Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

इमेजिंग FITC-विनियमित Exocytosis के लिए एक रिपोर्टर के रूप में dextran

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

यहां हम विस्तार से विनियमित exocytosis के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक विधि । इस विधि का उपयोग करता है FITC-dextran, जो lysosome में जमा-संबंधित organelles, एक रिपोर्टर के रूप में । यह सरल तरीका भी कोशिकाओं है कि आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए मुश्किल है में विनियमित exocytosis के विभिंन तरीकों के बीच भेद की अनुमति देता है ।

Abstract

विनियमित exocytosis एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा कार्गो, जो स्रावी granules (एसजीएस) में संग्रहित है, एक स्रावी ट्रिगर के जवाब में जारी की है । विनियमित exocytosis सेलुलर संचार के लिए मौलिक है और न्यूरोट्रांसमीटर के स्राव के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है, हार्मोन, भड़काऊ मध्यस्थों, और अन्य यौगिकों, कोशिकाओं की एक किस्म से. तीन अलग तंत्र विनियमित exocytosis के लिए जाना जाता है: पूर्ण exocytosis, जहां एक एकल एसजी पूरी तरह से प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़, चुंबन और भागो exocytosis, जहां एक ही एसजी क्षणिक प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़, और यौगिक exocytosis, जहां एक दूसरे के साथ कई एसजीएस फ्यूज, पहले या प्लाज्मा झिल्ली के साथ एसजी संलयन के बाद । एक कोशिका द्वारा किए गए विनियमित exocytosis के प्रकार अक्सर स्रावी ट्रिगर के प्रकार से तय होता है. हालांकि, कई कोशिकाओं में, एक एकल स्रावी ट्रिगर विनियमित exocytosis के एक साथ कई मोड सक्रिय कर सकते हैं. सेल प्रकार और प्रजातियों में उनकी बहुतायत और महत्व के बावजूद, तंत्र है कि स्राव के विभिंन साधनों का निर्धारण काफी हद तक अनसुलझे हैं । विनियमित exocytosis के विभिंन साधनों की जांच में मुख्य चुनौतियों में से एक, उनके बीच भेद करने में कठिनाई के साथ ही उंहें अलग से तलाश है । यहाँ हम fluorescein isothiocyanate के उपयोग का वर्णन (FITC)-dextran एक exocytosis रिपोर्टर के रूप में, और लाइव सेल इमेजिंग, विनियमित exocytosis के विभिन्न मार्ग के बीच अंतर करने के लिए, यौगिक exocytosis पर ध्यान केंद्रित, मजबूती के आधार पर और exocytic घटनाओं की अवधि ।

Introduction

विनियमित exocytosis प्राथमिक प्रणाली है जिसके द्वारा आसानी से बनाया कार्गो एक स्रावी सेल से एक विशिष्ट ट्रिगर के जवाब में जारी की है । कार्गो पूर्व का गठन किया है और स्रावी बुलबुले, जिसमें यह एक ट्रिगर जब तक संग्रहीत है में तनहा है एसजीएस सामग्री की रिहाई के लिए संकेत रिले । संकेतों के विभिन्न प्रकार विनियमित exocytosis के विभिन्न मोड में परिणाम हो सकता है, या विनियमित exocytosis के विभिन्न मोड एक साथ हो सकता है. विनियमित exocytosis के तीन मुख्य मोड में जाना जाता है: पूर्ण exocytosis, जो प्लाज्मा झिल्ली के साथ एक एकल स्रावी दाना की पूर्ण संलयन शामिल है; चुंबन और भागो exocytosis, जो प्लाज्मा झिल्ली इसके रीसाइक्लिंग के बाद के साथ स्रावी granules के परिवर्तनीय संलयन शामिल है; और यौगिक exocytosis, जो कई एसजीएस पूर्व के homotypic संलयन की विशेषता है (यानी, multigranular exocytosis) या अनुक्रमिक (यानी, अनुक्रमिक exocytosis) प्लाज्मा झिल्ली1के साथ फ्यूजन करने के लिए. यौगिक exocytosis कार्गो रिलीज2का सबसे व्यापक मोड माना जाता है, के रूप में यह कार्गो के तेजी से स्राव के लिए अनुमति देता है, सहित कि एसजीएस से प्लाज्मा झिल्ली से बाहर स्थित हैं । यौगिक exocytosis दोनों exocrine और अंत-स्रावी कोशिकाओं में प्रलेखित किया गया है3,4,5,6,7,8,9, साथ ही में प्रतिरक्षा कोशिकाओं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, जैसे इयोस्नोफिल्स10,11,12 और न्यूट्रोफिल13, यौगिक exocytosis मध्यस्थों कि हमलावर रोगजनकों को मारने के लिए आवश्यक है की तेजी से और मजबूत रिहाई की अनुमति देता है जैसे बैक्टीरिया या परजीवी । मस्तूल कोशिकाओं (MCs) सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, तीव्रग्राहिता, और अन्य एलर्जी प्रतिक्रियाओं के दौरान पूर्व संग्रहीत भड़काऊ मध्यस्थों के कुशल रिहाई के लिए यौगिक exocytosis तैनात14,15,16 , 17. चूंकि exocytosis के विभिंन तरीकों एक साथ18,19हो सकता है, यह एक चुनौती के लिए वास्तविक समय में उन दोनों के बीच अंतर या उनके संबंधित संलयन मशीनरी की पहचान बन गया है, इसलिए elucidating उनके अंतर्निहित तंत्र ।

यहाँ हम एक विधि वर्तमान सेल के लाइव सेल इमेजिंग पर आधारित है, FITC-dextran, कि वास्तविक समय exocytic घटनाओं की ट्रैकिंग और उनके अलग मोड के बीच भेद की अनुमति देता है । विशेष रूप से, हमारे विधि यौगिक exocytosis की अनंय निगरानी की अनुमति देता है ।

FITC-dextran FITC glucan polysaccharide के साथ पीएच के संवेदनशील fluorophore dextran का एक संयुग्मी है । फ्लोरोसेंट लेबल dextrans को micropinocytosis20,21 और macropinocytosis22,23द्वारा सेल में प्रवेश करते हुए दिखाया गया है । के रूप में endocytic डिब्बों lysosomes में परिपक्व, यह दिखाया गया है कि FITC-dextran कोई स्पष्ट गिरावट के साथ lysosome में जमा । हालांकि, के बाद से FITC एक उच्च पीएच संवेदनशील fluorophore24है, और lysosome लुमेन अंलीय है, FITC dextran प्रतिदीप्ति24तक पहुंचने पर शमन । इस प्रकार, lysosome लक्षित कार्गो के रूप में dextrans की स्थापना, FITC के पीएच संवेदनशीलता के साथ एक साथ लिया, dextran lysosome के अध्ययन में FITC-exocytosis के उपयोग के लिए नींव रखी है25,26,27 , 28 , 29.

MCs, न्यूट्रोफिल, इयोस्नोफिल्स, साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं, melanosomes, और दूसरों सहित कई सेल प्रकार में, एसजीएस प्रदर्शन lysosomal सुविधाओं और lysosome के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं-संबंधित organelles (LROs) या स्रावी lysosomes30,31 . चूंकि LROs एक अंलीय चमकदार पीएच है, FITC-dextran exteriorization के LROs के साथ जुड़े उच्च पीएच का एक परिणाम के रूप में, उनके exocytosis कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । दरअसल, FITC-dextran में MCs18,३२,३३में exocytosis की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस विधि में, FITC-dextran कोशिका संस्कृति, pinocytosis द्वारा कोशिकाओं द्वारा लिया और एसजीएस में हल करने के लिए जोड़ा गया है । जैसा कि यह lysosomes में है, FITC प्रतिदीप्ति जब वे कोशिका के भीतर हैं एसजीएस में बुझती है । हालांकि, प्लाज्मा झिल्ली और बाहरी वातावरण के फलस्वरूप जोखिम के साथ एसजी फ्यूजन पर, FITC-dextran के रूप में अपनी प्रतिदीप्ति फिर से प्राप्त एसजी पीएच उगता है, की अनुमति सरल ट्रैकिंग exocytic की घटनाओं के लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा । यहां, हम यौगिक exocytosis की अनूठी ट्रैकिंग सक्षम करने के लिए इस विधि समायोजित ।

दो अंय विधियों पहले यौगिक exocytosis ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी exocytic संरचनाओं कि exocytosis के विभिन्न मोड की घटना का सुझाव दिया विशेषता के लिए पहली विधि थी । विशेष रूप से, की टिप्पणियों "स्रावी सुरंगों" अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं में३४ औरMCs ३५,३६,३७ यौगिक exocytosis की परिकल्पना को जंम दिया । हालांकि, जबकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उच्च संकल्प से जुड़े बुलबुले प्रकट करने की शक्ति है, यह उनके फ्यूजन की गतिशीलता को ट्रैक नहीं कर सकते और इसलिए परिभाषित नहीं कर सकते कि वे यौगिक exocytosis या फिर से कब्जा granules के दौरान एसजी फ्यूजन के अनुरूप उनके endocytosis के बाद । इस बाधा अंय तरीकों कि exocytosis कोशिकाओं में रहने वाले, जैसे प्लाज्मा झिल्ली समाई11,13,३८,३९ या amperometry के पैच दबाना माप के उपाय कर सकते में दूर है मीडिया के ४० । हालांकि, पैच clamping एक विशेष सेट-अप की आवश्यकता है और सभी प्रकार के कक्ष के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । Amperometry माप exocytosis ट्रैक करने के लिए केवल अगर कार्गो बहुत करीब निकटता में इलेक्ट्रोड के लिए जारी किया गया है कर रहे हैं । इसलिए, लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग इन तरीकों पर एक लाभ प्रदान करता है, क्योंकि यह न केवल exocytosis की वास्तविक समय ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी पूरे सेल से डेटा के त्वरित और सरल अधिग्रहण की अनुमति देता है ।

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा FITC-dextran की ट्रैकिंग भी अन्य लाइव सेल इमेजिंग आधारित तरीकों के लिए कुछ लाभ प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) कोशिकाओं की एक फ्लोरोसेंट एसजी जांच के साथ भरी हुई है या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त-एसजी कार्गो या झिल्ली प्रोटीन-टैग26,४१, ४२ , ४३. इस विधि की शक्ति को विशेष रूप से घटनाओं है कि प्लाज्मा झिल्ली के करीब होने की निगरानी करने की क्षमता में निहित है (इस के साथ साथ पदचिह्न के रूप में संदर्भित), इसलिए exocytic घटनाओं । हालांकि, यह भी इस विधि का दोष है क्योंकि केवल सेल अंश है कि coverglass के निकट और माइक्रोस्कोप लेंस के पास है४४imaged किया जा सकता है । क्या इस तरह के पैरों के निशान वास्तव में पूरे सेल झिल्ली की सतह का प्रतिनिधित्व अभी भी बहस४५,४६,४७है । इस संबंध में, FITC-dextran और एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एक खुले pinhole के रूप में एक पीएच के प्रति संवेदनशील डाई का उपयोग पूरे सेल के इमेजिंग की अनुमति देता है, इस प्रकार है कि सेल में घटित कुल exocytic घटनाओं पर कब्जा.

