Summary
Ex vivo अग्नाशय टाप अध्ययन मधुमेह अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं । मौजूदा तकनीक अपने मूल 3 आयामी वास्तुकला में संस्कृतिपूर्ण टाप का अध्ययन करने के लिए समय लेने वाले हैं, अक्षम है, और अक्सर इस्तेमाल किया । यह काम पूरे कल्चरल टाप के उच्च गुणवत्ता वाले आयल वर्गों को पैदा करने के लिए एक नई, सरल और कुशल विधि का वर्णन करता है ।
Abstract
अलग अग्नाशय के टाप का उपयोग प्रयोगों मधुमेह अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन टाप महंगा और सीमित बहुतायत के होते हैं । टाप एक संरचित वास्तुकला में एक मिश्रित कोशिका जनसंख्या होते है कि प्रभाव समारोह, और मानव टाप सेल प्रकार संरचना में व्यापक रूप से चर रहे हैं । वर्तमान में अक्सर इस्तेमाल किया विधियों का अध्ययन करने के लिए प्रसंस्कृत टाप में पूरे टाप पर प्रदर्शन आणविक अध्ययन शामिल हैं, लादू असमान टाप सेल प्रकार एक साथ, या माइक्रोस्कोपी या आणविक अध्ययन फैलाया टाप कोशिकाओं पर, टाप वास्तुकला में खलल डालना. वीवो टाप स्टडीज में के लिए, आयल-एंबेडेड अग्ंयाशय खंड एक शक्तिशाली तकनीक देशी अग्नाशय के वातावरण में कोशिका विशिष्ट परिणामों का आकलन है । के बाद अध्ययन के तेल अनुभागीकरण द्वारा संस्कृति टाप कई लाभ की पेशकश करेगा: एक ही टाप पर एकाधिक परिणामों का पता लगाने (संभवतः भी सटीक-एक ही टाप, धारावाहिक वर्गों का उपयोग), सेल-प्रकार-विशिष्ट माप, और बनाए रखने देशी दोनों प्रयोगात्मक जोखिम के दौरान और विश्लेषण के लिए टाप सेल-सेल और सेल-बुनियाद बातचीत । हालांकि, अलग टाप पोस्ट संस्कृति embedding के लिए मौजूदा तकनीक अक्षम हैं, समय लगता है, सामग्री के नुकसान की संभावना है, और आम तौर पर अपर्याप्त टाप संख्या के साथ वर्गों का उत्पादन परिणामों को बढ़ाता है के लिए उपयोगी हो । नैदानिक पैथोलॉजी प्रयोगशाला सेल ब्लॉक तैयारी सुविधाएं दुर्गम और बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए अव्यावहारिक हैं । हम एक बेहतर विकसित की है, बेंच-टॉप विधि सरलीकृत कि मजबूत उपज और टाप के वितरण के साथ वर्गों उत्पंन करता है । फिक्स्ड टाप गर्म ऊतकवैज्ञानिक agarose जेल और pipetted में एक मानक गिलास स्लाइड पर एक फ्लैट डिस्क में reसस्पैंड कर रहे हैं, इस तरह है कि एक विमान में टाप वितरित कर रहे हैं । मानक निर्जलीकरण और embedding के बाद, एकाधिक (10 +) 4-5 µm वर्गों को एक ही टाप ब्लॉक से काटा जा सकता है । इस विधि का प्रयोग, ऊतकवैज्ञानिक और immunofluorescent विश्लेषण माउस, चूहा, और मानव टाप पर किया जा सकता है । यह एक प्रभावी, सस्ती, समय बचाने के लिए प्रसंस्कृत टाप से सेल प्रकार विशेष, बरकरार वास्तुकला परिणामों का आकलन दृष्टिकोण है ।
Introduction
अग्नाशय के आइलेट्स के टाप, परिसंचारी इंसुलिन का एकमात्र स्रोत, मधुमेह का अध्ययन कर रहे जांचकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण ऊतक हैं । किसी भी जीव से, टाप चर आकार, कोशिका प्रकार आवृत्ति, और वास्तुकला1,2,3है । vivo संरचना में अध्ययन करने के लिए पारंपरिक रणनीति और अग्नाशय के अंत में सेल संरचना के टाप अग्न्याशय ऊतक4,5द्वारा है । चूंकि टाप केवल कुल अग्नाशय सेलुलर सामग्री का एक छोटा सा अंश शामिल हैं, आणविक अध्ययन पृथक टाप पर प्रदर्शन कर रहे हैं । पूर्व विवो टाप कल्चरल प्रयोग परीक्षण पोषक तत्वों, जीन मॉडुलन (अभिकर्मक, transduction), या प्रयोगात्मक उपचार के लिए प्रतिक्रिया अंत में स्रावी सेल अस्तित्व, प्रसार, और समारोह मॉडुलन तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान 5 , 6.
Ex वीवो टाप प्रयोगों में प्रायः पूरे टाप या ऊतकवैज्ञानिक या monolayer५,६में उगाई गई टाप कोशिकाओं के आणविक अध्ययनों का आणविक अध्ययन का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है. पूरे टाप के आणविक विश्लेषण के लिए मिश्रण कोशिका प्रकार है, जो झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मक परिणाम जब किसी भी व्यक्ति को सेल प्रकार के लिए extrapolated उत्पादन कर सकते है की गंभीर चेतावनी परिचय । पद के लिए coverslips पर सेल फैलाव-संस्कृति माइक्रोस्कोपी सेल प्रकार के विशिष्ट परिणाम माप की अनुमति देता है, लेकिन बाधित टाप वास्तुकला, जो हस्तक्षेप और वास्तुकला से संबंधित परिणामों की precludes पहचान के लिए प्रतिक्रिया को बदल सकता है । इसके अलावा, आम तौर पर केवल एक ही परिणाम मापा जा सकता है; उदाहरण के लिए, बीटा सेल प्रसार और एक ही स्थिति के तहत बीटा सेल मौत को मापने के लिए, दो अलग प्रयोगों प्रदर्शन करने की आवश्यकता है । इन दृष्टिकोण भी अंतर-टाप परिवर्तनशीलता, क्षेत्र में रुचि बढ़ाने का एक क्षेत्र के लिए अंधा कर रहे हैं । सेल-प्रकार विशिष्ट आणविक अध्ययन, या एकल सेल आरएनए अध्ययन के लिए प्रवाह cytometry द्वारा टाप कोशिकाओं छंटाई सुरुचिपूर्ण लेकिन महंगा, समय लेने, ऊतक बहुतायत, वास्तुकला-उंमूलन द्वारा सीमित हैं, और नियमित सेल संस्कृति के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं 5 , 7. पूरे माउंट immunostained टाप के फोकल इमेजिंग उच्च गुणवत्ता बरकरार वास्तुकला डेटा प्रदान करता है, लेकिन श्रम गहन है, और डेटा प्रत्येक नमूने से प्राप्त एक एकल immunostaining8में पहचाने परिणामों तक ही सीमित है ।
पद-संस्कृति पूरे टाप के उच्च गुणवत्ता वाले तेल वर्गों उत्पंन करने की क्षमता इन चिंताओं के कई पते होंगे । उच्च लागत, कम बहुतायत अद्वितीय आनुवंशिक मॉडल से या मानव अंग दाताओं से टाप ऊतक, या टाप स्थिति पोस्ट vivo या इन विट्रो में प्रयोगात्मक हेरफेर, कीमती हैं । एक ही टाप से एकाधिक आयल सेक्शन प्राप्त करने से एक ही प्रयोग से कई सेल-प्रकार के विशिष्ट, अक्षुण्ण-वास्तुकला विश्लेषणों की अनुमति मिलेगी ।
मौजूदा तकनीक खंड के लिए टाप छर्रों उत्पंन करने के लिए अपूर्ण हैं । प्रोटोकॉल-अनुकूलित agarose एक जलीय कम पिघलने बिंदु जेल है कि व्यापक रूप से प्रसंस्करण ऊतकवैज्ञानिक और छोटे या खंडित ऊतक नमूने है कि9प्रक्रिया के लिए मुश्किल है सहित कोशिकाविज्ञान नमूनों में प्रयोग किया जाता है । एक टाप embedding दृष्टिकोण एक microcentrifuge ट्यूब में agarose में टाप को निलंबित करने के लिए है, सामग्री गोली करने के लिए, आगर प्लग पुनः प्राप्त, फिर प्रक्रिया और10,11के लिए एंबेड करने के लिए । ट्यूब के नीचे से जम नमूना निकालने समय लेने और मुश्किल है, नमूना और व्यक्तिगत चोट के जोखिम के सामयिक विखंडन के लिए अग्रणी है । टाप प्लग की नोक में केंद्रित कर रहे हैं, इस पद्धति से प्राप्त वर्गों में अपर्याप्त टाप वितरण करने के लिए अग्रणी । प्लग के गोल नीचे embedding पेचीदा है कि एक टाप-गरीब क्षेत्र के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है । कुल मिलाकर, इस विधि के परिणामस्वरूप वर्गों में कम उपज और झुरमुट टाप वितरण की ओर जाता है.
इस नई विधि टाप सेक्शन की तैयारी के लिए एक सरलीकृत और बेहतर दृष्टिकोण है । टाप एक छोटी मात्रा में केंद्रित कर रहे है और फिर एक खुर्दबीन स्लाइड की चिकनी सतह पर रखा एक छोटी सी डिस्क के रूप में, एक एकल विमान में टाप के साथ । Histogel-टाप डिस्क बाद में एक छोटा निर्जलीकरण और xylene घुसपैठ प्रोटोकॉल में तेल embedding के लिए कार्रवाई की है । पिछले दृष्टिकोण, जो एक microfuge ट्यूब के तल में टाप ध्यान केंद्रित है, यह भी एक तुलना के रूप में किया जाता है । इस नई तकनीक से प्रति सेक्शन टाप की उपज में सुधार होता है, प्रत्येक सेक्शन में टाप का वितरण होता है, और टाप ब्लॉक्स को कैसेट्स के हस्तांतरण में कम समय लगता है. इस तकनीक को टाप जीव या अंय वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी है अपने मूल ऊतक वास्तुकला में एक नमूना पर कई परिणामों को मापने के द्वारा एक कम बहुतायत ऊतक के उत्पादक उपयोग को अधिकतम करने के इच्छुक ऊतक के छोटे टुकड़े का अध्ययन ।
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Protocol
सभी पशुओं को शामिल प्रक्रियाओं UMass मेडिकल स्कूल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । मानव टाप स्टडीज UMass संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा आईआरबी की समीक्षा या छूट के योग्य नहीं होने के कारण निर्धारित किए गए थे क्योंकि उनमें मानव विषयों का उपयोग शामिल नहीं है ।
1. टाप अलगाव और संस्कृति
- अलग-अलग टाप और अपनी पसंद की विधि का उपयोग कर exocrine और डक्टर ऊतक को दूषित करने से पृथक करें ।
नोट: इस विधि को एकीकृत टाप डिस्ट्रीब्यूशन प्रोग्राम (IIDP13; मानव) से collagenase डक्टर सांस और Ficoll पृथक्करण12 (कुतर) या पोस्ट-शिपमेंट टाप से पृथक किए गए टाप का उपयोग करके ऑप्टिमाइज़ किया गया था । टाप एक P200 micropipette के साथ चुना गया । - टाप आकृति विज्ञान को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, टाप को 10 मिलीलीटर पूर्ण टाप मीडियम में रातोंरात पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें (RPMI के साथ 10% FBS, पेनिसिलिन/streptomycin, और ५.५ mmol/L ग्लूकोज) एक humidified कक्ष में 5% CO2 में ३७ ° c. यह चरण अनुभागों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है, हालांकि, टाप एक पुनर्प्राप्ति अवधि के बाद अधिक बरकरार है ( चित्र 2देखें) ।
2. टाप निर्धारण
- एक कम बाध्यकारी P200 टिप का प्रयोग, handpick लगभग २५० टाप समकक्ष (IEQ)13 एक stereomicroscope के तहत एक १.५ मिलीलीटर कम बाध्यकारी microfuge ट्यूब में एक नपे ग्रिड का उपयोग कर । कम बाध्यकारी युक्तियां और ट्यूबों कम टाप नुकसान ।
- microfuge ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए टाप की अनुमति दें । एक P200 प्लास्टिक टिप के साथ सबसे supernatant निकालें, देखभाल के लिए किसी भी टाप को दूर नहीं ले ।
- पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें । एक झूलते बाल्टी में ट्यूब केंद्रापसारक जब तक गति २०० x g तक पहुंच जाता है और फिर स्पिन रोक । supernatant निकालें । दोहराएं पंजाबियों धो दो, एक कुल के लिए धो ।
- 10% formalin समाधान या 4% हौसले से बनाया paraformaldehyde के ५०० µ एल जोड़ें । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करें । इस विधि में परीक्षण परिणामों के लिए, इन निर्धारण तरीकों को अलग किया गया । छोटा निर्धारण भी संभव हो सकता है; यह वांछित परिणाम के लिए निर्धारण अवधि का अनुकूलन करने के लिए सिफारिश की है ।
- एक P200 टिप के साथ निर्धारण को हटा दें ।
- पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें । केंद्रापसारक ट्यूब तक गति तक पहुंच जाता है २०० x जी और फिर स्पिन रोक । supernatant निकालें । दोहराएं पंजाबियों धो दो, एक कुल के लिए धो ।
- अगले चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें ।
3. टाप डिस्क तैयार करना (figure 1)
- पहले प्रयोग पर, ७० डिग्री सेल्सियस पर जेल (जैसे, Histogel) पिघला और लंबी अवधि के भंडारण के लिए १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में aliquots बनाते हैं । Aliquot मात्रा महत्वपूर्ण नहीं है, के बाद से aliquots फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- जेल (लगभग १०० µ एल प्रति नमूना) गर्म ७० डिग्री सेल्सियस पर microfuge ट्यूब एक गर्मी ब्लॉक में ७० डिग्री सेल्सियस के लिए सेट में जेल aliquot युक्त रखकर ।
- स्थानांतरण agarose नीले मोती (प्रत्येक नमूने के लिए 10 µ एल) एक १.५ मिलीलीटर स्वच्छ microfuge ट्यूब में । अच्छी तरह से pipetting से पहले मोतियों को फिर से सस्पेंड ।
नोट: नीले मोतियों को agarose बटन और आयल ब्लॉक में एंबेडेड सामग्री की दृश्य पहचान में सहायता करने के लिए टाप के साथ मिश्रित कर रहे हैं । नीले रंग की मोतियों की संख्या के परिणाम के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन अत्यधिक मोतियों से बचने के लिए (> 5x टाप की संख्या) वर्गों में टाप के इष्टतम वितरण की अनुमति है । - 1mL पंजाबियों, दो बार के साथ नीले मोती धो लो । प्रत्येक धोने के लिए, ८०० x g पर मोतियों 1 मिनट स्पिन दूसरा धोने के बाद, (n+ 2) x 10 µ l पंजाब, जहां n नमूना ट्यूबों की संख्या है में मोतियों को पुनर्निलंबित; उदाहरण के लिए, 2 नमूना ट्यूबों के लिए, पंजाबियों मात्रा मोतियों को जोड़ने के लिए ४० µ एल होगा ।
- microfuge ट्यूब युक्त टाप (२०० x g करने के लिए संक्षिप्त स्पिन) और supernatant के सबसे हटाने के केंद्रापसारक । कैंची या एक ब्लेड के साथ एक 10 µ एल micropipette टिप की नोक कट और प्रत्येक टाप ट्यूब करने के लिए मोतियों की 10 µ एल जोड़ने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए एक साफ टिप का उपयोग कर । मिश्रण (टाप खोने से बचने के लिए) नहीं है ।
- केंद्रापसारक टाप और मोती (२०० x g करने के लिए संक्षिप्त स्पिन) । एक बिना खतना के 10 µ l micropipette टिप के साथ यथासंभव अधिक से अधिक पंजाबियों को निकालें.
- नमूना पहचान के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड लेबल । प्रत्येक स्लाइड पर दो से तीन नमूने तैयार किए जा सकते हैं । गर्म जेल के साथ हीट ब्लॉक के पास बेंच पर स्लाइड रखें । तीन से ५ २० µ के नुस्खे काटें l कम एक उस्तरा ब्लेड या कैंची के साथ नमूना प्रति micropipette युक्तियां । एक से दूसरे में तेजी से स्विचन की अनुमति देने के लिए कटौती सुझावों के साथ दो P20 micropipettes लोड ।
- सबसे पहले micropipette का उपयोग कर, 15-20 µ l को गर्म जेल के टाप से जोड़ें/microfuge ट्यूब; तुरंत मिश्रण, बुलबुले से बचने; और एक < 1 cm व्यास डिस् क बनाने के लिए स् लाइड में लिक्विड आगार/टाप/मोतियों का मिश्रण लागू करें । डिस्क को स्लाइड के किनारे के पास रखें, बाहरी जेल रिंग (अगला चरण) के लिए स्थान छोड़ रहा है । स्लाइड को धीरे से ठोकरें कई बार टाप और मोतियों का निपटान करने के लिए ।
- एक दूसरे micropipette का उपयोग कर, नमूना ट्यूब के लिए गर्म जेल के 20 µ एल जोड़ें । पहले micropipette का प्रयोग, किसी भी शेष टाप के साथ नए जेल मिश्रण/मोती, गर्मी ब्लॉक में पुनः वार्मिंग अगर यह जमना शुरू होता है, तो स्लाइड पर इस मिश्रण लागू, मूल डिस्क आसपास । आवश्यक के रूप में दोहराएँ, अतिरिक्त पूर्व कटौती सुझावों का उपयोग, जब तक डिस्क वांछित आकार और मोटाई है.
