Summary
여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.
Abstract
규제 exocytosis는 화물 분 비과 립 (SGs)에 저장 되어 있는 분 비 방 아 쇠에 대 한 응답에 출시 하는 과정 이다. 규제 exocytosis 세포 커뮤니케이션에 대 한 기본 이며 신경 전달 물질, 호르몬, 염증 중재자 및 세포의 다양 한 다른 화합물의 분 비에 대 한 핵심 메커니즘입니다. 적어도 세 가지 메커니즘 규제 exocytosis 알려져 있다: 전체 exocytosis, 단일 SG 키스 실행 exocytosis, 어디 하나의 SG는 뚜렷이 플라즈마 막으로 퓨즈, 그리고 복합 exocytosis, 플라즈마 막으로 완전히 퓨즈 어디 이전에 또는 플라즈마 막으로 SG 퓨전 후 여러 SGs 서로 융합. 셀에 의해 착수 하는 규제 exocytosis 유형의 자주 분 비 트리거 유형에 의해 결정 됩니다. 그러나, 많은 셀에 단일 분 비 트리거를 활성화할 수 있다 규제 exocytosis의 다중 모드 동시에. 그들의 풍요로 움과 세포 유형 및 종 중요성에도 불구 하 고 분 비의 다른 모드를 결정 하는 메커니즘 크게 확인 되지 않습니다. 규제 exocytosis의 다른 모드를 조사 하 고 있는 주요 과제 중 하나입니다 뿐만 아니라 그들을 별도로 탐험으로 그들 사이 구별에 어려움. 여기 우리가 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여 설명-dextran exocytosis 기자 및 라이브 셀 이미징, 규제 exocytosis, 복합 exocytosis에 초점의 다른 경로 구분 하는 견고성에 따라 고 exocytic 이벤트의 기간입니다.
Introduction
규제 exocytosis를 쉽게 만든된 화물 특정 트리거에 분 비 세포에서 출시 하는 기본 메커니즘입니다. 화물은 미리 형성 하 고 그것까지 트리거 릴레이 SGs의 콘텐츠의 출시에 대 한 신호 저장 되어 있는 분 비 소포에 압수. 다양 한 유형의 신호 규제 exocytosis의 다른 모드에서 발생할 수 있습니다 또는 다른 형태의 규제 exocytosis 동시에 발생할 수 있습니다. 규제 exocytosis의 세 가지 주요 모드 알려져 있습니다: 전체 exocytosis, 원형질 막;와 단일 분 비과 립의 완전 융합을 포함 키스 실행 exocytosis, 재활용; 다음 플라즈마 막으로 분 비과 립의 과도 융합을 포함 그리고 여러 SGs 이전 (즉, multigranular exocytosis)의 homotypic 융합이 특징인 복합 exocytosis 순차적 또는 (즉, 순차 exocytosis) 플라즈마 멤브레인1퓨전 하. 복합 exocytosis 간주 됩니다 화물 릴리스2의 가장 광범위 한 모드는 SGs에서를 포함 하 여 화물의 빠른 분 비에 대 한 수 플라즈마 멤브레인에서 원심. 모두 외 분 비 및 내 분 비 세포3,,45,6,7,8,9에서 복합 exocytosis 문서화 되었습니다. 면역 세포입니다. 면역 세포, 호 산 구는10,,1112 및 호 중구13, 같은 복합 exocytosis 수 같은 침입 병원 체를 죽 일 하는 데 필요한 중재자의 신속 하 고 강력한 출시 박테리아 또는 기생충입니다. 타고 난 면역 반응, 알레르기, 및 다른 알레르기 반응14,,1516 미리 저장 된 염증 성 중재자의 효율적인 릴리스에 대 한 복합 exocytosis를 배포 하는 돛대 세포 (MCs) , 17. exocytosis의 다양 한 모드로18,19를 동시에 발생할 수 있습니다, 이후 그것은 실시간으로 그들을 구별 하거나 그들의 각각 융합 기계, 따라서 elucidating 식별 도전 되고있다 그들의 기본 메커니즘입니다.
여기에 우리가 메서드를 기반으로 현재 라이브 셀에 셀의 이미지 로드 FITC-dextran, exocytic 이벤트의 실시간 추적 및 그들의 다른 모드를 구별 하는. 특히, 우리의 메서드 복합 exocytosis의 독점 모니터링 수 있습니다.
FITC dextran 글 루 칸 다 당 류 dextran와 pH에 민감한 fluorophore FITC 켤레입니다. 붙일 레이블된 dextrans micropinocytosis20,21 , macropinocytosis,2223여 셀 입력 표시 되었습니다. Endocytic 구획 리소좀으로 성숙, 그것은 보였다 FITC dextran 명백한 저하 없이 리소좀 축적. 그러나, FITC는 높은 pH에 민감한 fluorophore24리소좀 루멘은 산 성 때문에, FITC dextran 형광 리소좀24를 도달 하는 즉시 냉각. 따라서, 화물, FITC의 pH 감도 함께 찍은 대상 리소좀으로 dextrans를 설립, 리소좀 exocytosis25,,2627 의 연구에 FITC dextran의 사용을 위한 기초 마련 , 28 , 29.
MCs, 호 중구, 호 산 구는, 세포 독성 T 세포, melanosomes, 및 다른 사람을 포함 한 여러 세포 유형, SGs lysosomal 기능을 표시 하 고 리소좀 관련 세포 (LROs) 또는 분 비 리소좀30,31로 분류 됩니다. . LROs 산 성 luminal pH 때문에, FITC dextran 높은 pH는 LROs의 exteriorization와 관련 된 결과로 그들의 exocytosis 시각화를 사용할 수 있습니다. 실제로, FITC dextran MCs18,,3233exocytosis를 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 이 방법에서는, FITC dextran 세포 배양에 추가, pinocytosis 하 여 셀에 의해 촬영 이며 SGs에 정렬. 그것은 리소좀 때 그들이 셀 내에 SGs에 FITC 형광 침묵 이다. 그러나, 플라즈마 멤브레인 및 외부 환경에 따른 노출 SG 퓨전, 따라 FITC dextran 차릴 SG pH 상승으로 그것의 형광 라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 exocytic 이벤트의 간단한 추적 허용. 여기, 우리는 복합 exocytosis의 고유 추적을 사용 하도록이 메서드를 조정.
다른 두 가지 방법은 이전 복합 exocytosis를 추적 하기 위해 사용 되었습니다. 전자 현미경은 exocytosis의 다른 모드의 발생을 제안 하는 exocytic 구조를 특성화 하기 위해 첫 번째 방법입니다. 특히, "분 비 터널" 췌 장 acinar 셀34 에 MCs35,,3637 의 복합 exocytosis의 가설에 상승을 했다. 그러나, 전자 현미경 검사 법의 높은 해상도 융합된 소포를 공개 하는 힘, 그것은 그들의 융해의 역학을 추적할 수 없습니다. 및 따라서 복합 exocytosis 동안 SG 퓨전 또는 다시 캡처한 알갱이의 융합에 대응 여부를 정의할 수 없습니다. 다음 그들의 endocytosis. 살아있는 세포, 원형질 막 커패시턴스11,13,,3839 또는 amperometry의 패치 클램프 측정 등에서 exocytosis를 측정할 수 있는 다른 방법에이 장애물을 극복 미디어의 40 . 그러나, 패치 죄는 특별 한 설정 필요 하며 모든 세포 유형에 적합 하지 않을 수 있습니다. Amperometry 측정 exocytosis 화물 전극에 매우 가까이에 출시 하는 경우에 추적할 수 있습니다. 따라서, 그것은 뿐만 아니라 허용 exocytosis의 실시간 추적 하지만 그것 또한 모든 셀에서 데이터의 신속 하 고 간단한 수집 수 있습니다 이러한 방법을 통해 이점을 제공 라이브 셀 이미징 사용 하 여 합니다.
라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 FITC dextran의 추적 또한 몇 가지 장점을 다른 라이브 셀 이미징 기반 방법을 제공합니다. 예를 들어 널리 사용 되는 방법은 세포 형광 SG 프로브 로드 또는 표현 하는 형광 단백질 태그 SG 화물 또는 막 단백질26,41, 의 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)는 42 , 43.이 방법의 강점 독점적으로 (여기 라고도 발자국), 원형질 막 가까이 발생 하는 이벤트를 모니터링 하는 기능에 따라서 exocytic 이벤트. 그러나, 이것은 또한이 방법의 단점은 셀 일부분만 하는 coverglass에 인접 한 현미경 렌즈에 가까운 수44군데 있기 때문에. 같은 발자국 실제로 전체 세포 막 표면 표시 하는지 여부를 여전히 미해결45,,4647이다. 이와 관련, 오픈 pinhole와 FITC dextran 등 pH에 민감한 염료 및 표준 형광 현미경 confocal 현미경을 사용 하 여 따라서 해당 셀에 발생 하는 총 exocytic 이벤트를 캡처, 전체 셀의 이미지를 수 있습니다.
전체 셀 이미징 또는 TIRFM 규제 exocytosis를 공부 하는 데 사용 되는 추가 pH에 민감한 기자 SG 화물 또는 SG 막 단백질 phlourin, pH에 민감한 GFP 변종 융합을 포함 합니다. 예로 NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, 및 synapto phluorin48,49,50,,5152있습니다. 이러한 프로브 식 SGs의 내 생 적인 구성을 더 밀접 하 게 나타낼 수, 그것은 세포의 transfection를 수반 고 따라서 덜 어려운 transfect 세포에 적합 있을 수 있습니다. 따라서 때 세포 공부 transfect 어렵다 또는 여러 게놈 조작이 필요로 하는 실험 조건에서 세포 배양의 FITC-dextran 등으로 간단 하 게 보완 될 수 있습니다 화합물의 사용이 유리 . FITC dextran 또한 제공 하는 이점을 acridine 오렌지 (AO), 라이브 셀 현미경53,54,,5556 여 exocytosis의 추적을 위해 사용 된 또 다른 pH에 민감한 염료 , 57 , 58. 아오 소포 실제 분 비와 일치 하지 않는 거짓 플래시에서 결과27처리의 photolysis를 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 반면, FITC dextran 반응성 산소27의 그것의 낮은 사진 유도 된 생산 때문에 아마 더 나은 분 비 이벤트를 반영합니다.
특히, exocytosis 공부에 대 한 다른 접근 방법이입니다 융합 기 공이 과정을 통해 SG에 외부 매체에서 염료의 유입에 추적. 이 경우에 염료 분 비 트리거 함께 외부 매체에 추가 됩니다. 다음, 융합 기 공이 열리면 염료 SG59,60으로 확산. 이 방법의 명확한 이점은 이다 그것 또한 가변 크기의 염료의 사용에 의해 융합 기 공 크기를 예측 하는 기능을 제공 합니다. 예를 들어 서로 다른 분자량 (MW), 다른 fluorophores에 활용 된의 dextrans SG를 관통할 수 있다 dextran의 최대 크기 것 융합 공59, 의 크기에 해당 하는 그것에 의하여 extracellular 염료로 사용할 수 있습니다. 61 , 62 , 63 , 64. 또한,이 방법은 pH에 민감한 프로브를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 그러나, 중요 한 불리가 이다 신호 대 잡음 비는 매우 낮은 이기 때문에 많은 양의 염료는 미디어에 높은 백그라운드에서 발생 하는 이미지의 중.
전반적으로, exocytosis 마커로 FITC dextran 사용 신호 소음 비율, 독성, 동적 추적 및 복잡성 등 이전에 보고 된 방법에 몇 가지 단점을 극복 했다.
여기 우리는 FITC-dextran (여기 라고도 RBL, Eccleston 외 에 의해 주로 설립 RBL-2 H 3 돛대 세포 라인에 복합 exocytosis 모니터의 사용 설명 65 Barsumian 그 외 여러분 에 의해 복제 추가 66)에 면역 글로불린 E (IgE) / 항 원 (Ag) 활성화.
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Protocol
1입니다. 준비
- RBL 문화 미디어의 준비
- 낮은 포도 당 Dulbecco의의 믹스 500 mL 페니실린-스-nystatin 솔루션, L-글루타민 200 m m 솔루션의 5.5 mL의 5.5 mL 소 태아 혈 청 (FBS)의 56 mL와이 글의 중간 (DMEM)를 수정합니다. 낮은 포도 당에서이 결과 DMEM와 10 %FBS, 100 µ g/mL 스, 100 단위/mL 페니실린, 12 단위/mL nystatin, 2 mM L-글루타민 보충.
- 4 ° c.에 0.22 μ m 기 공 크기 및 저장소의 최고 진공 필터를 사용 하 여 미디어를 필터링
- RBL 세포의 유지 보수입니다.
- 10 cm 접시에 90%의 최대 confluency RBL 세포 성장. 건강 한 세포 배양의 경우 셀 가끔 돌출 된 스핀 들 모양이 있어야 합니다.
- 셀 분할 분리 접시에서 셀 미디어를 발음 하 고 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 5-10 분에 대 한 trypsine/EDTA 솔루션 B. 품 2 mL와 함께 교체
- 셀을 분리 했으면 일단 한 피 펫을 사용 하 여 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 하 여는 트립 신을 중화 하 고 1:2-1 셀 분할: 10 비율.
- Tyrode의 버퍼 x 20의 준비
- X 54 m m KCl의 솔루션, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl, 두 배 증류수 (DDW)에서 8 밀리미터 NaH2포4 주식 20를 준비 합니다. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장
2. 라이브 셀입니다 RBL 세포의 문화
- FITC dextran 솔루션의 준비입니다.
- 문화 미디어 (1.1.1 단계 참조)의 1 mL 당 FITC dextran 가루 (150 K) 1 mg을 혼합. 전체 연 발된 coverglass 3 mL 준비.
- 0.22 μ m 기 공 크기와 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터 단위를 사용 하 여, 녹아 FITC dextran 필터링.
- 1 µ g/mL의 농도를 마우스 IgE를 추가 합니다.
- 이미징에 대 한 시드 RBL 셀
- 이미징, 전날 문화 접시에서 미디어를 발음 하 고 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 5-10 분에 대 한 trypsine/EDTA 솔루션 B. 품의 2 개 mL를 바꿉니다 셀을 분리 했으면 일단 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 하 여는 트립 신을 중화.
- 수 RBL 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 볼륨을 조정 따라 105/mL x 7.5의 세포 농도를 문화 미디어.
- 10 µ L 연 발된 coverglass 미리 가득 신선한 FITC-dextran을 세포 현 탁 액의 보충 (7.5 x 103 셀 챔버에 시드 결과) 문화 미디어를 추가 합니다.
- 37 ° c.에 5% CO2 의 humified 분위기에서 하룻밤 RBL 세포 성장 셀 셀 구분 되 고 쉽게 현미경 개별적으로 각 셀을 식별할 수 있는지 확인 하기 위해 하위 confluent 수준에 있어야 합니다.
- Transfection RBL 세포-옵션 의입니다.
- 함께 다른 붙일 태그가 단백질 exocytic 이벤트 영상, transfection 프로토콜 RBL 셀 Azouz 그 외 여러분 에 대 한 참조 67
3. 라이브 셀 Exocytosis의 현미경 검사 법
- 솔루션의 준비:
- 1시 20분에서 DDW에서 재고 솔루션을 diluting 하 여 최종 Tyrode의 버퍼 솔루션 준비 희석 및 20 mM Hepes ph 7, 1.8 m m CaCl2, BSA, 1 mg/mL 및 5.6 m m 포도 당 보충.
- Tyrode의 버퍼에 20 x 간접적인 시 갓 준비 [1 µ g/mL dinitrophenyl 인간 혈 청 알 부 민을 활용 (DNP-은 (Ag)) 50 ng/mL 1 배 농도 대 한 우리의 경우에].
- Tyrode의 버퍼에 분말을 용 해 하 여 400 m m 염화 암모늄 솔루션을 준비 합니다.
- 셀의 준비입니다.
- 상공에서 미디어를 발음 하 고 37 ° c prewarmed Tyrode의 버퍼의 300 µ L로 그것을 채우는 여 연 발된 coverglass 3 번 씻어 마지막으로, Tyrode의 버퍼, 37 ° c.에 prewarmed의 300 µ L와 챔버를 보충
- 현미경의 보육 실에서 연 발된 coverglass를 놓습니다. 챔버는 안정 다는 것을 확인 하십시오.
- 현미경을 설정
- 추적에 대 한 관심의 영역을 선택 하려면 형광 광원 (전통적으로 수은 램프) 설정 하 고 적절 한 형광 필터 선택 (FITC dextran을 보기 위한 녹색 fluorophores에 대 한 필터를 선택). 일단 관심 영역 초점 보기의 필드는가 사진-표백 및 독성을 피하기 위하여 광원을 해제.
참고: 일부 셀에 FITC dextran의 형광을 유지 수 있습니다. 이 때문에 FITC dextran endosomes 같은 비 lysosomal 구획에도 정렬할 수 있습니다. - FITC 여기에 대 한 적절 한 조명 설정. 레이저 기반 현미경을 사용 하는 경우 488 nm 레이저를 켭니다. 방출 주위 수집 해야 500-550 nm (510-520 nm에서 FITC 방출 봉우리).
- Confocal 현미경을 사용 하는 경우 최대에 작은 구멍을 엽니다. 이 표백 피하기 위해 저전력 레이저 및 독성을 사용 하 고 셀의 모든 비행기에서 exocytosis 이벤트 캡처를 보장 합니다.
- 보정 이미지 인수 사이의 시간 간격.
- 다른 세포는 규제 exocytosis68의 그들의 활동에서 달라질 수 있습니다. 복합 exocytosis의 특정 이미지에 대 한 시간 간격을 5 초 이상 하는 것이 좋습니다. 그러나, 엄지손가락의 규칙으로 서 빠른 이미징 있도록 확인 단일 프레임의 획득 시간 빠릅니다.
- 레이저 검사 confocal 현미경을 사용할 때 스캔 방향을 양방향으로 설정, 평균, 수 없고 512 x 512에서 해상도 설정 (권장, 후자의 두 조항 또한 표백 및 독성을 최소화 하기 위해 도움이 될 것입니다).
- 추적에 대 한 관심의 영역을 선택 하려면 형광 광원 (전통적으로 수은 램프) 설정 하 고 적절 한 형광 필터 선택 (FITC dextran을 보기 위한 녹색 fluorophores에 대 한 필터를 선택). 일단 관심 영역 초점 보기의 필드는가 사진-표백 및 독성을 피하기 위하여 광원을 해제.
- Exocytosis의 이미지입니다.
- 이미지 셀의 셀 또는 간접적인 유형에 따라 원하는 기간에 대 한. RBL 세포 IgE/Ag와 발생, 대부분의 exocytic 이벤트 활성화의 15-20 분 이내 발생.
- 세포의 활성화, 대 한 상공 회의소 간접적인 솔루션 x 20에서 16 µ L을 추가 합니다.
- 셀에 FITC dextran 존재 확인.
- 존재와 FITC-dextran SGs에의 지역화를 확인 하려면 추가 염화 암모늄 솔루션의 16 µ L (초점을 잃게 하기에서 챔버를 이동 하지 않도록 주의 수) 챔버를 부드럽게 (이 20 m m의 최종 농도 만들 것입니다). 이 SGs의 자율 및 초 이내 발생 합니다 FITC 형광의 dequenching을 유발 한다.
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Representative Results
그림 1a 는 개요로 exocytosis를 규제 하 고 exocytic 이벤트의 다양 한 모드를 정리 FITC dextran 기자로 서 행동 수 있습니다 얼마나 나타냅니다. 첫째, 세포 FITC-dextran, pinocytosis에 의해 내 면 고 SGs 정렬와 함께 알을 품는. MCs의 SGs LROs 이기 때문에, 그들의 낮은 pH FITC, 그림과 같이 검은 알갱이의 형광을 따 윈 (A-C, 난). 세포는 간접적인 및 플라즈마 막으로 SGs 신관에 의해 트리거됩니다 때 양성자의 경과 SGs의 자율 융합 기 공이 형성 된다. 결과적으로, FITC 차릴 그것의 형광 (A II). 전체 exocytosis 짧은 표출 됩니다 (미만 5 s) 형광 이벤트 exteriorized SG의 막 완전히 원형질 막 및 FITC dextran 축소로 확산 한다 멀리 문화 매체 (, III). 키스 실행 exocytic 이벤트 동안 SG의 막만 뚜렷이 단기 퓨전 공 결과 플라즈마 막으로 퓨즈 따라서 SG로 형광의 간단한 폭발만 빠르게 분리와 그것의 루멘 빠르게 다시 (B, 산성화 III-4)입니다. 마지막으로, 복합 exocytosis, 동안 SGs의 시리즈 순차적으로 퓨즈 서로 (다음 SG 퓨전) 뿐만 아니라 유지 보수는 오픈 퓨전의 원형질 막. 그 결과, FITC dextran의 훨씬 더 큰 질량은 dequenched, 프로브 (C, V) 외부 매체로 확산 때 부패 하는 크고 긴 형광 버스트 (C, 3 세-4 세)의 결과로.
우리는이 모델을 사용 하 고 이미징 컨트롤 셀과 셀 Rab5, 우리는 중요 한 homotypic SG-SG 퓨전69 및 복합 exocytosis33표시가의 고갈에 의해 그것의 예측을 확인 했다. 모든 15 이미지 획득 시간을 설정 하 여 s, 우리 분 비, 즉, 복합 exocytosis의 주로 지속적인 이벤트를 검색할 것으로 예상. 사실, 그림 1B와 같이 우리의 데이터 쇼 동안 통제에서 세포 많은 크고 오랫동안 exocytic 이벤트 기록 될 수, 몇 이벤트만 Rab5 최저의 셀 (shRab5)에 기록 되었다. 또한, shRab5 셀에 기록 된 이벤트는 컨트롤 셀에 기록 된 이벤트에 비해 크기가 훨씬 작은 했다. 노트, shRab5 세포의 분 비 능력은 동일한 조건69, shRab5 복합 exocytosis 억제, 하는 동안 그것은 없는 분 비를 폐지 않습니다 제안에서 변경 되지 않은 남아 있습니다. 따라서, 긴 시간 간격에 이미징 FITC dextran 형광 화합물 exocytosis의 특정 검색에 대 한 수 있습니다. 또한, 이미징 FITC dextran 릴리스 복합 exocytosis의 순차 자연의 캡처 수 있습니다. 그림 1b, 빛, 플래시 다음에서 화살표로 표시 된 대로 두 번째 플래시 첫 번째에 인접 한 약한 플래시 시작 합니다. 이 SG (즉, 순차 exocytosis) 원형질 막으로 융합 하는 과정은 이미 SG와의 융합으로 추정 될 수 있다. 따라서, 두 번째과 립 융합 기 공에 의해 원형질 막에 이미 연결 된 첫 번째과 립와 퓨즈 두 번째과 립의 pH도 증가 하 고 FITC 형광 dequenches, 형광의 두 번째 버스트 저조한. 인접 한 SGs 순차 융합 동안 FITC dextran 릴리스 이러한 시나리오는 그림 1 c에서 제공 됩니다.
복합 exocytosis 동안 SGs 순차 융합의 또 다른 예는 그림 2에 표시 됩니다. RBL 세포의 Rab5a WT 스냅-23, 더 강력한33되는 복합 exocytosis에서 constitutively 활성 (CA) 형태로 공동 transfected 했다. SG-SG 퓨전을 위해 필수적 이며 큰 SGs33,69, FITC-dextran 함께 코팅은 CA Rab5a의 이미지와 큰 CA Rab5a 장식과 립 작은 립의 융합의 더 나은 시각화 수 있습니다.
FITC dextran SG 내부 저장 될 때 침묵 이다, 이후 그것은 FITC dextran는 SGs에 실제로 존재 하는지 확인 하기 위한 기술을 구현 하는 데 필요한. Preforming 분 비를 폐지 하는 것으로 예상 된다 조건 하에서 실험 하는 때 이것은 더 많은 필수 된다. 이 장애물을 극복 하기 위해 염화 암모늄의 20 m m 각 실험의 끝에 챔버에 추가 되었습니다. 이 치료는 FITC 형광에 대 한 수 있도록 SGs 내부 pH를 올린다. 미디어, 염화 암모늄의 추가 후에 그림 3에서 같이 FITC dextran 표시 되 고 공동 mRFP 태그 neuropeptide Y는 RBL 세포70에서 SG 기자와 지역화 됩니다.
그림 1: 복합 exocytosis의 특정 탐지. (a) 다이어그램 FITC dextran 형광에 변화 규제 exocytosis의 다른 모드를 정리 하는 방법 설명. (b) 표시 된 대로 셀 FITC-dextran RBL 세포에서의 이미징 NPY mRFP 및 pSilencer 또는 shRab5, 페를 살고 있습니다. Transfection는 앞에서 설명한67,70으로 수행 되었다. 간단히, 1.5 x 107 RBL 세포 transfection 버퍼 (20 m m K-파이프 ph 7, 아세테이트2 + 10 µ M Ca, Mg2 + 아세테이트, 128 mM 칼륨 조미료 2mm 보충 DMEM)에 resuspended은 15 µ g NPY mRFP 및 pSilencer의 어느 30 µ g 또는 15 µ g의 shRab5A, 그리고 shRab5B/c Transfection 15 µ g 300 V와 20 밀리초 펄스 길이 electroporation에 의해 달성 되었다. 셀 1 mg/mL FITC dextran을 포함 하는 문화 매체에 replated 즉시 했다. 24 h 후 세포 IgE의 1 µ g/mL와 함께 민감하게 되었고 추가 24 h에 대 한 인 큐베이 팅. 셀 전체 Tyrode의 버퍼에 세 번 씻어 그리고 50 ng/mL DNP HSA (Ag)에 의해 활성화 되었다. 셀 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 구상 했다. PSilencer 이미지에 흰색 화살표 FITC 형광의 버스트 포인트를 백색 원형 방전된 SG를 표시 합니다. ShRab5A/B/C 이미지에서 흰색 화살표 분 형광 이벤트 Rab5-최저 셀, 전체 exocytosis의 나타낼 것에서 발생 하는 나타냅니다. 노트, ShRab5 이미지의 강도 신호 감지를 허용 하도록 증가 되었다. 이미지 (37 ° C)가 열된 챔버 및 공동2 컨트롤러 (4.8%)와 오픈 pinhole 설정에서 C-Apochromat x63/1.2 W Corr 목표는 confocal 현미경에 의해 인수 했다. 전체 영화에 대 한 참조 클라인 외. 33 (c) (b) 에서처럼 homotypic SG 퓨전 프로세스의 도식 다이어그램. 세부 사항에, 첫 번째 SG 원형질 막으로 융합 하 고 융합 공 설정 시작 FITC dextran 콘텐츠를 발표 하는 동안 alkalize 하. 따라서, 시간에 의해 두 번째 SG 순차적으로, FITC dextran의 방출으로 인해 첫 번째 SG 페이드의 형광 첫 번째와 퓨즈. 그러나, 두 번째 SG alkalizes, 나타나는 첫 번째 SG에 인접 한 a FITC 플래시 결과. 이 수치는 클라인 외. 에서 적응 33 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: mStr-캘리포니아-Rab5와 FITC dextran의 듀얼 이미징. RBL 세포 했다 HA-wt-SNAP23의 20 µ g와 10 µ g mStr-캘리포니아 Rab5A의 공동 transfected. 셀은 미리 FITC dextran와 IgE incubated 하 고 그림 1에 설명 된 대로 Ag와 트리거됩니다. (a) 담금질된 SG (흰색 화살표)와 SG 사이 퓨전 이벤트 캡처 이미지의 시리즈를 이미 플라즈마 막으로 융합은 이며 따라서 형광. 15.8 분 침묵과 SG는 그것의 이웃 SG와 융합 고 형광을 얻기 위해 시작. 박스형된 지역 각 시간 점의 왼쪽 하단에 확대 됩니다. mSTR-캘리포니아 Rab5A (빨간색)으로 표시 하는 해당 시간 점에서 (녹색)에서 FITC dextran (b) 프레 젠 테이 션에 (a), 두 사이의 융합을 보여주는 SGs 이미지 confocal 현미경 검사 법 (오픈 pinhole) 계획 apochromat를 사용 하 여 인수 했다 x63-나 1.4 목표 이 수치는 클라인 외. 에서 적응 33 전체 영화에 대 한 참조 클라인 외. 33 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 듀얼 이미징 NPY mRFP FITC dextran의 NH4cl. SG의 자율 중 RBL 세포 shRab5와 페, FITC dextran와 IgE, 미리 incubated 되었고 Ag, 그림 1에 설명 된 대로 유발. (a) 세포 했다 시각 경과 형광 현미경 검사 법에 의해. 이미지에 시간을 지정 하는 것은 Ag와 실행 후 분입니다. 이미지는 confocal 현미경 검사 법 사용 하는 계획-apochromat x63-나 1.4 목표에 의해 인수 했다. (b) 표시 하는 실험의 정량 분석에 (a). 그래프에서 각 줄의 FITC 관심 (ROI)의 지역에서 평균 형광 단일 셀 끝났습니다. 화살표는 NH4Cl (20mm) 추가의 시간을 가리킵니다. 바 = 5 µ m. 이 수치는 클라인 외. 에서 적응 33 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 어떻게 추적 FITC-dextran SGs에 로드의 형광 특히 복합 exocytosis 이벤트를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 이 인수는 이미지 15 초 마다 현미경을 설정, 따라서 시간이 지남에, 오랫동안 이벤트만 기록 됩니다 하 고 따라서 짧은 것이 해당 하는 이벤트 전체 exocytosis 또는 키스 실행 exocytosis를 제외 하 여 달성 되었다. 메서드를 설정 하려면 우리는 RBL 세포에 표현 되 고 복합 exocytosis 중추적인, 동안 전반적인 분 비 세포에 의해 영향을 받지 않습니다, FITC dextran 출시 이벤트를 캡처할 수 없습니다 Rab5 isoforms의 그 최저를 보였다.
방법의 가장 눈에 띄는 단점은 그것만 산 성 SGs 포함 된 셀에 적용 됩니다. 그러나, 방법의 가장 눈에 띄는 장점은 그 기반 FITC-dextran 셀의 간단한 인큐베이션 transfection를 필요로 하지 않고. 규제 exocytosis를 공부 하 고 SG 화물 또는 SG 막 단백질-phlourin, (예: NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, 및 synapto phluorin48, pH에 민감한 GFP 변종 융합을 포함 하는 데 사용 되는 다른 pH에 민감한 기자 49,50,,5152), 더 밀접 하 게 SGs의 내 생 적인 구성을 나타낼 수 있습니다. 그러나, 그들의 사용 덜 어려운 transfect 세포에 적합 있을 세포의 transfection를 수반 한다. 따라서 때 세포 공부 transfect 어렵다 또는 여러 게놈 조작이 필요로 하는 실험 조건에서 FITC-dextran 등 세포 배양 매체에 단순히 보완 될 수 있습니다 화합물의 사용은 유리. 우리의 프로토콜 셀 특정 조정의 다른 세포 유형68exocytosis의 활동에서 차이 수용 하기 위해 필요할 수 있습니다. 따라서, 이미지 수집을 위해 선택한 시간 간격을 최적화 합니다. RBL 세포에 대 한 우리 수 있도록 복합 exocytosis 이벤트의 독점 추적 설정 캡처 새로운 이미지를 매 15 초는 ige 의/Ag RBL 세포 발생 현미경만 오랫동안 이벤트 시각화 수 있었습니다 있다.
또 다른 요소는 고려 되어야 사용할 수 dextran의 유형입니다. 그들의 분자 무게에서 변화 하는 dextrans의 다양 한 사용할 수 있습니다. 따라서, 그것은 다른 dextrans 셀에 있을 수 있는 잠재적인 영향을 고려, 기자로 서 적절 한 dextran을 선택 하는 것이 중요. 예를 들어 낮은 분자량 dextrans MCs 활성화 되 고 분 비71,72,,7374유도 표시 되었습니다. 따라서, 낮은 분자량 dextrans 엠씨 분 비에 대 한 적절 한 기자를 않을 것 이다. Dextrans 향해 셀 반응성에 차이 다른 쥐 종자75또는 다른 co-stimulatory 조건71,76,,7778또한 지적 했다. 여기, 우리는 150 K FITC-dextran 이전 RBL 셀 라인에서 공부 되 고 분 비18,79유도에 효과적인 것으로 표시 된 사용 하도록 선택 했습니다.
광원을 선택할 수 있는 프로토콜에 대 한 중요 한 이기도 합니다. Confocal 현미경을 사용 하 여, 광원은 전통적으로 레이저 기반. 따라서, 독성을 피하기 위해, 낮은 레이저 파워를 선택 하는 것이 필수적 이다. 원하는 레이저 전력 유형 및 레이저의 나이 따라 현미경 사이 다릅니다. 또한, 원하는 레이저 전력 사용 하는 검출기의 종류에 따라 이기도 합니다. 예를 들어 광 전 증폭 관 관 기반 검출기 등 일반적인 검출기를 사용 하 여, 높은 전원 레이저 필요 합니다 보다는 현대 하이브리드 검출기 (광 전 증폭 관 관 눈사태 포토 다이오드 하이브리드 검출기 등)를 사용 하는 경우. 가능한 가장 낮은 레이저 파워를 사용 하 고 레이저 전력의 10%를 초과 하지 않는 것이 좋습니다.
요약 하자면, SG의 dequenching 모니터링 로드 FITC dextran 경과 현미경 신중 하 게 선택한 설정에서 허용 되는 시간 우리 RBL MCs, 분자 엔터티의 크게 촉진 식별에에서 독점적으로 캡처 복합 exocytosis를 하 여 이 과정을 통제 한다. 이 메서드를 더 구별 하기 위하여 전체 키스 실행 exocytosis 줄이고 이미지 인수 관련 키스 실행 된 짧은 섬광의 구별을 허용 하는 시간 간격을 신중 하 게 보정 하 여 조정 될 수 있었다 전체 exocytosis 동반도 짧은 섬광에서 exocytosis. 이러한 조건 화합물 및 키스 실행 exocytosis 저명한 다음 수 신호의 기간에 따라 캡처 것입니다.
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Disclosures
저자 선언 경쟁 금융 관심
Acknowledgments
CDNA의 관대 한 선물에 감사 박사 미 Ashery 하 고. 우리 박사 G. 질량, L. Mittleman, M. Shaharbani, 및 Y.Zilberstein Sackler 세포질 & 분자 영상 센터에서 현미경으로 그들의 귀중 한 도움에 대 한 감사. 이 미국-이스라엘 Binational 과학 재단 (그랜트 2013263 R. Sagi-아이젠 버그, I. Hammel, 및 S.J.Galli)에 의해 지원 되었다 일과 933/15 이스라엘 아카데미 과학 (R.Sagi-아이젠 버그에 의해 설립 된 이스라엘 과학 재단에서 부여 )와 NIH 교부 U19 AI 104209 및 R01 AR067145 (하 스 Galli).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM low glucose | Biological Inductries | 01-050-1A | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12657 | |
| Pen-strep-nystatin solution | Biological Inductries | 03-032-1B | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Biological Inductries | 03-020-1A | |
| FITC dextran 150K | Sigma-Aldrich | 46946-500MG-F | |
| Trypsin/EDTA Solution B | Biological Inductries | 03-052-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size | Sartorius | 16534K | |
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-HSA (Ag) | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid direct light exposure |
| Hepes buffer 1M, pH 7.4 | Biological Inductries | 03-025-1B | |
| CaCl2 | MERK | 102382 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Ammonium chloride | MERK | 1145 | |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| NaH2PO4 | MERK | 6346 | |
| NaCl | MERK | 106404 | |
| MgCl2 | MERK | 105833 | |
| KCl | MERK | 104936 | |
| Electroporator | BTX | ECM830 | |
| Confocal microscope, Zeiss | Zeiss | LSM 5 Pascal, Axiovert 200M | Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator |
| Confocal microscope, Zeiss | Zeiss | LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 | Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator |
| Confocal microscope, Leica | Leica | SP5 | Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab) |
| RBL-2H3 cells | RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67 |
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