पूरे सेल इमेजिंग या TIRFM द्वारा विनियमित exocytosis अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है कि अतिरिक्त पीएच-संवेदी रिपोर्टर एसजी कार्गो या एसजी झिल्ली प्रोटीन phlourin, एक पीएच-संवेदी GFP संस्करण से जुड़े शामिल हैं । उदाहरणों में NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, और synapto-phluorin४८,४९,५०,५१,५२शामिल हैं । जबकि इन जांचों की अभिव्यक्ति और अधिक निकटता एसजीएस के अंतर्जात संरचना का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, यह कोशिकाओं के अभिकर्मक जरूरत पर जोर देता है, और इसलिए कम कोशिकाओं है कि transfect के लिए मुश्किल है के लिए उपयुक्त हो सकता है । इसलिए, जब कोशिकाओं है कि transfect के लिए या प्रयोगात्मक शर्तों है कि एकाधिक जीनोमिक जोड़तोड़ की आवश्यकता के तहत, एक यौगिक है कि बस सेल संस्कृति माध्यम में पूरक हो सकता है का उपयोग करने के लिए मुश्किल है अध्ययन, जैसे FITC-dextran, लाभप्रद है . FITC-dextran भी acridine नारंगी (ए ओ), एक और पीएच-संवेदनशील डाई कि लाइव सेल माइक्रोस्कोपी५३,५४,५५,५६ द्वारा exocytosis की ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है पर एक लाभ प्रदान करता है , ५७ , ५८. ए. ओ. ने बुलबुले के photolysis प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है कि झूठी चमक में परिणाम है, जो वास्तविक स्राव के अनुरूप नहीं है27प्रक्रियाओं. इसके विपरीत, FITC-dextran बेहतर स्राव की घटनाओं को दर्शाता है, शायद अपने कम तस्वीर के कारण प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन27के उत्पादन प्रेरित ।

विशेष रूप से, exocytosis अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक डाई की आमद ट्रैकिंग द्वारा है, बाहरी माध्यम से एसजी में फ्यूजन ताकना कि इस प्रक्रिया के दौरान खुलता है के माध्यम से. इस मामले में, डाई स्रावी ट्रिगर के साथ बाहरी माध्यम से जोड़ा जाता है । फिर, जब फ्यूजन ताकना खोलता है, डाई५९,६०एसजी में फैलाना । इस विधि का एक स्पष्ट लाभ यह है कि यह भी फ्यूजन ताकना आकार का अनुमान लगाने की क्षमता प्रदान करता है, चर आकार के रंजक का उपयोग करके । उदाहरण के लिए, विभिंन आणविक वजन के dextrans (मेगावाट), संयुग्मित विभिंन fluorophores के लिए, extracellular रंजक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जिससे dextran का अधिकतम आकार कि एसजी घुसना कर सकते है फ्यूजन ताकना५९के आकार के अनुरूप होता है, ६१ , ६२ , ६३ , ६४. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण एक पीएच के प्रति संवेदनशील जांच के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, एक महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि शोर अनुपात करने के लिए संकेत बहुत कम है, डाई की एक बड़ी राशि के बाद से छवियों के अधिग्रहण के दौरान मीडिया में मौजूद है, उच्च पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप.

कुल मिलाकर, exocytosis के लिए एक मार्कर के रूप में FITC-dextran का उपयोग पहले से सूचना के तरीके में कई कमियां, शोर अनुपात, विषाक्तता, गतिशील ट्रैकिंग और जटिलता के लिए संकेत के रूप में काबू ।

यहां हम FITC-dextran के उपयोग का वर्णन करने के लिए RBL-2H3 मस्तूल सेल लाइन में यौगिक exocytosis की निगरानी (इस के साथ RBL के रूप में संदर्भित, मुख्य रूप से Eccleston एट अल द्वारा स्थापित । ६५ और आगे Barsumian एट अल द्वारा क्लोन । ६६), के जवाब में immunoglobulin E (IgE)/antigen (Ag) सक्रियण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. तैयारी

  1. RBL कल्चर मीडिया की तैयारी
    1. मिश्रण ५०० कम ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) के ५६ मिलीलीटर के साथ भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), ५.५ मिलीलीटर की पेनिसिलिन-streptomycin-nystatin समाधान, ५.५ मिलीलीटर की एल-Glutamine २०० मिमी समाधान. 10% FBS, १०० µ जी/एमएल streptomycin, १०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, 12 इकाइयों/एमएल nystatin, और 2 मिमी एल-glutamine के साथ पूरक कम ग्लूकोज DMEM में यह परिणाम है ।
    2. ०.२२ µm ताकना आकार और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के एक शीर्ष-वैक्यूम फिल्टर का उपयोग करके मीडिया फ़िल्टर ।
  2. RBL कोशिकाओं का रखरखाव ।
    1. एक 10 सेमी डिश में ९०% की एक अधिकतम प्रवाह के लिए RBL कोशिकाओं को विकसित । यदि कोशिका संस्कृति स्वस्थ है, कोशिकाओं को सामयिक दखलंदाजी के साथ एक धुरी आकार होना चाहिए ।
    2. सेल बंटवारे के लिए, मीडिया aspirating द्वारा पकवान से अलग कोशिकाओं और trypsine/EDTA समाधान बी की 2 मिलीलीटर के साथ की जगह 5% CO2 के एक humidified वातावरण में 5-10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    3. एक बार कोशिकाओं अलग है, संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बेअसर, एक पिपेट का उपयोग कर, और एक 1:2-1:10 अनुपात में कोशिकाओं को विभाजित ।
  3. 20x Tyrode के बफर की तैयारी
    1. ५४ मिमी KCl, 20 मिमी MgCl2, २.७४ एम NaCl, और 8 मिमी णः2PO4 में डबल आसुत जल (DDW) के एक शेयर 20x समाधान तैयार करें । अच्छी तरह मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

2. लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए RBL कोशिकाओं की संस्कृति

  1. FITC-dextran समाधान की तैयारी ।
    1. मिक्स 1 FITC-dextran पाउडर (१५० K) संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर प्रति मिलीग्राम (1.1.1 कदम देखें) । एक पूर्ण चैम्बर्ड coverglass के लिए, 3 मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. ०.२२ µm ताकना आकार के साथ एक फाइबर एसीटेट सिरिंज फिल्टर इकाई का उपयोग करना, भंग FITC-dextran फिल्टर.
    3. 1 µ g/एमएल की एकाग्रता के लिए माउस IgE जोड़ें ।
  2. इमेजिंग के लिए RBL कोशिकाओं सीडिंग
    1. इमेजिंग से पहले दिन, संस्कृति पकवान से मीडिया महाप्राण और trypsine/EDTA समाधान बी के 2 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित 5% CO2 के एक humidified वातावरण में 5-10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर । एक बार कोशिकाओं अलग है, संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बेअसर ।
    2. एक hemocytometer का उपयोग कर RBL कोशिकाओं गिनती और संस्कृति मीडिया के साथ तदनुसार मात्रा समायोजित ७.५ x 105/mL. के एक सेल एकाग्रता पाने के लिए
    3. कक्ष निलंबन के 10 µ एल जोड़ने के लिए एक चैम्बर्ड coverglass पूर्व ताजा FITC-dextran पूरक संस्कृति मीडिया (एक कक्ष में ७.५ x 103 कोशिकाओं के बोने में यह परिणाम) से भरा है ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के एक humified वातावरण में रातोंरात RBL कोशिकाओं को विकसित । कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं और यह माइक्रोस्कोप के तहत व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक कोशिका की पहचान करने के लिए आसान है कि यह सुनिश्चित करने के क्रम में एक उप-धाराप्रवाह स्तर में रहना चाहिए.
  3. RBL कोशिकाओं की अभिकर्मक-वै.
    1. अन्य फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के साथ संयोजन में इमेजिंग exocytic घटनाओं के लिए, Azouz एट अल में RBL कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक प्रोटोकॉल देखें. ६७