नोट: gelled डिस्क हैंडलिंग आसान है अगर बाहर की अंगूठी थोड़ा मोटा है । आमतौर पर, 3 एक्स 20 µ एल जेल के पर्याप्त है । यह चरण ट्यूब बहाकर द्वारा टाप के नुकसान को कम करता है और डिस्क हैंडलिंग की सुविधा के लिए डिस्क के बाहर टाप-गरीब agarose को जोड़ता है । - प्रत्येक डिस्क को व्यक्तिगत रूप से तैयार करें और प्रत्येक स्लाइड पर एकाधिक डिस्क्स रखने पर, नमूना क्रम के सावधानीपूर्वक ट्रैक रखें ।
- गीले बर्फ की एक सपाट सतह पर स्लाइड प्लेस, एक कवर के साथ, 10 मिनट के लिए या जब तक जेल जम । यह कांच से डिस्क स्लाइड अगर यह सूख जाता है और अधिक कठिन है ।
- लेबल बायोप्सी प्रसंस्करण/पेंसिल के साथ ऊतक कैसेट, नमूना प्रति एक एंबेडिंग । नीले कागज गीला करने से बचने के लिए स्लाइड के पीछे सूखी ।
- एक उस्तरा ब्लेड के कुंद धार का प्रयोग, धीरे से प्रत्येक दिशा में डिस्क धक्का यह गिलास से मुक्त करने के लिए । जब यह आसानी से स्लाइड, धीरे नीले ऊतक कागज पर माइक्रोस्कोप स्लाइड से डिस्क धक्का. डिस्क, सपाट ओर नीचे, सीधे कागज पर रखें ।
- डिस्क सपाट रखते हुए, डिस्क के चारों ओर कागज मोड़ो को रोकने के लिए, कैसेट में तह कागज में डिस्क जगह है, और कैसेट बंद करो । यदि डिस्क शीशे से साफ रूप से स्लाइड नहीं करती है, तो अधिक जेल जोड़ें और/या कुछ और मिनटों के लिए स्लाइड को बर्फ में लौटें ।
- एक चोंच में पंजाब में कैसेट जलमग्न । आयल के लिए प्रक्रिया इष्टतम आकृति विज्ञान के लिए एक ही दिन embedding ।
4. आयल embedding
नोट: नीचे वर्णित के रूप में एक संक्षिप्त निर्जलीकरण श्रृंखला का उपयोग कर आयल ब्लॉकों के लिए टाप जेल डिस्क की प्रक्रिया । इस तकनीक को एक स्वचालित प्रोसेसर का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था, लेकिन मैनुअल प्रसंस्करण समान परिणाम उत्पादन करना चाहिए ।
- 15 मिनट के लिए ८५% इथेनॉल में कैसेट विसर्जित कर दिया ।
- 15 मिनट के लिए ९५% इथेनॉल में कैसेट विसर्जित कर दिया ।
- 15 मिनट के लिए १००% इथेनॉल में कैसेट विसर्जित कर दिया । तीन बहाकर एक कुल के लिए दो बार दोहराएं ।
- xylene में 15 मिनट के लिए कैसेट विसर्जित कर दिया । तीन बहाकर एक कुल के लिए दो बार दोहराएं ।
- पिघला हुआ तेल में 10 मिनट के लिए कैसेट विसर्जित कर दिया ।
- 10-30 मिनट के लिए ताजा पिघला हुआ तेल के लिए स्थानांतरण कैसेट ।
- ध्यान से कैसेट खोलो और नीले कागज खोलना । जेल डिस्क निकालें, फ्लैट सतह है कि कागज के लिए विरोध किया गया था का ट्रैक रखते हुए । डिस्क को एक छोटे सांचे में एंबेड करें, जिसमें समतल (टाप-युक्त) सतह नीचे, काटने की सतह के समानांतर हो । प्लग के लिए, ध्यान से यह कैसेट से हटा दें और इसे काटने की सतह की ओर इशारा करते हुए टिप के साथ एक छोटे से मोल्ड में एंबेड ।
5. आयल सेक्शनिंग और धुंधलान
- यदि सीरियल अनुभागों की आवश्यकता है तो क्रमिक रूप से लेबल स्लाइड ।
- एक अनुभवी histotechnologist द्वारा 5 µm आयल सेक्शन में कटौती की है । उपज को अधिकतम करने के लिए, सामग्री युक्त सभी वर्गों को बचाने के । आम तौर पर, इकट्ठा 20 वर्गों सामग्री का सबसे पर कब्जा करने की अनुमति देता है ।
- कमरे के तापमान पर वर्गों की दुकान । वर्गों नियमित ऊतकवैज्ञानिक दाग (जैसे, एच एंड ई) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (जैसे, इंसुलिन, ग्लूकागन और DAPI) के लिए उत्तरदायी हैं । यदि आवश्यक हो, तो अन्य एंटीजन के लिए निर्धारण का अनुकूलन ।
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Representative Results
जेल डिस्क तैयार करने के लिए चरणों का एक सचित्र योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है । इस जेल डिस्क विधि आयल वर्गों है कि एक विमान में वितरित की पर्याप्त संख्या में परिणाम के सार्थक ठहराव की अनुमति के लिए एक हवाई जहाज में वितरण किया । चित्रा 2 परिणामी वर्गों के कम आवर्धन छवियों से पता चलता है प्रति अनुभाग पर कब्जा कर लिया टाप की संख्या वर्णन । सामांय में, > 35 टाप प्रत्येक खंड में दिखाई दे रहे थे जब २५० IEQ प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया है, और > 10 वर्गों (4-5 µm) युक्त टाप प्रत्येक नमूने से प्राप्त किया गया । प्रक्रिया के लिए प्रयुक्त होने वाले टाप की संख्या बढ़ाने से वर्गों में टाप की संख्या में वृद्धि हुई. वर्गों में टाप संरचनात्मक रूप से विविध थे और अलग आकार के, अवधारणा का समर्थन है कि नए और दिलचस्प डेटा वर्गों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है बजाय तकनीक अंतर को अंधा टाप अंतर । विधि (चूहा, माउस) प्रयोगशाला में अलग से और IIDP द्वारा शिपमेंट के बाद प्राप्त मानव टाप के लिए कुतर टाप के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम किया । एक चिकनी गोल सतह और कॉम्पैक्ट गोलाकार आकार (चित्रा 2ए) के साथ, टाप टाप में रात भर बाद अलगाव वसूली के बाद कुतर दिया गया था और अधिक अक्षुण्ण आकृति विज्ञान । मानव टाप आकृति विज्ञान समान था जब आगमन के दिन पर एंबेडेड या जब बाद शिपमेंट वसूली रातोंरात के बाद एंबेडेड, शायद क्योंकि टाप पहले से ही अलगाव तनाव से लदान से पहले बरामद किया था । microtube विधि एक छोटे ऊतक पार अनुभागीय क्षेत्र, अनुभाग प्रति कम टाप के साथ, और घनी पैक टाप और मोती (चित्रा 2बी) झुकेंगे । चित्रा 2बी में दिखाया microtube छवियों को हम इस विधि के साथ प्राप्त करने में सक्षम थे सबसे अच्छा कर रहे थे; एक के बाद एक नमूनों को अधिक सेक्शन कट करने के लिए वापस भेजा जाना था क्योंकि सेक्शन के पहले सेट में कोई टाप नहीं पाया गया ।
इस तकनीक ऊतकवैज्ञानिक और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (चित्रा 3) के लिए उच्च गुणवत्ता वाले टाप वर्गों उत्पंन करता है । इंसुलिन और ग्लूकागन के दाग ने टाप आर्किटेक्चर की विविध रचना और विविधता को दिखाया । वर्गों स्पष्ट रूप से recapitulated मानव, माउस और चूहे के बीच वास्तुकला मतभेद जाना जाता है, मानव के साथ प्रचुर मात्रा में α-कोशिकाओं बीटा कोशिकाओं के साथ मिश्रित के शामिल टाप, माउस और चूहा टाप जबकि एक बीटा सेल कोर के साथ इसी तरह की वास्तुकला दिखाया और परिधि में अल्फा कोशिकाओं । धारावाहिक वर्गों प्राप्य थे; इस पैनल में चित्रा 3 दिखाने के धारावाहिक वर्गों के एक ही टाप एच और ई के लिए दाग (बाएं) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (दाएं) ।
चित्रा 1 . टाप जेल डिस् क बनाने के लिए महत् वपूर्ण चरणों का चित्रण । एक गर्मी ब्लॉक में ७० ° c करने के लिए गर्म जेल (क) कम बाध्यकारी microfuge ट्यूब टाप/मनका गोली (बी)युक्त करने के लिए हस्तांतरित किया जाता है । टाप गर्म जेल में reसस्पैंड और एक गिलास स्लाइड में स्थानांतरित कर रहे हैं, एक डिस्क आकार में सामग्री फैल (सी डी)। अतिरिक्त क्लीन जेल microfuge ट्यूब को हस्तांतरित कर दिया है, तो सभी शेष सामग्री निकाल दी जाती है और ग्लास स्लाइड (ई-एफ)पर प्रारंभिक टाप/मनका-युक्त डिस्क के आसपास circumferentially फैल गया है । बर्फ पर बीच बढ़िया तालमेल के बाद, डिस्क स्थानांतरित कर दिया है, फ्लैट की ओर नीचे, प्रोटोकॉल कागज (जी), जो तह और प्रसंस्करण के लिए एक कैसेट (एच) में रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. जेल डिस्क के आयल वर्गों अच्छी तरह से वितरित टाप की एक बड़ी संख्या में होतेहैं । (क) कम आवर्धन पैनलों (40X, 3 x 3 छवियों को एक साथ सिले, 15% ओवरलैप के साथ) माउस की, चूहा या मानव टाप सेक्शन एच एंड ई के साथ सना हुआ पता चलता है कि कई टाप प्रत्येक खंड में दिखाई दे रहे हैं । उच्च आवर्धन presets (200X) प्रतिनिधि टाप शो । वाम पैनलों अलगाव (माउस, चूहा) या शिपमेंट (मानव) के बाद तुरंत एंबेडेड टाप के वर्गों दिखाओ; सही पैनलों दिखाने के लिए संस्कृति में रातोंरात वसूली के बाद एंबेडेड टाप । 40X छवियों में देखा पीला नीला हलकों embedding और अनुभाग के दौरान दृश्य के लिए शामिल मोतियों हैं । इन विशेष नमूनों में से एक C57BL/6N माउस (1 वर्ष) और BBDR चूहा (4 सप्ताह पुरानी), प्रडक्टर collagenase इंजेक्शन और Ficoll जुदाई द्वारा अलग टाप, और मानव T2D IIDP से प्राप्त टाप । (ख) पुराने microfuge ट्यूब तकनीक के प्रति एंबेडेड मानव टाप की २५० IEQ, तुलना के लिए । कम इज़ाफ़ा पैनलों (40X; एक भी unसिले छवि सभी सामग्री पर कब्जा कर लिया) और उच्च पत्रिका presets (200X) दिखाएँ प्रतिनिधि वर्गों. संस्कृति मध्यम 10% FBS, पेनिसिलिन/streptomycin, और ५.५ mmol/L ग्लूकोज के साथ RPMI था । कम आवर्धन पैनलों के लिए स्केल बार्स १००० µm हैं; उच्च आवर्धन पैनलों के लिए स्केल बार्स ५० µm हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 . धारावाहिक टाप वर्गों पर प्रतिनिधि histochemical और इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग. माउस के वर्गों, चूहा, और मानव रात भर संस्कृति के बाद एंबेडेड टाप एच एंड ई के लिए दाग और brightfield माइक्रोस्कोपी (200X; बाएं) द्वारा imaged थे । एक आसंन अनुभाग (लाल) इंसुलिन के लिए दाग था, ग्लूकागन (हरा), DAPI युक्त मीडिया (नीला) में घुड़सवार और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (200X; सही) का उपयोग कर imaged । स्केल बार्स: ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह संशोधित जेल-डिस्क-आधारित embedding विधि एक सरल, सस्ता और कुशल तरीका प्रदान करता है, जो प्रति अनुभाग टाप की एक उच्च उपज उत्पन्न करती है । एक फ्लैट कांच की सतह पर जेल डिस्क का निर्माण एक अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्र में एक भी वितरण में टाप के प्रसार की सुविधा । एक फ्लैट डिस्क में टाप फैल अनुभाग के विमान में कई टाप रखने का लाभ प्रदान करता है, अनुकूलन उपज और कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा टाप की अनुमति । डिस्क मोटाई को जांचकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । के बाद से कई वर्गों प्राप्त किया जा सकता है, एक ही टाप के धारावाहिक वर्गों विश्लेषण किया जा सकता है, अलग परिणामों की संख्या में वृद्धि है कि एक ही प्रयोगात्मक नमूना पर मापा जा सकता है । हालांकि अग्नाशय के टाप के लिए यहां अनुकूलित, तकनीक अंय कम बहुतायत सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है, छोटे टुकड़े, friable प्रकृति, या चिपचिपा नमूने है कि अंयथा प्रक्रिया के लिए मुश्किल हो जाएगा के साथ उन सहित । यह विधि ताजा-फिक्स्ड टाप के लिए अनुकूलित है और अन्य प्रकार की सामग्री के लिए परीक्षण नहीं किया गया है, जैसे कि पहले से जमे हुए टाप. इन वर्गों के लिए भी सीटू संकरण परख में डीएनए या आरएनए का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है । अतिरिक्त जेल के अतिरिक्त दो प्रयोजनों के कार्य करता है: टाप संग्रह को अधिकतम करने के लिए और हैंडलिंग के दौरान व्यवधान से टाप युक्त डिस्क केंद्र की रक्षा के लिए/ पतली जेल डिस्क जल्दी जम जाता है और छोटा निर्जलीकरण और xylene तेल embedding के लिए घुसपैठ कदम की अनुमति देता है । एक समतल सतह पर डिस्क बनाने के बजाय एक द्वितीयक कंटेनर (microfuge ट्यूब या संस्कृति प्लेट अच्छी तरह से) में यह आसान शारीरिक रूप से प्रसंस्करण के लिए कैसेट के लिए डिस्क हस्तांतरण करने के लिए बनाता है । डिस्क तकनीक के नतीजों से तुलना करते समय microtube तकनीक ने टाप यील्ड और झुरमुट टाप डिस्ट्रीब्यूशन को कम किया था, हालांकि नॉन planar टिशू अरेंजमेंट से टाप-युक्त वर्गों की संख्या अधिक उत्पन्न हो सकती थी ।
प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम ऊतक निर्धारण, जेल डिस्क के गठन, आयल embedding, और अनुभाग शामिल हैं । निर्धारण के संबंध में, के रूप में एच एंड ई द्वारा परीक्षण और इंसुलिन और ग्लूकागन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस, पीएफए और formalin, या निर्धारण 10-30 मिनट (नहीं दिखाया गया है) से लेकर अवधि के बीच कोई अंतर नहीं पाया गया । हालांकि, निर्धारण तीव्रता और अवधि अंत प्रयोक्ता जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । प्रिंसिपल अभिनव इस प्रोटोकॉल में निहित जेल टाप डिस्क की तैयारी है; महत्वपूर्ण चरणों चित्रा 1में संक्षेप हैं । महत्वपूर्ण कदम जेल की एक छोटी मात्रा का उपयोग करने के लिए एक छोटे से क्षेत्र में ऊतक ध्यान केंद्रित करने और एक सपाट सतह पर डिस्क बनाने के लिए एक एकल विमान में अनुभाग के लिए ऊतक की व्यवस्था शामिल हैं । कम बाध्यकारी microfuge ट्यूबों और सुझावों और सभी spins के लिए एक झूलते बाल्टी केंद्रापसारक का उपयोग ऊतक उपज में सुधार; निर्धारण के बाद टाप प्लास्टिक से चिपक जाते हैं. आसानी से दिखाई मोतियों के अलावा डिस्क गठन के साथ सहायता, embedding और अनुभाग । जेल जोड़ने से पहले जितना संभव हो सके पंजाबियों को हटाना कमजोर agarose, जो गरीब solidification और कठिनाई कागज को डिस्क स्थानांतरित करने के लिए सुराग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । पतली डिस्क को बरकरार रखते हुए इसे कांच की स्लाइड से कागज पर फिसलने से चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यदि डिस्क में एक शिकन होती है, यह मूल स्थिति में लौटने के लिए अनुमति देते हैं, और अधिक जेल जोड़ने और स्लाइड फिर से ठंडा । आयल embedding के लिए संमान के साथ, यह महत्वपूर्ण है कि डिस्क सपाट-पक्ष नीचे और काटने के विमान के समानांतर एंबेडेड हो । एक histotechnologist आयल वर्गों को काटने के साथ अनुभवी इस प्रक्रिया की सफलता के लिए आवश्यक है, के बाद से सामग्री ब्लॉक के अग्रणी किनारे पर केंद्रित है । अत्यधिक ब्लॉक के बंद का सामना करना पड़ सकता है नमूना के नुकसान के लिए नेतृत्व । यह जैसे ही नीले मोती दिखाई दे रहे हैं वर्गों का संग्रह शुरू करने के लिए सिफारिश की है ।
निर्धारण तीव्रता और अवधि अंत उपयोगकर्ता के विशिष्ट ऊतक और जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । प्रति नमूना इस्तेमाल किया टाप की संख्या यदि आवश्यक संशोधित किया जा सकता है; हालांकि, प्रारंभिक सामग्री को कम करने के साथ कम टाप वर्गों उत्पंन करता है । मोटा या बड़ा डिस्क इस तकनीक का उपयोग कर उत्पंन किया जा सकता है; निर्जलीकरण और xylene घुसपैठ कदम को लंबा करने की आवश्यकता हो सकती है और अनुकूलित किया जाना चाहिए । यदि परिणामी अनुभागों में केवल एक आंशिक डिस्क आकृति हो, तो इस संभावना पर विचार करें कि डिस्क काटने की सतह के समानांतर एंबेड नहीं की गई थी । यदि बहुत कम अनुभाग प्राप्त होते हैं, तो टेक्नोलॉजिस्ट प्रारंभिक ब्लॉक तैयारी के दौरान सामग्री खो सकता है ।
इस विधि निर्धारित टाप ऊतक युक्त वर्गों उत्पंन करता है और, जैसे, केवल ऊतकवैज्ञानिक परिणामों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रति अनुभाग बड़ी संख्या में टाप प्राप्त करने के लिए, २००-२५० IEQ प्रारंभ सामग्री का उपयोग किया गया था, जो कुछ प्रयोग प्रकारों के लिए जेनरेट करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. उच्च गुणवत्ता वर्गों एक अनुभवी histotechnologist होने पर निर्भर हैं ।
10 उत्पंन करने की क्षमता + एक ही प्रयोगात्मक हालत से कई टाप युक्त वर्गों एक ही सामग्री पर कई परिणामों के ठहराव की अनुमति देगा, प्रयोगात्मक दक्षता में सुधार । बरकरार टाप का नियमित विश्लेषण केवल सेलुलर स्तर पर ही नहीं, बल्कि टाप लेवल पर भी, जिसके बारे में थोड़ा वर्तमान में समझा जाता है, को समझने में प्रगति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । अंय सीमित बहुतायत ऊतक नमूनों के लिए इस तकनीक को लागू करने के रूप में अच्छी तरह से अंय क्षेत्रों के लिए लाभ प्रदान कर सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों के हित की घोषणा करने का कोई टकराव नहीं है.
Acknowledgments
हम कृतज्ञता UMass मधुमेह उत्कृष्टता के केंद्र में उपयोगी सलाह और विचार विमर्श के लिए बीटा सेल जीवविज्ञान समूह स्वीकार करते हैं । मानव अग्नाशय टाप आशा के शहर में NIDDK वित्त पोषित एकीकृत टाप डिस्ट्रीब्यूशन प्रोग्राम (IIDP) द्वारा प्रदान की गई । यह काम NIH/NIDDK द्वारा वित्त पोषित किया गया: R01-DK114686 (एलसीए), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन ग्रांट #1 -15-बी एस-003 (एलसीए) द्वारा Amaranth के आदेश के सहयोग से ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
