Summary
Ex vivo pankreas adacık çalışmalar diyabet araştırma için önemlidir. Onların yerli 3 boyutlu mimari kültürlü adacıkları çalışmaya varolan zaman alıcı, verimsiz ve az kullanılan tekniklerdir. Bu eser bütün kültürlü adacıkları yüksek kalitede parafin bölümleri oluşturmak için yeni, basit ve etkili bir yöntem açıklanır.
Abstract
İzole pankreas adacıkları kullanarak deneyler diyabet araştırma için önemlidir, ama adacıkları pahalı ve sınırlı bolluğu. Adacıkları karma hücre nüfus işlevi etkiler bir yapısal mimarisi içerir, ve insan adacıkları yaygın değişken hücre türü kompozisyon. Kültürlü adacıkları eğitim için geçerli sık kullanılan yöntemleri Moleküler çalışmalar bütün adacıkları, topaklanmasını farklı adacık hücre tipleri birlikte, veya mikroskopi veya adacık mimari engellemeden Moleküler çalışmalar dağınık adacık hücreleri üzerinde gerçekleştirilen içerir. Vivo adacık çalışmaları için parafin gömülü pankreas kesit yerel pankreas ortamında hücre özel sonuçları değerlendirmek için bir güçlü tekniktir. Eğitim sonrası kültür adacıkları parafin kesit tarafından çeşitli avantajları sunmak: birden çok sonuçlar aynı adacıkları (seri bölümleri kullanarak potansiyel olarak bile tam olarak aynı adacıkları,), hücre türüne özgü ölçümleri ve bakımı yerli tespiti adacık hücre-hücre ve hücre-terkedilemeyen etkileşimleri deneysel pozlama sırasında ve analiz için. Ancak, katıştırma için varolan teknikleri sonrası kültür verimsiz, zaman alıcı, malzeme kaybı eğilimli ve genellikle sonuçları miktarının için yararlı olması için yetersiz adacık numaraları bölümlerle üreten adacıkları izole. Klinik patoloji laboratuvar hücre block hazırlama olanakları ulaşılmaz ve temel araştırma laboratuarlar için pratik. Bölümleri sağlam verim ve dağıtım adacıklar oluşturur bir geliştirilmiş, Basitleştirilmiş tezgah üstü yöntem geliştirdik. Sabit adacıkları sıcak histolojik özel jel resuspended ve bir standart cam slayt üzerinde düz bir disk içine adacıkları bir düzlemde dağıtılır öyle ki pipetted. Standart su kaybı ve katıştırma sonra birden çok (10 +) 4-5 µm bölüm aynı adacık bloğundan kesilebilir. Bu yöntemi kullanarak, histolojik ve immünfloresan analizleri fare, sıçan ve insan adacıkları üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu kültürlü adacıkları gelen hücre türüne özgü, bozulmamış mimari sonuçlar değerlendirmek için etkili, ucuz, zaman kazandıran yaklaşımıdır.
Introduction
Pankreas adacıkları of Langerhans, insülin, dolaşan tek kaynağı diyabet eğitim araştırmacılar için kritik bir doku bulunur. Verilen herhangi bir organizma adacıkları değişken boyutu, hücre türü frekans ve mimari1,2,3var. Vivo yapısı ve endokrin hücre kompozisyon pankreas adacıkları çalışmaya geleneksel pankreas dokusu4,5kesit tarafından stratejisidir. Bu yana adacıkları toplam pankreas hücresel içeriği yalnızca küçük bir kısmını oluşturan, Moleküler çalışmalar izole adacıkları üzerinde gerçekleştirilir. Ex vivo adacık kültür deneyler, besin tepki testi gen modülasyon (transfection, iletim) veya deneysel tedaviler endokrin hücre hayatta kalma, yayılması ve işlev oransal mekanizmaları içine önemli fikir sağlamak 5 , 6.
Ex vivo adacık deneyler kez bütün adacıklar Moleküler çalışmalar veya histolojik veya moleküler çalışmalar monolayer5,6' yetiştirilen dağınık adacık hücre kullanarak analiz edilir. Moleküler analiz bütün adacıklar ciddi uyarı ne zaman herhangi bir tek hücre türüne yaygınlaştırılması yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlar doğurabilir intermixing hücre tiplerinin tanıtır. Hücre dağılımı sonrası kültür mikroskobu için coverslips üzerine hücre türüne özgü sonucu ölçüm verir, ancak yanıt-e doğru müdahale değiştirebilir ve mimari ile ilgili sonuçları tanımlaması engellemektedir adacık mimari bozan. Ayrıca, genellikle sadece tek bir sonuç ölçülebilir; Örneğin, beta hücre çoğalması ve beta hücre ölümü aynı koşullar altında ölçmek için iki ayrı deney gerçekleştirilmesi gerekir. Bu yaklaşımlar da arası adacık değişkenliği, bir alandaki artan ilgi alanı için kör vardır. Sıralama adacık hücreleri tarafından akış sitometresi hücre türüne özgü Moleküler çalışmalar veya tek hücre RNA çalışmaları için pahalı, zaman alıcı, limited tarafından doku bolluk, mimari ortadan kaldırılması ve rutin hücre kültür analizleri için uygun değil ama zarif 5 , 7. bütün-mount immunostained adacıklar confocal görüntüleme yüksek kalite mimari sağlam veri sağlar, ancak emek yoğun ve veri her örnekten elde edilen sonuçlara tek immunostaining8' olarak tanımlanabilir sınırlıdır.
Yüksek kalitede parafin kesitler sonrası kültür bütün adacıklar oluşturma yeteneği bu endişeleri çoğuna hitap. Yüksek maliyetli, düşük-bereket adacık doku benzersiz genetik modellerini veya insan organ bağış ya da adacıkları durum sonrası içinde VIVO veya vitro deneysel manipülasyon, değerli bulunur. Birden fazla parafin kesitler aynı adacıkları alma aynı deneyi üzerinden birden çok hücre türüne özgü, bozulmamış mimari analizleri sağlayacak.
Adacık granül kesit için oluşturmak için varolan kusurlu tekniklerdir. Histoloji optimize edilmiş özel işlem9' a zor olan küçük ya da parçalanmış doku örnekleri de dahil olmak üzere histolojik ve saytolojik örnekleri işlenirken kullanılan bir sulu düşük erime noktası jel olan. Bir adacık yaklaşım katıştırma adacıkları özel bir microcentrifuge tüp içinde askıya alma, malzeme cips, agar fiş almak sonra işlemek ve10,11kesit için embed için santrifüj kapasitesi etmektir. Katılaşmış örnek tüp alttan zaman alıcı ve zor, önde gelen örnek zaman zaman parçalanma ve kişisel yaralanma riski işlemdir. Adacıkları yetersiz adacık dağıtım bölümlerde bu yöntem elde edilen önde gelen fiş ipucunda yoğunlaşmıştır. Öyle ki bir adacık-yoksul bölgesi kesit için sunulabilir katıştırma fiş yuvarlak alt zorlaştırmaktadır. Genel olarak, bu yöntem düşük verim ve elde edilen bölümlerinde olmalı adacık dağıtım yol açar.
Bu yeni yöntem adacık bölümleri hazırlanması için Basitleştirilmiş ve geliştirilmiş bir yaklaşımdır. Adacıklar içinde küçük bir birim konsantre ve daha sonra tek bir düzlemde adacıkları ile küçük bir disk oluşturmak için mikroskop slayt pürüzsüz yüzeyi yerleştirilir. Histogel-adacık disk daha sonra kısaltılmış dehidratasyon ve Ksilen infiltrasyon Protokolü katıştırma parafin için işlenir. Microfuge tüp dibinde adacıkları konsantreleri, önceki yaklaşım, aynı zamanda bir karşılaştırma olarak yapılır. Bu yeni teknik adacıkları bölüm, her bölümde adacıkları dağıtımını başına verimi artırır ve adacık blok kaset aktarmak için daha az zaman alır. Bu teknik adacık biyologlar için yararlıdır veya yerel doku yapısı tek bir örneğinde birden çok sonuçlar ölçerek düşük-bereket dokusunun üretken en üst düzeye çıkarmak isteyen doku parçaları okuyan diğer bilim adamları kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm yordamları UMass tıbbi okul kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi. İnsan adacık çalışmalar UMass kurumsal İnceleme Kurulu tarafından insan denekler kullanımını karıştırmayın çünkü IRB gözden geçirme veya muafiyet için değil hak kazanmak için belirlenmiştir.
1. adacık yalıtım ve kültür
- Adacıkları yalıtmak ve kendi seçtiğiniz yöntemi kullanarak ekzokrin ve duktal doku bulaşıcı ayrı.
Not: Bu yöntem collagenase duktal üfleme ve Ficoll ayrılık12 (kemirgen) veya sonrası sevk irsaliyesi adacıkları entegre adacık dağıtım programı (IIDP13; insan) tarafından izole adacıkları kullanarak optimize edildi. Adacıkları P200 micropipette ile seçilmiş. - Adacık morfoloji en iyi duruma getirmek için adacıkları gecede 10 mL tam adacık Orta (RPMI %10 FBS, penisilin/streptomisin ve 5.5 mmol/L glikoz) içeren % 5 CO2 37 ° C'de bir oksijen odasında kurtarmak izin Bu adımı bölümler elde etmek için gerekli değildir, ancak adacıkları sonra bir iyileşme döneminde daha sağlam (bkz. Şekil 2).
2. adacık fiksasyon
- Düşük-bağlama P200 ipucu kullanarak, bir kalibre edilmiş bir 1,5 mL düşük bağlama microfuge tüp içine bir stereomicroscope altında kullanılması yaklaşık 250 adacık eşdeğerleri (IEQ)13 futbolla. Düşük-bağlama ipuçları ve tüpler adacık kaybını azaltmak.
- Adacıkları microfuge tüp altına yerleşmek izin verir. Çoğu süpernatant ile herhangi bir adacıkları değil çıkarmak için dikkat çekici bir P200 damlalıklı ipucu kaldırın.
- PBS 1 mL ekleyin. Hızı 200 x g ulaşıncaya kadar sallanan bir kova santrifüj tüpü santrifüj kapasitesi ve spin durdurmak. Süpernatant kaldırın. PBS yıkama, iki yıkar toplam için yineleyin.
- 500 µL % 10 formalin çözüm veya taze yapılmış % 4 paraformaldehyde ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca düzeltmek. Bu yöntemde test edilen sonuçlar için bu fiksasyon Yöntemler ayırt edilemez. Daha kısa fiksasyon da mümkün olabilir; Bu fiksasyon süresi için istenen sonucu en iyi duruma getirmek için tavsiye edilir.
- Sabitleştirici P200 bahşiş ile kaldırın.
- PBS 1 mL ekleyin. Hızı 200 x g ulaşıncaya kadar tüp santrifüj kapasitesi ve spin durdurmak. Süpernatant kaldırın. PBS yıkama, iki yıkar toplam için yineleyin.
- Hemen bir sonraki adıma geçin.
3. adacık disk (Şekil 1) hazırlanması
- İlk kullanımda, 70 ° c (Örneğin, Histogel) jel eritin ve aliquots 1.5 mL microfuge tüpler uzun süreli depolama için yapmak. Aliquots yeniden kullanılmış olabilir bu yana aliquot birim önemli değildir.
- 70 ° c (örnek başına yaklaşık 100 µL) jel microfuge tüp jel aliquot 70 ° C'ye ayarla ısı taşını içeren yerleştirerek sıcak
- Özel mavi boncuk (her örnek için 10 µL) 1,5 mL temiz microfuge tüp içine aktarın. İyice boncuk pipetting önce resuspend.
Not: Mavi boncuk özel düğme ve parafin blok katıştırılmış malzemenin görsel tanımlama yardımcı olan adacıkları ile karıştırılır. Mavi boncuk kullanılan sayısı sonucu için kritik değildir, ancak aşırı boncuk önlemek (> 5 x adacıkları sayısı) adacıkları bölümlerde en uygun dağıtımına olanak tanımak için. - Mavi boncuk ile 1 mL PBS, iki kez yıkayın. Her yıkama için boncuk vasıl 800 x g 1 dk spin. Sonra ikinci yıkama, x 10 µL PBS, burada n örnek tüpler sayısıdır (n+ 2) boncuk resuspend; Örneğin, 2 örnek tüpler için 40 µL boncuk için eklemek için PBS birim olacaktır.
- Adacıkları (200 x g için kısa spin) içeren microfuge tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant çoğunu kaldırın. 10 µL micropipette İpucu İpucu off makas ya da bıçak ile kesme ve her örnek için temiz bir ipucu kullanarak her adacık tüp boncuk 10 µL ekleyin. (Adacıkları kaybetmemek için) birlikte kullanmayın.
- Adacıkları ve boncuk (200 x g için kısa spin) santrifüj kapasitesi. Bir kesilmemiş 10 µL micropipette ucu ile mümkün olduğu kadar PBS kaldırın.
- Mikroskop slayt örnek kimliği için etiket. İki ya da üç örnekleri her slaytta hazırlanabilir. Yer ısıtılan jel ile ısı blok yakındaki bankta slayt. 3-5 İpuçları 20 µL düşük bağlama micropipette ipuçları bir jilet veya makas ile örnek başına kesti. İki P20 Mikropipetler birinden diğerine geçiş hızlı izin vermek için kesme ipuçları ile yükleyin.
- İlk micropipette kullanarak, 15-20 µL sıcak jel adacıkları/boncuk microfuge tüp ekleyin; Hemen mix, bubbles kaçınmak; ve forma slayt sıvı agar/adacıkları/boncuk karışımı uygulamak bir < 1 cm çapında yuvarlak yüzey. Dış jel yüzük için alan bırakarak slaydın kenarına yakın belgili tanımlık yuvarlak yüzey yer (sonraki adım). Slayt adacıkları ve boncuk yerleşmek için bir kaç kez hafifçe dokunun.
- İkinci bir micropipette kullanarak, sıcak jel 20 µL örnek tüp ekleyin. İlk micropipette, mix yeni jel kuvvetlendirmek başlarsa ısı bloğunda yeniden ısınma herhangi bir kalan adacıkları/boncuk ile kullanarak bu karışımı orijinal disk çevreleyen Slayta Uygula. Gerektiğinde ek önceden kesilmiş ipuçları, disk istenen boyutu ve kalınlığı kadar kullanarak yineleyin.
Not: dış halka biraz daha kalın ise genellikle disk kullanımı kolaydır. Genellikle, 3 x 20 µL jel yeterli olur. Bu adım tüp yıkama tarafından adacıkları kaybı en aza indirir ve adacık-yoksul özel disk işleme kolaylaştırmak için disk dışarı doğru ekler. - Tek tek her diski hazırlamak ve dikkatli örnek sipariş çoklu diskler her slayta yerleştirerek Eğer takip.
- 10 dakika veya jel katılaşır kadar düz bir yüzeye bir kapak ile ıslak buz slaytları yerleştirin. O kurur Eğer kapalı cam disk slayt daha zordur.
- Etiket biyopsi işleme/doku kaset kalem, örnek başına bir ile gömme. Mavi kağıt ıslatma önlemek için slaytın arkasına kuru.
- Künt kenarına bir jilet kullanarak, yavaşça diski camı ücretsiz için her yönde itin. Kolayca slayt, yavaş yavaş disk mavi doku kağıt üzerine mikroskop slayttan itin. Diski, düz tarafı, doğrudan kağıt üzerine yerleştirin.
- Belgili tanımlık yuvarlak yüzey düz tutmak, hareket önlemek, katlanmış kağıt kasedi diski yerleştirin ve kaseti kapatmak için diskin çevresinde kağıt katlama. Belgili tanımlık yuvarlak yüzey temiz bir şekilde cam slayt değil, daha fazla jel eklemek ve/veya bir kaç dakika daha buz slayt dönmek.
- PBS bir ölçek kasete daldırın. Aynı gün için en uygun morfoloji katıştırma parafin işlemde.
4. parafin katıştırma
Not: İşlem adacık jel parafin blok aşağıda açıklandığı gibi bir kısaltılmış dehidratasyon serisi kullanarak diskleri. Bu teknik bir otomatik işlemci kullanarak optimize edildi, ancak el ile işleme benzer sonuçlar üretmesi gerekir.
- Kaset % 85 etanol içinde 15 dakika bırakın.
- Kaset % 95 etanol içinde 15 dakika bırakın.
- Kaset % 100 etanol içinde 15 dakika bırakın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın.
- Kaset ksilen içinde 15 dakika bırakın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın.
- Kaset içinde erimiş parafin 10 dakika bırakın.
- Kaset için taze erimiş parafin 10-30 dakika aktarın.
- Dikkatle kaset açın ve mavi kağıt paketini açmak. Edildi karşı düz kağıdın yüzeye takip edilmesi jel diski çıkarın. Disk aşağı, paralel olarak kesme yüzeyi düz (adacık içeren) yüzeyi ile küçük bir kalıp içine embed. Fişi için dikkatle kaset kaldırmak ve doğru kesme yüzeyi işaret ucu küçük bir kalıp içine embed.
5. parafin kesit ve boyama
- Seri bölümler gerekiyorsa slaytlar ardışık olarak etiketleyin.
- Deneyimli bir histotechnologist tarafından kesilmiş 5 µm parafin bölümü vardır. Verimi en üst düzeye çıkarmak için malzeme içeren tüm bölümler kaydedin. Genel olarak, 20 bölüm toplama malzeme çoğunun yakalama sağlar.
- Bölümler, oda sıcaklığında saklayın. Bölümler rutin histolojik lekeleri (örn., H & E) ve (Örneğin, insülin, glukagon ve DAPI) ayirt mükellef bulunmaktadır. Fiksasyon diğer antijenleri için optimize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jel disk hazırlamak için adımlar resimli bir şematik resim 1' de gösterilen. Bu jel disk yöntemi sonuçları sonuçlar anlamlı miktar izin vermek için tek bir düzlemde dağıtılmış adacıkları yeterli sayıda içeren parafin bölümlerde yer. Şekil 2 bölüm başına yakalanan adacıkları sayısını göstermek için elde edilen bölümlerin düşük-büyütme görüntüleri gösterir. Genel olarak, > 35 adacıkları görünür her bölümünde 250 IEQ kullanılmıştır zaman yordamı için ve > adacıkları içeren 10 bölümler (4-5 µm) her örnekten elde. Yordam için kullanılan adacıkları artırıldığında adacıkları bölümlerde yer sayısı arttı. Ve bu yeni kavramı destekleyen farklı boyutlarda yapısal olarak farklı bölümlerde adacıkları ve veri ilginç teknikleri arası adacık farklılıklar kör yerine bölümler kullanılarak elde edilebilir. Belgili tanımlık yöntem amele aynı derecede de kemirgen adacıkları laboratuvarında (sıçan, fare) ve sevk irsaliyesi sonra tarafından IIDP alınan insan adacıkları için izole için. Sonra sonrası yalıtım kurtarma adacık orta, pürüzsüz bir yuvarlak yüzey ile bir gecede ve küresel şekli (Şekil 2A) kompakt kemirgen adacıkları belirgin bir şekilde daha fazla olduğu gibi kara delik vardı. İnsan adacık morfoloji varış gününde katıştırılmış veya adacıkları yalıtım stres sevkiyat öncesinde zaten kurtarıldı çünkü sonrası sevk irsaliyesi kurtarma sonra bir gecede, belki gömülü benzer. Microtube yöntemi bölüm, başına daha az adacıkları ile daha küçük doku bir kesit alanı vermiştir ve yoğun adacıkları ve boncuk (Şekil 2B) dolu. Şekil 2'B deki microtube görüntüleri en iyi biz bu yöntemle elde edebildik vardı; hiçbir adacıkları bölümleri ilk kümesi içinde bulunduğundan daha fazla bölümleri geri kesmek için gönderilmek üzere örnekleri vardı.
Bu teknik için yüksek kaliteli adacık bölümleri oluşturur histolojik ve ayirt boyama (Şekil 3). İnsülin ve glukagon boyama çeşitli kompozisyon ve heterojenlik adacık mimarisinin gösterdi. Bölümleri açıkça bilinen mimari farklılıklar recapitulated fare ve sıçan adacıkları beta hücre çekirdeği ile benzer mimari gösterdi, ancak beta hücreleri ile fare ve sıçan adacıkları, bol α-hücreleri oluşan insan adacıkları ile insan arasında iç içe ve çevre Alfa hücreleri. Seri bölümler elde edilebilecek; Şekil 3 panellerinde aynı H için lekeli adacık & E (solda) ve ayirt (sağda) seri bölümlerini göster.
Resim 1 . Kritik adımlar adacık jel disk yapmak için Illustration. Jel ısındı 70 ° c (A) (B)adacık/boncuk Pelet içeren düşük bağlama microfuge tüp transfer bir ısı blok içinde. Adacıkları sıcak jel resuspended ve malzeme (C-D)bir disk şeklinde yayılan bir cam slayt aktarılır. Ek temiz jel microfuge tüp aktarılır, sonra tüm kalan malzeme kaldırılır ve çepeçevre ilk adacık/boncuk-içeren disk üzerinde cam slayt (E-F)etrafında yayılmış. Buz üstünde uyuyor sonra disk transfer edilen, düz aşağı, Histoloji kağıt (G), ve işleme için bir kaset (H) yerleştirilen katlanıp takımıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Çok sayıda iyi dağıtılmış adacıkları parafin bölümleri jel disk içerir. (A) düşük büyütme panelleri (40 X, 3 x 3 görüntüleri birlikte, % 15 örtüşme ile dikişli) fare, sıçan ve insan adacık kısımlara H & E ile lekeli birçok adacıkları her bölümünde görünür olduğunu göstermektedir. Yüksek büyütme insets (200 X) temsilcisi adacıkları göster. Sol kapı aynası yalıtım (fare, sıçan) veya sevk irsaliyesi (insan); hemen sonra gömülü adacıkları bölümlerini göster doğru kapı aynası gecede kurtarma sonra kültür içinde gömülü adacıkları göster. 40 X imge içinde görülen soluk mavi daireler için gömme ve kesit sırasında görselleştirme dahil boncuk vardır. Belirli bu örneklerde C57BL/6N fare (1 yaşında) ve BBDR sıçan (4 hafta) duktal collagenase enjeksiyon ve Ficoll ayırma tarafından izole adacıkları ve IIDP alınan insan T2D adacıkları vardır. (B) 250 IEQ insan adacıkları karşılaştırma için eski microfuge tüp tekniği başına gömülü. Düşük büyütme panelleri (40 X; tek bir unstitched görüntü yakalanan tüm malzeme) ve yüksek mag insets (200 X) temsilcisi bölümleri göster. Kültür orta RPMI %10 FBS, penisilin/streptomisin ve 5.5 mmol/L glikoz vardı. Ölçek çubukları düşük büyütme panelleri için 1000 µm vardır; ölçek çubukları yüksek büyütme panelleri için çoğu 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Temsilcisi histochemical ve seri adacık bölümler üzerinde boyama ayirt. Bölümleri fare, sıçan ve insan adacıkları gömülü sonra gecede kültür H & E için lekeli ve tarafından aydınlık alan mikroskobu görüntüsü (200 X; sol). Bitişik bir bölümü (kırmızı) insülin, glukagon için DAPI içeren ortam (mavi) takılı ve floresan mikroskopi kullanarak yansıma (yeşil), lekeli (200 X; sağ). Ölçek çubukları: 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Değiştirilen Bu jel disk tabanlı Gömme yöntemi basit, ucuz ve yüksek bir verim adacıklar bölüm başına oluşturmak için verimli şekilde sağlar. Jel disk düz cam yüzey üzerinde inşa bile bir dağıtım Yayilim adacıkları iyi tanımlanmış bir alana kolaylaştırır. Düz a yuvarlak yüzey içinde adacıkları yayılan birçok adacıkları bölüm düzlemde yerleştirerek, verim en iyi duruma getirme ve daha az adacıkları kullanılmak üzere izin avantajı sunuyor. Disk kalınlığı müfettişler ihtiyaçlarını karşılamak için ayarlanabilir. Birden çok bölüm elde edilebilir beri aynı adacıklar seri bölümler, aynı deneysel örnek üzerinde ölçülebilir farklı sonuçlar artırıldığında analiz edilebilir. Her ne kadar burada pankreas adacıkları için en iyi duruma getirilmiş, tekniği ile küçük parçalar, kayrak doğa ya da aksi durumda işlem için zor olacak viskoz örnekleri de dahil olmak üzere diğer düşük-bereket malzeme uygulanabilir. Bu yöntem taze-sabit adacıkları için en iyi duruma getirilmiş ve daha önce dondurulmuş adacıkları gibi malzeme diğer türleri için test edilmemiştir. Bu bölümler de DNA veya RNA algılamaya in situ hibridizasyon deneyleri için yararlı olabilir. Ekstra jel ilavesi iki amaca hizmet eder: adacık koleksiyonu en üst düzeye çıkarmak ve bozulma işleme/aktarma sırasında adacık zengini disk Merkezi korumak için. İnce jel disk çabuk katılaşır ve kısaltılmış dehidratasyon ve Ksilen parafin gömmek için infiltrasyon adımları sağlar. Düz bir yüzey yerine ikincil kap (microfuge tüp veya kültür plaka iyi) içinde belgili tanımlık yuvarlak yüzey oluşturan fiziksel disk kaseti işlemek için transfer etmek için kolaylaştırır. Disk tekniği sonuçları ile karşılaştırıldığında, microtube teknik adacık verim azalır ve clumped adacık dağıtım, her ne kadar sigara düzlemsel doku düzenleme adacık içeren daha yüksek bir sayı üretebilir bölümler.
İletişim kuralının kritik adımlar doku fiksasyon, jel disk, gömme ve kesit parafin oluşumu içerir. Fiksasyon ile ilgili olarak H & E ve insülin ve glukagon, ayirt test PFA ve formalin veya fiksasyon süresi 10-30 dakika (gösterilmez) arasında değişen arasında hiçbir fark algılandı. Ancak, fiksasyon şiddeti ve süresi son kullanıcı ihtiyaçları için optimize edilmelidir. Bu iletişim kuralında yer alan asıl yeniliktir jel adacık disk hazırlanması; kritik adımlar Şekil 1' de özetlenmiştir. Doku küçük bir alanda konsantre jel küçük bir birim için ve tek bir uçağı dokusunda kesit için düzenlemek için düz bir yüzeye diski oluşturan anahtar adımlar içerir. Düşük-bağlama microfuge tüpler ve ipuçları ve tüm spin için sallanan bir kova santrifüj kullanımı doku verimi artırır; adacıkları fiksasyon sonra plastik için sopa. Ayrıca kolayca görünür boncuk gömme ve kesit disk oluşumu ile yardımcı olur. Mümkün olduğu kadar PBS jel özel sulandrarak önlemek için önemlidir eklemeden önce kaldırma, hangi zavallı katılaşma ve kağıt için disk aktarma zorluk yol açar. Kağıt için cam slayttan sürgülü zor olabilir iken ince disk olduğu gibi tutmak. Diski bir sorun ortaya çıkarsa, başlangıçtaki konumuna döndürmek, daha jöle ekleyin ve slaydı yeniden chill izin verir. Parafin gömme ile ilgili olarak, disk düz tarafı aşağı ve kesme düzlemi paralel gömülü olması önemlidir. Malzeme blok öncü konsantre olduğundan parafin kesitler kesme ile deneyimli bir histotechnologist bu yordamı başarısı için önemlidir. Blok uzakta-in aşırı bakan örnek kaybına yol açabilir. Bu bölümler en kısa zamanda mavi boncuk görülebilir toplamaya başlamak için tavsiye edilir.
Fiksasyon şiddeti ve süresi son kullanıcının belirli doku ve ihtiyaçları için optimize edilmelidir. Örnek kullanılan adacıkları sayısı gerekirse değiştirilebilir; Ancak, Başlangıç materyali azaltarak daha az adacıkları ile bölümleri oluşturur. Kalın veya daha büyük diskler bu tekniği kullanarak oluşturulabilir; dehidratasyon ve Ksilen infiltrasyon adımları uzamış gerekebilir ve optimize edilmelidir. Elde edilen bölümler yalnızca kısmi disk şekli içerir, paralel olarak kesme yüzeyi disk değildi olasılığı gömülü göz önünde bulundurun. Çok az bölümleri aldıysanız, teknoloji malzeme ilk blok hazırlık sırasında kaybetmiş olabilirim.
Bu yöntem sabit adacık doku içeren bölümler oluşturur ve bu nedenle, yalnızca histolojik sonuçlar için kullanılabilir. Çok sayıda adacıkları bölüm, 200-250 IEQ başına elde etmek için malzeme başlayan, hangi zordur bazı deney türleri için oluşturmak için kullanılan. Yüksek kaliteli bölümler deneyimli bir histotechnologist sahip bağlıdır.
Tek bir deneysel durum birçok adacıkları içeren 10 + bölümler oluşturma yeteneği miktar birden çok sonuçlar deneysel etkinliğini artırma aynı malzeme üzerinde izin verir. Sağlam adacıklar rutin analiz doku heterojenite, hücresel düzeyde, hem de adacık düzeyinde hakkında hangi az şu anda anlaşılmaktadır anlamada önemli ilerlemeler neden olabilir. Bu teknik diğer limited-bereket doku örnekleri uygulayarak faydaları diğer alanlara de sunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Beta hücre biyolojisi grubu UMass diyabet Center of Excellence yararlı tavsiye ve tartışmalar için minnetle anıyoruz. İnsan pankreas adacıkları tarafından NIDDK tarafından finanse edilen entegre adacık dağıtım programı (IIDP) umut şehir temin edilmiştir. Bu eser NIH/NIDDK tarafından finanse edildi: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) ve Amerikan Diyabet Derneği tarafından Amaranth sırasını ile işbirliği içinde #1-15-BS-003 (LCA) verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