3. Exocytosis की लाइव सेल माइक्रोस्कोपी

  1. समाधान की तैयारी:
    1. एक 1:20 कमजोर पड़ने और 20 मिमी Hepes पीएच 7, १.८ मिमी CaCl2, 1 मिलीग्राम/एमएल BSA, और ५.६ मिमी ग्लूकोज के साथ पूरक में DDW में स्टॉक समाधान कमजोर द्वारा एक अंतिम Tyrode बफर समाधान तैयार करें ।
    2. नए सिरे से Tyrode के बफर में एक 20x secretagogue एजेंट तैयार [1 µ g/एमएल dinitrophenyl संयुग्मित मानव सीरम एल्ब्युमिन (DNP-has (Ag)) हमारे मामले में, एक ५० एनजी/एमएल 1x एकाग्रता के लिए] ।
    3. Tyrode के बफर में पाउडर भंग करके एक ४०० mM अमोनियम क्लोराइड समाधान तैयार करें ।
  2. कोशिकाओं की तैयारी ।
    1. चैंबर्ड coverglass से धो 3 बार मीडिया aspirating और Tyrode के बफर के ३०० µ एल के साथ इसे फिर से भरना, ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम । अंत में, Tyrode के बफर के ३०० µ एल के साथ चैंबर की भरपाई, ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम ।
    2. माइक्रोस्कोप की मशीन चैंबर में चैम्बर्ड coverglass प्लेस । सुनिश्चित करें कि चैंबर स्थिर है ।
  3. माइक्रोस्कोप की स्थापना
    1. ट्रैक करने के लिए ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत (पारंपरिक रूप से एक पारा लैंप) पर बारी और उचित प्रतिदीप्ति फिल्टर का चयन (FITC देखने के लिए हरी fluorophores के लिए फिल्टर-dextran चुनें) । एक बार ब्याज का क्षेत्र ध्यान में है और देखने के क्षेत्र के बीच में है, ताकि फोटो ब्लीचिंग और विषाक्तता से बचने के लिए प्रकाश स्रोत बंद ।
      नोट: कुछ FITC-dextran कक्षों में शामिल प्रतिदीप्ति बनाए रख सकते हैं । इसका कारण यह है FITC-dextran जैसे endosomes के गैर-lysosomal डिब्बों को भी सुलझाया जा सकता है.
    2. FITC उत्तेजना के लिए उपयुक्त प्रकाश व्यवस्था को चालू करें । यदि एक लेज़र आधारित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, ४८८ एनएम लेजर पर बारी । उत्सर्जन ५००-५५० एनएम के आसपास इकट्ठा किया जाना चाहिए (FITC उत्सर्जन चोटियों पर ५१०-५२० एनएम) ।
    3. जब एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, अधिकतम करने के लिए pinhole खुला । यह ब्लीचिंग और विषाक्तता से बचने के लिए कम लेजर शक्ति का उपयोग करने की अनुमति देगा और सेल के सभी विमानों से exocytosis घटनाओं पर कब्जा सुनिश्चित करेगा ।
    4. छवि अधिग्रहण के बीच समय अंतराल जांचना ।
      1. विभिंन कोशिकाओं को विनियमित exocytosis६८के अपने कैनेटीक्स में भिंन हो सकते हैं । यौगिक exocytosis की विशिष्ट इमेजिंग के लिए, हम कम से कम 5 सेकंड के समय अंतराल की सलाह देते हैं । हालांकि, अंगूठे के एक नियम के रूप में, फास्ट इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए, सुनिश्चित करें कि एक एकल फ्रेम के अधिग्रहण समय तेजी से है ।
      2. जब एक लेज़र स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, द्वि-दिशात्मक करने के लिए स्कैन दिशा सेट, औसत के लिए अनुमति नहीं है, और ५१२ x ५१२ पर संकल्प सेट (अनुशंसित; उत्तरार्द्ध दो प्रावधानों को भी ब्लीचिंग और विषाक्तता को कम करने में मदद मिलेगी).
  4. exocytosis की इमेजिंग ।
    1. इच्छित अवधियों के लिए छवि कक्ष, कक्ष या secretagogue के प्रकार पर निर्भर करता है । RBL IgE/एजी के साथ ट्रिगर कोशिकाओं में, सबसे exocytic घटनाओं सक्रियण के 15-20 मिनट के भीतर हो ।
    2. कक्षों के सक्रियकरण के लिए, 16 µ l 20x secretagogue समाधान कक्ष से जोड़ें ।
  5. कोशिकाओं में FITC-dextran उपस्थिति की पुष्टि.
    1. एसजीएस के लिए उपस्थिति और FITC-dextran के स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए, अमोनियम क्लोराइड समाधान के 16 µ एल जोड़ें (ध्यान नहीं खोना करने के लिए चैंबर को स्थानांतरित करने के लिए नहीं सावधान रहना) धीरे चैंबर के लिए (यह 20 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता कर देगा). यह एसजीएस और FITC प्रतिदीप्ति, जो सेकंड के भीतर हो जाएगा के शमन के alkalization प्रेरित करेगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्र 1a योजनाबद्ध तरीके से प्रतिनिधित्व करता है FITC-dextran विनियमित exocytosis के लिए एक रिपोर्टर के रूप में कार्य कर सकते हैं और exocytic घटनाओं के विभिन्न तरीकों दोहराऊंगा. सबसे पहले, कोशिकाओं FITC-dextran, जो pinocytosis द्वारा आंतरिक है और एसजीएस के लिए हल के साथ मशीन हैं । MCs के एसजीएस LROs रहे हैं के बाद से, उनके कम पीएच FITC के प्रतिदीप्ति, काला granules (ए-सी, मैं) के रूप में यहां दिखाया गया है । जब कोशिकाओं को एक secretagogue द्वारा ट्रिगर कर रहे हैं और एसजीएस फ्यूज प्लाज्मा झिल्ली के साथ, एक संलयन ताकना गठन किया है, की अनुमति समाप्ति प्रोटान और एसजीएस के alkalization. एक परिणाम के रूप में, FITC अपने प्रतिदीप्ति (एक, द्वितीय) पुनः प्राप्त । पूर्ण exocytosis में ही एक छोटी (कम से 5 एस) फ्लोरोसेंट घटना के रूप में बाहरी है एसजी झिल्ली पूरी तरह से प्लाज्मा झिल्ली में गिर जाता है और FITC-dextran प्रसार दूर संस्कृति माध्यम (ए, III) में प्रकट होगा । एक चुंबन और रन exocytic घटना के दौरान, एसजी की झिल्ली केवल क्षणिक प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़, एक छोटे से रहने वाले फ्यूजन ताकना और इसलिए केवल प्रतिदीप्ति के एक संक्षिप्त विस्फोट के रूप में एसजी तेजी से अलग करता है और इसके लुमेन तेजी से फिर से acidifies (बी, III-IV) । अंत में, यौगिक exocytosis के दौरान, एसजीएस क्रमिक रूप से एक दूसरे के साथ फ्यूज (एसजी फ्यूजन) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्लाज्मा झिल्ली के साथ, एक खुला फ्यूजन ताकना के रखरखाव के साथ. नतीजतन, FITC-dextran का एक बहुत बड़ा द्रव्यमान अतृप्त है, जिसके परिणामस्वरूप एक बड़े और लंबे समय तक प्रतिदीप्ति फट (सी, III-IV) रहता है कि क्षय जब जांच बाहरी माध्यम (सी, वी) में फैलाना ।

हम इस मॉडल का इस्तेमाल किया है और इमेजिंग नियंत्रण कोशिकाओं और कोशिकाओं है कि Rab5, जो हम homotypic एसजी एसजी फ्यूजन६९ और यौगिक exocytosis३३के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है की घट रहे है द्वारा इसकी भविष्यवाणियों की पुष्टि की । एक छवि हर 15 एस के लिए अधिग्रहण समय की स्थापना करके, हम ज्यादातर स्राव, यानी, यौगिक exocytosis की लगातार घटनाओं का पता लगाने की उंमीद थी । दरअसल, जैसा कि चित्र 1b में दिखाया गया है, हमारा डेटा यह दिखाता है कि नियंत्रण कक्षों में कई बड़े और लंबे समय तक चलने वाली exocytic घटनाओं को रिकॉर्ड किया जा सकता है, केवल कुछ घटनाओं को Rab5 पछाड़ना कोशिकाओं (shRab5) में रिकॉर्ड कर लिया गया । इसके अलावा, shRab5 कोशिकाओं में दर्ज की गई घटनाओं नियंत्रण कोशिकाओं में दर्ज की घटनाओं की तुलना में आकार में काफी छोटे थे । नोट, shRab5 कोशिकाओं की स्रावी क्षमता एक ही परिस्थितियों के तहत अनछुए रहता है६९, सुझाव है कि जब shRab5 यौगिक exocytosis को रोकता है, यह स्राव को समाप्त नहीं करता है. इसलिए, इमेजिंग FITC-dextran प्रतिदीप्ति लंबे समय अंतराल में यौगिक exocytosis का विशिष्ट पता लगाने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इमेजिंग FITC-dextran रिलीज यौगिक exocytosis की अनुक्रमिक प्रकृति पर कब्जा करने की अनुमति देता है । के रूप में चित्र 1bमें तीर से संकेत दिया, प्रकाश की एक फ्लैश के बाद, एक दूसरे फ़्लैश एक कमजोर फ़्लैश कि पहले से सटे है के रूप में शुरू होता है । यह एक एसजी कि प्लाज्मा झिल्ली (यानी, अनुक्रमिक exocytosis) के साथ फ्यूजन की प्रक्रिया में पहले से ही है के साथ एक एसजी के फ्यूजन के रूप में आस्थगित किया जा सकता है । इसलिए, पहले से ही एक फ्यूजन ताकना द्वारा प्लाज्मा झिल्ली से जुड़ा है कि पहला दाना के साथ दूसरा दाना फ़्यूज़ के रूप में, दूसरा दाना के पीएच के रूप में अच्छी तरह से बढ़ जाती है और FITC प्रतिदीप्ति शमन, प्रतिदीप्ति की एक दूसरी फट उपज । इस तरह के एक परिदृश्य आसंन एसजीएस के अनुक्रमिक संलयन के दौरान FITC-dextran रिहाई चित्रा 1cमें प्रस्तुत किया है ।

