Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Pазрешено внедрение для парафиновых срезах поджелудочной островок

doi: 10.3791/57931 Published: June 29, 2018

Summary

Ex vivo поджелудочной островок исследования имеют большое значение для исследования мочеизнурения. Существующие методы для изучения культивировали островков в их родной 3-мерной архитектуры времени, неэффективны и редко используемых. Эта работа описывает новый, простой и эффективный метод для создания высококачественных парафиновых срезах вся культивировали островков.

Abstract

Эксперименты с использованием изолированных островков поджелудочной железы имеют важное значение для исследования мочеизнурения, но островки являются дорогостоящими и ограниченный изобилия. Островки содержат смешанные клетки населения в структурированную архитектуру, которая влияет на функции, и человеческих островках широко переменная в ячейке тип композиции. Текущий часто используемые методы для изучения культивировали островков относятся молекулярные исследования на весь островков, комков разрозненных островковых клеток типов вместе, или микроскопия или молекулярные исследования на рассредоточенных островковых клеток, нарушая островок архитектуры. В vivo исследований островок секционирование парафин врезанных поджелудочной железы – это мощный метод для оценки результатов конкретных клеток в родной среде поджелудочной железы. Изучая после культуры островков, парафин секционирование будет предлагать ряд преимуществ: обнаружение нескольких результатов на же островков (потенциально даже точное же островки, используя последовательный секции), клетки определенного типа измерений и сохранения родной островок-клеток и клеток субстрат взаимодействий во время экспериментального воздействия, а также для анализа. Однако существующие методы для встраивания изолированных островков после культуры являются неэффективным, трудоемким, склонны к потере материала и обычно производят секции с неадекватным островок чисел будут полезны для количественной оценки результатов. Клинической патологии клетки блока подготовки лаборатории являются недоступными и непрактичным для основных исследовательских лабораторий. Мы разработали улучшения, упрощенный стендовые метод, который генерирует секции с надежной урожайность и распределение островков. Фиксированной островков высокомобильна в теплых гистологические агарозном геле и накапаны в плоский диск на слайде стандартного стекла, таким образом, что островки распределены в плоскости. После стандартной обезвоживания и встраивание несколько (10 +) 4-5 мкм разделов можно вырезать из одного блока островок. С помощью этого метода, гистологические и immunofluorescent анализ может выполняться на мыши, крысы и человеческих островках. Это является эффективной, недорогой, экономящий время подход к оценке конкретного типа клеток, нетронутыми архитектура результатов от искусственного островков.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Островки Лангерганса поджелудочной железы, единственным источником циркулирующего инсулина, являются критическим ткани для следователей, изучая сахарный диабет. Из любого данного организма островки имеют переменный размер, частота типа клеток и архитектуры1,2,3. Обычные стратегии для изучения в vivo структура и состав эндокринные клетки панкреатических островков, секционирование поджелудочной железы ткани4,5. Так как островки составляют лишь небольшую часть общего поджелудочной железы клеточного содержания, молекулярные исследования выполняются на изолированных островков. Ex vivo островок культуры эксперименты тестирование ответ на питательных веществ, Джин модуляции (трансфекции, трансдукция), или экспериментальное лечение обеспечивают важное понимание механизмы модуляции выживание эндокринные клетки, распространением и функции 5 , 6.

Ex vivo островок эксперименты часто анализируются с помощью молекулярных исследований всего островков или гистологических или молекулярных исследований дисперсных островковых клеток, выращиваемых в монослое5,6. Молекулярный анализ всего островков представляет серьезное предостережение перемешивающий типов клеток, которые может дать ложно отрицательные или ложно положительных результатов при экстраполяции на любой тип отдельных клеток. Дисперсия клеток на coverslips для микроскопии после культуры позволяет ячейки тип конкретных результатов измерения, но разрушает островок архитектуру, которая может изменить ответ на вмешательство и исключает возможность идентификации результатов, связанных с архитектурой. Кроме того обычно только один результат может быть измерена; например для измерения бета пролиферации и гибель бета клеток на тех же условиях, должны быть выполнены два отдельных экспериментов. Эти подходы также слепы к Интер островок изменчивости, площадь растущий интерес в области. Сортировки островковых клеток подачей cytometry для клеток тип-молекулярных исследований, или одно клеточной РНК исследований элегантной, но дорого, много времени, ограничивается ткани изобилия, архитектура искоренения и не хорошо подходит для обычной клетки культуры анализы 5 , 7. конфокальный изображений всего гора immunostained островков обеспечивает высокое качество нетронутыми архитектура данных, но является трудоемким, и данные, полученные от каждого образца ограничивается результаты в одном иммуноокрашивания8.

Возможность создания высококачественных парафиновых срезах после культуры всего островков рассмотрит многие из этих проблем. Ткани высокой стоимости, низкого изобилие островок от уникальной генетической модели или от доноров человеческих органов, или островков статус пост в естественных условиях или в пробирке экспериментально манипуляции, являются ценными. Получение нескольких парафиновых срезах же островков позволит несколько определенного типа клеток, нетронутыми архитектура анализа от же эксперимент.

Существующие методы для создания островок гранулы для разрезания несовершенны. Гистология оптимизированный агарозы является водный низкой температурой плавления гель, который широко используется в обработке гистологический и цитологический образцов, включая образцы малых или фрагментирован тканей, которые трудны для того чтобы процесс9. Один островок, внедрение подхода – приостановить островки в агарозы в пробки microcentrifuge, центрифуга гранул материал, извлечь штекер агар, а затем обрабатывать и внедрить для разрезания10,11. Извлечение затвердевших образца от нижней части трубки является трудоемким и сложным, приводит к фрагментации случайные выборки и риска травмирования. Островки сосредоточены в кончик вилку, приводит к неадекватным островок распределения в разделах, полученные из этого метода. Раунда нижней вилки осложняет внедрение таким образом, что островок плохой региона могут быть представлены для разрезания. В целом этот метод приводит к низкой урожайностью и распределения скомканным островок в результате секции.

Этот новый метод представляет собой упрощенный и Улучшенный подход для подготовки разделов островок. Островки сосредоточены в небольшом объеме и затем помещается на гладкой поверхности микроскопа сформировать небольшой диск, с островками в одной плоскости. Диск Histogel островок впоследствии обработаны для парафина, встраивание в укороченной обезвоживания и ксилол инфильтрации протокол. Предыдущий подход, который концентрируется островков в нижней части трубки отцентрифугировать, осуществляется также как сравнение. Эта новая методика повышает доходность островков в каждой секции, распределение островков в каждом разделе и занимает меньше времени для передачи блоков островок для кассет. Этот метод полезен для биологов островок или другие ученые, изучающие небольшие кусочки ткани, желающих максимально продуктивной использовать низкий обилие ткани путем измерения несколько результатов на один образец в своей родной ткани архитектуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры с участием животных были утверждены UMass медицинской школы помощи для институционального животных и использования Комитетом. Человека островок исследования были определены Советом UMass институционального обзора не претендовать на обзор IRB или освобождение, потому что они не связаны с использованием человеческих субъектов.

1. островок изоляции и культура

  1. Изолировать островков и отдельно от загрязнения экзокринной и протоковой ткани, используя метод по вашему выбору.
    Примечание: Этот метод был оптимизирован с помощью островков, изолированные протоковой инсуффляции коллагеназы и Ficoll разделения12 (грызунов) или послеотгрузочное островков из комплексной программы распределения островок (IIDP13; человека). Островки были подобраны с микропипеткой P200.
  2. Чтобы оптимизировать островок морфологии, позволяют островков восстановить всю ночь в 10 мл полный островок среднего (RPMI с 10% FBS, пенициллин/стрептомицина и глюкозы 5,5 ммоль/Л) в увлажненные камере, содержащей 5% CO2 при 37 ° C. Хотя этот шаг не требуется для получения секций, островки более нетронутыми после периода восстановления (см. Рисунок 2).

2. островок фиксации

  1. С помощью кончика Р200 низкий привязки, handpick приблизительно 250 островок эквиваленты (IEQ)13 с помощью калиброванного сетки под стереомикроскопом в 1,5 мл трубку низкой привязки отцентрифугировать. Низкий привязки советы и трубки уменьшить потери островок.
  2. Разрешить островков поселиться в нижней части трубки отцентрифугировать. Удаление большинство супернатант с кончиком пипетки Р200, стараясь не удалять любые островков.
  3. Добавьте 1 mL PBS. Центрифуга трубки в центрифугу размахивая ведро, до тех пор, пока скорость достигает 200 x g и затем остановить отжим. Удалите супернатант. Повторите PBS мыть, для в общей сложности двух стирок.
  4. 500 мкл раствора формалина 10% или 4% свежеприготовленные параформальдегида. Исправить при комнатной температуре за 30 минут. Для исходов испытания в этом методе эти методы фиксации неразличимы. Короче, фиксации также может быть возможным; рекомендуется оптимизировать длительность фиксации для желаемого результата.
  5. Снимите фиксатор с наконечником P200.
  6. Добавьте 1 mL PBS. Центрифуга трубку до тех пор, пока скорость достигает 200 x g и затем остановить отжим. Удалите супернатант. Повторите PBS мыть, для в общей сложности двух стирок.
  7. Немедленно приступить к следующему шагу.

3. Подготовка островок диска (рис. 1)

  1. При первом использовании расплавить гель (например, Histogel) при 70 ° C и аликвоты в 1,5 мл отцентрифугировать трубы для длительного хранения. Аликвота объем не является критическим, поскольку аликвоты может быть повторно использован.
  2. Теплый гель (примерно 100 мкл на сэмпл) при 70 ° C, поместив отцентрифугировать трубка, содержащая Алиготе гель в блоке тепла, равным 70 ° C.
  3. Перевод агарозы синий бисер (10 мкл для каждого образца) на 1,5 мл чистого отцентрифугировать. Тщательно Ресуспензируйте бисер перед закупорить.
    Примечание: Синий бисер смешиваются с островков для оказания помощи в визуальной идентификации встроенных материала в кнопке агарозы и блоком парафина. Количество синий бисер используется не имеет решающее значение для результатов, но избежать чрезмерного бусины (> 5 x количество островков) для обеспечения оптимального распределения островков в разделах.
  4. Вымойте синий бисер с 1 мл PBS, дважды. Для каждой стирки отжима бусы 1 мин на 800 x g. После второго мыть Ресуспензируйте бусины в (n+ 2) x 10 мкл PBS, где n — количество образцов труб; например для 2 образец трубки, объем PBS для добавления бисера будет 40 мкл.
  5. Центрифуга отцентрифугировать трубка, содержащая островков (краткое спин-200 x g) и удалить большую часть супернатант. Отрезать кончик кончик микропипеткой 10 мкл с ножницами или ножом и 10 мкл бусы для каждого островка трубки, с использованием чистой подсказка для каждого образца. Не следует смешивать (чтобы избежать потери островков).
  6. Центрифуга островков и бусы (краткое спин-200 x g). Удалите столько PBS как можно с наконечником микропипеткой режиссерский 10 мкл.
  7. Ярлык Микроскоп слайды для идентификации образца. Два-три образцы могут быть подготовлены на каждом слайде. Место слайда на скамейке возле блока тепла с утепленным гель. Вырежьте советы трех-пяти 20 мкл низкой привязки микропипеткой советы на сэмпл с бритвой или ножницами. Загрузите два micropipettes P20 с сократить советы, чтобы позволить быстрый переход от одного к другому.
  8. Используя первый микропипеткой, добавьте 15-20 мкл теплый гель островков/бусы отцентрифугировать трубки; сразу смешать, избегая пузыри; и применять смесь жидких агар/островков/бусы на слайд в форме < диск диаметром 1 см. Поместите диск на краю слайда, оставляя пространство для кольца внешних гель (следующий шаг). Коснитесь слайда, нежно несколько раз урегулировать островков и бусины.
  9. С помощью второй микропипеткой, добавьте 20 мкл теплый гель образец трубки. С помощью первого микропипеткой, новый гель микс любые оставшиеся островки/бисером, повторно потепления в блоке тепла, если он начинает затвердеть, затем применить эту смесь к слайду, окружающих оригинальный диск. Повторите по мере необходимости, с использованием дополнительных нарезанные советы, пока диск не будет нужного размера и толщины.
    Примечание: Обработка загущенное диск упрощается, если внешнего кольца немного толще. Как правило 3 x 20 мкл геля является достаточным. Этот шаг минимизирует потери островков, трубка моет и добавляет островок плохой агарозы для внешнего диска для облегчения обработки диска.
  10. Подготовка каждого диска индивидуально и тщательно отслеживать заказа образца если размещение нескольких дисков на каждом слайде.
  11. Место слайды на плоской поверхности мокрого льда, с крышкой, 10 минут или до тех пор, пока гель затвердевает. Это более трудно сдвиньте диск у стекла, если она высыхает.
  12. Биопсия метка обработки/встраивание ткани кассеты с карандашом, один на сэмпл. Сухой задней части слайда, чтобы избежать смачивания голубой бумаге.
  13. Использование тупой край лезвия бритвы, аккуратно вставьте диск в каждом направлении, чтобы освободить его от стекла. Когда он скользит легко, медленно толкать диск от микроскопа на голубой бумаге ткани. Поместите диск плоской стороной вниз, прямо на бумаге.
  14. Сохранение на диск плоский, согните бумагу вокруг диска, чтобы предотвратить движение, поместите диск в бумаги в кассету и закрыть кассеты. Если диск не чисто соскальзывать стекла, добавить больше гель и/или возвращения на слайд, чтобы лед за несколько минут.
  15. Опускайте кассету в PBS в стакан. Процесс для парафина, встраивание в тот же день для оптимального морфологии.

4. парафин встраивание

Примечание: Процесс островок гель диски парафиновых блоков с помощью сокращенного обезвоживания серии, как описано ниже. Эта техника была оптимизирована с помощью автоматизированных процессора, но ручной обработки следует производить аналогичные результаты.

  1. Погружайте кассеты в 85% этанола на 15 минут.
  2. Погружайте кассеты в 95% этаноле на 15 минут.
  3. Погружайте кассеты в 100% этанола на 15 минут. Повторите дважды для в общей сложности три автомойки.
  4. Погружайте кассеты в ксилоле на 15 минут. Повторите дважды для в общей сложности три автомойки.
  5. Погружайте кассеты в расплавленный парафин для 10 минут.
  6. Трансфер кассеты свежий расплавленный парафин для 10-30 минут.
  7. Тщательно открыть кассету и развернуть голубой бумаге. Удалите диск гель, следить за плоскую поверхность, которая выступает на бумаге. Внедрить диск в малые формы, с плоской поверхности (островок содержащие) вниз, параллельно режущей поверхности. Для вилки тщательно удалить его из кассеты и вставлять его в небольшой плесень с наконечником, указывая на режущей поверхности.

5. Парафинотерапия секционирование и окрашивания

  1. Ярлык слайды последовательно, если требуются последовательные секции.
  2. Иметь 5 мкм парафиновых срезах сократить на опытных histotechnologist. Чтобы увеличить урожайность, сохраните все разделы, содержащие материал. Как правило сбор 20 секций позволяет захвата большинства материала.
  3. Хранить разделы при комнатной температуре. Секции поддаются обычной гистологические пятна (например, H & E) и иммунофлюоресценции (например, инсулина, глюкагона и DAPI). Оптимизируйте фиксации для других антигенов, в случае необходимости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Иллюстрированная схема шаги, чтобы подготовить диск гель показан на рисунке 1. Этот диск гель результаты метода в парафин разделы, которые содержат достаточное количество островков, распределенных в одной плоскости, чтобы позволить значимые количественная оценка результатов. Рисунок 2 показывает низкий увеличение изображения результате секций для иллюстрации количество островков, захвачен в каждой секции. В общем > 35 островков были видны в каждом разделе, когда 250 IEQ были использованы для процедуры, и > 10 секций (4-5 мкм), содержащих островки были получены от каждого образца. Увеличивая количество островков, используемых для процедуры увеличилось количество островков в разделах. Островки в разделах были структурно разнообразных и различных размеров, поддерживая концепцию, что новые и интересные данные могут быть получены с помощью секции, вместо того, чтобы методы слепой различия между островок. Метод работал одинаково хорошо для грызунов островков, изолированных в лаборатории (крысы, мыши) и для человека островков, полученных после отгрузки IIDP. Грызун островков было заметно больше нетронутыми морфологии после восстановления после изоляции на ночь в среде островок, с гладкой поверхностью округлые и компактный сферической формы(рис. 2). Морфология человека островок был похож, когда встроенные в день прибытия или внедренные после восстановления после отгрузки на ночь, возможно потому, что островки уже оправилась от стресса изоляции до отгрузки. Микропробирка метод принесли меньше площадь поперечного сечения ткани, с меньшим количеством островков в каждой секции и плотно упакованные островков и бусы (рис. 2B). Микропробирка изображения показан на рисунке 2B были лучшее, что мы смогли получить с помощью этого метода; один из образцов должны были быть отправлены обратно в вырезать больше разделов, потому что не островков были найдены в первом наборе разделов.

Этот метод создает высокое качество островок разделы для гистологического и иммунофлюоресценции, окрашивание (рис. 3). Инсулин и глюкагон пятнать показал разнообразный состав и гетерогенность архитектуры островок. Секции четко резюмировалась известных архитектура различия между человеком, мыши и крысы островков, с человека состоит из обильные α-клеток островков перемешан с бета-клеток, в то время как мыши и крысы островков показали сходную архитектуру с сердечник клетки бета и альфа-клетки на периферии. Серийный разделы были доступным; панели на рисунке 3 показывают серийный разделы же островок, витражи для H & E (слева) и иммунофлюоресценции (справа).

Figure 1
Рисунок 1 . Иллюстрация критических шагов для принятия гель диск островок. Гель нагретой до 70 ° C в блоке тепла (A) передается низкой привязки отцентрифугировать трубка, содержащая островок/шарик Пелле (B). Островки высокомобильна в теплый гель и переданы на стеклянное скольжение, распространяя материалы в форме диска (C-D). Дополнительные чистый гель передается отцентрифугировать трубки, а затем все оставшиеся материал удаляется и распространение окружности вокруг первоначального островок/шарик содержащие диска на слайде стекла (E-F). После гелеобразующего на льду, диск является переведенных, плоской стороной вниз, гистология бумаги (G), которая складывается и помещается в кассету (H) для обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2Разделы парафина гель дисков содержат большое количество хорошо распределенных островков. (A) малое увеличение панелей (40 X, 3 x 3 изображения сшитые вместе с 15% совпадения) мыши, крысы или человека островок секции окрашивали гематоксилином и показывают, что многие островков видны в каждом разделе. Высокое увеличение вставками (200 X) показывают представитель островков. Левой панели показывают разделы островков, встроенный сразу после изоляции (мыши, крысы) или отгрузки (человека); правой панели показывают островков, внедренные после ночи восстановления в культуре. Бледно синие круги, видели в 40 X образы являются бусины, включенных для визуализации во время внедрения и секционирование. Эти частности образцы являются C57BL/6Н мыши (1 год) и BBDR крыса (4 недель), островков, изолируются протоковой коллагеназы инъекций и Ficoll отделение и человека T2D островков, полученных от IIDP. (B) 250 IEQ человека островков, встроенных в старая техника отцентрифугировать трубки, для сравнения. Низкое увеличение панелей (40 X; единый распоротые образ захвачен весь материал) и высокой mag вставками (200 X) показывают представитель Секции. Культура средних был RPMI с 10% FBS, пенициллин/стрептомицина и глюкозы 5,5 ммоль/Л. Масштаб гистограммы для малое увеличение панелей являются 1000 мкм; Масштаб гистограммы для большого увеличения панелей являются 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Представитель гистохимические и иммунофлюоресценции, окрашивание по разделам серийный островок. Разделы мыши, крысы и человеческих островках внедренные после ночи культуры были витражи для H & E и образы brightfield микроскопии (200 X; слева). Смежные секции был витражи для (красный) инсулин, глюкагон (зеленый), смонтированные в DAPI-содержащих СМИ (синий) и образы с помощью флуоресцентной микроскопии (200 X, право). Масштаб бары: 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот измененный гель диск на основе внедрения метод обеспечивает простой, недорогой и эффективным способом для создания высокодоходных островков в каждой секции. Строительство гель диск на поверхности плоского стекла облегчает распространение островков в равномерное распределение более четко определенной области. Распространяя островков в плоский диск предлагает преимущество размещения много островков в плоскости сечения, оптимизации доходности и позволяет меньше островков, которые будут использоваться. Толщина диска можно скорректировать для нужд следователей. Поскольку можно получить несколько разделов, серийный разделы же островков могут быть проанализированы, увеличивая количество различных результатов, которые могут быть измерены на же экспериментальный образец. Хотя здесь, обеспечивающее панкреатических островков, техника может применяться другим низкой изобилие материал, в том числе с небольшими кусочками, рыхлые природы или вязких образцов, которые в противном случае будет трудно процесс. Этот метод оптимизирован для островков свежей исправлена и не была испытана для других видов материалов, таких как ранее замороженных островков. Эти разделы также может быть полезным для в situ гибридизация анализов для выявления ДНК или РНК. Добавление дополнительных геля служит двум целям: чтобы максимизировать островок сбора и защиты центра Иле богатые диск от нарушения во время обработки/передачи. Диск тонкий гель затвердевает быстро и позволяет сократить обезвоживания и ксилола инфильтрации шаги для встраивания парафин. Формирование диска на плоской поверхности, а не в вторичный контейнер (отцентрифугировать трубки или культуры пластины хорошо) делает его легче физически передачи диска на кассету для обработки. По сравнению с результатами диска техника, техника Микропробирка снижение урожайности островок и неравномерное распределение островок, хотя неплоских ткани договоренности может создать большее количество островок содержащих разделы.

Важнейшие шаги протокола включают ткани фиксации, формирование гель диска, парафин, внедрение и секционирование. В отношении фиксации как проверены H & E и иммунофлюоресценции для инсулин и глюкагон, никакой разницы был обнаружен между PFA и формалина или длительность фиксации, начиная от 10-30 минут (не показан). Однако фиксация интенсивность и продолжительность должна быть оптимизирована для нужд конечных пользователей. Основные инновации, содержащиеся в настоящем Протоколе, является подготовка геля островок диска; важнейшие шаги приводится на рисунке 1. Ключевые шаги включают в себя с помощью небольшого количества геля сконцентрировать ткани в небольшой области и формирование диска на ровной поверхности, чтобы организовать для разрезания тканей в одной плоскости. Использование низкой привязки отцентрифугировать труб и советы и размахивая ведро центрифуги для всех спинов улучшает ткани доходности; островки придерживаться пластика после фиксации. Добавление легко видны бусинки помогает диск формирования, внедрения и секционирование. Удаление столько PBS как можно, перед добавлением что гель имеет решающее значение, чтобы избежать разбавления агарозы, что приводит к плохой затвердевания и трудности перевода диска на бумаге. Сохраняя тонкий диск нетронутыми, когда раздвижные из стекла слайд на бумаге может быть сложным. Если в диск происходит морщин, позволяют ему вернуться в исходное положение, добавьте больше гель и повторно холод слайд. В отношении внедрения парафин, важно, что диск быть внедрены с плоским стороной вниз и параллельно плоскости резания. Histotechnologist опыт работы с резки парафиновых срезах имеет важное значение для успеха этой процедуры, так как материал сосредоточены на переднем крае блока. Чрезмерная облицовки офф блока может привести к потере образца. Рекомендуется начать сбор разделы, как только синий бисер видны.

Фиксация интенсивность и продолжительность должна быть оптимизирована для конкретных тканей и потребностей конечных пользователей. Количество островков, используемые в образце могут быть изменены по мере необходимости; Однако уменьшение исходного материала создает разделы с меньшим количеством островков. Толще или больших дисков можно создавать с помощью этого метода; обезвоживание и ксилол инфильтрации шаги может потребоваться быть удлинен и должны быть оптимизированы. Если результирующие секции содержат только частичный диск форму, рассмотрите возможность того, что диск не был внедрен параллельно режущей поверхности. Если слишком мало секций получаются, технолог может потеряли материал во время подготовки первоначальных блоков.

Этот метод создает разделы, содержащие фиксированные островок ткани и, таким образом, может использоваться только для гистологической исходов. Чтобы получить большое количество островков в каждой секции, 200-250 IEQ исходного материала был использован, которая является сложной задачей для создания для некоторых типов эксперимент. Высокое качество секции зависит от наличия опытных histotechnologist.

Способность генерировать 10 + разделов, содержащих много островков из одного экспериментального состояния позволит количественная оценка нескольких результатов на того же материала, повышение эффективности экспериментальных. Рутинной анализ нетронутыми островков может привести к успехи в понимании в гетерогенность ткани, не только на клеточном уровне, но и на уровне островок, о котором мало понимается в настоящее время. Применяя эту технику для других образцов Лимитед обилие тканей может предложить выгоды в других областях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов объявить.

Acknowledgments

Мы с благодарностью признаем группе бета клеток биологии на UMass диабет центр повышения квалификации для полезные советы и дискуссий. Человека панкреатических островков были предоставлены, финансируемых NIDDK комплексной островок распределения программы (IIDP) в город надежды. Эта работа финансировалась NIDDK/НИЗ: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) и Американской ассоциации диабета Грант #1-15-BS-003 (LCA) в сотрудничестве с орденом Амарант.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tube Norgen Bioteck Corp P/N 10113 
Ranin Classic Starter Kit ShopRanin 17008708
Ranin ClassicPipette PR-2 ShopRanin 17008648
Low Binding Tip (1000 μL) Genesee Scientific 24-430
Low Binding Tip (200 μL) Genesee Scientific 24-412
Low Binding Tip (20 μL) Genesee Scientific 24-404
Low Binding Tip (10 μL) Genesee Scientific 24-401
10% Formalin solution Sigma HT501128
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710-S
Heatblock VWR 949312
HistoGel Thermo Scientific HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel Bio-Rad 153-7301
Dulbecco's PBS Life technologies 14190-144
Tissue processing cassette Simport M492-10
Bio-Wraps Leica-Surgipath 3801090
Citadel 2000 tissue processor Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof Decon Laboratories, INC 2701
Xylene Fisher Chemical X5SK-4
Paraffin McCormick Scientific 39503002
Microtome Thermo-Shandon LLC Finesse ME+
Insulin antibody DAKO A0564
Glucagon antibody Sigma G2654
Fluoroshield with DAPI Sigma F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies Life technologies A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies Life technologies A11001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1, (2), 129-136 (2009).
  2. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2, (3), 135-145 (2010).
  3. Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
  4. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7, (3), (2018).
  5. Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125, (10), 3831-3846 (2015).
  6. Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65, (4), 981-995 (2016).
  7. Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64, (9), 3172-3181 (2015).
  8. Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53, (9), 1087-1097 (2005).
  9. Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24, (4), 710-715 (2012).
  10. Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, (1), 149-159 (2004).
  11. La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125, (4), 267-276 (2017).
  12. Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56, (7), 1792-1801 (2007).
  13. Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
Pазрешено внедрение для парафиновых срезах поджелудочной островок
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kong, Y., Ebrahimpour, P., Liu, Y., Yang, C., Alonso, L. C. Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections. J. Vis. Exp. (136), e57931, doi:10.3791/57931 (2018).More

Kong, Y., Ebrahimpour, P., Liu, Y., Yang, C., Alonso, L. C. Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections. J. Vis. Exp. (136), e57931, doi:10.3791/57931 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter