Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

doi: 10.3791/57932 Published: July 24, 2018

Summary

Opgraving van plantenwortels uit het veld en verwerking van de monsters in endosphere, rhizosfeer en bodem worden in detail, met inbegrip van DNA-extractie en gegevens analysemethoden beschreven. Dit document is bedoeld om andere laboratoria maken gebruik van deze technieken voor de studie van de bodem, endosphere en microbiomes van de rhizosfeer.

Abstract

Plant en bodem microbiome studies zijn steeds belangrijker voor de micro-organismen van de rollen in landbouwproductiviteit spelen begrip. Het doel van dit manuscript moet detail geven over hoe snel genieten van de bodem, de rhizosfeer, en endosphere van gerepliceerde veldproeven en analyseren van wijzigingen voordoen bij de microbiële gemeenschappen als gevolg van monster type, behandeling en plant genotype. Het experiment gebruikt om aan te tonen deze methoden bestaat uit gerepliceerde veld percelen met twee, zuiver, warm-seizoen grassen (Panicum miliaceum en Andropogon Rus) en een lage-diversiteit gras mengsel (A. Rus, Sorghastrum Vogelmelk, en Bouteloua curtipendula). Kort, planten zijn opgegraven, een verscheidenheid van wortels zijn gesneden en geplaatst in fosfaatbuffer en geschud voor het verzamelen van de rizosfeer. Wortels worden gebracht naar het laboratorium op ijs en oppervlak gesteriliseerd met bleekmiddel en ethanol (EtOH). De rizosfeer is gefilterd en geconcentreerd door middel van centrifugeren. Afgegraven grond van rond de wortel bal is geplaatst in plastic zakken en gebracht naar het lab waar een kleine hoeveelheid bodem is genomen voor DNA extracties. DNA is gewonnen uit de wortels en bodem rhizosfeer en vervolgens versterkt met inleidingen voor de V4-regio van het 16S rRNA gen. Waarbij sequenced, dan geanalyseerd met open toegang bioinformatica tools. Deze methoden toestaan van onderzoekers om te testen hoe de microbiële Gemeenschap diversiteit en samenstelling varieert vanwege monster type, behandeling, en plant genotype. Met behulp van deze methoden samen met statistische modellen blijkt de representatieve resultaten er aanzienlijke verschillen in microbiële gemeenschappen van wortels, rhizosfeer en bodem. Methoden die hier gepresenteerd bieden een complete set van stappen voor het verzamelen van veldmonsters, isoleren, uitpakken, kwantificeren, versterken, en DNA-sequentie en analyseren van de microbiële Gemeenschap diversiteit en samenstelling in gerepliceerde veldproeven.

Introduction

Microbiome onderzoek heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen en manipuleren van ecosysteem processen zoals nutriënten fietsen, organisch materiaal omzet, en de ontwikkeling of remming van de bodem ziekteverwekkers1,2. Dit onderzoeksgebied houdt ook groot potentieel voor het begrijpen van de effecten van bodem-microben op de productiviteit van natuurlijke plantaardige Gemeenschappen en agro-ecosystemen. Hoewel er veel studies die zijn gericht op de microbiome van de bodem in natuurlijke ecosystemen, hebben minder gericht op plant rhizosfeer en endosphere microben in agro-ecosystemen3. In Nebraska domineert landbouw het landschap in grote delen van de staat, de studies van deze bodems maken waar agrarisch belangrijke gewassen een cruciaal onderwerp voor onderzoek worden gekweekt. Het doel van deze paper methoden is om onderzoekers te voorzien van een standaardset van protocollen bij het beschrijven van de microben aanwezig zijn in de agro-ecosystemen, om te bepalen hoe de plantenwortels de microbiële gemeenschappen in de rhizosfeer en endosphere, en uiteindelijk wijzigen begrijp de functies die deze microben in bodem sanitaire en fytosanitaire productiviteit spelen.

De methode die hier wordt gepresenteerd verschilt enigszins van de methoden die worden gebruikt door anderen4,,5 , in dat dit document is gericht op het leren welke microben zijn uitsluitend binnen de wortel en hoe ze verschillen van microben onmiddellijk buiten de root in de rhizosfeer. De volgorde van de amplicon gebruikt in deze studie identificeert de microbiële taxa gevonden in het DNA-monster en laat onderzoekers om te bepalen hoe de gemeenschappen afhankelijk van monster type of behandeling veranderen. Een van de belangrijkste verschillen tussen dit protocol en een zeer vergelijkbaar protocol dat wordt gebruikt door Lundberg et al. 6 is dat in plaats van ultrasoonapparaat, dit protocol oppervlakte sterilisatie met bleekmiddel en ethanol gebruikt om de rizosfeer van de wortels. Anderen hebben ook gebruik gemaakt van oppervlakte sterilisatie effectief7,8,9,10. Deze methoden zijn niet voordeliger dan andere methoden, maar iets anders. Deze methoden zijn bijzonder goed geschikt voor grote veld experimenten, want met genoeg mensen is het mogelijk voor het verwerken van meer dan 150 veld percelen per dag, waardoor maximaal ongeveer 450 monsters als gepartitioneerd in endosphere, rhizosfeer en bodem. Dit manuscript beschrijft in detail de gebruikte methoden voor proeven in het veld, het verwerken van het materiaal in het lab, uittreksel en de DNA-sequentie, en biedt een beknopt overzicht van de stappen om de resulterende rangschikken gegevens te analyseren.

Protocol

1. Beschrijving van de Site van veld

  1. Experimentele veld sites beschrijven collectie perioden. Bepalen van de locatie van het veld (latitude, longitude en hoogte) met behulp van een GPS.
  2. Beschrijven de bemonsteringsdiepte bemonsteringstijdstip en de bodemtextuur.
  3. Omgevingsfactoren spelen een belangrijke rol bij het vormgeven van microbiële gemeenschappen. Klimaat gegevens zoals de jaarlijkse gemiddelde temperatuur, neerslag, voorafgaande begrotingsjaren vruchtwisseling, grondbewerking praktijken, methode van bevruchting en geschiedenis van het veld site. Automatische weerstations of andere apparaten zijn handig voor het opnemen van de dagelijkse neerslag en temperatuur over een groeiseizoen.

2. verzameling en verwerking van de bodem, de rhizosfeer, en de Root veldmonsters

  1. Opgraving van planten.
    1. Label een wassen pan en een emmer met een kleverige nota dat informatie bevat over het plantmateriaal te bemonsteren. Bevatten gegevens zoals het nummer van het waarnemingspunt, plant genotype en plantensoorten. Dragen de gelabelde emmer aan het perceel en de pan wassen achterlaten op de gevestigde werkstation in het veld.
    2. Doorboren bodem met een schop op een diepte van 30 cm te snijden om het even welk van de laterale wortels houden de plant in de bodem. Het geschatte volume is 18 cm3. Willekeurig kiezen en twee planten per proefvlak verzamelen uit verschillende gebieden binnen het perceel.
    3. Excavata de plantenwortels door leveraging van de schop en plaats van de bal van de wortel in de gelabelde emmer. De gelabelde emmer met de uitgegraven wortel bal terug naar het werkstation in het veld brengen. Afgesneden en gooi de bovengrondse plantaardige biomassa.
  2. Verwijdering van de bodem van de wortels en het verzamelen van bulk bodem.
    1. Schud wortels om handmatig verwijderen van de bodem of een spade of een hand-held helmstok gebruiken om de bodem van de wortels. Schudden van de wortels is voldoende voor het verwijderen van de bodem in zeer zandige bodems. Draag handschoenen en wortels in de buurt van het station van verwerking plaats.
    2. Na het schudden van de wortels, zullen het grootste deel van de bodem in de pan wassen. Meng de bodem van de pan wassen en eventuele kluiten van de bodem met een hand-held helmstok breken. Leg een monster van de bodem die vrij is van puin in een gelabelde, 17,7 x 19,5 cm rits opbergtas en plaats op een koele plaats of op ijs.
  3. Verzameling van wortels en de rizosfeer.
    1. Met behulp van de snoeien schaar gesteriliseerd in 70% EtOH, accijnzen een verscheidenheid van wortels, ongeveer 4 tot 6 wortels per plant en elke wortel rond 9-12 cm in lengte. Plaats van de verwijderde wortels (snijden zo nodig aan te passen) in een tube van de gelabelde 50 mL met 35 mL gesteriliseerde met autoclaaf, fosfaatbuffer (6.33 g/L NaH2PO4, 8,5 g/L Na2HPO4 watervrij, pH = 6.5, de oppervlakteactieve stof 200 µl/L).
      Opmerking: De oppervlakteactieve stof (Zie Tabel van materialen) was toegevoegd na autoclaaf de fosfaatbuffer. Het volume van de wortel bal en wortel lengtes variëren, afhankelijk van leeftijd van de plant en plantensoorten.
    2. Buizen voor 2 min vrij de rizosfeer van het oppervlak van de wortels te schudden. Met een tang gesteriliseerd in 70% EtOH, verwijderen de wortels uit de buis, vlek kort op papieren handdoekjes, en plaatsen in een nieuwe, met het label tube 50 mL. Plaats zowel de buis met de rizosfeer en degene met wortels op ijs.

3. de verwerking van veld monsters in het laboratorium

  1. Oppervlakte sterilisatie van wortels na veld collectie.
    Opmerking: Voer oppervlakte sterilisatie zo spoedig mogelijk na zijn terugkeer uit het veld. Als het is niet mogelijk aan de oppervlakte de wortels in dezelfde dag steriliseren, wortels bij 4 ° C tot verwerkt op te slaan.
    1. Voeg ongeveer 35 mL 50% bleekmiddel + 0,01% Tween 20 50 mL wortel buizen verzameld in het veld. Schud 50 mL tubes voor 30 tot 60 seconden. Giet af 50% bleekwater en voeg 35 mL 70% EtOH. Schudden voor nog eens 30 tot 60 seconden.
    2. Giet af 70% EtOH en 35 mL steriele, ultrazuiver water toe te voegen. Schud gedurende 1 minuut. Herhaal het water wassen twee meer tijden.
      Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de behandeling van onze oppervlakte sterilisatie is voldoende, wij vergulde monsters van water uit de laatste spoeling en waargenomen geen groei van bacteriën (P. Wang, ongepubliceerde gegevens, 2014). Andere onderzoekers hebben getest voor root sterilisatie efficiëntie met behulp van soortgelijke methoden9,10.
    3. Wortels droog op schone papieren handdoeken van de vlek. Gebruik een schone papieren handdoek voor elk monster.
      Opmerking: Papieren handdoekjes kunnen vóór gebruik worden gesteriliseerd. Wij doen niet steriliseren onze papieren handdoeken. Echter, wij gebruiken 1 papieren handdoek per monster en houden van handdoeken gewikkeld totdat gebruikt.
    4. Snijden met behulp van steriele pincet en snoeien scharen, snijd de wortels in circa 5 mm stukken en plaats wortels in een schone, gelabelde 15 mL conische buis. Opslaan van monsters bij-80 ° C tot verder verwerkt.
  2. Verwerking rhizosfeer monsters.
    1. Schud 50 mL tubes met rhizosfeer monsters uit het veld resuspendeer de gehele steekproef. Met behulp van een steriele, 100-µm-mesh cel zeef (Zie Tabel of Materials), filter de geresuspendeerde monster af in een nieuwe tube van 50 mL.
    2. Centrifugeer de buizen bij 3000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Onmiddellijk giet af en verwijder het supernatant.
    3. Plaats de rhizosfeer pellets in de 50 mL tubes op ijs. Voeg 1,5 mL steriele fosfaatbuffer (zonder oppervlakteactieve stof) rhizosfeer pellets en vortex op te schorten.
    4. Pipetteer de geschorste vloeistof in een schone, gelabelde, 2 mL microfuge buis. Spin buizen bij 15,871 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Onmiddellijk giet af het supernatant en afvoer van de buizen op schone papieren handdoeken.
    5. Bewaar de pellets op-20 ° C tot verder verwerkt.
      Opmerking: Stappen 3.2.2 - 3.2.4 worden gedaan om het verminderen van de grootte van de steekproef buis voor opslag. Het is meer ruimte efficiënt voor het opslaan van de kleinere 2 mL tubes in vergelijking met de 50 mL tubes.
  3. Verwerking van bodemmonsters voor analyse van DNA-extractie en bodem.
    1. Met behulp van een steriele metalen spatel, vul een tube schoon, gelabelde 2 mL met ongeveer 3 g van de bodem voor DNA-extractie. Vermijd elke kleine wortel stukjes en puin. Bewaar deze bodemmonster bij-20 ° C. De metalen spatel spoelen in 70% EtOH tussen elk monster.
    2. In een pan schoon wassen, leeg de zak van de bodem in gestapelde zeven (Zie Tabel of Materials), grotere zeef boven op de kleinere zeef en zeef handmatig de bodem door beide zeven. Gebruik een borstel om zorgvuldig schoon de zeven tussen de monsters.
    3. 100 tot 125 g van het gezeefde grond in een zak 17,7 x 19,5 cm met rits voor toekomstige grond fysisch-chemische en textuur analyse gereserveerd. Plaats de zakken van de bodem op 4 ° C voor korte termijn opslag.
  4. Verwerking van bodemmonsters voor bodemvocht.
    1. Tarra een gelabelde bruine papieren zak op een schaal. Maat 40 tot en met 45 g van gezeefde grond in de bruine papieren zak. Het gewicht van de bruine papieren zak en de bodem op een veiligheidsinformatieblad en plaats zakken in een droogstoof ingesteld op 55-60 ° C.
    2. Na 72 uur, door de zakken van de droogstoof te verwijderen. Laat de bodem zakken voor minstens 30 min afkoelen en dan weeg.
    3. Registreren van het gewicht, tarra van de schaal naar nul en plaats van de bruine papieren zakken op de schaal. Bereken het percentage van bodemvocht voor elk monster met behulp van de formule:
      Equation
      Opmerking: De bodem vocht methode is van Kellogg biologische Station lange termijn Ecological Research (KBS LTER). KBS LTER biedt een breed scala van vastgestelde protocollen voor onderzoekers op hun website (https://Lter.kbs.msu.edu/).

4. bereiding van verwerkte Root monsters voor DNA extracties.

  1. Grind bevroren wortel materiaal zodat het monster homogeen is.
    1. Giet de vloeibare stikstof in een plastic bekerglas met schone spatels en in een schone mortier en stamper om te houden van de monsters gedurende het maalprocédé bevroren.
    2. Breng het bevroren weefsel in de mortier en vermalen met de stamper tot een fijn poeder. Vloeibare stikstof in de gehele slijpen zodat monsters bevroren voortdurend toe te voegen.
    3. Gebruik een spatel om grond weefsel in een schone, gelabelde 2 mL-buis. Winkel bij-80 ° C.

5. extractie van DNA van bodem- en rhizosfeer monsters in 96-Wells-indeling

  1. Het laden van bodemmonsters in 96-wells-platen.
    1. Veeg beneden het werkgebied met 70% EtOH en 1% bleekwater. Lab handschoenen dragen tijdens deze stappen. De bodemmonsters verwijderen uit de opslag van-20 ° C en laat ontdooien in een ijsemmer.
    2. Verwijder de verzegeling mat cover van een extractie van de 96-wells-plaat die wordt geleverd met de DNA-extractie-kit. Plaats de verzegeling mat cover tussen 2 papier veegt schoon terwijl ze niet in gebruik te houden. Om besmetting te voorkomen, het gebruik van zelfklevende 8-well PCR stroken ter dekking van de 12 kolommen van de extractie van de 96-wells-plaat.
    3. Tarra een steriele weeg-trechter (grootte SM) op een schaal en weeg 200 tot 250 mg van de bodem.
      Opmerking: Deze steriele trechters worden afgevlakt aan de ene kant, dus de trechter plat op een schaal legt. De trechter is gevuld met aarde en direct in een putje geplaatst. Deze techniek vermijdt het verlies van monsters, morsen minimaliseert, en voorkomt kruisbesmetting.
    4. Om te ontdekken het eerste putje van de plaat van de extractie, zorgvuldig de zelfklevende strip verheffen, plaats de hals van de gevulde weeg-trechter in de passende goed, en zachtjes begeleiden het bodemmonster in de passende put. Vervang de zelfklevende strip ter dekking van de put.
    5. Herhaal dit proces voor elk putje van de plaat, met behulp van een nieuwe, steriele trechter voor elk monster, totdat de plaat is gevuld. Laat een goed leeg als een blancocontrole extractie.
      Opmerking: Een goed leeg op elke winning plaat om te dienen als een negatieve (blanco)-controle. Hiermee wordt voor verontreinigingen die mogelijk aanwezig in de kit reagentia11.
    6. Vervang de verzegeling mat cover op de winning plaat en de plaat bij-20 ° C bewaren tot klaar voor DNA-extractie.
  2. Laden rhizosfeer monsters in 96-wells-platen.
    1. Verwijderen van de rhizosfeer monsters uit de opslag van-20 ° C en laat ontdooien in een ijsemmer.
    2. Volg stap 5.1.2 hierboven om het bereiden van de DNA-extractie-plaat.
    3. Plaats een schoon papieren doekje op een schaal en vervolgens op tarra een steriele metalen spatel op de schaal. Gebruik de spatel om zorgvuldig een aantal van de rhizosfeer pellet uit een monsterbuisje scoop. Terug van de spatel op de schaal en wegen tussen de 200 en 250 mg van de rhizosfeer monster.
    4. Trek voorzichtig de zelfklevende strip om te ontdekken het eerste putje van de plaat van de winning, de gevulde spatel hoek in de put en schraap de rhizosfeer materiaal in de juiste put met een steriel tandenstoker.
    5. Spoel de metalen spatel in water, gevolgd door 70% EtOH tussen de monsters. Herhaal dit proces voor elk putje van de plaat totdat de plaat is gevuld, het verlaten van een goed leeg als een blancocontrole extractie.
  3. Extractie van DNA van de rhizosfeer en grond monsters in 96-Wells-indeling.
    1. Uittreksel bodem en rhizosfeer DNA met behulp van een kit geoptimaliseerd voor de bodem (Zie Tabel of Materials), volgens protocol van de fabrikant.
      Opmerking: We gebruiken deze specifieke kit te isoleren van de bodem en de rhizosfeer DNA vanwege het vermogen van de propriëtaire reagentia humuszuur en andere krachtige remmers van de PCR gevonden in de bodem te verwijderen.
  4. DNA kwantificering.
    1. Kwantificeren van 92 monsters en 4 concentraties van normen met behulp van een kit (Zie Tabel of Materials; normen zijn opgenomen), volgens protocol van de fabrikant.
    2. Kwantificeren van de resterende 4 voorbeelden die werden verwijderd uit de plaat voor putten voor de vier normen met behulp van een kit (Zie Tabel of Materials), volgens protocol van de fabrikant.

6. extractie van DNA van Root monsters in 96-Wells-indeling.

  1. De monsters van de wortel van het laden in 96-wells-platen.
    1. Veeg beneden het werkgebied met 70% EtOH en 1% bleekwater. Draag handschoenen tijdens deze stappen.
    2. Houd de grond wortel monsters bevroren op elk moment door het plaatsen van de monsters in een emmer met droogijs.
    3. Vul een plastic bekerglas met vloeibare stikstof en antistatische microspatulas en steriele weeg-trechters (grootte XSM) plaats in het plastic bekerglas afkoelen.
    4. Verwijder de verzegeling mat kap van de 96-Wells extractie grondplaat die met kit wordt meegeleverd en plaats deze tussen de 2 papieren doekjes schoon terwijl ze niet in gebruik te houden.
      Opmerking: De nieuwere versie van deze kit, vrijgegeven na de tijd die wij uitgevoerd deze DNA extracties uit te voeren, moet de gebruiker de extractie kraal platen leveren. In de Tabel van materialen, wij gemaakt bben de leverancier catalogus informatie die nodig is om deze items.
    5. Om besmetting te voorkomen, het gebruik van zelfklevende 8-well PCR stroken ter dekking van de 12 kolommen van de extractie van de 96-wells-plaat.
    6. Plaats de grondplaat van de winning op droog ijs te houden van de monsters in de putjes bevroren.
    7. Zorgvuldig til de zelfklevende strip ontdekken het eerste putje van de plaat van de extractie, plaatst u de nek van de gevulde weeg-trechter in de passende put en toevoegen van 3 spatel bollen grond wortel weefsel. Vervang de zelfklevende strip ter dekking van de put.
      Opmerking: De bodem en de rhizosfeer zijn ontdooid op ijs voorafgaand aan wegen, overwegende dat plantaardig materiaal wordt gewogen uit bevroren. Bevroren plant weefsel, met name kleine hoeveelheden, is moeilijk af te wegen op een schaal zonder ontdooien. Weeg tests werden gedaan op grond wortel weefsel om te bepalen hoeveel spatel scoops volstonden. Merk op dat de fabrikant van de kit niet een exacte bedrag van weefsel hoeft maar rond 50 mg. raadt verschillende plant monster typen zal variëren en de gebruiker moet het bepalen van het juiste bedrag.
    8. Herhaal dit proces voor elk putje van de plaat totdat de plaat is gevuld.
    9. Bewaren plaat bij-20 ° C tot klaar voor DNA-extractie.
  2. DNA-extractie van wortel weefsel.
    1. Uittreksel van DNA met behulp van een kit geoptimaliseerd voor installaties (Zie Tabel van materialen) volgens protocol van de fabrikant.
      Opmerking: We gebruiken deze kit die speciaal voor plant weefsel ontworpen is te bereiken van de maximale opbrengst van de monsters van de wortel. In tegenstelling tot de bodem en de rhizosfeer zijn de humuszuur en andere verontreinigingen minder een probleem voor het root-weefsel.
  3. Het DNA als in stap 5.4 te kwantificeren.

7. de versterking en de geïsoleerde DNA Sequencing.

  1. Versterken van de V4-regio van het 16S-gen met een bewijs dat het lezen van de polymerase (Zie Tabel van materialen) zoals beschreven in Gohl et al. 12 Barcode monsters met verschillende indexing inleidingen en zwembad voordat sequencing. Volgorde met behulp van de methoden die worden beschreven door Gohl et al.12 met behulp van een PCR proces in twee stappen met V4 inleidingen (aanvullende bestand 1).
    Opmerking: Sommige van de methoden voor deze stappen worden beschreven detail elders12,13,14 en daarom zal worden hier niet beschreven. Voor de monsters van de wortel, werden PNA blokkers toegevoegd aan het verminderen van de hoeveelheid Plastide DNA versterkt van het weefsel van de plant, die al eerder volledig beschreven15. Twee besturingselementen werden gebruikt in sequencing, een negatieve controle, waaronder de winning plaat leeg besturingselementen (zienoot na stap 5.1.5), en een mock Gemeenschap van een bekende populatie van bacteriële DNA (Zie Tabel van materialen) die diende als een positief controle.
    Opmerking: In de meeste gevallen de v3 MiSeq reagens Kits worden gebruikt in de 2 X 300 basis gepaarde eindmodus. Voor de monsters in dit manuscript, werd de Illumina HiSeq 2500 gebruikt in de snelle modus met 250 gepaarde-einde (2 x 250) modus. Alle de steekproef waren sequenced in de zelfde baan.
  2. De gegevens rangschikken door middel van een pijpleiding voor analyses van de microbiële Gemeenschap (USEARCH v9.2.64, QIIME v1.9.1 en RStudio v3.4.3 16) verwerken.
    1. De gegevens van de sequencing met behulp van de USEARCH17te bereiden.
      Opmerking: USEARCH is beschikbaar online met volledige instructies (https://www.drive5.com/usearch/).
    2. De gegevens van de sequencing met behulp van de index leest of barcodes Illumina leest toewijzen aan monsters demultiplex.
    3. Het samenvoegen van de gepaarde-einde leest om consensus sequenties. Gebruik van de opdracht: usearch-fastq_mergepairs * R1*.fastq-relabel @ - fastq_maxdiffs 10 - fastq_minmergelen 230 - fastq_maxmergelen 320 - fastq_pctid 80 - fastqout merged.fq.
      Opmerking: De parameters worden ingesteld door verwijzing naar de handleiding USEARCH.
    4. Verwijder de inleidingen van de gegevens rangschikken om vervangingen in de primer sequenties, die kunnen worden veroorzaakt door de PCR-reactie. Gebruik van de opdracht: usearch-fastx_truncate merge.fq - stripleft 19 - stripright 20 - fastqout stripped.fq.
    5. Filteren van sequencing gegevens verwijderen van de lage kwaliteit leest en houden van hoogwaardige operationele taxonomische eenheid (OTU) sequenties. Gebruik van de opdracht: usearch-fastq_filter stripped.fq-fastq_maxee 1.0 - fastaout filtered.fa.
  3. OTUs genereren in USEARCH.
    1. Het uitvoeren van de dereplication ter identificatie van de verzameling van unieke OTU rijen. Gebruik van de opdracht: usearch-fastx_uniques filtered.fa - fastaout uniques.fa - sizeout-Uniq heretiketteren.
    2. Cluster OTUs met 97-100% reeks gelijkenis aan te wijzen van de unieke OTUs. Gebruik van de opdracht: usearch-cluster_otus uniques.fa - minimaal 2 - otus otus.fa-heretiketteren Otu.
      Opmerking: Deze stap neemt ook het wegnemen van singletons van de geclusterde OTUs en verwijdering van Chimaera van sequencing gegevens.
    3. Maak een tabel OTU in USEARCH. Gebruik van de opdracht: usearch-usearch_global stripped.fq - db otus.fa-strand plus - id 0.97 - otutabout otutable.txt.
      Opmerking: Deze opdracht genereert een tabel met het aantal leest (graven) van alle OTUs voor elk monster. De OTU tabel wordt gebruikt voor downstream stappen, met inbegrip van differentiële overvloed analyses en analyses van de microbiële diversiteit. Voorbeeld van OTU tabel is in aanvullende figuur 2 afgebeeld.
    4. Een analyse van de rarefaction in QIIME v1.9.1 18uitvoeren.
      Opmerking: De rarefaction-curve wordt berekend volgens de OTU tabel om te bepalen of de diepte van de volgorde goed monsters de microbiële Gemeenschap. Voorbeeld van de rarefaction curven zijn weergegeven in aanvullende figuur 3.
    5. Het gedrag van een alpha diversiteit analyse18. Alpha_rarefaction.py in QIIME v1.9.1 gebruiken voor het berekenen van de diversiteit van de microbiële Gemeenschap in elk monster.
      Opmerking: Deze analyse berekent diversiteit indexen zoals Shannon19, Simpson20en Chao121.
    6. Het gedrag van een beta diversiteit analyse18,22. Gebruik van de Python-script: beta_diversity_through_plots.py in QIIME v1.9.1 Bray-Curtis volgens matrix.
      Opmerking: Deze analyse vergelijkt de samenstelling van de microbiële Gemeenschap tussen de monsters.
    7. Het uitvoeren van statistische analyses tussen groepen. Gebruik de afstand matrices berekend voor PERMONOVA met de adonis en ANOVA-functie in de vegan pakket23 v2.4.5 in RStudio16. Canonieke analyse van de belangrijkste coördinaten (CAP)-analyse met behulp van de functie capscale in de vegan-pakket uitvoeren. Visualiseren van gegevens met behulp van ggplot2 pakket24 v2.2.1 in RStudio.

Representative Results

De representatieve resultaten gepresenteerd in dit manuscript komen uit een veld-site opgericht in 2012 op de Universiteit van Nebraska-Lincoln landbouw Research Division boerderij in de buurt van Mead, NE. voorafgaand aan het experiment, de site had beheerd als een rotatie van maïs-soja . De studieplaats bevond zich op drie verschillende soorten bodems, maar de gegevens werd geanalyseerd alsof alle wijzigingen in de bodemeigenschappen van de gemeten als gevolg van de behandelingen opgelegd.

De veld-site bevatte twee, puur, staat van switchgrass (P. miliaceum cv Liberty), evenals grote bluestem (A. Rus) en een mengsel van de lage-diversiteit gras met grote bluestem, indiangrass (S. Vogelmelk) en 'Butte' sideoats grama) B. curtipendula). De drie percelen van de warm-seizoen gras werden in een gerandomiseerde volledige blokontwerp dat driemaal is gerepliceerd. Genest in de drie verschillende gras percelen werden twee bevruchting behandelingen voor stikstof (N), die 56 (N1) en 112 (N2) kg N ha waren-1 van toegepaste ureum. Ten tijde van de bemonstering van de microbiome aan het einde van het groeiseizoen, de bodem opgenomen 8.0 ± 1.1 (gemiddelde ± SD) ppm nitraat in de percelen bevrucht met 112 kg N ha-1 en 6.8 ± 0,7 (mean + SD) ppm nitraat in de percelen bevrucht met 56 kg N ha-1. De percelen had al bevrucht wordt eenmaal per jaar. Het gras van de warm-seizoen percelen werden aangemerkt als de belangrijkste percelen (8000 m2) en N behandelingen waren de split percelen (4000 m2). Grote bluestem als een 50:50 mix van 'Bonanza' en 'Goudmijn' was uitgezaaid en Indiangrass als een 50:50 mix van 'Scout' en 'Warrior' was agarvoedingsbodem. De percelen werden geplant in 2012, en de eerste toepassing van de N opgetreden in het voorjaar van 2013.

De bodem en de wortel bemonstering vond plaats op 15 September 2014. De hieronder beschreven werk vond plaats op een veld dat is opgezet als een split-plot gerandomiseerde ontwerp met drie replicaat-organismen (Figuur 1). De diepte van de gemiddelde sequentiebepaling van alle de monsters voor de endosphere als volgt waren: 4871 ± 5711 (gemiddelde ± SD), rhizosfeer: 40726 ± 14684, bodem: 38184 ± 9043. Een van de grootste bronnen van variatie in deze experimenten, met behulp van de methoden die worden beschreven, is het verschil in microbiële gemeenschappen gevonden tussen monster typen (Figuur 2). In dit representatieve gegevensverzameling, de rhizosfeer en bodem lijken meer qua samenstelling bij elkaar liggen dan de endosphere (figuur 2A). Er waren echter ook veelbetekenend (p = 0,001) verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap rhizosfeer en bodem (figuur 2B). De totale variatie in deze experimenten geanalyseerd door monster type verantwoord was 26%.

Alfa diversiteit analyse toonde aan dat de microbiële gemeenschappen in de endosphere lager in monster diversiteit ten opzichte van de bodem en de rizosfeer (Figuur 3 waren). De enige belangrijke verschillen in verscheidenheid tussen de soorten gras in elk compartiment waren tussen de endosphere monsters van grote bluestem en switchgrass, met switchgrass hebben aanzienlijk hoger microbiële diversiteit (Figuur 3). De relatieve overvloed analyse (Figuur 4) benadrukt de dominantie van de Proteobacteria gevolgd door Straalzwammen in allerlei monster. Bodem en rhizosfeer ook beheerst door Acidobacteria en Chloroflexi de endosphere had een grotere relatieve overvloed van Bacteriodetes.

In dit experiment, planten zijn geteeld met twee verschillende hoeveelheden N-meststof en dus we de gegevens om te bepalen of er effecten van de behandeling waren geanalyseerd. Effecten van de behandeling goed voor 12% van de totale variatie maar waren niet significant verschillend hoewel in de wijding van de twee behandelingen verschillende (Figuur 5 kijken). Dit benadrukt het belang van statistische analyses voor deze datasets in plaats van visuele inspectie of kwalitatieve beslissingen.

Plant-beïnvloed verschillen in de microbiome van plantaardige weefsels en bodem werden gevisualiseerd met behulp van een gebonden methode van coördinatie. Statistische verschillen werden bepaald met behulp van een analyse van de PERMANOVA om te testen of specifieke variabelen, zoals soorten, in sterk afwijkt van de microbiële Gemeenschap samenstelling tussen de monsters resulteren. Wanneer alle monster typen waren samen geanalyseerd, werd een zeer significant verschil gevonden in microbiële Gemeenschap samenstelling als gevolg van plantensoorten (Figuur 6). In dit experiment was het bedrag van de variatie in rekening gebracht door plantensoorten 6,7%. Ten slotte was elk monster type afzonderlijk geanalyseerd om te bepalen welke van de soorten monster kan het effect van belangrijke plant soorten rijden. Alleen in de endosphere was er een zeer groot verschil (p = 0,001) tussen de microbiële Gemeenschap composities van de verschillende plantensoorten (Figuur 7). In de steekproef andersoortige was het soort effect niet significant wanneer afzonderlijk geanalyseerd. In de endosphere was het percentage variatie toe te schrijven aan soorten 27%, terwijl het lager in de rizosfeer (18%) en bodem (15%). Dit benadrukt verder het belang van elk weefseltype afzonderlijk analyseren.

Figure 1
Afbeelding 1: voorbeeld van het experimentele veld ontwerp. Experimentele veld ontwerp ter illustratie van een gerandomiseerde volledige blokontwerp in drievoud van het veld site ligt bij de Universiteit van Nebraska-Lincoln oostelijk Nebraska Research and Extension Center in de buurt van Mead, NE. Zie het gedeelte ' resultaten ' voor de volledige site beschrijving. N1 is de lage (56 kg N ha-1 ureum) en N2 (112 kg N ha-1 ureum) is het hogere tarief van de stikstof die was toegepast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Beta diversiteit analyse de microbiële samenstelling in de verschillende monster vormen, met inbegrip van endosphere, rhizosfeer en bodem van de overblijvende gras bemonstering in 2014 vergelijken. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in QIIME1.9.1 voor de productie van de Bray-Curtis volgens matrix. Analyse van de belangrijkste coördinaten (PCoA) op basis van de Bray-Curtis principegeloven matrix was gevisualiseerd in RStudio. PCoA1 en PCoA2 geven de afwijking van de eerste en tweede grootste verklaard door de analyse van de PCoA. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen monster typen, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de cijfers vertegenwoordigen de hele microbiële Gemeenschap voor elk monster. (A) Endosphere, rhizosfeer en bodem monster-typen zijn samen geanalyseerd. Alle 87 monsters werden verheven aan 486 sequenties per monster. (B) rhizosfeer en grond monsters werden geanalyseerd samen. Alle 59 monsters werden verheven met 8231 sequenties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Alpha diversiteit analyse met behulp van Shannon index voor elke soort in de endosphere, de rhizosfeer en de bodem. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in de QIIME1.9.1. Rarefaction werd gedaan voor de endosphere, de rhizosfeer, en de bodemtypes monster respectievelijk met 486, 17154 en 8231 sequenties per monster. Vakken geven aan de 25e en 75ste percentiel (eerste en derde kwartielen). De horizontale lijn in het vak geeft de mediaan en de rode plus toont het gemiddelde. Snorharen weergeven het bereik van de gegevens, met uitzondering van uitschieters (die worden weergegeven als zwarte stippen) en dat viel meer dan 1,5-maal de interkwartielafstand (n = 6 voor elk monster behalve voor sideoats grama mix waar n = 5). De Shannon-index van alle vijf soorten in de endosphere waren lager dan zowel de bodem als de rhizosfeer. Niet-parametrische Wilcoxon rangschikking som test werd gebruikt om de betekenis tussen de soorten en alleen significante verschillen tussen soorten werden getoond op de top van de vakken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: relatieve overvloed op het niveau van de stam in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem. Monsters werden geanalyseerd om te vergelijken de overvloed van microbiële stammen onder verschillende steekproeven (n = 29 voor elk monster-type). De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in QIIME1.9.1 uit de tabel OTU. De verschillende kleuren binnen het cirkeldiagram duiden de stammen. Het percentage geeft de relatieve overvloed van elke stam in elk monster-type. De informatie van de stam was van aantekeningen voorzien met behulp van de Ribosomal databaseproject classificatie (RDP)25. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: analyse met behulp van behandeling als beperkende factor tussen allerlei monster. Canonieke analyse van de belangrijkste coördinaten (CAP)-analyse werd uitgevoerd om te bepalen of er verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap tussen behandelingen waren. Voor de behandeling van elke N, n = 42 voor N1 (56 kg N ha-1) en n = 45 voor N2 (112 kg N ha-1). De Bray-Curtis volgens matrix werd gegenereerd met behulp van een python-script in de QIIME1.9.1. CAP analyse op basis van de Bray-Curtis volgens matrix werd gedaan door het beperken van de behandeling als de factor RStudio. PERMANOVA analyse werd uitgevoerd om te bepalen of de behandeling verschillen significant waren, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: analyse met behulp van plantensoorten als beperkende factor tussen allerlei monster. Analyse werd uitgevoerd om te bepalen of er verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap tussen plantensoorten in allerlei monster waren. Belangrijkste coördinaten wijding en CAP analyse allerhande monster (endosphere, rhizosfeer en bodem) werden gedaan met behulp van een Bray-Curtis volgens matrix. De Bray-Curtis volgens matrix werd gegenereerd met behulp van de Python-script in QIIME1.9.1. CAP analyse op basis van de Bray-Curtis volgens matrix werd gedaan door het beperken van de plantensoorten als de factor RStudio. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen plantensoorten, en de P-waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de cijfers vertegenwoordigt de gehele microbiële Gemeenschap voor dat monster. n = 18 voor elke soort in alle soorten, monster behalve n = 15 voor de sideoats grama mix. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: voorbeeld van de CAP analyse met behulp van soorten als beperkende factor voor elk monster type individueel. Belangrijkste coördinaat wijding en CAP analyse van elk monster type (endosphere, rhizosfeer en bodem) met behulp van Bray-Curtis volgens matrix. Elk type monster was verheven 486, 17154 en 8231 leest per monster respectievelijk in endosphere, de rhizosfeer en de bodem. Soorten werd gebruikt als de factor om te beperken de wijding. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen plantensoorten in elk monster type, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de figuur vertegenwoordigt de gehele microbiële Gemeenschap voor elk monster. Steekproefgrootte is n = 29 voor elk monster type, n = 6 voor elke plantensoorten in elk monster type met uitzondering van de sideoats grama mix (n = 5). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De methoden die worden beschreven in dit manuscript moeten inschakelen wetenschappers om gemakkelijk het gebied van bodem en plant metagenomics. Door de jaren heen, hebben wij onze methodes verfijnd sinds het uitvoeren van het experiment beschreven in dit manuscript. Één verandering is dat we nu vooraf label buizen voor het uitgaan naar het veld te monster. Onze afwerkcentrale gebruikt een barcoding-systeem en een labelprinter. De labelprinter bespaart niet alleen tijd toen labeling buizen, maar ook maakt alles makkelijker bijhouden en monsters zonder de grillen van menselijke hand schrijven correct te herkennen. Een ander belangrijk punt is dat we proberen te verwerken van het materiaal na brengen het terug uit het veld zo spoedig mogelijk. Wij streven ernaar om te bevriezen van de bodem gebruikt voor DNA-analyse, steriliseren en bevriezen van de wortels, en filteren en blokkeren de rizosfeer binnen 12 tot 36 uur na zijn terugkeer uit het veld. De DNA-extractie-procedures zijn langdurig met veel stappen, met name voor de bodem en de rhizosfeer, dus we een robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) die minimaliseert de handen op tijd voor de protocollen van de extractie van DNA kochten, vermindert menselijke fout die kan worden ingevoerd, en verbetert de consistentie in de manier waarop verschillende batches van bodem, wortels of rhizosfeer worden verwerkt. Bij het werken met plantaardig materiaal is het belangrijk om te beslissen over het type root te worden bestudeerd of te nemen van een verscheidenheid van wortel types te krijgen van een "representatief". Behoud van wortels en bladeren in een bevroren toestand bij het uitvoeren van de DNA-extracties zoals is het belangrijk is ervoor te zorgen is er geen kruisbesmetting tussen de monsters bij het invullen van de 96-Wells DNA-extractie-platen. Een andere belangrijke factor die meespeelt is het aantal replicatieonderzoeken moet worden gebruikt wanneer het veld experimenten ontwerpen en gebruiken van een complete gerandomiseerde ontwerp waar mogelijk26. Als gevolg van de variabiliteit van de hoge veld het mogelijk moet zijn een groot aantal wordt gerepliceerd naar het detecteren van kleine verschillen. Tot slot, uit onze ervaring het is essentieel om ervoor te zorgen dat bodems zijn niet te nat. Wanneer het opgraven van de wortels. Als de bodems zijn verzadigd met water het is niet alleen rommelig om mee te werken, maar het is ook zeer moeilijk te bepalen van de rhizosfeer en te verwijderen van de bodem van de wortels.

Een wijziging die werd gemaakt al vroeg tijdens de ontwikkeling van deze methoden is in plaats van het schudden van de buizen met de hand om de rizosfeer die we opgewaardeerd tot vortexers aangedreven door een gas generator om het werk gemakkelijker in het veld en meer gestandaardiseerd in termen van de tijd en de wijze dat elke buis werd geschud. Een beperking van de amplicon rangschikking aanpak is dat de resolutie van de taxonomische van de resultaten vaak beperkt is en vele OTUs onbekende of enige bekende op de familie of een genus niveau zijn. Dit veld van onderzoek evolueert snel dus is het belangrijk op de hoogte van nieuwe en ontwikkelende benaderingen, met name voor data-analyse die de resolutie van de resultaten kan verbeteren.

Deze protocollen zijn alleen voor het studeren niet schimmels, bacteriën en archaea. Het gebruik van verschillende inleidingen voor versterking zal toestaan voor de studie van fungale gemeenschappen met behulp van de dezelfde DNA monsters27,-28. Deze methoden vereisen niet de aankoop van grote hoeveelheden materiaal omdat de methoden kunnen worden vereenvoudigd. De methoden die we beschrijven hier zijn voornamelijk voor het bepalen van de "wie is er", maar het veld snel ontwikkelt zich tot een belangrijke vragen over de functie, die kan worden aangepakt met behulp van shotgun sequencing methoden, isolatie en testen van de functionaliteit van microben, of de hele microbiële genoom sequencing.

De representatieve resultaten benadrukken de verschillen in microbiële gemeenschappen die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de beschreven methoden. Met behulp van een bèta-diversiteit benadering de data analyse22, werden samenstelling verschillen tussen monster types getoond. Deze verschil zijn in de meeste andere studies waar endosphere, rhizosfeer en bodem bevatten unieke microbiële gemeenschappen3duidelijk waargenomen. Het indexcijfer van de diversiteit van de Shannon was berekend de overvloed en de gelijkmatigheid van de microbiële soorten waarvan de aanwezigheid binnen iedere plantensoorten in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem te bepalen. Zoals u in deze studie en vele anderen, is Alfa diversiteit het hoogst in de bodem, licht dalend in de rizosfeer en dan daalt aanzienlijk in de endosphere3,5,29. Deze resultaten wijzen erop dat de hier beschreven methoden geschikt zijn voor het identificeren van compositorische wijzigingen in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem.

De dominantie van de Proteobacteria is een gemeenschappelijke vaststelling in studies over endosphere en bodem30,31,32. Endosphere heeft over het algemeen een lagere diversiteit van microbiële soorten met een hogere relatieve abundantie van de Proteobacteria. Hieruit blijkt opnieuw dat de resultaten hier representatief voor andere bevindingen in de literatuur zijn. De effecten van de behandeling in deze studie waren niet significant verschillend en twee grote redenen daarvoor kunnen worden dat de verschillen die zijn opgelegd door de behandelingen niet groot genoeg is waren voor het genereren van voldoende variatie om op te sporen en dat deze bemonstering werd gedaan aan het einde van de groeiseizoen, wanneer de velden kunnen hebben voldoende tijd gehad om te vestigen beneden de stikstof op vergelijkbare niveaus, die is wat werd gemeten aan het eind van het seizoen. In een andere studie met behulp van soortgelijke bevruchting tarieven over een langere periode van tijd, werden slechts relatief kleine veranderingen in de samenstelling van de microbiome gemeten33. Andere studies hebben aangetoond wijzigingen in zowel schimmel en bacteriële gemeenschappen als gevolg van stikstof kunstmest34,35.

Plantensoorten zijn gekend om te spelen een rol bij het bepalen van hun microbiomes3,32,36 en zelfs kleine verschillen in de variant van de microbiële Gemeenschap zijn aangetoond tussen verschillende plant genotypen binnen een enkele soorten37. In deze studie werd een significant verschil in samenstelling van de microbiële Gemeenschap gevonden tussen plantensoorten. In alle soorten van de steekproef bleek dat switchgrass had de meest verschillende microbiële samenstelling, maar waren de verschillen tussen soorten alleen statistisch significant in de endosphere. Rhizosfeer Gemeenschap samenstelling kan beduidend indien meer replicatieonderzoeken beschikbaar voor analyse waren zijn geworden.

De gecombineerde veld, lab en analytische protocollen beschreven hier bieden een krachtige methode voor het bestuderen van de manier waarop de verschillende factoren invloed de samenstelling van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer, en de endosphere van wortels36. Er is een heleboel werk te doen op het gebied van het bestuderen van de microbiomes, met name in agrarische velden. Belangrijke vragen op over hoe de opbrengsten worden gewijzigd door de microbiome van de bodem moeten nog volledig worden opgehelderd. Zelfs de meest elementaire vragen over hoe vruchtwisseling invloed op de microbiome van de bodem, hoe timing verandert de microbiome, hoe abiotische stress verandert de microbiome, hoe bodemtype interageert met deze factoren te wijzigen van de microbiome, en of er universele microben in bepaalde gewassen of regio's van de VS zijn allemaal open vragen. Deze methoden zullen ook nuttig voor epidemiologisch onderzoek om de aanwezigheid en de persistentie van pathogene en gunstige bacteriën te identificeren. Een andere toekomstige horizon voor deze methoden zullen om te beginnen met de hier beschreven met plant- en microbe RNA- en metaboliet gegevens DNA-methoden te integreren. Extra verbetering en het testen van meer variabelen is belangrijk voor verdere optimalisatie van deze protocollen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De ontwikkeling van dit manuscript wordt ondersteund door de National Science Foundation EPSCoR Center voor Root en Rhizobiome innovatie Award OIA-1557417. Het verzamelen van gegevens werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Nebraska-Lincoln, landbouwkundig onderzoek en ontwikkeling en door een subsidie van de Hatch van USDA. Wij erkennen ook steun van de USDA-ARS en ondersteuning werd verstrekt door de landbouw en voedsel onderzoek initiatief concurrerende Grant nr. 2011-68005-30411 van de USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw te richten en te beheren van deze velden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 12955-4 Extraction kit for soil and rhizosphere
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 13496-4 Extraction kit for roots
D-Handle Digging shovel, 101 cm L Fiskars 9669
Rapid Tiller, 40 cm L Truper 34316
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm Ziploc NA
Cooler Any NA
Wash pan Any NA
Plastic bucket Any NA
Gloves (work and lab) Any NA
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-8FS
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-4FS
portable generator Honda brand works well NA
Sterile cell strainers 100 μm mesh size Fisher Scientific 22-363-549
NaH2PO4·H2O VWR 0823
Na2HPO4 VWR 0404
Silwet L-77 Lehman Seeds VIS-30 Surfactant
Autoclaves Any NA
Drying Oven Any NA
Scale Any Any
Bleach CLOROX - household strength NA
Tween 20 Any NA
Liquid Nitrogen Any NA
Dry Ice pellets Any NA
Ethanol Any NA
11 cm precision fine point tweezers Fisher 17456209
18 cm Straight point specimen forceps VWR 82027-436
13.5 cm Pruning Scissors Fiskars 9921
2 mL tube Any NA
15 mL PP conical tube MIDSCI C15B
50 mL PP conical tube MIDSCI C50B
Ultrapure water Millipore-sigma Milli-Q Integral, Q-POD
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854 For DNA quantification of removed samples
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 For DNA quantification
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates Corning 3631
pPNA PCR Blocker PNA Bio PP01-50
mPNA PCR Blocker PNA Bio MP01-50
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing BEI Resources HM782D
Adhesive 8 well-strips for plates VWR 89134-434
Stainless steel beads, 3.2 mm dia Next Advance SSB32
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) CoStar 3959
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere TWD Tradewinds, INC ASWF1SPK
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf TWD Tradewinds, INC ASWFXSCS
Genie 2 Digital Vortex Scientific Industries SI-0236
Vortex adapter for 50 mL tubes Scientific Industries SI-H506
Mortar (100 mL) and pestle Any NA
Metal micro-spatula VWR 80071-672
Disposable antistatic microspatulas VWR 231-0106
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) Duro 18402
5424 Centrifuge for 2 mL tube Eppendorf 22620461
Centrifuge for 96-well plate Sigma4-16S 81510
Centrifuge rotor for 50 mL tubes Sigma4-16S 12269 - Biosafe
KAPA HiFi DNA polymerase Kapa Biosystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
  2. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15, (10), 579-590 (2017).
  3. Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7, (1), 15019 (2017).
  4. White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28, (1), 22-29 (2015).
  5. Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, (8), E911-E920 (2015).
  6. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  7. Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7, (6), 819-827 (2005).
  8. Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47, (1), 23-33 (2009).
  9. Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77, (17), 5934-5944 (2011).
  10. Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
  12. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34, (9), 942-949 (2016).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79, (17), 5112-5120 (2013).
  14. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6, (8), 1621-1624 (2012).
  15. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10, (10), 999-1002 (2013).
  16. RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
  17. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10, (10), 996-998 (2013).
  18. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, (5), 335-336 (2010).
  19. Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
  20. Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
  21. Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
  22. Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1, (1), 3-8 (2008).
  23. Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
  24. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
  25. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
  26. Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
  27. O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71, (9), 5544-5550 (2005).
  28. Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84, (1), 3-20 (2014).
  29. Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349, (6250), 860-864 (2015).
  30. Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
  31. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, (12), E2450-E2459 (2017).
  32. Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115, (6), E1157-E1165 (2018).
  33. Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91, (12), 3463-3470 (2010).
  34. Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5, (7), e11915 (2010).
  35. Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18, (5), 1338-1351 (2016).
  36. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  37. Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, (16), 6548-6553 (2013).
Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).More

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter