Summary
Udgravning af planternes rødder fra feltet samt behandling af prøver i endosphere, rhizosfære og jord er beskrevet i detaljer, herunder DNA-ekstraktion og data analysemetoder. Dette papir er beregnet til at aktivere andre laboratorier til at anvende disse metoder til undersøgelse af jordbundens, endosphere og rhizosfære microbiomes.
Abstract
Plante og jord microbiome undersøgelser stadig vigtigere for forståelse roller mikroorganismer spiller i landbrugets produktivitet. Formålet med dette manuskript er at give detaljer om, hvordan du hurtigt prøve jord, rhizosfære og endosphere af replikerede markforsøg og analysere ændringer, der kan opstå i de mikrobielle samfund prøvetype, behandling og plante genotype. Eksperimentet bruges til at påvise disse metoder består af replikerede felt parceller indeholdende to, ren, varm-sæson græsser (Panicum virgatum og Andropogon gerardii) og en lav-mangfoldighed græs blanding (A. gerardii, Sorghastrum nutans, og Bouteloua curtipendula). Kort, planter er udgravet, en bred vifte af rødder er skåret og placeret i fosfat buffer, og derefter rystet til at indsamle rhizosfære. Rødderne er bragt til laboratoriet på is og overflade steriliseret med blegemiddel og ethanol (EtOH). Rhizosfære er filtreret og koncentreret ved centrifugering. Opgravet jord fra omkring rodklumpen er placeret i plastikposer og bragt til laboratoriet, hvor en lille mængde af jord er taget for DNA ekstraktioner. DNA er ekstraheret fra rødderne, jordbunden og rhizosfære og derefter forstærkes med primere for regionen V4 af 16S rRNA-genet. Amplikoner sekventeret, så analyseret med åben adgang bioinformatik værktøjer. Disse metoder giver forskere til at teste, hvordan den mikrobielle samfund mangfoldighed og sammensætning varierer på grund af prøvetype, behandling, og plante genotype. Bruger disse metoder sammen med statistiske modeller, viser de repræsentative resultater, er der betydelige forskelle i mikrobielle samfund af rødder, rhizosfære og jord. Metoder præsenteres her giver et komplet sæt af trin til hvordan man kan indsamle feltprøver, isolere, uddrag, kvantificere, forstærke og DNA-sekvens, og analysere mikrobielle samfund mangfoldighed og sammensætning i replikerede feltforsøg.
Introduction
Microbiome forskning har stor betydning for forståelse og manipulere økosystem processer som næringsstof cykling, organisk materiale omsætning, og den udvikling eller hæmning af jord patogener1,2. Dette område af forskning også rummer et stort potentiale for at forstå virkningerne af jord mikrober på produktiviteten i naturlige plantesamfund og agroecosystems. Mens der er mange undersøgelser, der har fokuseret på jord microbiome i naturlige økosystemer, har færre fokuseret på plante rhizosfære og endosphere mikrober i agroecosystems3. I Nebraska dominerer landbrug landskabet i store dele af den stat, at foretage undersøgelser af disse jordtyper hvor landbrugsmæssigt vigtige afgrøder dyrkes et vigtigt emne for forskningen. Formålet med denne metoder papir er at give forskerne et standard sæt af protokoller til at beskrive de mikrober til stede i agroecosystems, for at bestemme, hvordan planterødder ændre de mikrobielle samfund i rhizosfære og endosphere, og at i sidste ende forstå de funktioner, disse mikrober spille i jordens sundhed og plantesundhed produktivitet.
Metoden præsenteres her adskiller sig lidt fra metoder, der anvendes af andre4,5 i, dette dokument tager sigte på læring som mikrober er udelukkende inde i roden og hvordan de adskiller sig fra mikrober umiddelbart uden rod i den rhizosfære. Amplikon sekventering anvendes i denne undersøgelse identificerer de mikrobielle taxa fundet i DNA-prøven og giver mulighed for efterforskerne at finde ud af, hvordan Fællesskaberne ændres afhængigt af prøvetypen eller behandling. En af de vigtigste forskelle mellem denne protokol og en meget lignende protokol, der bruges af Lundberg et al. 6 er at i stedet for sonikering, denne protokol bruger overflade sterilisation med blegemiddel og ethanol til at fjerne rhizosfære fra rødderne. Andre har også brugt overflade sterilisation effektivt7,8,9,10. Disse metoder er ikke mere fordelagtig end andre metoder, men lidt anderledes. Disse metoder er særligt velegnet til store markforsøg, fordi med nok folk er det muligt at behandle over 150 felt parceller pr. dag, der tilføjer op til ca 450 prøver når opdelt i endosphere, rhizosfære og jord. Dette manuskript beskriver i detaljer de metoder, der anvendes til prøve i feltet, behandle materialet i laboratoriet, uddrag og DNA-sekvens, og giver en kort oversigt over de skridt til at analysere de resulterende sequencing data.
Protocol
1. Site feltbeskrivelsen
- Beskrive eksperimentelle felt websteder samling perioder. Bestemmer placeringen af felt (Breddegrad, længdegrad og højde) ved hjælp af en GPS.
- Beskriv prøveudtagning dybde, prøvetagningstid og jordstruktur.
- Miljømæssige faktorer spiller en vigtig rolle i udformningen af mikrobielle samfund. Optage klima oplysninger Årsmiddeltemperaturen, årlige nedbør, forudgående års sædskifte, jordbearbejdning praksis, metode til befrugtning, og historien om webstedet felt. Automatiske vejrstationer eller andre enheder er nyttige til at optage den daglige nedbør og temperatur over en vækstsæson.
2. indsamling og forarbejdning af jord, rhizosfære og rod feltprøver
- Udgravning af planter.
- Mærke en vask pan og spand med en huskeseddel, der indeholder oplysninger om plantemateriale skal udtages. Indeholde oplysninger såsom plot tal, plante genotype og plantearter. Bære mærket spanden til plottet og efterlade vask pan på den etablerede arbejdsstation i feltet.
- Gennembore jord med en skovl til en dybde af 30 cm til at skære noget af de laterale rødder holde planten i jorden. Den omtrentlige mængde er 18 cm3. Tilfældigt vælge og indsamle to planter pr. plot fra forskellige områder inden for plot.
- Udgrave planternes rødder ved at udnytte skovlen og placere rodklumpen i mærket spanden. Laddet mærket med den udgravede rodklump tilbage til arbejdsstation i feltet. Afskåret og kassér den overjordiske plantebiomasse.
- Fjernelse af jord fra rødderne og samling af bulk jord.
- Ryst rødder for at manuelt fjerne jord eller bruge en spade eller en håndholdt fræser til at fjerne jord fra rødderne. Ryster rødderne er tilstrækkelige til at fjerne jord i meget sandede jorder. Bære handsker og placere rødder tæt behandling.
- Efter omrystning rødderne, bliver hovedparten af jorden i vask pan. Bland jorden i vask pan og bryde op enhver jord clods med en håndholdt rorpind. Placer en stikprøve af jord, der er fri for snavs ind i en mærket, 17,7 x 19,5 cm lynlås opbevaringspose og sted i et køligt sted eller på is.
- Indsamling af rødder og rhizosfære.
- Ved hjælp af beskæring saks steriliseret i 70% EtOH, punktafgifter en bred vifte af rødder, ca 4 til 6 rødder pr. plante og hver root ca 9-12 cm i længden. Placer skåret rødderne (skæring som skulle passe) i en mærket 50 mL tube indeholder 35 mL af autoklaveres, fosfat buffer (6,33 g/L NaH2PO4, 8,5 g/L Na2HPO4 vandfri, pH = 6,5, 200 µl/L overfladeaktivt stof).
Bemærk: Det overfladeaktive stof (Se Tabel af materialer) blev tilføjet efter autoklavering fosfat buffer. Mængden af rodklump og root længder varierer afhængigt af anlægget alder og plantearter. - Ryst rør for 2 min til at frigive rhizosfære fra overfladen af rødderne. Med pincet steriliseret i 70% EtOH, Fjern rødder fra røret, skamplet kort på papir håndklæder, og sted i en ny, mærket 50 mL tube. Placere begge rør indeholdende rhizosfære og den, der indeholder rødder på is.
- Ved hjælp af beskæring saks steriliseret i 70% EtOH, punktafgifter en bred vifte af rødder, ca 4 til 6 rødder pr. plante og hver root ca 9-12 cm i længden. Placer skåret rødderne (skæring som skulle passe) i en mærket 50 mL tube indeholder 35 mL af autoklaveres, fosfat buffer (6,33 g/L NaH2PO4, 8,5 g/L Na2HPO4 vandfri, pH = 6,5, 200 µl/L overfladeaktivt stof).
3. behandling af feltet prøver i laboratoriet
- Overflade Sterilisation af rødder efter feltsamlingen.
Bemærk: Udføre overflade sterilisation hurtigst muligt efter hjemkomsten fra feltet. Hvis det ikke er muligt at overfladen sterilisere rødderne i den samme dag, gemme rødder ved 4 ° C indtil behandles.- Tilsættes ca 35 mL af 50% blegemiddel + 0,01% Tween 20 til 50 mL root rør indsamlet i feltet. Ryst 50 mL rør i 30 til 60 sekunder. Hæld 50% blegemiddel og tilsaettes 35 mL 70% EtOH. Ryste for en anden 30 til 60 sekunder.
- Hæld 70% EtOH og tilsaettes 35 mL sterilt ultrarent vand. Rystes 1 minut. Gentag vandet vaskes to gange mere.
Bemærk: For at sikre vores overflade sterilisation behandling er tilstrækkelig, vi forgyldt prøver af vandet fra den sidste skylning og observerede ingen vækst af bakterier (P. Wang, upublicerede data, 2014). Andre efterforskere har testet for root sterilisation effektivitet ved hjælp af lignende metoder9,10. - DUP rødder tør på rene papirservietter. Brug en ren papirserviet for hver prøve.
Bemærk: Papirhåndklæder kan steriliseres inden brugen. Vi ikke sterilisere vores papirhåndklæder. Men vi bruger 1 papir håndklæde pr. prøve og holde håndklæder indpakket indtil anvendes. - Brug steril pincet og beskæring saks, skåret rødderne i ca 5 mm stykker og sted skåret rødder i en ren, mærket 15 mL konisk slange. Gemme prøver på-80 ° C indtil videreforarbejdes.
- Behandling af rhizosfære prøver.
- Ryst 50 mL rør indeholdende rhizosfære prøver fra feltet til resuspend hele prøven. Ved hjælp af en steril, 100 µm mesh celle si (Se Tabel af materialer), filter den resuspenderede prøve ind i en ny 50 mL rør.
- Der centrifugeres rør på 3000 x g i 5 min ved stuetemperatur. Straks hæld og supernatanten.
- Placer rhizosfære pellets i 50 mL rør på is. Tilføje 1,5 mL sterilt fosfat buffer (uden overfladeaktivt stof) til rhizosfære pellets og vortex at suspendere.
- Med pipette overfoeres suspenderede væsken ind i en ren, mærket, 2 mL mikrofuge rør. Spin rør på 15,871 x g i 2 min. ved stuetemperatur. Straks hæld supernatanten og afløb rør på rene papirservietter.
- Gemme piller ved-20 ° C indtil videreforarbejdes.
Bemærk: Trin 3.2.2 - 3.2.4 er gjort for at reducere tube stikprøvestørrelse for opbevaring. Det er mere plads effektivt at gemme de mindre 2 mL rør sammenlignet med 50 mL rør.
- Behandling af jordprøver til DNA-ekstraktion og jord analyse.
- Med en steril metal spatel, udfylde en ren, mærket 2 mL tube med ca. 3 g jord til DNA-ekstraktion. Undgå enhver lille rod stykker og debris. Gemme denne jordprøve på-20 ° C. Skyl metal spatel i 70% EtOH mellem hver prøve.
- I en ren vask pan, Tom pose jord i stablet sier (Se Tabel af materialer), større sigte på mindre sien, og manuelt sigten jorden gennem begge sier. Brug en børste til forsigtigt rengøre sier mellem prøver.
- Der er afsat 100 til 125 g af sigtede jord i en 17,7 x 19,5 cm lynlås pose for fremtidige jordbundens fysisk-kemiske og tekstur analyse. Placere tasker af jord ved 4 ° C for kortvarig oplagring.
- Behandling af jordprøver til jord fugt.
- Tara en mærket brune papirpose på en skala. Mål 40-45 g sigtede jord i den brune papirpose. Vægt af brun papirpose og jord på et datablad og sted poser i en tørring ovn indstillet til 55-60 ° C.
- Efter 72 timer, skal du fjerne poser fra tørring ovnen. Tillad jord poser afkøles i mindst 30 min. og derefter vejes.
- For at registrere vægten, Tara-skala til nul og placere de brune papirsposer på skalaen. Beregne procentdelen af jordfugtighed for hver prøve ved hjælp af formlen:
Bemærk: Jord fugt metode er fra Kellogg biologiske Station lang sigt økologisk forskning (KBS LTERET). KBS LTERET giver en bred vifte af etablerede protokoller for forskere på deres hjemmeside (https://Lter.kbs.msu.edu/).
4. forberedelse af forarbejdede rod prøver til DNA ekstraktioner.
- Grind frosne roden materiale, således at prøven er homogen.
- Hæld flydende kvælstof i en plastik bæger med ren spatler og i en ren morter og støder at holde prøver frosset hele slibeprocessen.
- Læg den frosne væv i mørtel og male med pistil til et fint pulver. Løbende tilføje flydende kvælstof i hele slibning for at holde prøver nedfryses.
- Brug en spatel til at anbringe jorden væv i en ren, mærket 2 mL tube. Opbevares ved-80 ° C.
5. udvinding af DNA fra jorden og rhizosfære prøver i 96-brønds Format
- Ilægning af jordprøver i 96-brønd plader.
- Tørre ned arbejdsområdet med 70% EtOH og 1% blegemiddel. Lab handsker under disse trin. Fjerne Jordprøverne fra-20 ° C opbevaring og tillade for at tø i en isspand.
- Fjern dækslet til forsegling mat fra en 96-brønd udvinding plade, der er forsynet med DNA udvinding kit. Placer den forsegling mat dække mellem 2 papir klude til at holde ren mens den ikke er i brug. At undgå kontaminering, brug selvklæbende 8-godt PCR strips for at dække de 12 kolonner i 96-brønd udvinding plade.
- Tara en steril vejer-tragt (størrelse SM) på en skala og afvejes 200 til 250 mg af jord.
Bemærk: Disse sterile tragte samkopieres på den ene side, så tragten ligger fladt på en skala. Tragten er fyldt med jord og placeres direkte i en brønd. Denne teknik forhindrer tab af prøver, minimerer spild og forhindrer krydskontaminering. - At afdække de første godt af udvinding plade, løft forsigtigt den selvklæbende strimmel, sted fyldt vejer-tragten i den passende hals godt, og forsigtigt guide jordprøven i passende brønden. Erstatte den selvklæbende strimmel for at dække brønden.
- Gentag denne proces for hver brønd af plade, med en ny, sterile tragt for hver prøve, indtil pladen er fyldt. Forlade en godt tomme som en udvinding blindprøvekontrollen.
Bemærk: Et godt tomt på hver udvinding plade til at tjene som et negativ (tom) kontrol. Dette kontrollerer for forurenende stoffer, der kan være til stede i kit reagenserne11. - Erstatte forsegling mat dækslet på udvinding plade og opbevar plade på-20 ° C indtil klar til DNA-ekstraktion.
- Indlæse rhizosfære prøver i 96-brønd plader.
- Fjern rhizosfære prøver fra-20 ° C opbevaring og tillade for at tø i en isspand.
- Følg trin 5.1.2 ovenfor for at forberede DNA udvinding plade.
- Placer en ren papir tørre på en skala, så Tara en steril metal spatel på skalaen. Brug spatlen til omhyggeligt øse ud nogle af de rhizosfære pellet fra et prøveglas. Returnere spatlen til omfanget og vejer mellem 200 og 250 mg af den rhizosfære prøve.
- Løft forsigtigt Lim strimlen for at afdække de første godt af udvinding plade, betragtningsvinkel fyldte spatel ned i brønden og skrabe off rhizosfære materialet i de relevante brønd med en steril tandstikker.
- Skyl den metal spatel i vand, efterfulgt af 70% EtOH mellem prøver. Gentag denne proces for hver brønd af pladen, indtil pladen er fyldt, forlader et godt tomme som en udvinding blindprøvekontrollen.
- Udvinding af DNA fra rhizosfære og jord prøver i 96-brønds format.
- Ekstrakt jord og rhizosfære DNA ved hjælp af et kit optimeret til jorden (Se Tabel af materialer), efter fabrikantens protokol.
Bemærk: Vi bruger denne specifikke kit til at isolere jord og rhizosfære DNA på grund af de proprietære reagenser evne til at fjerne humusfraktionerne syre og andre magtfulde PCR hæmmere fundet i jord.
- Ekstrakt jord og rhizosfære DNA ved hjælp af et kit optimeret til jorden (Se Tabel af materialer), efter fabrikantens protokol.
- DNA kvantificering.
- Kvantificere 92 prøver og 4 koncentrationer af standarder ved hjælp af et kit (Se Tabel af materialerstandarder er inkluderet), efter fabrikantens protokol.
- Kvantificere de resterende 4 prøver, der blev fjernet fra pladen til at rumme brønde for de fire standarder ved hjælp af et kit (Se Tabel af materialer), efter fabrikantens protokol.
6. udvinding af DNA fra roden prøver i 96-brønds Format.
- Indlæse rod prøver i 96-brønd plader.
- Tørre ned arbejdsområdet med 70% EtOH og 1% blegemiddel. Bære handsker under disse trin.
- Holde jorden rod prøver fastfrosset på alle tidspunkter ved at placere prøver i en spand med tøris.
- Fyld en plastik bæger med flydende kvælstof og placere antistatisk microspatulas og sterile vejer-kanaler (størrelse XSM) i plast bægerglasset at køle ned.
- Fjern forsegling mat dækslet fra 96-brønd udvinding perle pladen, der er forsynet med kit og Placer den mellem 2 papir klude til at holde ren mens den ikke er i brug.
Bemærk: Den nyere version af dette kit, udgivet efter den tid, vi udførte disse DNA ekstraktioner, kræver, at brugeren til at levere udvinding perle plader. I Tabel af materialer, har vi opført katalog kreditoroplysninger skulle bestille disse elementer. - At undgå kontaminering, brug selvklæbende 8-godt PCR strips for at dække de 12 kolonner i 96-brønd udvinding plade.
- Udvinding perle pladen anbringes på tøris til at holde prøver i brøndene frosset.
- Løft forsigtigt den selvklæbende strimmel at afdække de første godt af udvinding plade, placere halsen af den fyldte vejer-tragt i passende brønden og tilføje 3 spatel skefulde af jorden roden væv. Erstatte den selvklæbende strimmel for at dække brønden.
Bemærk: Jord og rhizosfære optøet på is før vejning, mens plantemateriale vejes frosne. Frosne plantevæv, især små mængder, er vanskeligt at vurdere på en skala uden optøning. Vejer tests blev udført på jorden roden væv til at afgøre, hvor mange spatel scoops var tilstrækkelig. Bemærk, at fabrikanten af kit ikke kræver en præcis mængde væv men anbefaler omkring 50 mg. forskellige plante prøve typer vil variere og brugeren bliver nødt til at bestemme den passende mængde. - Gentag denne proces for hver brønd af pladen, indtil pladen er fyldt.
- Gemme plade på-20 ° C indtil klar til DNA-ekstraktion.
- DNA-ekstraktion af root væv.
- Uddrag DNA ved hjælp af et kit optimeret for planter (Se Tabel af materialer) efter producentens protokol.
Bemærk: Vi bruger dette sæt, der er designet specielt til plantevæv at opnå maksimalt udbytte fra root-stikprøver. I modsætning til jord og rhizosfære er humusfraktionerne syre og andre forurenende stoffer mindre af et problem for root væv.
- Uddrag DNA ved hjælp af et kit optimeret for planter (Se Tabel af materialer) efter producentens protokol.
- Kvantificere DNA som i trin 5.4.
7. forstærkning og sekventering isolerede DNA.
- Forstærke 16S gen V4-regionen med en korrekturlæsning polymerase (Se Tabel af materialer) som beskrevet i gjort et al. 12 stregkode prøver med forskellige indeksering primere og pool før sekvensering. Rækkefølge ved hjælp af de metoder beskrevet af gjort mfl12 ved hjælp af en to-trins PCR proces med V4 primere (supplerende fil 1).
Bemærk: Nogle af metoderne for disse trin beskrives i detaljer andetsteds12,13,14 og derfor vil ikke blive beskrevet her. For root-stikprøver, blev PNA blokkere føjet til at reducere mængden af plastid DNA forstærkes fra plantevæv, som tidligere har været fuldt beskrevet15. To kontrolelementer blev brugt i sekventering, en negativ kontrol, som omfattede de udvinding plade Tom kontrol (se note efter trin 5.1.5), og en mock Fællesskabets af en kendt population af bakteriel DNA (Se Tabel af materialer) som fungerede som en positiv kontrol.
Bemærk: I de fleste tilfælde anvendes MiSeq reagens Kits v3 i 2 X 300 base parrede end-tilstand. Prøverne i dette manuskript, blev Illumina HiSeq 2500 brugt i hurtigt tilstand med 250 forbundne-udgangen (2 x 250) tilstand. Alle prøven blev sekventeret i den samme vognbane. - Processen sequencing data via en pipeline for mikrobielle samfund analyser (USEARCH v9.2.64, QIIME v1.9.1 og RStudio v3.4.3 16).
- Forberede sequencing data ved hjælp af USEARCH17.
Bemærk: USEARCH er tilgængelige online med fuld instruktioner (https://www.drive5.com/usearch/). - Afmultiplekse sequencing data ved hjælp af indeks læser eller stregkoder tildeles Illumina læser til prøver.
- Flette parret ende læser for at få konsensus sekvenser. Bruge kommandoen: usearch-fastq_mergepairs * R1*.fastq-relabel @ - fastq_maxdiffs 10 - fastq_minmergelen 230 - fastq_maxmergelen 320 - fastq_pctid 80 - fastqout merged.fq.
Bemærk: Parametrene er angivet gennem henvisninger USEARCH instruktionsbog. - Fjerne primere fra sequencing data at undgå udskiftninger i primer sekvenser, som kan være forårsaget af PCR reaktionen. Bruge kommandoen: usearch-fastx_truncate merge.fq - stripleft 19 - stripright 20 - fastqout stripped.fq.
- Filtrer sequencing data for at fjerne lav kvalitet læsninger og holde høj kvalitet operationelle taksonomisk enhed (OTU) sekvenser. Bruge kommandoen: usearch-fastq_filter stripped.fq-fastq_maxee 1,0 - fastaout filtered.fa.
- Forberede sequencing data ved hjælp af USEARCH17.
- Generere OTUs i USEARCH.
- Udføre dereplication for at identificere sæt af unikke OTU sekvenser. Bruge kommandoen: usearch-fastx_uniques filtered.fa - fastaout uniques.fa - sizeout-ommærke Uniq.
- Klynge OTUs med 97-100% sekvens lighed til at udpege de unikke OTUs. Bruge kommandoen: usearch-cluster_otus uniques.fa - minsize 2 - otus otus.fa-ommærke Otu.
Bemærk: Dette trin også omfatter fjernelse af enebørn fra de grupperede OTUs og fjernelse af kimærer fra sequencing data. - Oprette en OTU tabel i USEARCH. Bruge kommandoen: usearch-usearch_global stripped.fq - db otus.fa-aktionsdel plus - id 0,97 - otutabout otutable.txt.
Bemærk: Denne kommando genererer en tabel med antallet af læser (tæller) i alle OTUs for hver prøve. Tabellen OTU bruges til downstream trin herunder differential overflod analyser og analyser, mikrobiel diversitet. Eksempel på OTU tabel er vist i supplerende figur 2. - Gennemføre en analyse af rarefaction i QIIME v1.9.1 18.
Bemærk: Rarefaction kurven beregnes ved hjælp af tabellen OTU for at afgøre, om dybden af Sekventeringen ordentligt prøver den mikrobielle samfund. Eksempel på rarefaction kurver er vist i supplerende figur 3. - Gennemføre en alpha mangfoldighed analyse18. Brug alpha_rarefaction.py i QIIME v1.9.1 til at beregne mangfoldigheden af den mikrobielle samfund inden for hver enkelt prøve.
Bemærk: Denne analyse beregner mangfoldighed indekser som Shannon19, Simpson20og Chao121. - Gennemføre en beta mangfoldighed analyse18,22. Bruge Python script: beta_diversity_through_plots.py i QIIME v1.9.1 Bray-Curtis forskellighed matrix.
Bemærk: Denne analyse sammenligner den mikrobielle samfund sammensætning mellem prøver. - Gennemføre statistiske analyser mellem grupper. Bruge afstand matricer beregnet for PERMONOVA ved hjælp af funktionen adonis og anova i vegansk pakke23 v2.4.5 i RStudio16. Foretage kanoniske analyse af vigtigste koordinater (CAP) analyse ved hjælp af funktionen capscale i pakken veganer. Visualiser data ved hjælp af ggplot2 pakke24 v2.2.1 i RStudio.
Representative Results
Repræsentative resultaterne præsenteres i dette manuskript kommer fra et område etableret i 2012 på University of Nebraska-Lincoln landbruget forskning Division gård nær Mead, NE. forud for forsøget, stedet havde været forvaltet som en majs-sojabønner rotation . Undersøgelse site var placeret på tre forskellige typer af jordbund, men dataene blev analyseret som om alle ændringer i målte jordegenskaber var på grund af de behandlinger, der er pålagt.
Webstedet felt indeholdt to, ren, står switchgrass (P. virgatum cv Liberty) og store bluestem (A. gerardii) samt en lav-mangfoldighed græs blanding indeholdende big bluestem, indiangrass (S. nutans) og 'Butte' sideoats grama ( B. curtipendula). Tre varme-sæson græs parceller blev i en randomiseret komplet blok design, der blev gentaget tre gange. Indlejret i de tre forskellige græs arealer var to kvælstof (N) befrugtning behandlinger, som var 56 (N1) og 112 (N2) kg N ha-1 anvendt urea. På tidspunktet for microbiome prøveudtagning i slutningen af vækstsæsonen, jord indeholdt 8,0 ± 1.1 (gennemsnit ± SD) ppm nitrat i observationsområderne befrugtet med 112 kg N ha-1 og 6,8 ± 0,7 (mean + SD) ppm nitrat i observationsområderne befrugtet med 56 kg N ha-1. Observationsområderne havde været befrugtet en gang om året. Varm-sæson græs parceller blev udpeget som de væsentligste grunde (8000 m2) og N behandlinger var split parceller (4000 m2). Store bluestem var seedet som et 50: 50 blanding af 'Bonanza' og 'Guldgrube' og Indiangrass var seedet som et 50: 50 blanding af 'Spejder' og 'Warrior'. Parceller blev plantet i 2012, og de første N ansøgning opstod i foråret 2013.
Jord og rod prøver blev gennemført på 15 September 2014. Arbejdet beskrevet nedenfor blev udført på et felt, der blev oprettet som et split-plot randomiseret design med tre flergangsbestemmelser (figur 1). Den gennemsnitlige sekventering dybde af alle prøverne til endosphere blev som følger: 4871 ± 5711 (gennemsnit ± SD), rhizosfære: 40726 ± 14684, jord: 38184 ± 9043. En af de største kilder til variation i disse eksperimenter, ved hjælp af de metoder, der beskrives, er forskellen i mikrobielle samfund fundet mellem prøve typer (figur 2). I denne repræsentative datasæt synes rhizosfære og jorden at være mere ens i sammensætning til hinanden end endosphere (figur 2A). Men der var også meget sigende (p = 0,001) forskelle i mikrobielle samfund sammensætning mellem rhizosfære og jord (figur 2B). Den samlede variation tegnede sig for i disse forsøg analyseret af prøvetypen var 26%.
Alpha mangfoldighed analyse viste, at de mikrobielle samfund i endosphere var lavere i stikprøven mangfoldighed i forhold til jorden og rhizosfære (figur 3). De kun betydelige forskelle i mangfoldighed mellem græs arter i ethvert rum var mellem endosphere prøver af store bluestem og switchgrass, med switchgrass at have betydeligt højere mikrobielle arternes mangfoldighed (figur 3). Relative forekomst analysen (figur 4) fremhæver dominans af proteobakterier efterfulgt af Actinobacteria i alle prøve typer. Jord og rhizosfære er også domineret af Acidobacteria og Chloroflexi paa endosphere havde en større relativ overflod af Bacteriodetes.
I dette eksperiment, planterne blev dyrket med to forskellige mængder af N gødning og derfor vi analyseret data for at afgøre, om der var behandling effekter. Behandling effekter tegnede sig for 12% af den samlede variation, men var ikke væsentligt anderledes, selv om i koordineringen af de to behandlinger ser forskellige (figur 5). Dette understreger vigtigheden af statistiske analyser for disse datasæt i stedet for besigtigelse eller kvalitative domme.
Plante-påvirket forskelle i microbiome plantevæv og jord blev visualiseret ved hjælp af en begrænset metode til koordinering. Statistiske forskelle blev bestemt ved hjælp af en PERMANOVA analyse til at teste, om specifikke variabler, såsom arter, resulterer i væsentligt forskellige mikrobielle samfund sammensætning mellem prøver. Når alle prøve typer blev analyseret sammen, fandtes en meget betydelig forskel i mikrobielle samfund sammensætning på grund af plantearter (figur 6). I dette eksperiment var mængden af variation af plantearter 6,7%. Endelig blev hver prøvetype analyseres individuelt for at afgøre, hvilken af typerne prøve kan være drivkræfterne betydelig plante arter effekt. Kun i endosphere var der en meget signifikant forskel (p = 0,001) mellem de mikrobielle samfund kompositioner af de forskellige plantearter (figur 7). I andre typer for eksempel var arter effekten ikke signifikant når analyseres individuelt. I endosphere var den procentvise variation på grund af arter 27%, mens det var lavere i rhizosfære (18%) og jord (15%). Dette understreger yderligere betydningen af at analysere hver vævstype individuelt.
Figur 1: eksempel på eksperimentelle felt design. Eksperimentelle felt design illustrerer en randomiseret komplet blok design i tre eksemplarer af feltet stedet ligger ved University of Nebraska-Lincoln østlige Nebraska forskning og Extension Center i nærheden af Mead, NE. Fuld site beskrivelse i afsnittet resultater. N1 er lavt (56 kg N ha-1 urea) og N2 (112 kg N ha-1 urinstof) er højere i kvælstof, der blev anvendt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Beta mangfoldighed analyse sammenligne den mikrobielle sammensætning i de forskellige prøve typer herunder endosphere, rhizosfære og jord fra flerårig græs prøveudtagning i 2014. Analysen blev foretaget ved hjælp af en Python script i QIIME1.9.1 til at producere Bray-Curtis forskellighed matrix. Vigtigste koordinater analyse (PCoA) baseret på Bray-Curtis forskellighed matrix blev visualiseret i RStudio. Angiver den første og anden største afvigelse forklares ved PCoA analyse, PCoA1 og PCoA2. PERMANOVA statistiske analyse blev udført for at bestemme betydningen mellem prøve typer, og p -værdi er vist i øverste højre hjørne. Hvert symbol i tal, der repræsenterer hele det mikrobielle samfund for hver prøve. (A) Endosphere, rhizosfære og jord prøve typer var analyseret sammen. Alle 87 prøver var forfinede til 486 sekvenser pr. prøve. (B) rhizosfære og jord prøver blev analyseret sammen. Alle 59 prøver var forfinede med 8231 sekvenser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Alpha mangfoldighed analyse ved hjælp af Shannon indeks for hver art i endosphere, rhizosfære og jord. Analysen blev foretaget ved hjælp af en Python-script, i QIIME1.9.1. Rarefaction blev gjort til endosphere, rhizosfære og prøve jordtyper henholdsvis med 486, 17154 og 8231 sekvenser pr. prøve. Boksene angiver 25 og 75 percentiler (første og tredje kvartiler). Den vandrette linje i boksen betegner medianen og røde plus viser middelværdien. Whiskers vise Datablokken bortset fra outliers (der er vist som sorte prikker), som faldt mere end 1,5 gange det interkvartil område (n = 6 for hver prøve, undtagen for sideoats grama Bland hvor n = 5). Shannon indekset for alle fem arter i endosphere var lavere end både rhizosfære og jord. Non-parametriske Wilcoxon rang summen test blev brugt til at bestemme betydningen mellem arterne og kun signifikante forskelle mellem arter var vist oven på boksene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: relativ overflod på phylum niveau i endosphere, rhizosfære og jord. Prøverne blev analyseret for at sammenligne overfloden af mikrobielle phyla blandt forskellige prøver typer (n = 29 for hver enkelt prøve). Analysen blev foretaget ved hjælp af en Python script i QIIME1.9.1 fra tabellen OTU. De forskellige farver inde cirkeldiagrammet betegne phyla. Procentsatsen angiver den relative forekomst af hver række i hver prøvetype. Phylum oplysninger blev kommenteret ved hjælp af de ribosomale databaseprojekt klassificering (RDP)25. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: analyse ved hjælp af behandling som begrænsende faktor mellem alle prøve typer. Kanoniske analyse af vigtigste koordinater (CAP) analyse blev udført for at afgøre, om der var forskelle i mikrobielle samfund sammensætning mellem behandlinger. For hvert N behandling, n = 42 for N1 (56 kg N ha-1) og n = 45 for N2 (112 kg N ha-1). Bray-Curtis forskellighed matrix blev genereret ved hjælp af en python-script, i QIIME1.9.1. CAP analyse baseret på Bray-Curtis forskellighed matrix blev udført af begrænsende behandling som faktor i RStudio. PERMANOVA analyse blev udført for at afgøre, om behandlingen forskellene var betydelig, og p -værdi er vist i øverste højre hjørne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: analyse ved hjælp af plantearter som begrænsende faktor mellem alle prøve typer. Analyse blev udført for at afgøre, om der var forskelle i den mikrobielle samfund sammensætning mellem plantearter i alle prøve typer. Vigtigste koordinater koordinering og fælles landbrugspolitik analyse af alle prøve typer (endosphere, rhizosfære og jorden) blev udført ved hjælp af en Bray-Curtis forskellighed matrix. Bray-Curtis forskellighed matrix blev genereret ved hjælp af Python script i QIIME1.9.1. CAP analyse baseret på Bray-Curtis forskellighed matrix blev udført af begrænsning plantearter som faktor i RStudio. PERMANOVA statistiske analyse blev udført for at bestemme betydningen mellem plantearter, og P-værdi er vist i øverste højre hjørne. Hvert symbol i tal, der repræsenterer hele det mikrobielle samfund for at prøve. n = 18 for hver art i alle prøve typer undtagen n = 15 sideoats grama blanding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: eksempel på CAP analyse med arter som begrænsende faktor for hver prøvetype individuelt. Vigtigste koordinere koordinering og fælles landbrugspolitik analyse af hver prøve (endosphere, rhizosfære og jord) ved hjælp af Bray-Curtis forskellighed matrix. Hver prøvetype var forfinede 486, 17154 og 8231 læser per sample henholdsvis i endosphere, rhizosfære og jord. Arter blev brugt som faktoren, for at begrænse ordination. PERMANOVA statistiske analyse blev udført for at bestemme betydningen mellem plantearter i hver prøvetype, og p -værdi er vist i øverste højre hjørne. Hvert symbol i figur repræsenterer hele mikrobielle samfund for hver prøve. Prøvestørrelse er n = 29 for hver prøvetype, n = 6 for hver planteart i hver prøvetype undtagen sideoats grama mix (n = 5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Metoderne beskrevet i dette manuskript bør give forskerne nemt indtaste inden for jord og plante metagenomics. Gennem årene har vi forfinet vores metoder siden gennemføre forsøget er beskrevet i dette håndskrift. En ændring er, at vi nu pre pladeselskab rør før du går ud til området for at prøve. Vores laboratorium bruger et stregkodesystem system og en etiketprinter. Labelprinter ikke kun sparer tid, når mærkning rør, men også gør alting nemmere at spore og til korrekt at identificere prøver uden luner i menneskehænder skriftligt. Et andet kritisk punkt er, at vi forsøger at behandle materialet efter bringer det tilbage fra området så hurtigt som muligt. Vi tilstræber at fryse jorden anvendes til DNA-analyse, sterilisere og fryse rødderne, og filtrere og fryse rhizosfære inden for 12 til 36 timer efter hjemkomsten fra feltet. DNA ekstraktion procedurer er lang med mange trin, især for jord og rhizosfære, så vi købte en robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher), der minimerer hænderne på tid til DNA udvinding protokoller, reducerer menneskelige fejl, der kan indføres, og forbedrer sammenhængen i den måde forskellige partier af jord, rødder eller rhizosfære behandles. Når du arbejder med plantemateriale er det vigtigt at afgøre typen root studeres eller at tage en række forskellige typer rod at få en "repræsentativ". Opretholdelse af rødder og blade i frossen tilstand, når udførelse DNA-ekstraktion er vigtig, som at sikre, at der er ingen krydskontaminering mellem prøver ved påfyldning 96-brønd DNA udvinding plader. En anden vigtig faktor til at overveje, er antallet af gentagelser skal bruges, når designe markforsøg og bruge et komplet randomiseret design, hvor det er muligt26. På grund af høje felt variation kan det være nødvendigt at have et stort antal flergangsbestemmelser til at opdage små forskelle. Endelig fra vores oplevelse er det vigtigt at sørge for jord ikke er for vådt, når udgravning rødderne. Hvis jorder er mættet med vand, det er ikke kun rodet at arbejde med, men det er også meget vanskeligt at definere rhizosfære og fjerne jord fra rødderne.
En ændring, der var lavet tidligt under udviklingen af disse metoder var i stedet for at ryste rør i hånden for at frigive rhizosfære vi opgraderet til vortexers drevet af en gasgenerator til at gøre arbejdet lettere og mere standardiseret i tid og måde at hver tube blev ophidset. En begrænsning af amplikon sekventering tilgang er at den taksonomiske opløsning af resultaterne er ofte begrænset og mange OTUs er ukendt eller kun kendt på niveauet familie eller slægt. Dette forskningsfelt hurtigt udvikler sig, så det er vigtigt at være opmærksom på nye og udvikle metoder, især for data-analyse, der kan forbedre løsningen af resultaterne.
Disse protokoller er kun for at studere bakterier og archaea, ikke svampe. Brug af forskellige primere for forstærkning vil give mulighed for undersøgelse af svampe samfund ved hjælp af de samme DNA prøver27,28. Disse metoder kræver ikke indkøb af store mængder af udstyr, fordi metoderne, der kan forenkles. De metoder vi beskrive her er primært til bestemmelse af "hvem er der", men feltet hurtigt udvikler sig til vigtige spørgsmål om funktion, som kan løses ved hjælp af shotgun sekventering metoder, isolation og test funktionaliteten af mikrober, eller sekventering hele mikrobielle genomer.
De repræsentative resultater fremhæve forskellene i mikrobielle samfund, der kan identificeres ved hjælp af de beskrevne metoder. Ved hjælp af en beta-mangfoldighed tilgang til data analyse22blev kompositoriske forskelle vist mellem prøve typer. Disse forskel er blevet tydeligt observeret i de fleste andre undersøgelser, hvor endosphere, rhizosfære og jord indeholder unikke mikrobielle samfund3. Shannon diversitet indeks var beregnet til at bestemme den overflod og jævnhed i den mikrobielle arter, der forekommer inden for hver planteart i endosphere, rhizosfære og jord. Som vist i denne undersøgelse og i mange andre, er alpha mangfoldighed højest i jord, mindske lidt i rhizosfære og derefter faldende betydeligt i endosphere3,5,29. Disse resultater viser, at metoderne beskrevet her er egnet til at identificere kompositoriske ændringer i endosphere, rhizosfære og jord.
Dominans af proteobakterier er et fælles resultat i undersøgelser om endosphere og jordbundens30,31,32. Endosphere har generelt et lavere mangfoldighed af mikrobielle arter med en højere relativ overflod af proteobakterier. Dette understreger igen, at resultaterne her er repræsentant for andre fund i litteraturen. Effekterne behandling i denne undersøgelse var ikke signifikant forskellig og to store grunde der kan være at de forskelle, der er pålagt af behandlingerne, der ikke var stor nok til at generere tilstrækkelig variation til at opdage og at denne prøve blev gjort i slutningen af den vækstsæson, når felterne muligvis har haft tilstrækkelig tid til at trække ned af kvælstof til lignende niveauer, hvilket er hvad blev målt i slutningen af sæsonen. I en anden undersøgelse ved hjælp af samme befrugtning rente over en længere periode, blev kun forholdsvis små ændringer i sammensætningen af microbiome målt33. Andre undersøgelser har vist ændringer i både svampe- og bakterielle samfund på grund af kvælstof gødning34,35.
Plantearter er kendt for at spille en rolle ved fastsættelsen af deres microbiomes3,32,36 , og selv små forskelle i mikrobielle samfund variation har påvist mellem forskellige plante genotyper inden for en enkelt art37. I denne undersøgelse fandt en signifikant forskel i mikrobielle samfund sammensætning mellem plantearter. I alle de prøve typer det viste sig at switchgrass havde de mest forskellige mikrobielle sammensætning, men forskellene mellem arter var kun statistisk signifikant i endosphere. Rhizosfære Fællesskabet sammensætning kan være blevet betydeligt, hvis flere replikater var tilgængelige til analyse.
Kombinerede felt, lab og analytiske protokoller er beskrevet her giver en kraftfuld metode til at studere hvordan forskellige faktorer indflydelse sammensætningen af mikrobielle samfund i jordbund, rhizosfære og endosphere af rødder36. Der er en masse arbejde at gøre i området for at studere microbiomes, navnlig landbrugs områder. Vigtige spørgsmål om hvordan udbyttet er ændret af jord microbiome har endnu at blive fuldt belyst. Selv de mest grundlæggende spørgsmål vedrørende hvordan sædskifter påvirke jorden microbiome, hvordan timing ændrer microbiome, hvordan abiotisk stress ændrer microbiome, hvordan jordtype interagerer med disse faktorer til at ændre microbiome, og om der er Universal mikrober i visse afgrøder eller regioner i USA er alle uafklarede spørgsmål. Disse metoder vil også være nyttigt for epidemiologiske undersøgelser for at identificere tilstedeværelse og persistens af patogene og gavnlige bakterier. En anden kommende horisont for disse metoder vil være at begynde at integrere de DNA-metoder, der beskrives her med plante og mikrobe RNA og metabolitten data. Yderligere forbedring og afprøvning af flere variabler vil være vigtigt for yderligere optimering af disse protokoller.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Udviklingen af dette manuskript er støttet af National Science Foundation EPSCoR Center for rod og Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Dataindsamlingen blev støttet af midler fra University of Nebraska-Lincoln, landbrugs-forskning og udvikling og af en luge tilskud fra USDA. Vi anerkender også støtte fra USDA-ARS og støtte blev leveret fra landbrug og fødevarer forskning initiativ konkurrencedygtige tilskud nr. 2011-68005-30411 fra USDA National Institute for fødevarer og landbrug til at oprette og administrere disse felter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
| Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
| D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
| Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
| Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
| Cooler | Any | NA | |
| Wash pan | Any | NA | |
| Plastic bucket | Any | NA | |
| Gloves (work and lab) | Any | NA | |
| 20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
| 20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
| portable generator | Honda brand works well | NA | |
| Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
| Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
| Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
| Autoclaves | Any | NA | |
| Drying Oven | Any | NA | |
| Scale | Any | Any | |
| Bleach | CLOROX - household strength | NA | |
| Tween 20 | Any | NA | |
| Liquid Nitrogen | Any | NA | |
| Dry Ice pellets | Any | NA | |
| Ethanol | Any | NA | |
| 11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
| 18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
| 13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
| 2 mL tube | Any | NA | |
| 15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
| 50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
| Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
| 96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
| pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
| mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
| Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
| Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
| Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
| 1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
| antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
| antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
| Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
| Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
| Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
| Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
| Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
| 5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
| Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
| Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 - Biosafe | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |
References
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
- Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7 (1), 15019 (2017).
- White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
- Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).
- Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).
- Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).
- Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
- Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
- Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
- Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
- Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).
- Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
- Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
- O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).
- Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).
- Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349 (6250), 860-864 (2015).
- Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).
- Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).
- Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5 (7), e11915 (2010).
- Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).
