Summary
Utgrävning av växternas rötter från fältet samt bearbetning av prover till endosphere, odlingsbädden och jord beskrivs i detalj, inklusive DNA extraktion och data analysmetoder. Denna uppsats syftar till att aktivera andra laboratorier att använda dessa tekniker för studier av jorden, endosphere och odlingsbädden microbiomes.
Abstract
Växt och jord mikrobiomet studier blir allt viktigare för att förstå de roller mikroorganismerna spelar produktiviteten inom jordbruket. Syftet med detta manuskript är att ge information om hur snabbt prov jord, odlingsbädden och endosphere av replikerade fältförsök och analysera förändringar som kan uppstå i de mikrobiella samhällena på grund av provtyp, behandling och växt genotyp. Experimentet används för att demonstrera dessa metoder består av replikerade fältet tomter som innehåller två, ren, varm-säsong gräs (Panicum virgatum och conopsea gerardii) och en låg-mångfald gräs blandning (A. gerardii, Sorghastrum nutans, och Bouteloua curtipendula). Kort, växter är utgrävd, en mängd rötter skär och placeras i fosfatbuffert, och sedan skakas för att samla in rhizosfären. Rötter förs till laboratoriet på is och ytan steriliseras med blekmedel och etanol (EtOH). Odlingsbädden filtreras och koncentrerad genom centrifugering. Uppgrävda massor från runt rotklumpen placeras i plastpåsar och förde till labbet där en liten mängd jord tas för DNA extraktioner. DNA extraheras från rötter, jord och odlingsbädden och sedan förstärks med grundfärg för regionen V4 av 16S rRNA-genen. Amplikoner är sekvenserade, sedan analyseras med öppen access bioinformatiska verktyg. Dessa metoder tillåter forskare att testa hur den mikrobiella gemenskapens mångfald och sammansättning varierar på grund av provtyp, behandling, och plantera genotyp. Med dessa metoder tillsammans med statistiska modeller, visar representativa resultaten finns betydande skillnader i mikrobiella samhällen av rötter, odlingsbädden och jord. Metoder som presenteras här tillhandahåller en fullständig uppsättning steg för hur du samlar in fältprov, isolera, extrahera, kvantifiera, förstärka och sekvensera DNA och analysera mikrobiell gemenskapens mångfald och sammansättning i replikerade fältförsök.
Introduction
Mikrobiomet forskning har stor betydelse för förståelse och manipulera ekosystem processer såsom näringsämne Cykling, organiskt omsättning och utveckling eller hämning av jord patogener1,2. Detta område av forskning har också stor potential för att förstå effekterna av jord mikrober på produktiviteten i naturliga växt samhällen och agroecosystems. Medan det finns många studier som har fokuserat på den jord mikrobiomet i naturliga ekosystem, har färre fokuserat på anläggningen odlingsbädden och endosphere mikrober i agroecosystems3. I Nebraska dominerar jordbruket landskapet över stora delar av staten, att göra studier av dessa jordar där agriculturally viktiga grödor odlas ett viktigt ämne för forskning. Syftet med denna metoder papper är att förse forskare med en standarduppsättning protokoll att beskriva Mikroberna som är närvarande i agroecosystems, för att bestämma hur växternas rötter ändra de mikrobiella samhällena i odlingsbädden och endosphere, och att så småningom förstå de funktioner som dessa mikrober spelar i jord och växtskydd produktivitet.
Metoden presenteras här skiljer sig något från metoder som används av andra4,5 i att denna uppsats syftar till att lära sig vilka mikrober är uteslutande insidan roten och hur de skiljer sig från mikrober omedelbart utanför roten i den odlingsbädden. Amplikon sekvensering används i denna studie identifierar de mikrobiella taxa Funna i DNA-provet och gör att utredarna att avgöra hur gemenskaperna ändras beroende på Provtyp eller behandling. En av de viktigaste skillnaderna mellan denna och en mycket liknande-protokollet används av Lundberg et al. 6 är att istället för ultraljudsbehandling, detta protokoll använder surface sterilisering med blekmedel och etanol att ta bort odlingsbädden från rötterna. Andra har också använt surface sterilisering effektivt7,8,9,10. Dessa metoder är inte fördelaktigare än andra metoder, men något annorlunda. Dessa metoder är särskilt väl lämpad för stora fältexperiment eftersom med tillräckligt många människor är det möjligt att bearbeta över 150 fältet tomter per dag, vilket ger upp till ca 450 prover när uppdelad i endosphere, odlingsbädden och jord. Detta manuskript i detalj beskriver de metoder som används för provtagning i fältet, bearbeta materialet i labbet, extrahera och sekvensera DNA, och ger en kort översikt över stegen för att analysera sekvensering resulterande data.
Protocol
1. webbplatsen Beskrivning
- Beskriva experimentella fältet platser under samling perioder. Bestämma placeringen av fältet (latitud, longitud och höjd) med en GPS.
- Beskriv provtagning djup, provtagningstiden och jordens textur.
- Miljöfaktorer spelar viktiga roller i utformningen av mikrobiella samhällen. Spela in klimatinformation såsom årliga medeltemperaturen, årlig nederbörd, tidigare års växtföljd, jordbearbetning praxis, metod för befruktning och historia av webbplatsen fältet. Automatiska väderstationer eller andra enheter är användbara för att spela den dagliga nederbörd och temperatur över en växtsäsong.
2. insamling och bearbetning av jord, odlingsbädden och rot fältprov
- Utgrävning av växter.
- Märka en wash pan och skopan med en fästis som innehåller information om växtmaterial som skall provtas. Innehålla information som områdets nummer, plantera genotyp och växtarter. Bära märkt skopan till tomten och lämna tvätt pannan vid etablerade arbetsstationen i fältet.
- Pierce jord med en spade till ett djup av 30 cm att klippa någon av laterala rötter håll plantan i jorden. Ungefärlig volym är 18 cm3. Slumpmässigt välja och samla in två plantor per tomt från olika områden inom tomten.
- Gräva växternas rötter genom att utnyttja skyffeln och placera rotklumpen i märkta hinken. Ta märkt hinken med utgrävda roten bollen tillbaka till arbetsstationen i fältet. Skär av och kassera den aboveground växtbiomassa.
- Borttagning av jord från rötter och samling av bulk jord.
- Skaka rötter för att manuellt ta bort jord eller använda en spade eller en handhållen rorkult för att ta bort jord från rötterna. Skakar rötterna räcker att ta bort jord i mycket sandiga jordar. Använd handskar och placera rötter ligger i närheten av bearbetning.
- Efter omskakning rötterna, kommer att huvuddelen av marken vara i tvätta pannan. Blanda jorden i tvätta pannan och bryta upp någon jord jordklumpar med en handhållen rorkult. Placera ett prov av jord som är fria från skräp till en märkt, 17,7 x 19,5 cm dragkedja förvaringsväska och plats på en sval plats eller på is.
- Insamling av rötter och odlingsbädden.
- Med hjälp av beskärning sax steriliseras i 70% EtOH, punktskatt en mängd rötter, ungefär 4 till 6 rötter per planta och varje rot runt 9-12 cm i längd. Placera exciderad rötterna (skärning som behövs för att passa) i en märkt 50 mL tub som innehåller 35 mL autoklaveras, fosfatbuffert (6.33 HB NaH2PO4, 8,5 g/L Na2HPO4 vattenfri, pH = 6,5, 200 µl/L tensid).
Obs: Tensiden (se Tabell för material) lades efter autoklavering fosfatbuffert. Volymen av rotklumpen och rot längder varierar beroende på växten ålder och växtarter. - Skaka rör för 2 min att släppa odlingsbädden från ytan av rötterna. Med pincett steriliseras i 70% EtOH, ta bort rötterna från röret, blot kort på papper handdukar och placera i en ny, märkt 50 mL tub. Placera båda röret som innehåller odlingsbädden och den som innehåller rötter på is.
- Med hjälp av beskärning sax steriliseras i 70% EtOH, punktskatt en mängd rötter, ungefär 4 till 6 rötter per planta och varje rot runt 9-12 cm i längd. Placera exciderad rötterna (skärning som behövs för att passa) i en märkt 50 mL tub som innehåller 35 mL autoklaveras, fosfatbuffert (6.33 HB NaH2PO4, 8,5 g/L Na2HPO4 vattenfri, pH = 6,5, 200 µl/L tensid).
3. bearbetningen av fältet prover i laboratoriet
- Yta sterilisering av rötter efter fältuppsättningen.
Obs: Utföra ytan sterilisering så snart som möjligt efter att ha återvänt från fältet. Om det inte är möjligt att ytan sterilisera rötterna i samma dag, lagra rötter vid 4 ° C tills bearbetas.- Tillsätt cirka 35 mL 50% blekmedel + 0,01% Tween-20 till 50 mL rot rör samlas i fältet. Skaka 50 mL rör i 30 till 60 sekunder. Häll av 50% blekmedel och tillsätt 35 mL 70% EtOH. Skaka för ytterligare 30 till 60 sekunder.
- Häll av 70% EtOH och tillsätt 35 mL steril, ultrarent vatten. Skaka i en minut. Upprepa de vatten tvätten två gånger.
Obs: För att säkerställa vår yta sterilisering behandling räcker, vi Pläter prover av vatten från den sista sköljningen och observerades ingen tillväxt av bakterier (s. Wang, opublicerade data, 2014). Andra utredare har testat för roten sterilisering effektivitet använder liknande metoder9,10. - Blot rötter torr på rent hushållspapper. Använd en ren pappershandduk för varje prov.
Obs: Pappershanddukar kan steriliseras före användning. Vi sterilisera inte våra pappershanddukar. Men vi använder 1 pappershandduk per prov och hålla handdukar insvept tills används. - Med hjälp av steril pincett och beskärning sax, klippa rötterna i cirka 5 mm bitar och plats skär rötter i en ren, märkt 15 mL koniska rör. Lagra prover vid-80 ° C tills bearbetas vidare.
- Bearbetning odlingsbädden prover.
- Skaka 50 mL rör som innehåller odlingsbädden prover från fältet att resuspendera hela provet. Med hjälp av en steril, 100-µm-mesh cell sil (se Tabell för material), filtret återsuspenderade provet i en ny 50 mL tub.
- Centrifugera rören vid 3000 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Omedelbart Häll av och Kassera supernatanten.
- Placera odlingsbädden pellets i 50 mL tuberna på is. Lägga till 1,5 mL steril fosfatbuffert (utan tensider) i odlingsbädden pellets och vortex att avbryta.
- Pipettera svävande vätskan i en ren, märkt, 2 mL mikrofugrör. Snurra rören vid 15,871 x g under 2 minuter vid rumstemperatur. Häll av supernatanten och töm rören på rent hushållspapper direkt.
- Lagra pellets vid-20 ° C tills bearbetas vidare.
Obs: Steg 3.2.2 - 3.2.4 görs för att minska tube urvalsstorleken för lagring. Det är mer yteffektiva att lagra mindre 2 mL tuberna jämfört med 50 mL tuberna.
- Bearbetning av jordprover för DNA-extraktion och jord analys.
- Med hjälp av en steril metall spatel, Fyll en ren, märkt 2 mL tub med cirka 3 g jord för DNA-extraktion. Undvika små rot bitar och skräp. Lagra denna jordprov vid-20 ° C. Skölj metall spatel i 70% EtOH mellan varje prov.
- I en ren tvätt stekpanna, Töm påsen med jord i staplade siktar (se Tabell för material), större sieve ovanpå mindre sikten och manuellt siktas jorden genom båda siktar. Använd en borste för att noggrant rengöra siktarna mellan prover.
- Avsätta 100 till 125 g av sållen jord i en 17,7 x 19,5 cm blixtlås väska för framtida jord fysikalisk-kemiska och textur analys. Placera påsar av jord vid 4 ° C för kortsiktig lagring.
- Bearbetning av jordprover för markfuktighet.
- Tare en märkt brun papperspåse på en skala. Mät 40 till 45 g av sållen jord i den bruna papperspåsen. Vikten av den bruna papperspåsen och jord på ett datablad och plats väskor i torkugn ställs in till 55-60 ° C.
- Efter 72 timmar, ta bort påsar från torkugnen. Låt jord påsar svalna i minst 30 min och sedan väg.
- För att registrera vikten, Taravikt skalan till noll och placera de bruna papperspåsar på skalan. Beräkna procentandelen av markfuktighet för varje prov med hjälp av formeln:
Obs: Metoden jord fukt är från Kellogg biologiska Station lång sikt ekologisk forskning (KBS LTER). KBS LTER erbjuder ett brett utbud av etablerade protokoll för forskare på deras hemsida (https://Lter.kbs.msu.edu/).
4. beredning av bearbetade Root prover för DNA extraktioner.
- Mala frusna rot material så att provet är homogen.
- Häll flytande kväve i en plast bägare med ren spatlar och en ren mortel och stöt att hålla prover frysta under hela slipprocessen.
- Placera den frysta vävnaden i morteln och slipa med mortelstöten till ett fint pulver. Ständigt lägga till flytande kväve under slipning för att hålla prover fryst.
- Använda en spatel för att placera marken vävnaden i en ren, märkt 2 mL tub. Förvaras vid-80 ° C.
5. extraktion av DNA från jord och odlingsbädden prover i 96 brunnar Format
- Läsa in jordprover i 96 brunnar.
- Torka av arbetsområdet med 70% EtOH och 1% blekmedel. Använd lab handskar under dessa steg. Avlägsna jordproverna från-20 ° C lagring och låt Tina i en ishink.
- Ta bort locket tätning matta från en 96 brunnar utvinning plattan som tillhandahålls med DNA extraktion kit. Placera locket tätning matta mellan 2 papper våtservetter att hålla rena samtidigt som det inte är i bruk. Att undvika kontaminering, använda självhäftande 8-väl PCR remsor för att täcka de 12 kolumnerna med 96 brunnar utvinning plattan.
- Taravikt en steril väga-tratt (storlek SM) på en skala och väger sig 200 till 250 mg av jord.
Obs: Dessa sterila trattar är tillplattade på ena sidan, så tratten ligger plant på en skala. Tratten är fylld med jord och placeras direkt i en brunn. Denna teknik undviker förlust av prover, minimerar spill och förhindrar förorening. - Att avslöja den första brunnen Skyltens utvinning, lyft försiktigt självhäftande remsa, plats fylld väger-tratten till lämplig hals väl, och försiktigt vägleda jordprov i lämpliga brunnen. Ersätta den självhäftande remsan för att täcka brunnen.
- Upprepa processen för varje brunn av plattan, med en ny och steril tratt för varje prov tills plattan är fylld. Lämna en väl tom som en extraktion tom kontroll.
Obs: En väl är tomt på varje utvinning tallrik att servera som en negativ (tomt) kontroll. Detta styr för föroreningar som kan finnas i kit reagenser11. - Ersätta tätning matta locket på utvinning plattan och förvara plattan vid-20 ° C tills redo för DNA-extraktion.
- Laddar odlingsbädden prover i 96 brunnar.
- Ta bort odlingsbädden proverna från-20 ° C lagring och låt Tina i en ishink.
- Följ steg 5.1.2 ovan att förbereda DNA extraktion plattan.
- En rent papper torka på en skala, sedan Taravikt en steril metall spatel på skalan. Använd spateln för att noggrant ösa ut några av odlingsbädden pelleten från en prov tub. Återgå spateln till skalan och väger mellan 200 och 250 mg av odlingsbädden provet.
- Lyft försiktigt självhäftande remsa för att avslöja den första brunnen Skyltens utvinning, vinkel fyllda spateln i brunnen och skrapa bort odlingsbädden materialet i lämpliga brunnen med en steril tandpetare.
- Skölj den metall spateln i vatten, följt av 70% EtOH mellan prover. Upprepa processen för varje brunn av plattan tills plattan är fylld, lämnar en väl tom som en extraktion tom kontroll.
- Extraktion av DNA från odlingsbädden och jord prover i 96 brunnar format.
- Extrakt jord och odlingsbädden DNA med ett kit optimerad för jord (se Tabell för material), efter tillverkarens protokollet.
Obs: Vi använder detta specifika kit för att isolera mark och odlingsbädden DNA på grund av de egenutvecklade reagenserna förmåga att ta bort humussyra och andra kraftfulla PCR-hämmare finns i jord.
- Extrakt jord och odlingsbädden DNA med ett kit optimerad för jord (se Tabell för material), efter tillverkarens protokollet.
- DNA kvantifiering.
- Kvantifiera 92 prover och 4 koncentrationer av standarder med ett kit (se Tabell för material; standarder ingår), enligt tillverkarens protokollet.
- Kvantifiera de återstående 4 prover som har tagits bort från plattan att rymma brunnar för de fyra standarder använda ett kit (se Tabell för material), enligt tillverkarens protokollet.
6. extraktion av DNA från rot prover i 96 brunnar Format.
- Läsa in rot prover i 96 brunnar.
- Torka av arbetsområdet med 70% EtOH och 1% blekmedel. Använd skyddshandskar under dessa steg.
- Hålla marken rot prover frysta vid alla tider genom att placera prover i en hink med torris.
- Fyll en plast bägare med flytande kväve och placera antistatisk microspatulas och steril väga-trattar (storlek XSM) i plast bägaren att svalna.
- Ta bort lockets tätning matta från 96 brunnar utvinning pärla plattan som medföljer kit och placera den mellan 2 papper våtservetter att hålla rena samtidigt som det inte är i bruk.
Obs: Den nya versionen av detta kit, släppt efter den tid som vi utfört dessa DNA extraktioner, kräver att användaren att tillhandahålla extraktion pärla plattorna. I Tabellen för material, har vi listat leverantör kataloginformation för att beställa dessa artiklar. - Att undvika kontaminering, använda självhäftande 8-väl PCR remsor för att täcka de 12 kolumnerna med 96 brunnar utvinning plattan.
- Placera utvinning pärla plattan på torris att hålla prover i brunnarna fryst.
- Lyft försiktigt självhäftande remsa till avslöja den första brunnen av utvinning plattan, placera halsen på fylld väger-tratten i lämpliga brunnen, och tillsätt 3 spatel skopor av marken root vävnad. Ersätta den självhäftande remsan för att täcka brunnen.
Obs: Mark och odlingsbädden är Tinas på is före vägning, medan växtmaterial är invägda frysta. Fryst växtvävnad, särskilt små mängder, är svårt att väga på en skala utan upptining. Väga tester gjordes på marken root vävnad att avgöra hur många spatel skopor var tillräckliga. Observera att tillverkaren av kit kräver inte en exakt mängd vävnad men rekommenderar cirka 50 mg. olika växttyper prov varierar och användaren kommer att behöva bestämma lämpligt belopp. - Upprepa processen för varje brunn av plattan tills plattan är fylld.
- Förvara plattan vid-20 ° C tills redo för DNA-extraktion.
- DNA-extraktion av root vävnad.
- Extrahera DNA med en optimerad för växter (se Tabell för material) efter tillverkarens protokollet.
Obs: Vi använder detta kit som är utformad speciellt för växtvävnad att uppnå maximal avkastning från roten proverna. Till skillnad från jord och odlingsbädden är humussyra och andra föroreningar mindre problem för root vävnad.
- Extrahera DNA med en optimerad för växter (se Tabell för material) efter tillverkarens protokollet.
- Kvantifiera DNA som i steg 5,4.
7. förstärkning och sekvensering isolerad DNA.
- Förstärka regionen V4 av 16S genen med en korrekturläsning polymeras (se Tabell för material) som beskrivs i Gohl o.a. 12 streckkod prover med olika indexering grundfärger och pool innan sekvensering. Sekvensen med hjälp av de metoder som beskrivs av Gohl et al12 med en PCR process i två steg med V4 primers (kompletterande fil 1).
Obs: Några av metoderna dessa steg beskrivs i detalj på annan plats12,13,14 och kommer därför inte beskrivas här. För root prover lades PNA-blockerare till minska mängden plastid DNA amplifierats från växt vävnaden, som tidigare varit beskrivas fullständigt15. Två kontroller användes i sekvensering, en negativ kontroll som inkluderade extraktion plattan tom kontrollerna (se anmärkning efter steg 5.1.5), och en mock gemenskap av kända befolkningen på bakteriell DNA (se Tabell för material) som tjänade som som en positiv kontroll.
Obs: I de flesta fall används MiSeq reagens kit v3 i 2 X 300 bas Parade slutet läge. För prover i detta manuskript användes den Illumina HiSeq 2500 i snabb läge med 250 Paired-end (2 x 250)-läge. Alla provet var sekvenserade i samma körfält. - Bearbeta sekvensering data via en pipeline för mikrobiell gemenskapen analyser (USEARCH v9.2.64, QIIME till v1.9.1 och RStudio v3.4.3 16).
- Förbereda sekvensering data med hjälp av USEARCH17.
Obs: USEARCH är tillgänglig online med fullständiga instruktioner (https://www.drive5.com/usearch/). - Multiplex sekvensering data med hjälp av index läsningar eller streckkoder att tilldela prover Illumina läsningar.
- Slå samman den Parade-end läser för att få konsensus sekvenser. Använd kommandot: usearch-fastq_mergepairs * R1*.fastq-märka @ - fastq_maxdiffs 10 - fastq_minmergelen 230 - fastq_maxmergelen 320 - fastq_pctid 80 - fastqout merged.fq.
Obs: Parametrar ställs in genom att referera till USEARCH bruksanvisning. - Ta bort primers från sekvensering data för att undvika substitutioner i primer sekvenser, som kan orsakas av PCR-reaktionen. Använd kommandot: usearch-fastx_truncate merge.fq - stripleft 19 - stripright 20 - fastqout stripped.fq.
- Filtrera sekvensering data för att ta bort den låg kvalité läser och hålla hög kvalitet operativa taxonomiska enheten (OTU) sekvenser. Använd kommandot: usearch-fastq_filter stripped.fq-fastq_maxee 1.0 - fastaout filtered.fa.
- Förbereda sekvensering data med hjälp av USEARCH17.
- Generera OTUs i USEARCH.
- Utföra dereplication för att identifiera uppsättningen unika OTU sekvenser. Använd kommandot: usearch-fastx_uniques filtered.fa - fastaout uniques.fa - sizeout-märka om Uniq.
- Klustret OTUs med 97 – 100% sekvens likhet att utse de unika OTUs. Använd kommandot: usearch-cluster_otus uniques.fa - minstorlek 2 - otus otus.fa-märka Otu.
Obs: Detta steg också inlemmar avlägsnande av singletons från de klustrade OTUs och borttagning av hybridvarelser från sekvensering data. - Skapa en OTU-tabell i USEARCH. Använd kommandot: usearch-usearch_global stripped.fq - db otus.fa-strand plus - id 0,97 - otutabout otutable.txt.
Obs: Det här kommandot genererar en tabell med antal läsningar (antal) av alla OTUs för varje prov. Tabellen OTU används för efterföljande steg inklusive differential överflöd analyser och mikrobiell mångfald analyser. Exempel på OTU tabell visas i kompletterande bild 2. - Genomföra en förtunning analys i QIIME till v1.9.1 18.
Obs: Förtunning kurvan beräknas med tabellen OTU för att avgöra huruvida djupet av sekvensering ordentligt prover mikrobiell gemenskapen. Exempel på förtunning kurvor visas i kompletterande figur 3. - Genomföra en alfa mångfald analys18. Använd alpha_rarefaction.py i QIIME till v1.9.1 för att beräkna mångfalden av mikrobiell gemenskapen inom varje prov.
Obs: Denna analys beräknar mångfald index som Shannon19, Simpson20och Chao121. - Genomföra en beta mångfald analys18,22. Använda Python skript: beta_diversity_through_plots.py i QIIME till v1.9.1 Bray – Curtis olikhet matris.
Obs: Denna analys jämför mikrobiell gemenskapen sammansättning mellan prover. - Utföra statistiska analyser mellan grupperna. Använd de avstånd matriser beräknas för PERMONOVA med hjälp av adonis och anova funktionen i den veganska paketet23 v2.4.5 i RStudio16. Genomföra kanonisk analys av huvudsakliga koordinater (CAP) analys med hjälp av funktionen capscale i vegan paketet. Visualisera data med ggplot2 paketet24 2.2.1 i RStudio.
Representative Results
De representativa resultat som presenteras i detta manuskript kom från en plats inrättades 2012 på University of Nebraska-Lincoln jordbruk forskning Division gård nära Mead, NE. före experimentet, platsen hade hanterats som en majs-sojabönor rotation . Webbplatsen för studien var belägen på tre olika typer av jordar, men data analyserades som om alla ändringar i uppmätta markens egenskaper berodde på de behandlingar som införts.
Webbplatsen för fältet innehöll två, ren, står switchgrass (P. virgatum cv frihet) och stora bluestem (A. gerardii) samt en låg-mångfald gräs blandning som innehåller stora bluestem, familjen (S. nutans) och 'Butte' sideoats grama) B. curtipendula). Tre varma-säsong gräs tomterna var en randomiserad komplett block design som duplicerades tre gånger. Kapslade in tre olika gräs tomterna var två kväve (N) befruktning behandlingar, vilka var 56 (N1) och 112 (N2) kg N ha-1 tillämpad urea. På tiden av mikrobiomet provtagning i slutet av växtsäsongen, mark innehöll 8,0 ± 1,1 (medelvärde ± SD) ppm nitrat i tomterna gödslats med 112 kg N ha-1 och 6,8 ± 0,7 (medelvärde + SD) ppm nitrat i tomterna gödslats med 56 kg N ha-1. Tomterna hade varit befruktade en gång om året. Varm-säsong gräset tomter designerades som den huvudsakliga tomter (8000 m2) och N behandlingar var split tomterna (4000 m2). Stora bluestem var seedad som en 50: 50-blandning av 'Bonanza' och 'Goldmine' och familjen var seedad som en 50: 50-blandning av 'Scout' och 'Krigare'. Tomterna planterades i 2012, och den första N-ansökan inträffade våren 2013.
Mark och rot provtagning genomfördes den 15 September 2014. Arbetet beskrivs nedan utfördes på ett fält som inrättades som en split-plot randomiserad design med tre replikat (figur 1). Genomsnittliga sekvensering djupet av alla proverna för endosphere var följande: 4871 ± 5711 (genomsnitt ± SD), odlingsbädden: 40726 ± 14684, jord: 38184 ± 9043. En av de största källorna till variationen i dessa experiment, med hjälp av de metoder som beskrivs, är skillnaden i mikrobiella samhällen mellan provtyper (figur 2). I detta representativa data set verkar den odlingsbädden och jord vara mer liknande sammansättning till varandra än endosphere (figur 2A). Men det fanns också mycket betydelsefullt (p = 0,001) skillnader i mikrobiell gemenskapen sammansättning mellan odlingsbädden och jord (figur 2B). Den totala variationen som redovisas i dessa experiment som analyseras av provtyp var 26%.
Alpha mångfald analys visade att de mikrobiella samhällena i endosphere var lägre i provet mångfald jämfört med jord och odlingsbädden (figur 3). De enda betydande skillnaderna i mångfald mellan gräs arterna i någon avdelning var mellan de endosphere proverna av stora bluestem och switchgrass, med switchgrass har betydligt högre mikrobiell artrikedom (figur 3). Den relativa överflöd analysen (figur 4) belyser dominans av Proteobacteria följt av Actinobacteria i alla provtyper. Jord och odlingsbädden domineras också av Acidobacteria och Chloroflexi medan endosphere hade en större relativa överflöd av Bacteriodetes.
I detta experiment, växter odlades med två olika mängder av N-gödselmedel och därför vi analyserat data för att avgöra om det var behandlingseffekter. Behandlingseffekter stod för 12% av den totala variationen men var inte signifikant även i ordinationen de två behandlingarna ser olika (figur 5). Detta belyser vikten av statistiska analyser för dessa datamängder snarare än okulärbesiktning eller kvalitativa bedömningar.
Växt-influerade skillnader i mikrobiomet växt vävnader och jord var visualiserat med en begränsad metod för samordning. Statistiska skillnader fastställdes genom en PERMANOVA analys för att testa om specifika variabler, såsom arter, leda till avsevärt olika mikrobiella gemenskapen sammansättning mellan prover. När alla provtyper av analyserades tillsammans, hittades en mycket betydande skillnad i mikrobiell gemenskapen sammansättning på grund av växtarter (figur 6). I detta experiment var 6,7% av variationen förklaras av växtarter. Slutligen analyserades varje Provtyp individuellt för att bestämma vilka av typerna av prov kan köra effekten signifikant växt arter. Endast i endosphere var det en mycket signifikant skillnad (p = 0,001) mellan den mikrobiella gemenskap kompositioner av de olika växtarterna (figur 7). I de andra typerna av prov var arter effekten inte signifikant när analyseras individuellt. I endosphere var procent variationen på grund av arter 27%, medan den var lägre i odlingsbädden (18%) och jord (15%). Detta understryker ytterligare vikten av att analysera varje vävnadstyp individuellt.
Figur 1: exempel på experimental fältet designen. Experimental fältet design illustrerar en randomiserad komplett block design i tre exemplar av fältet platsen ligger på University of Nebraska-Lincoln östra Nebraska forskning och förlängning centrum nära Mead, NE. För fullständiga webbplatsen beskrivning se avsnittet resultat. N1 är låg (56 kg N ha-1 urea) och N2 (112 kg N ha-1 urea) är den högsta kväve ränta som tillämpades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beta mångfald analys jämföra mikrobiella sammansättningen i de olika provtyper inklusive endosphere, odlingsbädden och jord från perenna gräs provtagning 2014. Analysen genomfördes med ett Python-skript i QIIME1.9.1 för att producera matrisen Bray-Curtis olikhet. Huvudsakliga koordinater analys (PCoA) baserat på matrisen Bray-Curtis olikhet var visualiserat i RStudio. PCoA1 och PCoA2 visar första och näst största variansen förklaras av PCoA analysen. PERMANOVA statistisk analys utfördes för att fastställa betydelsen mellan typer av prov och p värde visas längst upp till höger. Varje symbol i siffrorna representerar hela mikrobiell gemenskapen för varje prov. (A) Endosphere, odlingsbädden och jord provtyper analyseras tillsammans. Alla 87 prover var uttunnade till 486 sekvenser per prov. (B) odlingsbädden och jord prover analyserades tillsammans. Alla 59 prover var uttunnade med 8231 sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Alpha mångfald analys använder Shannon index för varje art i endosphere, odlingsbädden och jord. Analysen genomfördes med ett Python-skript i QIIME1.9.1. Förtunning gjordes för endosphere, odlingsbädden och jordtyper prov respektive med 486, 17154 och 8231 sekvenser per prov. Rutorna ange 25 och 75: e percentilerna (första och tredje kvartiler). Den horisontella linjen inom rutan betecknar medianen och röda plus visar medelvärdet. Whiskers visar utbudet av data exklusive extremvärden (som visas som svarta prickar) som föll mer än 1,5 gånger interkvartilintervall (n = 6 för varje prov utom för sideoats grama blanda där n = 5). Shannon index för alla fem arter i endosphere var lägre än både odlingsbädden och jord. Icke-parametrisk Wilcoxon rank sum test användes för att fastställa betydelsen mellan arterna och endast signifikanta skillnader mellan arter visades ovanpå rutorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: relativa överflöd på stam nivå i endosphere, odlingsbädden och jord. Proverna analyserades för att jämföra överflödet av mikrobiell phyla bland olika prover typer (n = 29 för varje prov). Analysen genomfördes med ett Python-skript i QIIME1.9.1 från tabellen OTU. De olika färgerna i pie-diagrammet beteckna phyla. Procentsatsen anger det relativa överflödet av varje stam i varje Provtyp. Den stam informationen var kommenterad använder den Ribosomal databasprojektet klassificerare (RDP)25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: analys med behandling som begränsande faktor mellan alla provtyper. Kanonisk analys av huvudsakliga koordinater (CAP) analys utfördes för att fastställa huruvida det fanns skillnader i mikrobiell gemenskapen sammansättning mellan behandlingarna. För varje N behandling, n = 42 för N1 (56 kg N ha-1) och n = 45 för N2 (112 kg N ha-1). Bray-Curtis olikhet matrisen genererades med ett python-skript i QIIME1.9.1. CAP analys utifrån matrisen Bray-Curtis olikhet gjordes av begränsande behandling som faktor i RStudio. PERMANOVA analys utfördes för att avgöra om behandling skillnader var signifikanta och p värde visas längst upp till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: analys med växtarter som begränsande faktor mellan alla provtyper. Analys utfördes för att fastställa huruvida det fanns skillnader i mikrobiell gemenskapen sammansättning mellan växtarter i alla provtyper. Huvudsakliga koordinater samordning och CAP analys av alla provtyper (endosphere, odlingsbädden och jord) gjordes med en Bray-Curtis olikhet-matris. Bray-Curtis olikhet matrisen genererades med hjälp av Python-skript i QIIME1.9.1. CAP analys utifrån matrisen Bray-Curtis olikhet gjordes av begränsande växtarterna som faktor i RStudio. PERMANOVA statistisk analys utfördes för att fastställa betydelsen mellan växtarter och P värde visas längst upp till höger. Varje symbol i siffrorna representerar hela mikrobiell gemenskapen för urvalet. n = 18 för varje art i alla typer av prov utom n = 15 för den sideoats grama blandningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: exempel på CAP analys med arter som begränsande faktor för varje Provtyp individuellt. Huvudsakliga samordna samordning och CAP analys av varje Provtyp (endosphere, odlingsbädden och jord) med hjälp av Bray-Curtis olikhet matris. Varje Provtyp var uttunnade 486, 17154 och 8231 läsningar per prov respektive i endosphere, odlingsbädden och jord. Arter användes som faktorn för att begränsa ordinationen. PERMANOVA statistisk analys utfördes för att fastställa betydelsen mellan växtarter i varje Provtyp och p värde visas längst upp till höger. Varje symbol i figuren representerar hela mikrobiell gemenskapen för varje prov. Urvalsstorleken är n = 29 för varje provtyp, n = 6 för varje växtart i varje Provtyp utom sideoats grama mixen (n = 5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De metoder som beskrivs i detta manuskript bör göra det möjligt för forskare att enkelt ange fältet av jord och växt metagenomik. Genom åren har vi förfinat våra metoder sedan genomför de experiment som beskrivs i detta manuskript. En förändring är att vi nu före etiketten rör innan du går ut till fältet till provet. Vårt labb använder ett barcoding system och en etikettskrivare. Etikettskrivaren sparar inte bara tid då märkning rör, men också gör allting lättare att spåra och att korrekt identifiera prover utan nyckfulla av mänsklig hand skrivande. En annan kritisk punkt är att vi försöker bearbeta materialet efter bringande den tillbaka från fältet så snart som möjligt. Vi strävar efter att frysa den jord som används för DNA-analys, sterilisera och frysa rötterna, och filtrera och frysa odlingsbädden inom 12 till 36 timmar efter återkomsten från fältet. DNA extraktion förfarandena är lång med många steg, särskilt för jord och odlingsbädden, så vi köpte en robot (kungsfiskare Flex, ThermoFisher) som minimerar händerna på tid för DNA extraktion protokoll, minskar mänskliga fel som kan införas, och förbättrar samstämmigheten i de sätt olika partier av marken, rötter eller odlingsbädden bearbetas. När du arbetar med växtmaterial är det viktigt att besluta på vilken rot studeras eller att ta en mängd rot typer att få ett ”representativt urval”. Att upprätthålla rötter och lämnar i fryst tillstånd när genomför de DNA extraktioner är viktigt, vilket är att säkerställa att det finns ingen korskontamination mellan prover när du fyller 96 brunnar DNA extraktion plattor. En annan viktig faktor att beakta är antalet replikat som ska användas när designa fältexperiment och använda en komplett randomiserad design om möjligt26. Det kan vara nödvändigt att ha ett stort antal replikat att upptäcka små skillnader på grund av kicken sätter in variabilitet. Slutligen från vår erfarenhet är det viktigt att se till jordar inte är alltför våt när grävning rötterna. Om marken är mättad med vatten är det inte bara rörigt att arbeta med, men det är också mycket svårt att definiera i odlingsbädden och ta bort jorden från rötterna.
En ändring som gjordes tidigt under utvecklingen av dessa metoder var istället för skakningar rören för hand för att släppa den odlingsbädden vi uppgraderade till vortexers som drivs av en gasgenerator för att göra arbetet lättare och mer standardiserat i termer av tid och sätt att varje tub var upprörd. En begränsning med metoden amplikon sekvensering är att resultaten taxonomisk upplösning är ofta begränsad och många OTUs är okänd eller bara kända på familj- eller släkte. Forskningsområdet utvecklas snabbt så det är viktigt att vara medveten om nya och utveckla metoder, särskilt för dataanalys som kan förbättra resolutionen av resultaten.
Dessa protokoll är endast för att studera bakterier och arkéer, inte svampar. Användning av olika grundfärger för förstärkning kommer att möjliggöra studiet av svamp samhällen med de samma DNA prover27,28. Dessa metoder kräver inte inköp av stora mängder utrustning eftersom metoderna kan förenklas. De metoder som vi beskriver här är främst för att bestämma ”vem är det”, men fältet är att snabbt utvecklas till viktiga frågor om funktion, som kan åtgärdas med hjälp av shotgun sekvenseringsmetoder, isolering och testa funktionaliteten i mikrober eller sekvensering hela mikrobiell genomen.
De representativa resultat belysa skillnader i mikrobiella samhällen som kan identifieras med hjälp av de metoder som beskrivs. Med en beta-mångfald metod till data analys22, visades kompositionella skillnader mellan provtyper. Dessa skillnaden tydligt har observerats i de flesta andra studier där endosphere, odlingsbädden och jord innehåller unika mikrobiella samhällen3. Shannon mångfaldsindex beräknades för att bestämma överflöd och jämnhet av mikrobiell arten som finns inom varje växtarter i endosphere, odlingsbädden och jord. Som framgår i denna studie och i många andra, är alfa mångfald högst i smutsa, minska något i odlingsbädden och sedan minskar betydligt i endosphere3,5,29. Dessa resultat tyder på att de metoder som beskrivs här är lämpliga för att identifiera kompositionella förändringar i endosphere, odlingsbädden och jord.
Herravälden av Proteobacteria är ett vanligt konstaterande i studier på endosphere och jord30,31,32. Endosphere har i allmänhet en lägre mångfald av mikrobiell art med en högre relativa överflöd av Proteobacteria. Detta belyser återigen att resultaten här är representativa för andra fynd i litteraturen. Behandling effekterna i denna studie var inte signifikant och två stora skäl för det kan vara att skillnaderna som införts av behandlingarna inte var tillräckligt stor för att generera tillräcklig variation att upptäcka och att denna provtagning var klar i slutet av den växande säsongen, när fälten kan ha haft tillräcklig tid att dra ner kvävet till liknande nivåer, vilket är vad mättes i slutet av säsongen. I en annan studie med liknande befruktning priser över en längre tidsperiod, var endast relativt små förändringar i sammansättningen av mikrobiomet uppmätta33. Andra studier har visat förändringar i både svamp och bakteriella samhällen på grund av kväve gödselmedel34,35.
Växtarter är känd för att spela roller vid fastställandet av deras microbiomes3,32,36 och även små skillnader i mikrobiell gemenskapen variation har påvisats mellan olika växt genotyper inom en enda art37. I denna studie sågs en signifikant skillnad i mikrobiell gemenskapen sammansättning mellan växtarter. Alla provtyper av visade att switchgrass hade mest distinkta mikrobiella sammansättningen, men skillnaderna mellan arterna var endast statistiskt signifikant i endosphere. Odlingsbädden gemenskapen sammansättning kan bli betydande om fler replikat fanns tillgängliga för analys.
Den sammanslagna fältet, lab och analytiska protokoll som beskrivs här ger en kraftfull metod för att studera hur olika faktorer påverkar sammansättningen av mikrobiella samhällen i jordar, odlingsbädden och endosphere av rötter36. I området i närheten finns det en hel del arbete att göra i området studerar microbiomes, särskilt i jordbruks områden. Viktiga frågor om hur avkastningen ändras med den jord mikrobiomet har ännu inte vara helt klarlagd. Även de mest grundläggande frågorna om hur växtföljder påverka den jord microbiom, hur timing förändrar microbiom, hur abiotisk stress förändrar microbiom, hur jordart interagerar med dessa faktorer att förändra mikrobiomet och om det finns Universal mikrober i vissa grödor eller regioner i USA är alla öppna frågor. Dessa metoder kommer också vara användbar för epidemiologiska studier för att identifiera närvaron och persistens av patogena och nyttiga bakterier. En annan framtida Horisont för dessa metoder kommer att börja integrera de DNA-metoderna som beskrivs här med växt- och mikrob RNA- och metaboliten data. Ytterligare förbättring och testning av fler variabler kommer att vara viktigt för ytterligare optimering av dessa protokoll.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Utvecklingen av detta manuskript stöds av National Science Foundation EPSCoR Center för Root och Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Datainsamlingen var stöds av medel från University of Nebraska-Lincoln, jordbruksforskning och utveckling och en lucka bidrag från USDA. Vi erkänner också stöd från USDA-ARS och stöd tillhandahölls av jordbruk och livsmedel forskning initiativ konkurrenskraftiga bidrag nr 2011-68005-30411 från USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk för att upprätta och hantera dessa fält.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
| Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
| D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
| Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
| Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
| Cooler | Any | NA | |
| Wash pan | Any | NA | |
| Plastic bucket | Any | NA | |
| Gloves (work and lab) | Any | NA | |
| 20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
| 20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
| portable generator | Honda brand works well | NA | |
| Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
| Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
| Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
| Autoclaves | Any | NA | |
| Drying Oven | Any | NA | |
| Scale | Any | Any | |
| Bleach | CLOROX - household strength | NA | |
| Tween 20 | Any | NA | |
| Liquid Nitrogen | Any | NA | |
| Dry Ice pellets | Any | NA | |
| Ethanol | Any | NA | |
| 11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
| 18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
| 13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
| 2 mL tube | Any | NA | |
| 15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
| 50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
| Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
| 96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
| pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
| mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
| Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
| Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
| Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
| 1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
| antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
| antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
| Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
| Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
| Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
| Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
| Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
| 5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
| Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
| Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 - Biosafe | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |
References
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
- Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7 (1), 15019 (2017).
- White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
- Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).
- Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).
- Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).
- Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
- Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
- Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
- Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
- Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).
- Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
- Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
- O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).
- Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).
- Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349 (6250), 860-864 (2015).
- Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).
- Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).
- Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5 (7), e11915 (2010).
- Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).
