Summary
췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.
Abstract
격리 된 췌 장 독도 사용 하 여 실험은 당뇨병 연구를 위한 중요 하지만 독도 비싸고 한정 된 풍부의. 독도 포함 영향을 함수, 구조화 된 아키텍처에 혼합된 셀 인구 그리고 인간의 독도 널리 셀 형식 구성에서 변수. 교양된 독도 공부를 현재 자주 사용 되는 방법 분자 연구 수행 전체 독도, 총괄 한 이종 섬 세포 유형, 또는 현미경 또는 섬 건축을 방해 하는 분산 된 작은 섬 세포에 분자 연구에 포함 됩니다. Vivo에서 섬 연구, 파라핀 끼워 넣어진 췌 단면 네이티브 췌 장 환경에서 셀 관련 결과 평가 하기 위해 강력한 기술입니다. 여러 가지 이점을 제공할 것 이라고 파라핀 단면에 의해 후 문화 독도 공부: 같은 독도 (도 잠재적으로 정확한 같은 독도, 직렬 섹션을 사용 하 여), 셀 형식 관련 측정 및 유지 관리 기본에 여러 결과의 검출 섬-셀 및 셀 층 상호 작용 실험 노출 시 및 분석을 위해. 그러나, 기존 기술을 포함 고립 독도 후 비효율적인, 시간 소모, 소재의 손실에 수 그리 다 문화와 일반적으로 부적당 한 섬 숫자 결과 측정 하는 데 유용 해야 섹션을 생산. 임상 병 리 실험실 셀 블록 준비 시설 기초 연구 실험실에 대 한 허무 하 고 액세스할 수 있습니다. 우리는 강력한 수율 및 독도의 배포 섹션을 생성 하는 개선, 벤치 탑 메서드를 개발 했습니다. 고정된 독도 따뜻한 조직학 agarose 젤에 resuspended 하 고는 독도 평면에서 배포 되는 표준 유리 슬라이드에 플랫 디스크에 pipetted. 표준 탈수 후에 포함, 여러 (10 +) 4-5 µ m 섹션 같은 섬 블록에서 잘릴 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 마우스, 쥐, 인간 시리즈에 조직학 및 immunofluorescent 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 교양된 독도에서 셀 형식 관련, 건축이 그대로 결과 평가 하는 효과적인, 저렴 한, 시간-절약 접근.
Introduction
췌 장 독도 Langerhans, 인슐린, 순환의 유일한 소스는 당뇨병 mellitus를 공부 하는 수 사관에 대 한 중요 한 조직. 어떤 주어진된 유기 체에서 독도 가변 크기, 셀 유형 주파수, 및 건축1,2,3있다. Vivo에서 구조와 췌 장 독도의 내 분 비 세포 구성 공부 하는 기존의 전략 췌 장 조직4,5단면입니다. 콘텐츠의 전체 췌 장 세포의 작은 일부만 구성 하는 독도, 이후 고립 된 독도에 분자 연구 수행 됩니다. 비보 전 섬 문화 영양소에 대 한 응답을 테스트, 실험 유전자 변조 (transfection, 변환), 또는 실험적 치료 내 분 비 세포 생존, 확산, 및 기능을 조절 하는 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 5 , 6.
섬 실험 비보 전 종종 전체 독도의 분자 연구 또는 단층5,6에 성장 하는 분산 된 작은 섬 세포의 조직학 또는 분자 연구를 사용 하 여 분석 된다. 전체 독도의 분자 분석의 혼합과 세포 유형, 모든 개별 셀 형식을 추정 하는 경우 false 네거티브 또는 허위-긍정적인 결과 얻을 수 있는 심각한 경고를 소개 합니다. 이후 문화 현미경 검사 법에 대 한 coverslips에 셀 분산 셀 형식 관련 결과 측정, 있지만 섬 아키텍처, 개입에 대 한 응답을 변경할 수 있습니다 및 건축 관련 결과의 식별을 방해 방해. 또한, 일반적으로 단지 단일 결과 측정할 수 있다; 예를 들어 베타 세포 증식 및 동일한 조건 하에서 베타 세포 죽음을 측정, 두 개의 별도 실험 수행 해야 합니다. 이러한 방식을 간 섬 가변성, 분야에서 증가 관심의 영역에 눈도 있습니다. Cytometry 셀 형식 관련 분자 연구, 또는 단일 셀 RNA 연구에 의해 정렬 작은 섬 세포는 조직 풍부, 건축 근절, 그리고 일상적인 셀 문화 분석에 적합 하지 비싼, 시간이 걸리는 제한 하지만 우아한 5 , 7. 각 샘플에서 가져온 데이터 이며 단일 immunostaining8에 식별 가능한 결과 제한 confocal 영상 전체 마운트 immunostained 독도의 높은-품질 그대로 아키텍처 데이터를 제공 하지만 노동 집약, 이다.
-문화 전체 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하는 기능이이 관심사의 많은 주소 것 이다. 높은 비용, 낮은 풍부한 섬 조직 또는 인간 장기 기증자, 또는 독도 상태 게시물에 비보 또는 생체 외에서 실험 조작, 독특한 유전자 모델에서 귀중 한 있습니다. 같은 독도에서 여러 파라핀 섹션을 가져오는 동일한 실험에서 여러 셀 형식 관련, 그대로 건축 분석이 하게된다.
단면에 대 한 섬 펠 릿을 생성 하기 위해 기존 기술을 완벽 하지 않습니다. 조직학 최적화 agarose 어려운 과정9조각난 또는 작은 조직 샘플을 포함 하는 조직학 및 cytological 표본 처리에서 널리 이용 되는 수성 낮은 녹는점 젤입니다. 접근을 포함 한 섬 agarose microcentrifuge 튜브에서에 독도 일시 중단, 원심 작은 자료, agar 플러그를 검색 다음 처리 하 고10,11단면에 대 한 포함입니다. 튜브의 아래쪽에서 응고 샘플을 추출 시간이 많이 걸리며 어려운, 샘플의 가끔 조각화 및 신체 상해의 위험입니다. 독도이 방법에서 얻은 단원의 부적절 한 섬 분포 선도 플러그의 끝에 집중 된다. 플러그의 둥근 바닥 복잡 포함 되도록 섬-가난한 지역 단면 제시 될 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 낮은 수율 및 결과 섹션에서 이멀전의 섬 유통 리드.
이 새로운 방법은 섬 섹션의 준비에 대 한 단순 하 고 향상 된 접근 이다. 독도 작은 볼륨에 집중 하 고 단일 평면에 독도와 작은 디스크를 현미경 슬라이드의 매끄러운 표면에 배치. Histogel-섬 디스크 파라핀 단축된 탈수 및 자일 렌 침투 프로토콜에 대 한 이후 처리 됩니다. Microfuge 관의 하단에 독도 집중, 이전 접근은 또한 비교로 수행 됩니다. 이 새로운 기술은 섹션, 각 섹션에서 독도의 유통 당 독도의 수율 향상과 카세트 섬 블록 전송 하는 데 시간이 적게 걸립니다. 이 기술은 유용 섬 생물학 또는 생산성을 극대화 하고자 하는 조직의 작은 조각을 공부 하는 다른 과학자의 기본 조직 아키텍처에서 단일 샘플에 여러 결과 측정 하 여 낮은 풍부 조직 사용.
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Protocol
동물 관련 된 모든 절차는 UMass 의료 학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 인간의 섬 연구는 인간을 대상의 사용을 포함 하지 않는 때문에 IRB 검토 또는 면제에 대 한 자격 하지 UMass 기관 검토 위원회에 의해 결정 했다.
1. 섬 격리와 문화
- 독도 분리 하 고 외 분 비 및 ductal 조직 선택의 방법을 사용 하 여 오염에서 분리.
참고:이 방법은 독도 콜라 ductal insufflation 및 Ficoll 분리12 (설치류) 또는 통합 섬 배포 프로그램 (IIDP13, 인간)에서 후 선적 독도 격리를 사용 하 여 최적화 되었다. 독도 P200 micropipette로 뽑아서 했다. - 섬 형태를 최적화 하려면 독도 10 mL 완전 한 섬 매체 (와 10 %FBS, 페니실린/스, 5.5 mmol/L 포도 당 RPMI) 37 ° c.에 5% CO2 를 포함 하는 습도 챔버에 밤새 복구 허용 이 단계는 섹션을 얻이 필요가 없습니다,는 독도 더 그대로 복구 기간 후 ( 그림 2참조).
2. 섬 고정
- 낮은 바인딩 P200 팁을 사용 하 여, 약 250 섬 등가물 (IEQ)13 1.5 mL 낮은 바인딩 microfuge 관으로는 stereomicroscope에서 보정된 그리드를 사용 하 여 따. 낮은 바인딩 팁 및 튜브 섬 손실을 줄일.
- 독도 microfuge 관의 바닥에 정착을 허용 합니다. 대부분 상쾌한 P200 피펫으로 팁, 어떤 독도 제거 하지 않도록 주의 복용 제거 합니다.
- PBS의 1 mL를 추가 합니다. 속도 200 x g에 도달할 때까지 튜브 스윙 양동이 원심 분리기에 원심 고 스핀을 중단. 제거는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한 PBS 세척을 반복 합니다.
- 10% 포 르 말린 용액 또는 갓 만든 4% paraformaldehyde 500 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실내 온도에 수정. 이 방법에서는 테스트 결과 대 한 이러한 종류의 고정 방식이 구별할 수 없었다. 짧은 고정 또한 수 있습니다; 원하는 결과 대 한 고정 기간을 최적화 하는 것이 좋습니다.
- P200 팁 정착 액을 제거 합니다.
- PBS의 1 mL를 추가 합니다. 속도 200 x g에 도달할 때까지 튜브를 원심 고 스핀을 중단. 제거는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한 PBS 세척을 반복 합니다.
- 즉시 다음 단계를 진행 합니다.
3. 섬 디스크 (그림 1)의 준비
- 처음 사용에 70 ° C에서 (예를 들어, Histogel) 젤을 녹여 고 aliquots 1.5 ml에서 장기 저장용 microfuge 관. Aliquot 볼륨 aliquots 다시 사용 될 수 있기 때문에 중요 한, 아니다.
- 배치 microfuge 관 70 ° c.에 설정 열 블록에 젤 약 수를 포함 하 여 70 ° C에서 젤 (샘플 당 약 100 µ L)를 따뜻한
- 1.5 mL 깨끗 microfuge 관으로 블루 agarose 구슬 (10 µ L 각 샘플)를 전송 합니다. 철저 하 게 pipetting 전에 구슬 resuspend.
참고: 파란색 구슬 agarose 단추와 파라핀 블록에 포함 된 자료의 시각적 식별을 지원 하기 위해 독도와 혼합 됩니다. 사용 하는 파란 구슬 수 결과에 중요 한 하지만 과도 한 구슬 방지 (> 5 독도의 수 배) 섹션에서 독도의 최적의 배포를 허용 하도록. - 1 mL PBS와 함께 파란 구슬 두 번 씻는 다. 각 세척에 대 한 회전 구슬 800 x g에서 1 분. 두 번째 세척 후 10 µ L PBS, 여기서 n 은 샘플 튜브; 수 x (n+ 2) 구슬 resuspend 예를 들어 2 샘플 튜브, 구슬에 추가할 PBS 볼륨 40 µ L 것입니다.
- 원심 microfuge 관 독도 (간단한 스핀 200 x g)을 포함 하 고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다. 가 위 또는 칼 10 µ L micropipette 팁의 끝을 잘라내어 각 샘플에 대 한 깨끗 한 팁을 사용 하 여 각 섬 튜브에 구슬의 10 µ L를 추가. ()을 피하기 위해 독도 잃고 혼합 하지 마십시오.
- 독도 구슬 (200 x g 간단한 스핀) 원심. 포경 10 µ L micropipette 팁 가능한 많은 PBS를 제거 합니다.
- 현미경 슬라이드 샘플 식별에 대 한 레이블을 지정 합니다. 2 ~ 3 샘플 각 슬라이드에 준비 될 수 있다. 따뜻하게 젤으로 열 블록 근처 벤치에 슬라이드를 놓습니다. 면도날 또는 위 샘플 당 20 µ L 낮은 바인딩 micropipette 팁 3 ~ 5의 끝을 잘라. 다른 하나에서 전환 급속 한 수 있도록 컷 팁 두 P20 micropipettes을 로드 합니다.
- 첫 번째 micropipette를 사용 하 여, 추가 15-20 µ L 따뜻한 젤의 독도/구슬 microfuge 관; 즉시 혼합, 피하 거품; 형태로 슬라이드에 액체 한 천/독도/구슬 혼합물을 적용 한 < 1 cm 직경 디스크. 디스크 공간 외부 젤 링 슬라이드 가장자리 근처에 배치 (다음 단계). 부드럽게 몇 번 독도 비즈를 해결 하기 위해 슬라이드를 누릅니다.
- 두 번째 micropipette를 사용 하 여 샘플 튜브를 따뜻한 젤의 20 µ L를 추가 합니다. 원본 디스크를 둘러싼 슬라이드에이 혼합물을 적용 다음 첫 번째 micropipette, 모든 나머지 독도/구슬, 응고, 시작 하는 경우 다시 열 블록에 온난화와 혼합 새로운 젤을 사용 하 여. 디스크는 원하는 크기와 두께 추가 미리 잘라 팁을 사용 하 여 필요에 따라 반복 합니다.
참고: 외부 반지는 약간 두꺼운 경우 쉽습니다 gelled 디스크 처리. 일반적으로, 젤의 3 x 20 µ L은 충분 합니다. 이 단계 튜브 세척 하 여 독도의 손실을 최소화 하 고 섬-가난한 agarose 디스크 처리를 촉진 하기 위하여 디스크의 바깥쪽에 추가 됩니다. - 각 디스크를 개별적으로 준비 하 고 끊임없이 주의의 샘플 주문 각 슬라이드에 여러 개의 디스크를 삽입 하는 경우.
- 10 분 동안 또는 젤 굳은 때까지 슬라이드 커버, 젖은 얼음의 평평한 표면에 놓습니다. 그것은 더 밖으로 마른 경우 유리에서 디스크를 밀어 어렵다입니다.
- 레이블 처리/포함 조직 카세트 샘플 하나씩 연필로 생 검. 블루 종이 일로 방지를 슬라이드의 뒤쪽을 건조.
- 유리에서 그것을 각 방향에 있는 디스크를 밀어 부드럽게 면도날의 무딘 가장자리를 사용 하 여. 때 그것은 쉽게 슬라이드, 파란 티슈 페이퍼에 현미경 슬라이드에서 디스크를 밀어 천천히. 디스크, 편평한 측, 종이에 직접 놓습니다.
- 디스크 유지 평면, 방지 운동, 디스크, 카세트에 접힌된 종이에 놓고 카세트를 닫습니다 디스크 주위 종이 접어. 디스크 유리에서 깔끔하게 슬라이드 하지 않습니다, 경우 더 많은 젤을 추가 및/또는 몇 가지 더 많은 분 동안 얼음에 슬라이드를 반환.
- 비 커에 PBS에 카세트 잠수함 최적의 형태에 대 한 같은 날을 포함 하는 파라핀 프로세스.
4. 파라핀 포함
참고: 프로세스 섬 젤 아래 설명 된 대로 약식된 탈수 시리즈를 사용 하 여 파라핀 블록을 디스크. 이 기술은 자동화 된 프로세서를 사용 하 여 최적화 되었습니다 하지만 수동 처리 비슷한 결과 생산 한다.
- 15 분 동안 85%의 에탄올에 카세트를 담가.
- 15 분 동안 95% 에탄올에 카세트를 담가.
- 15 분 동안 100% 에탄올에 카세트를 담가. 3 세척의 총 두 번 반복 합니다.
- 15 분 동안 크 실 렌에 카세트를 담가. 3 세척의 총 두 번 반복 합니다.
- 카세트 녹은 파라핀에 10 분 동안 담가.
- 10-30 분에 대 한 신선한 녹은 파라핀에 카세트를 전송.
- 신중 하 게 카세트를 열고 파란색 종이 풀 다. 종이를 평평한 표면 반대 했다 그의 추적을 유지 하는 젤 디스크를 제거 합니다. 아래로, 절단 표면에 평행한 평면 (섬 포함) 표면으로 작은 몰드에 디스크를 포함 합니다. 플러그인에 대 한 신중 하 게 카세트에서 그것을 제거 하 고 절단 표면 쪽으로 향하고 함께 작은 몰드에 포함.
5입니다. 파라핀 단면화 및 얼룩
- 슬라이드 레이블 순차적으로 직렬 섹션 필요한 경우.
- 경험 있는 histotechnologist에 의해 잘라 5 µ m 파라핀 단면도 있다. 수율을 최대화 하기 위해 물자를 포함 하는 모든 섹션을 저장 합니다. 일반적으로, 20 섹션 수집 자료의 대부분의 캡처 수 있습니다.
- 실 온에서 섹션을 저장 합니다. 섹션 (예: H & E) 일상적인 조직학 얼룩과 면역 형광 검사 (예: 인슐린, 글 루카 곤 및 DAPI) 의무가 있습니다. 필요한 경우 다른 항 원에 대 한 고정을 최적화 합니다.
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Representative Results
젤 디스크를 준비 하는 단계의 그림된 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 이 젤 디스크 메서드 결과 결과의 의미 있는 정량화를 허용 하는 단일 평면에 배포 하는 독도의 충분 한 수를 포함 하는 파라핀 섹션에서. 그림 2 는 독도 섹션 당 캡처 수를 설명 하기 위해 결과 섹션의 낮은 확대 이미지. 일반적으로, > 250 IEQ 절차, 사용 되었다 때 각 섹션에서 35 독도 했다 표시 하 고 > 10 섹션 (4-5 µ m) 독도 포함 하는 각 샘플에서 가져온. 독도 절차에 대 한 사용의 수를 증가 섹션에서 독도의 수 증가. 섹션에서 독도 구조적으로 다양 하 고 그 새로운 개념을 지 원하는 다양 한 크기의 고 기술 간 섬 차이에 장 님 보다는 섹션을 사용 하 여으로 데이터 흥미로운 얻을 수 있습니다. 방법은 동등 하 게 일 잘 설치류 독도 연구소 (쥐, 마우스)에 IIDP에 의해 선적 후 받은 인간의 독도 대 한 격리에 대 한. 설치류 독도 후 격리 복구 부드러운 둥근된 표면으로 섬 미디어에서 밤새 고 둥근 모양 (그림 2A) 압축 후 눈에 띄게 더 그대로 형태를 했다. 도착 당일에 포함 하거나 독도 이미 선적 전에 격리 스트레스 로부터 회복 했다 때문에 아마도 후 선적 복구, 후 포함 된 인간의 섬 형태 유사 했다. Microtube 메서드는 작은 조직 단면적, 섹션 당 적은 독도와 굴복 하 고 밀도가 포장 독도 고 구슬 (그림 2B). 그림 2B microtube 이미지 했다 우리이 방법;를 얻을 수 있었다 최고 샘플 중 하나 아니 독도 섹션의 첫 번째 집합에서 발견 된 때문에 더 많은 부분을 잘라 다시 전송 했다.
이 기술은 생성 고품질 섬 섹션 조직학 및 면역 형광 염색 법 (그림 3). 인슐린과 글 루카 곤 얼룩이 지는 다양 한 구성 및 섬 건축의이 보였다. 섹션은 명확 하 게 알려진된 아키텍처 차이 지, 인간 사이의 풍부한 α-셀의 구성 인간 독도와 쥐와 쥐 독도과 혼합 된 베타 세포, 반면 마우스와 쥐 독도 보였다 베타 셀 코어와 비슷한 아키텍처 그리고 주변에 알파 세포입니다. 직렬 섹션은 얻을 수; 그림 3 에서 패널 같은 H에 대 한 스테인드 섬 & E (왼쪽)와 면역 형광 검사 (오른쪽)의 직렬 섹션을 표시 합니다.
그림 1 . 섬 젤 디스크를 만들기 위한 중요 한 단계 그림. 젤 열 블록 (A) 슬 렛/비드 펠 렛 (B)를포함 하는 낮은 바인딩 microfuge 관으로 전송에서 70 ° C로 예 열. 독도 따뜻한 젤에 resuspended 고 유리 슬라이드, 디스크 모양 (C-D)의 소재를 확산 전송. 추가 깨끗 겔 microfuge 관으로 전송 됩니다 다음 모든 나머지 재료를 제거 하 고 유리 슬라이드 (E-F)에 초기 섬/구슬 포함 디스크 주위 원주 확산. 얼음에 고 후 디스크가 쓰러졌습니다 전송, 편평한 측, 조직학 종이 (G), 접혀 그리고 처리를 위해 카세트 (H) 에 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. 젤 디스크의 파라핀 섹션 잘 분산된 독도의 많은 수를 포함합니다. (A) 낮은 확대 패널 (40 X 3 x 3 이미지 15% 중복와 함께 물 렸 다) 마우스, 쥐 또는 인간 섬 섹션 H & E와 스테인드 쇼의 많은 독도 각 섹션에서 볼 수 있습니다. 높은 확대 인세트 (200 X) 대표 독도 표시합니다. 왼쪽된 패널 절연 (쥐, 쥐) 또는 (인간); 선적 후 즉시 포함 하는 독도의 섹션 표시 오른쪽 패널 표시 독도 문화에 하룻밤 복구 후 포함. 옅은 파란색 동그라미 40 X 이미지에서 볼 구슬 포함 및 단면 중 시각화에 대 한 포함 되어 있습니다. 이 특정 샘플 ductal 콜라 주입 및 Ficoll 분리에 의해 분리 하는 독도는 IIDP에서 받은 인간의 T2D 독도 C57BL/6N 마우스 (1 세)와 BBDR 쥐 (4 주 이전)에서 있다. (B) 250 IEQ 오래 된 microfuge 관 기술 비교에 대 한 당 포함 된 인간의 독도의. 낮은 확대 패널 (40 X; 단일 unstitched 이미지 캡처 모든 자료) 높은 매기 인세트 (200 X) 대표 섹션을 보여줍니다. 문화 매체와 10 %FBS, 페니실린/스, 5.5 mmol/L 포도 당 RPMI 이었다. 낮은 확대 패널 스케일 바는 1000 µ m; 높은 확대 패널 스케일 바는 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 표와 조직화 학적인 면역 형광 직렬 섬 섹션에 얼룩. 마우스, 쥐, 인간 시리즈의 섹션 포함 후 숙박 문화를 H & E 스테인드 명시 야 현미경 검사 법에 의해 이미지 (200 X, 왼쪽). 인접 한 섹션은 스테인드 (빨간색) 인슐린, 글 루카 곤에 대 한 (녹색), DAPI 포함 된 미디어 (파란색)에 탑재 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데 (200 X; 오른쪽). 스케일 바: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 수정된 젤 디스크-기반 포함 메서드는 단순, 저렴 한, 및 섹션 당 독도의 높은 수율을 생성 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 평면 유리 표면에 젤 디스크 구성 동등한 배급에 퍼지는 독도 용이 하 게 잘 정의 된 영역. 평면 디스크에 독도 확산 섹션의 비행기에 많은 독도 배치 하 고, 수확량을 최적화 하 고 적은 독도 사용할 수 있도록의 이점을 제공 합니다. 디스크 두께 수 사관의 요구에 맞게 조정할 수 있습니다. 여러 섹션을 얻을 수 있습니다, 이후 같은 독도의 직렬 섹션 분석할 수 있습니다, 같은 실험 샘플에 측정할 수 있는 뚜렷한 결과의 수를 증가. 여기에 최적화 된 췌 장 독도 대 한, 비록 기술은 작은 조각, 어렵다면 자연, 또는 점성 샘플 과정 그렇지 않으면 어려울 것 이다을 포함 한 다른 낮은 풍부한 자료에 적용할 수 있습니다. 이 메서드는 신선한 고정 독도 대 한 최적화 하 고 다른 유형의 이전 냉동된 독도 등의 재료에 대 한 테스트 되지 않았습니다. 이 섹션은 또한 DNA 또는 RNA를 검출 하기 위하여 교 잡 분석 현장에 대 한 유용할 수 있습니다. 여분의 젤의 추가 서브 2 목적: 섬 컬렉션을 최대화 하 고 장애 처리/전송 중에서 섬 풍부한 디스크 센터를 보호 하기 위해. 얇은 젤 디스크 신속 하 게 굳은 고 단축된 탈수 및 크 실 렌을 파라핀 포함에 대 한 침투 단계 있습니다. 평평한 표면에 보다는 보조 컨테이너 (microfuge 관 또는 문화 판 잘)에서 디스크를 형성 물리적 처리를 위해 카세트 디스크 전송 쉽게. Microtube 기술 섬 수확량 감소 했다 및 비 평면형 조직 배열 섬 포함의 더 높은 숫자를 생성할 수 있지만 섬 배포를 clumped 디스크 기술 결과와 비교할 때 섹션.
프로토콜의 중요 한 단계 조직 고정, 포함, 및 단면 파라핀 젤 디스크의 형성을 포함 합니다. 고정, 기준 H & E와 인슐린과 글 루카 곤에 대 한 면역 형광 검사 테스트 PFA와 포 르 말린, 또는 10-30 분 (표시 되지 않음)에서 배열 하는 고정 기간 사이 차이가 발견 되었다. 그러나, 고정 강도와 기간 최종 사용자의 요구에 대 한 최적화 되어야 합니다. 이 프로토콜에 포함 된 주요 혁신은 젤 섬 디스크;의 준비 중요 한 단계는 그림 1에서 요약 된다. 주요 단계 젤의 작은 볼륨을 사용 하 여 조직의 작은 영역에 집중 하 고 디스크를 형성 하는 단일 면에 조직 단면을 평평한 표면에 포함 됩니다. 낮은 바인딩 microfuge 관 및 팁과 모든 스핀에 대 한 스윙 양동이 원심 분리기 사용 향상 조직 수확량; 독도 고정 후 플라스틱에 충실. 쉽게 보이는 구슬의 추가 디스크 형성, 포함 및 단면을 지원 합니다. 젤은는 agarose를 diluting 방지에 중요 한 추가 하기 전에 가능한 많은 PBS를 제거, 가난한 응고 및 종이 디스크 전송 어려움을 이끌어. 종이를 유리 슬라이드를 슬라이딩 도전 될 수 있지만 얇은 디스크를 그대로 유지 합니다. 디스크에서 발생 하는 주름, 원래 위치로 반환, 더 많은 젤을 추가 하 고 슬라이드 다시 진정을 허용 합니다. 파라핀 포함, 기준 평면-측면 내려와 절단의 평면에 평행한 디스크 포함 될 중요 하다. 자료 블록의 앞 가장자리에 집중 이므로 절단 파라핀 섹션에 익숙한 histotechnologist이이 절차의 성공에 필수적 이다. 블록의 과도 한 연결 샘플의 손실 될 수 있습니다. 파란 구슬 볼 수 있습니다 섹션을 수집을 시작 하는 것이 좋습니다.
고정 강도와 기간 최종 사용자의 특정 조직 및 요구에 대 한 최적화 되어야 합니다. 샘플 당 사용 된 독도의 수; 필요한 경우 수정할 수 있습니다. 그러나, 적은 독도와 섹션이 생성 시작 물자를 감소 합니다. 이 기술을;를 사용 하 여 두꺼운 또는 더 큰 디스크를 생성할 수 있습니다. 탈수 및 자일 렌 침투 단계 길게 할 필요가 있습니다 최적화 합니다. 결과 섹션 부분 디스크 모양만 들어 경우 디스크 아니었다 가능성 포함 절단 표면에 평행 하 게 하는 것이 좋습니다. 너무 몇 가지 섹션, 가져온 경우는 기술자 수 있습니다 잃 었 소재 초기 블록 준비 하는 동안.
이 방법 고정된 섬 조직을 포함 하는 섹션을 생성 하 고, 등, 사용할 수 있습니다만 조직학 결과. 섹션, 200-250 IEQ 당 독도의 많은 수를 시작 물자 사용 되었다, 어떤은 도전 실험 형식에 대 한 생성 하. 높은 품질 섹션 경험이 풍부한 histotechnologist에 따라 달라 집니다.
10 + 단일 실험 조건에서 많은 독도 포함 하는 섹션을 생성 하는 기능 실험 효율 개선, 같은 물자에 여러 결과의 정량화를 허용할 것 이다. 그대로 독도의 일상적인 분석 진보는 조금에 대 한 현재 이해는 조직이, 세포 수준에서 뿐만 아니라 섬 수준에서 이해 될 수 있습니다. 다른 제한 된 풍부한 조직 샘플에이 기술을 적용 하는 것은 뿐만 아니라 다른 분야에 대 한 혜택 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 기꺼이 도움이 조언과 토론에 대 한 우수 UMass 당뇨병 센터에서 베타 세포 생물학 그룹 인정합니다. 인간의 췌 장 독도 여는 NIDDK 자금 통합 섬 배포 프로그램 (IIDP) 희망의 도시에 제공 했다. 이 작품은 NIH/NIDDK에 의해 투자 되었다: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP)와 미국 당뇨병 협회에 의해 공동으로 아마 란 스의 순서 #1-15-학사-003 (LCA)을 부여.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
Heatblock | VWR | 949312 | |
HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
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