collagenase injeksjon og Ficoll separasjon og menneskelig T2D holmer mottatt fra IIDP. (B) 250 IEQ av menneskelig holmer innebygd per gamle microfuge tube teknikken, for sammenligning. Lav forstørrelse paneler (40 X; ett unstitched bildet tatt alt materiale) og høy mag insets (200 X) viser representant deler. Kultur medium var RPMI med 10% FBS, penicillin/streptomycin og 5.5 mmol/L glukose. Skala barer for lav forstørrelse paneler er 1000 µm; skala barer for forstørring paneler er 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Representant histochemical og immunofluorescence flekker på seriell Holme deler. Deler av mus, rotte og menneskelige holmer innebygd etter at natten kultur var farget H & E og fotografert av brightfield mikroskopi (200 X, venstre). En tilstøtende delen var farget for insulin (rød), glukagon (grønn), montert i DAPI inneholder medier (blå) og fotografert med fluorescerende mikroskopi (200 X, høyre). Skalere barer: 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne endrede gel-disk-baserte innebygging metoden gir en enkel, billig og effektiv måte å generere en høy avkastning av holmer per seksjon. Konstruere gel platen på en flat glassoverflate forenkler spre holmer i en jevn distribusjon over et godt definert område. Spre øyene en flat plate tilbyr fordelen av å plassere mange holmer i flyet delen, optimalisere ytelse og slik at færre holmer skal brukes. Platen tykkelsen kan justeres etter etterforskere behov. Siden flere inndelinger kan oppnås, kan seriell deler av de samme holmer analyseres, øke antall forskjellige resultater som kan måles på samme eksperimentelle prøven. Selv om optimalisert her for bukspyttkjertelen holmer, kan teknikken brukes til andre lav-overflod materiale, inkludert de små biter, basert natur eller tyktflytende prøver som ellers ville være vanskelig å prosessen. Denne metoden er optimalisert for frisk-fast holmer og testet for andre typer materiale, for eksempel tidligere frosne holmer. Disse delene kan også være nyttig for i situ hybridisering analyser å oppdage DNA eller RNA. Tillegg av ekstra gel tjener to formål: å maksimere Holme samling og beskytte Holme-rik plate sentrum fra avbrudd under håndtering/overføring. Tynn gel platen stivner raskt og tillater forkortet dehydrering og xylen infiltrasjon fremgangsmåte for innebygging av parafin. Danner platen på et flatt underlag og ikke i en sekundær beholder (microfuge rør eller kultur plate godt) gjør det enklere å overføre fysisk platen til kassetten for behandling. Sammenliknet med platen teknikk resultatene, microtube teknikken hadde redusert Holme avkastning og klumpet seg Holme distribusjon, men ikke-plane vev ordningen kan generere mange Holme inneholder inndelinger.
De avgjørende skritt av protokollen inkluderer vev fiksering, dannelsen av gel platen, parafin innebygging og snitting. Med hensyn til fiksering fant ingen forskjell mellom PFA og formalin eller fiksering varigheten fra 10-30 minutter (ikke vist) som testet av H & E og immunofluorescence for insulin og glukagon. Imidlertid skal fiksering intensitet og varighet være optimalisert for sluttbruker behov. Den viktigste innovasjonen i denne protokollen er utarbeidelsen av gel Holme disken. avgjørende skritt oppsummeres i figur 1. Nøkkeltrinn inkluderer bruker en liten mengde gel for å konsentrere vev i et lite område og danner platen på et flatt underlag å arrangere vevet i et enkelt fly snitting. Bruk av lav-bindende microfuge rør og tips og en svingende bøtte centrifuge for alle spinner forbedrer vev avkastning; holmer holde seg til plast etter fiksering. Tillegg av lett synlige perler bistår plate formasjon, innebygging og snitting. Fjerne så mye PBS som mulig før du legger til gel er avgjørende for å unngå fortynne agarose, som fører til dårlig herding og vanskeligheter med å overføre platen til papiret. Beholder tynn platen mens skyve den fra av objektglass til papiret kan være utfordrende. Hvis det oppstår en rynke på platen, la det gå tilbake til den opprinnelige plasseringen, legge mer gel og re chill lysbildet. Når det gjelder parafininnstøper er det viktig at platen bygges flat side ned og parallelt flyet kutte. En histotechnologist med kutte parafinsnitt er avgjørende for suksessen til denne prosedyren siden materialet er konsentrert i forkant av blokken. Overdreven vendt av blokken kan føre til tap av prøven. Det anbefales å begynne å samle deler straks blå perlene er synlig.
Fiksering intensitet og varighet skal være optimalisert for sluttbrukerens spesifikke vev og behov. Antall holmer brukes per prøve kan endres om nødvendig; imidlertid genererer redusere utgangsmaterialet seksjoner med færre holmer. Tykkere eller større plater kan genereres ved hjelp av denne teknikken; dehydrering og xylen infiltrasjon skritt må være forlenget og skal optimaliseres. Hvis resulterende inndelinger inneholder bare en delvis plate figur, vurdere muligheten for at disken ikke var innebygd parallell til skjæring overflate. Hvis også noen deler er oppnådd, kan teknolog mistet materiale i løpet av første kvartal forberedelse.
Denne metoden genererer inndelinger som inneholder fast Holme vev, og som sådan, kan bare brukes for histologiske resultater. For å få et stort antall holmer per seksjon, 200-250 IEQ ble starter materiale brukt som er utfordrende for å generere for enkelte eksperiment. Høy kvalitet deler er avhengige av å ha en erfaren histotechnologist.
Muligheten til å generere 10 + inndelinger som inneholder mange holmer fra én eksperimentelle betingelse gjør kvantifisering av flere resultater på samme materialet, forbedre eksperimentelle effektivitet. Rutinemessig analyse av intakt holmer kan føre til fremskritt i forståelsen i vev heterogenitet, ikke bare på cellenivå, men også på Holme nivå, om hvilke lite forstås nå. Bruke denne teknikken til andre begrenset-overflod vevsprøver kan tilby fordelene til andre felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å erklære.
Acknowledgments
Vi erkjenner takknemlig gruppen Beta-celle biologi ved UMass Diabetes Center of Excellence for nyttige råd og diskusjoner. Menneskelige bukspyttkjertelen holmer ble levert av den NIDDK-finansierte integrert Holme distribusjon Program (IIDP) på City of Hope. Dette arbeidet ble finansiert av NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) og ved American Diabetes Association gir #1-15-BS-003 (LCA) i samarbeid med rekkefølgen av Amaranth.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