यौगिक exocytosis के दौरान एसजीएस के अनुक्रमिक संलयन का एक और उदाहरण चित्रा 2में दिखाया गया है । RBL कोशिकाओं Rab5a और WT स्नैप-23 के एक constitutively सक्रिय (सीए) फार्म के साथ सह-transfected थे, शर्तों जिसके तहत यौगिक exocytosis अधिक मजबूत३३हो जाता है । सीए Rab5a की इमेजिंग, जो एसजी एसजी फ्यूजन के लिए आवश्यक है और बड़ी एसजीएस३३,६९, एक साथ FITC-dextran के साथ, एक बड़ा CA-Rab5a सजाया granules के साथ एक छोटे दाना के फ्यूजन के बेहतर दृश्य की अनुमति देता है ।

चूंकि FITC-dextran जब एसजी अंदर संग्रहीत बुझती है, यह सत्यापित करने के लिए एक तकनीक को लागू करने के लिए आवश्यक है कि FITC-dextran वास्तव में एसजीएस में मौजूद है । यह और भी अधिक आवश्यक हो जाता है जब शर्तों के तहत एक प्रयोग है जो स्राव समाप्त होने की उंमीद कर रहे हैं । इस बाधा को दूर करने के लिए, प्रत्येक प्रयोग के अंत में चैंबर में अमोनियम क्लोराइड के 20 मिमी जोड़ा गया था । इस उपचार एसजीएस के अंदर पीएच तरक्की, FITC प्रतिदीप्ति के लिए अनुमति देता है । के रूप में चित्र 3में दिखाया गया है, मीडिया के लिए अमोनियम क्लोराइड के अलावा, FITC dextran दिखाई देता है और mRFP-टैग neuropeptide Y, जो RBL कोशिकाओं७०में एक एसजी रिपोर्टर है के साथ सह स्थानीयकृत है ।

Figure 1
चित्र 1: यौगिक exocytosis का विशिष्ट पता लगाना. (क) एक चित्र का वर्णन कैसे FITC में परिवर्तन-dextran प्रतिदीप्ति विनियमित exocytosis के विभिंन साधनों दोहराऊंगा । (ख) RBL कोशिकाओं में FITC-dextran के लाइव सेल इमेजिंग NPY-mRFP के साथ transfected और या तो pSilencer या shRab5, के रूप में संकेत दिया । अभिकर्मक पहले६७,७०वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया । संक्षेप में, १.५ x 107 RBL कोशिकाओं अभिकर्मक बफर में reसस्पैंड किया गया (DMEM 20 मिमी K-पाइप पीएच 7 के साथ पूरक, 10 µ एम सीए2 + एसीटेट, 2 एमएम मिलीग्राम2 + एसीटेट, १२८ एमएम पोटेशियम ग्लूटामेट) युक्त 15 µ जी NPY-mRFP और या तो 30 µ जी के pSilencer या 15 µ g के shRab5A, और 15 µ g के shRab5B/अभिकर्मक द्वारा ३०० वी और एक 20 electroporation पल्स लंबाई में mSec द्वारा प्राप्त किया गया था । कोशिकाओं को तुरंत 1 मिलीग्राम/एमएल FITC-dextran युक्त संस्कृति मध्यम में reप्लेटेड थे । 24 एच के बाद, कोशिकाओं को 1 µ जी के साथ संवेदनशील थे/IgE के एमएल और आगे 24 घंटे के लिए मशीन । कोशिकाओं को तो पूर्ण Tyrode बफर में तीन बार धोया और DNP-HSA (एजी) के ५० एनजी/ कोशिकाओं समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized थे । pSilencer छवियों में सफेद तीर FITC प्रतिदीप्ति और सफेद चक्र के एक फट करने के लिए अंक एक छुट्टी एसजी निशान । shRab5A/B/C छवियों में सफेद तीर Rab5-पछाड़ना कोशिकाओं में होने वाले मिनट फ्लोरोसेंट घटनाओं, पूर्ण exocytosis का संकेत होने की संभावना को इंगित करता है । नोट, ShRab5 छवि की तीव्रता संकेत का पता लगाने की अनुमति देने के लिए बढ़ गया था । छवियों को एक गर्म चैंबर (३७ डिग्री सेल्सियस) और सह2 नियंत्रक (४.८%) और एक सी-Apochromat x63/1.2 W Corr उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत किया गया, ओपन pinhole सेटिंग के तहत । पूर्ण फिल्मों के लिए, क्लेन एट अल करने के लिए देखें । ३३ (ग) में दिखाया homotypic एसजी फ्यूजन प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध आरेख (b). विस्तार में, के रूप में पहली एसजी प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ और एक फ्यूजन ताकना स्थापित करता है, यह alkalize करने के लिए शुरू होता है, जबकि अपनी FITC-dextran सामग्री जारी. इस प्रकार, एक दूसरी एसजी एक अनुक्रमिक तरीके से पहले एक के साथ फ़्यूज़ द्वारा, पहली एसजी के प्रतिदीप्ति FITC-dextran के रिलीज के कारण मुरझाता है. हालांकि, दूसरी एसजी alkalizes, जो एक FITC फ्लैश है कि पहली एसजी के निकट प्रकट होता है में परिणाम है । यह आंकड़ा क्लेन एट अल से अनुकूलित किया गया था । ३३ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: mStr की दोहरी इमेजिंग-CA-Rab5 और FITC-dextran । RBL कोशिकाओं को सह transfected के 20 µ g के साथ हा-wt-SNAP23 और 10 µ g का mStr-कै Rab5A था । कोशिकाओं पूर्व FITC-dextran और IgE और एजी के साथ ट्रिगर के रूप में 1 चित्रामें वर्णित के साथ मशीन थे । (एक) एक बुझती एसजी (सफेद तीर) और एक एसजी है कि पहले से ही प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े हुए है और इसलिए फ्लोरोसेंट के बीच एक संलयन घटना पर कब्जा छवियों की एक श्रृंखला । १५.८ मिनट में, बुझती एसजी अपने पड़ोसी एसजी के साथ जुड़े हुए है और प्रतिदीप्ति हासिल करने के लिए शुरू कर दिया । बॉक्स्ड क्षेत्रों हर समय बिंदु के नीचे छोड़ दिया पर बढ़े हुए हैं । (ख) दोनों mSTR की प्रस्तुति-CA Rab5A (लाल रंग में) और FITC-dextran (हरे रंग में) इसी समय (ए) में दिखाया गया अंक से, दो एसजीएस के बीच फ्यूजन का प्रदर्शन. छवियों को फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत किया गया (ओपन pinhole) एक योजना का उपयोग-apochromat x63-ना १.४ उद्देश. यह आंकड़ा क्लेन एट अल से अनुकूलित किया गया था । पूरी फिल्म के लिए ३३ , क्लेन एट अल देखें । ३३ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: NPY की दोहरी इमेजिंग-mRFP और FITC-dextran के दौरान alkalization एसजी द्वारा एनएच4सीएल. RBL कोशिकाओं shRab5 के साथ transfected थे, पूर्व FITC-dextran और IgE के साथ मशीन, और एजी के साथ शुरू, के रूप में 1 चित्रामें वर्णित है । (एक) कोशिकाओं समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized थे । छवियों में निर्दिष्ट समय एजी के साथ ट्रिगर के बाद मिनट हैं । चित्र फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा एक योजना का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया-apochromat x63-NA १.४ उद्देश्य । ( ख) में दर्शाए गए प्रयोग का मात्रात्मक विश्लेषण (क). ग्राफ़ में प्रत्येक पंक्ति किसी एकल कक्ष पर ब्याज (ROI) के किसी क्षेत्र में FITC की औसत प्रतिदीप्ति है. इसके अलावा एनएच4सीएल (20 एमएम) के समय तक तीर अंक । बार्स = 5 µm । यह आंकड़ा क्लेन एट अल से अनुकूलित किया गया था । ३३ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ हम वर्णन कैसे FITC के प्रतिदीप्ति अनुरेखण-dextran एसजीएस में लोड विशेष रूप से यौगिक exocytosis घटनाओं पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए एक छवि हर 15 सेकंड प्राप्त करने के द्वारा प्राप्त किया गया था, इस प्रकार यह सुनिश्चित करना है कि केवल लंबे समय तक चलने की घटनाओं को वक्त के साथ दर्ज किया जाएगा, और इसलिए छोटी घटनाओं है कि पूर्ण exocytosis या चुंबन के अनुरूप होता है और exocytosis चलाने को छोड़कर । विधि स्थापित करने के लिए, हमें पता चला है कि पछाड़ना Rab5 isoforms कि RBL कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं, और यौगिक exocytosis के लिए निर्णायक हैं, FITC-dextran रिहाई की घटनाओं पर कब्जा करने की क्षमता समाप्त, जबकि सेल द्वारा समग्र स्राव प्रभावित नहीं है.

विधि का सबसे प्रमुख नुकसान यह है कि यह केवल अंलीय एसजीएस युक्त कोशिकाओं पर लागू होता है । हालांकि, विधि का सबसे प्रमुख लाभ यह है कि यह FITC-dextran के साथ कोशिकाओं की सरल मशीन पर आधारित है, अभिकर्मक की आवश्यकता के बिना । अंय पीएच संवेदनशील पत्रकारों कि विनियमित exocytosis अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है और एसजी कार्गो या एसजी झिल्ली प्रोटीन शामिल phlourin, एक पीएच के प्रति संवेदनशील GFP संस्करण (जैसे NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, और synapto-phluorin४८के लिए जुड़े ४९,५०,५१,५२), और अधिक निकटता एसजीएस की अंतर्जात संरचना का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । हालांकि, उनके उपयोग कोशिकाओं है, जो कोशिकाओं है कि transfect के लिए मुश्किल है के लिए कम उपयुक्त हो सकता है की अभिकर्मक हय । इसलिए, जब कोशिकाओं है कि transfect के लिए या प्रयोगात्मक शर्तों है कि कई जीनोमिक जोड़तोड़ की आवश्यकता के तहत, एक यौगिक है कि बस सेल संस्कृति माध्यम में पूरक हो सकता है का उपयोग करने के लिए मुश्किल है अध्ययन, जैसे FITC-dextran, लाभप्रद है । हमारे प्रोटोकॉल भिंन कक्ष प्रकार६८के exocytosis के कैनेटीक्स में अंतर को समायोजित करने के लिए कक्ष विशिष्ट समायोजन की आवश्यकता हो सकती है । इसलिए, छवि अधिग्रहण के लिए चुना समय अंतराल अनुकूलित किया जाना चाहिए । RBL कोशिकाओं के लिए, हम सेट अप माइक्रोस्कोप एक नई छवि पर कब्जा करने के लिए हर 15 सेकंड, जो IgE/एजी ट्रिगर RBL कोशिकाओं में हमें केवल लंबे समय तक चलने वाली घटनाओं कल्पना करने की अनुमति दी, जिससे यौगिक exocytosis घटनाओं के अनंय ट्रैकिंग की अनुमति ।

एक और पहलू है कि विचार किया जाना चाहिए dextran के प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है । dextrans की एक किस्म है कि उनके आणविक भार में भिंनता उपलब्ध हैं । इसलिए, यह एक रिपोर्टर के रूप में उपयुक्त dextran का चयन महत्वपूर्ण है, खाते में विभिंन dextrans कोशिकाओं पर हो सकता है कि संभावित प्रभाव ले । उदाहरण के लिए, कम आणविक भार dextrans MCs को सक्रिय करने और स्राव७१,७२,७३,७४प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है । इसलिए, कम आणविक भार dextrans एम सी स्राव के लिए उपयुक्त संवाददाताओं नहीं होगा । dextrans के प्रति सेल जेट में मतभेद भी अलग चूहे उपभेदों७५, या विभिंन सह stimulatory शर्तों७१,७६,७७,७८में उल्लेख किया गया । यहां, हम एक 150K FITC-dextran है कि पहले RBL सेल लाइन में अध्ययन किया गया है का उपयोग करने के लिए चुना है और18,७९स्राव उत्प्रेरण में अप्रभावी हो दिखाया ।

प्रकाश स्रोत का चयन किया जाना भी प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है । जब एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, प्रकाश स्रोत परंपरागत रूप से लेजर आधारित है । इस प्रकार, विषाक्तता से बचने के लिए, यह एक कम लेजर शक्ति का चयन करने के लिए आवश्यक है. वांछित लेजर शक्ति प्रकार और लेजर की उम्र पर निर्भर करता है, सूक्ष्मदर्शी के बीच अलग है । इसके अलावा, वांछित लेजर शक्ति भी इस्तेमाल किया डिटेक्टर के प्रकार पर निर्भर है । उदाहरण के लिए, जब एक photomultiplier ट्यूब के रूप में एक आम डिटेक्टर का उपयोग-डिटेक्टर आधारित, एक उच्च शक्ति लेजर जब एक आधुनिक संकर डिटेक्टर (जैसे एक photomultiplier ट्यूब और एक हिमस्खलन फोटो डायोड संकर डिटेक्टर के रूप में) का उपयोग कर की तुलना में जरूरत होगी । हम सबसे कम लेजर शक्ति का उपयोग करने की सिफारिश और लेजर शक्ति का 10% से अधिक नहीं है ।

सारांश में, समय चूक द्वारा FITC भरी एसजी की शमन-dextran निगरानी-ध्यान से चुना सेटिंग्स के तहत माइक्रोस्कोपी हमें विशेष रूप से RBL MCs में यौगिक exocytosis पर कब्जा करने की अनुमति दी, बहुत आणविक संस्थाओं की पहचान की सुविधा है कि इस प्रक्रिया को विनियमित । इस विधि को और अधिक चुंबन से पूरा अंतर को समायोजित किया जा सकता है और कम करने और ध्यान से छवि अधिग्रहण के बीच समय अंतराल जांचना कम रहते थे के भेद की अनुमति के लिए चुंबन के साथ जुड़े चमक और भागो exocytosis से भी कम चमक है कि पूर्ण exocytosis के साथ । इस तरह की स्थितियों दोनों यौगिक और चुंबन और फिर संकेत की अवधि के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि रन exocytosis पर कब्जा होता ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित घोषित नहीं

Acknowledgments

हम सीडीएनए के उदार उपहार के लिए Dr. U. Ashery धंयवाद । हम डीआरएस. जी. मास, एल मिटलमैन, एम शहरबन्नी, और Sackler सेलुलर और आणविक इमेजिंग केंद्र से Zilberstein माइक्रोस्कोप के साथ उनकी अमूल्य सहायता के लिए धंयवाद । यह काम संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा समर्थित किया गया था-इसराइल Binational विज्ञान फाउंडेशन (आर सागी-ट्विटर, Hammel, और एस जे Galli) और अनुदान 933/15 से इसराइल विज्ञान फाउंडेशन, विज्ञान के लिए इसराइल अकादमी द्वारा स्थापित (आर. सागी-ट्विटर के लिए अनुदान २०१३२६३ ) और NIH अनुदान U19 ऐ १०४२०९ और R01 AR067145 (to S.J. Galli) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

जीव विज्ञान अंक १३६ FITC-dextran विनियमित exocytosis यौगिक exocytosis लाइव सेल इमेजिंग lysosome-संबंधित organelles pinocytosis
इमेजिंग FITC-विनियमित Exocytosis के लिए एक रिपोर्टर के रूप में dextran
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter