Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging FITC-декстран репортером для регулируемых экзоцитоз

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Здесь мы подробно метод для живых клеток изображений регулируемых экзоцитоз. Этот метод использует FITC-декстрана, который накапливается в связанных с Лизосома органеллы, как репортер. Этот простой метод также позволяет различать различные виды регулируемых экзоцитоз в клетках, которые трудно манипулировать генетически.

Abstract

Регулируемые экзоцитоз представляет собой процесс, по которому груз, который хранится в секреторных гранул (SGs), выпущен в ответ на триггер секреторной. Регулируемые экзоцитоз является основополагающим для межклеточные связи и является ключевым механизмом для секреция нейротрансмиттеров, гормоны, воспалительных посредников и других соединений, различных клеток. По крайней мере три отдельных механизмов известны для регулируемых экзоцитоз: полный экзоцитоз, где один SG полностью сливается с плазматической мембраны, поцелуй и побегите экзоцитоз, где один SG временно предохранители с плазматической мембраны, и составные экзоцитоз, где несколько SGs сливаются друг с другом, до или после сплавливания SG с плазматической мембраны. Тип регулируемого экзоцитоз, предпринимаемые ячейки часто продиктовано тип секреторной триггера. Однако многих клеток, секреторные один триггер может активировать несколько режимов регулируемых экзоцитоз одновременно. Несмотря на обилие и значение различных видов и типов клеток механизмы, которые определяют различные режимы секреции основном нерешенными. Одна из главных задач в расследовании различных режимов регулируемых экзоцитоз, является трудность проведения различия между ними, а также изучать их отдельно. Здесь мы описываем использование флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстран как репортер экзоцитоз и живой клетки, воображения, чтобы различать разные пути регулируемых экзоцитоз, сосредоточив внимание на составные экзоцитоз, основанный на надежность и продолжительность события exocytic.

Introduction

Регулируемые экзоцитоз является основным механизмом, который легко сделал груза освобождается от секреторных клеток в ответ на конкретного триггера. Груз предварительно сформированы и поглощенных в секреторные пузырьки, в которых он хранится до тех пор, пока триггер передает сигнал для выпуска SGs содержание. Различные типы сигналов может привести к различных режимов регулируемых экзоцитоз, или различные виды регулируемых экзоцитоз может произойти одновременно. Известны три основных видов регулируемых экзоцитоз: полный экзоцитоз, который включает в себя полное слияние одного секреторных гранул с плазматической мембраны; поцелуй и побегите экзоцитоз, который включает в себя временные синтеза секреторных гранул с плазматической мембраны, следуют его переработки; и составные экзоцитоз, которая характеризуется homotypic слияние нескольких предварительного SGs (то есть, многогранулярную экзоцитоз) или последовательный (то есть, последовательные экзоцитоз) фьюжн с плазматической мембраны1. Составные экзоцитоз считается самой обширной режим грузовой версии2, как он позволяет быстро секрецию грузов, в том числе от SGs, которые расположены дистальной от плазматической мембраны. Составные экзоцитоз задокументировано как эндокринной и экзокринной клетки3,4,5,6,,78,9, а также в иммунные клетки. В иммунных клеток, таких как эозинофилов10,,1112 и нейтрофилы13составные экзоцитоз позволяет быстрый и надежный высвобождение медиаторов, которые обязаны убить вторжение патогенов, таких как бактерии и паразитов. Тучные клетки (MCs) развернуть составные экзоцитоз для эффективного выпуска предварительно воспалительных медиаторов во время врожденные иммунные реакции, анафилактический шок и другие аллергические реакции14,,1516 , 17. Поскольку различные режимы экзоцитоз может происходить одновременно1918,, он стал проблемой различие между ними в режиме реального времени или для определения их соответствующих фьюжн механизмов, поэтому изучение их основные механизмы.

Здесь мы представляем метод, основанный на живой клетки визуализации ячейки загружен FITC-декстрана, который позволяет реального времени отслеживания событий exocytic и различия между их различными способами. В частности наш метод позволяет эксклюзивные мониторинг соединения экзоцитоз.

FITC-декстран является конъюгата Флюорофор рН чувствительных FITC с глюкан полисахарид декстрана. Дневно обозначенные декстраны показали ввести в ячейку micropinocytosis20,21 и макропиноцитозом22,23. Как endocytic отсеков перерастет лизосомы, было показано, что FITC-декстран накапливается в Лизосома без явного ухудшения качества. Однако поскольку FITC рН высокочувствительных Флюорофор24, и лизосомальных люмен является кислой, FITC-декстран флуоресценции утоляет по достижении Лизосома24. Таким образом установление декстраны как Лизосома целевых груза, наряду с рН чувствительность FITC, заложили основу для использования FITC-декстрана в исследованиях Лизосома экзоцитоз25,,2627 , 28 , 29.

В нескольких типов клеток, в том числе MCs, нейтрофилов, эозинофилов, цитотоксических Т-клеток, меланосомы и другие SGs отображения лизосомальных особенности и классифицируются как связанные с Лизосома органеллы (LROs) или секреторной лизосомы30,31 . Так как LROs имеют кислый рН Люминал, FITC-декстран может использоваться для визуализации их экзоцитоз, вследствие более высоких рН, связанные с экстериоризации LROs. Действительно FITC-декстран был использован для мониторинга экзоцитоз в МКН18,32,33. В этом методе FITC-декстран добавляется к культуре клетки, рассмотрены клетками Пиноцитоз и отсортированный в SGs. Как это лизосомы, FITC флуоресценции угасает в SGs, когда они находятся в пределах ячейки. Однако после SG сплавливание с плазматической мембраны и последующего воздействия внешней среды, FITC-декстран восстанавливает его флуоресценции SG повышением рН, позволяя простое отслеживание событий exocytic, микроскопия живой клетки. Здесь мы скорректировали этот метод, чтобы включить уникальный отслеживания составных экзоцитоз.

Два других метода ранее использовались для отслеживания составных экзоцитоз. Электронная микроскопия был первый метод для характеристики структур exocytic, которые предложили возникновение различных видов экзоцитоз. В частности замечания «секреторной туннелей» клеток поджелудочной железы ацинарной34 и MCs35,,3637 вызвал гипотеза составных экзоцитоз. Однако в то время как высокое разрешение электронной микроскопии имеет право раскрыть плавленого везикулы, он не может отслеживать динамику их синтеза и поэтому невозможно определить, соответствуют ли они SG фьюжн во время соединения экзоцитоз или фьюжн пойманных гранул после их эндоцитоз. Преодолеть это препятствие в других методах, которые можно измерить экзоцитоз в живых клетках, таких как патч зажим измерения плазматической мембраны емкости11,13,,3839 или amperometry 40 средств массовой информации. Однако пережатия патч требует специальной установки и не могут быть пригодны для всех типов клеток. Amperometry измерения имеют возможность отслеживать экзоцитоз, только если груз выпускается в непосредственной близости к электроду. Таким образом использование живых клеток предлагает преимущество над этими методами, как он позволяет не только реального времени отслеживать экзоцитоз, но он также позволяет быстро и просто приобретение данных из всей ячейки.

Отслеживания FITC-декстрана, микроскопия живой клетки также предлагает ряд преимуществ для других живых клеток изображений на основе методов. Например широко используемым методом является микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM) клеток загруженных с флуоресцентного зонда SG или выражая флуоресцентный протеин тегами SG груза или мембранный белок26,41, 42 , 43. сила этого метода заключается в его способность отслеживать только те события, которые происходят недалеко от плазматической мембраны (далее именуемая след), поэтому exocytic события. Однако это также недостаток этого метода, потому что только ячейки фракция, которая примыкает к coverglass и недалеко от Микроскоп объектив может быть воспроизведен образ44. Представляют ли такие следы действительно поверхности всей клеточной мембраны является по-прежнему спорным45,,46-47. В этой связи с помощью РН чувствительных краска например FITC-декстран и стандартный флуоресцентным микроскопом или Конфокальный микроскоп с открытым отверстием позволяет изображений всей клетки, тем самым захватив всего exocytic события, которые происходят в этой ячейке.

Дополнительные pH фактора репортеров, которые используются для изучения регулируемых экзоцитоз клеточных изображений или TIRFM включают SG груза или SG мембранных белков сливается с phlourin, вариант GFP pH фактора. Примеры включают NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin и synapto-phluorin48,49,50,,5152. В то время как выражение этих датчиков может представлять более тесно эндогенного состав SGs, это влечет за собой transfection клетки и поэтому могут быть менее пригодны для клеток, которые трудно transfect. Поэтому, когда изучение клеток, трудно transfect или в экспериментальных условиях, которые требуют нескольких геномной манипуляции, выгодно использовать соединение, которое может дополняться просто в среду культуры клеток, таких как FITC-декстрана, . FITC-декстран также предлагает преимущество над акридин оранжевый (AO), другой рН чувствительных краситель, используемый для отслеживания экзоцитоз живой клетки микроскопии53,54,55,56 , 57 , 58. было показано, что АО побудить фотолиз везикулы, что результат в ложных вспышки, которые не соответствуют фактическим секрецию процессов27. В противоположность этому FITC-декстран отражает лучше секрецию события, вероятно из-за его низкой фото индуцированной производства кислорода27.

Примечательно альтернативный подход для изучения экзоцитоз является отслеживание приток красителя, с внешнего носителя в SG через поры фьюжн, который открывается во время этого процесса. В этом случае краситель добавляется к внешней среде наряду с секреторной триггера. Затем когда открывает поры фьюжн, краситель диффундирует в SG59,60. Явным преимуществом данного метода является, что он также предлагает возможность оценить размер пор фьюжн, путем использования красителей переменного размера. К примеру декстраны разной молекулярной массы (МВт), конъюгированных с различными флуорофоров, может использоваться как внеклеточного красители, whereby максимальный размер декстрана, которые могут проникнуть SG будет соответствовать размеру фьюжн поры59, 61 , 62 , 63 , 64. Кроме того, этот подход не требует использования чувствительных рН зонд. Однако существенным недостатком является, что соотношение сигнал-шум является очень низким, поскольку большое количество красителя присутствует в средствах массовой информации во время приобретения изображений, что приводит к высокой фоновой.

В целом использование FITC-декстрана в качестве маркера для экзоцитоз преодолевает несколько недостатков в сообщалось ранее методы, такие как сигнал/шум соотношение, токсичность, динамическое отслеживание и сложности.

Здесь мы описываем использование FITC-декстран следить составные экзоцитоз в RBL - 2H 3 тучных клеток линии (далее именуемая RBL, главным образом установленные Экклстон et al. 65 и далее клонирован, Barsumian и др. 66), в ответ на иммуноглобулина Е (IgE) / Активация антигена (Ag).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка

  1. Подготовка RBL культуры средств массовой информации
    1. Смесь 500 мл низкий глюкозы Дульбекко изменения среднего (DMEM) орла с 56 мл плода бычьим сывороточным (ФБС), 5,5 мл раствора пенициллина стрептомицином нистатин, 5,5 мл раствора L-глютамин 200 мм. Это приводит к низкой глюкозы DMEM дополнена 10% FBS, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 единиц/мл пенициллин, 12 единиц/мл нистатин и 2 мм L-глютамина.
    2. Фильтр СМИ с помощью топ вакуумный фильтр 0,22 мкм поры и хранить при 4 ° C.
  2. Техническое обслуживание RBL клеток.
    1. Вырасти клетки руб максимальная confluency 90% в 10 см блюдо. Если культура клетки здоровых, клетки должны иметь форму шпинделя с случайные выступов.
    2. Для расщепления ячейки отсоедините клетки от блюдо, аспирационных СМИ и заменив с 2 мл раствора trypsine/ЭДТА B. инкубировать на 5-10 минут в атмосфере увлажненные 5% CO2 при 37 ° C.
    3. После того, как клетки отдельный, нейтрализовать трипсина, добавив 2 мл культуры средств массовой информации, с помощью пипетки и разбиение ячеек в 1:2-1:10 соотношение.
  3. Подготовка 20 x Tyrode в буфер
    1. Подготовьте запас 20 x решение 54 мм KCl, 20 мм MgCl2, 2,74 М NaCl и 8 мм NaH2PO4 в двойной дистиллированной воде (DDW). Хорошо перемешать и хранить при 4 ° C.

2. Культура клеток руб для микроскопии живой клетки

  1. Приготовление раствора FITC-декстрана.
    1. Смешайте 1 мг порошка FITC-декстрана (150 K) на 1 мл культуры средств массовой информации (см. шаг 1.1.1). Для полного патрон coverglass Подготовьте 3 мл.
    2. С помощью ацетат целлюлозы шприц фильтр с размером пор 0,22 мкм, фильтр растворенных FITC-декстрана.
    3. Добавьте мыши IgE в концентрации 1 мкг/мл.
  2. Заполнение RBL клетки для изображений
    1. За день до изображений, аспирационная СМИ от культуры блюдо и заменить с 2 мл раствора trypsine/ЭДТА B. инкубировать на 5-10 минут в атмосфере увлажненные 5% CO2 при 37 ° C. После того, как клетки отдельный, нейтрализовать трипсина, добавив 2 мл культуры средств массовой информации.
    2. Count RBL клеток с помощью Горяева и отрегулировать громкость соответственно с культуры средств массовой информации для получения концентрации клеток 7,5 x 105/мл.
    3. Добавьте 10 мкл суспензии клеток в патрон coverglass, предварительно заполнены свежими FITC-декстран дополнены Культура СМИ (это приводит к посева 7.5 x 103 клеток в камере).
    4. Рост клеток руб на ночь в атмосфере гумифицированный 5% CO2 при 37 ° C. Клетки должны оставаться в югу вырожденная уровне для того, чтобы убедиться, что клетки отделяются и что это легко идентифицировать каждую ячейку индивидуально под микроскопом.
  3. Transfection клеток RBL - необязательно.
    1. Для визуализации exocytic события в сочетании с другими тегами, дневно белков, см. Протокол transfection RBL ячеек в Азуза et al. 67

3. живой клетки микроскопия экзоцитоз

  1. Подготовка решений:
    1. Подготовить окончательный Tyrode буферного раствора путем разбавления Стоковый раствор в ВКБН в 1:20 разрежения и дополнения с 20 мм Hepes рН 7, 1.8 мм CaCl глюкозы2, 1 мг/мл BSA и 5,6 мм.
    2. Свеже подготовить 20 x secretagogue реагента в Tyrode в буфере [1 мкг/мл dinitrophenyl конъюгированных человеческого сывороточного альбумина (DNP-имеет (Ag)) в нашем случае, 50 нг/мл концентрация 1 x].
    3. Приготовляют раствор хлорида аммония 400 мм путем растворения порошка в Tyrode в буфере.
  2. Подготовка клетки.
    1. Мыть патрон coverglass 3 раза, аспирационных СМИ из камеры и пополнение его с 300 мкл буфера в Tyrode, подогретую до 37 ° C. Наконец пополните в камеру с 300 мкл буфера в Tyrode, подогретую до 37 ° C.
    2. Патрон coverglass место в инкубатор камеры микроскопа. Убедитесь, что камера является стабильным.
  3. Установка в Микроскоп
    1. Выбрать регион, представляющие интерес для отслеживания, включите флуоресцентный источник света (традиционно ртутная лампа) и выбрать соответствующий флуоресценции фильтр (выбрать фильтр для зеленых флуорофоров для просмотра FITC-декстрана). После того как региона интерес находится в фокусе и в середине поля зрения, выключите источник света во избежание обесцвечивания фото и токсичности.
      Примечание: Некоторые из FITC-декстрана, включены в клетках может удерживать флуоресценции. Это потому что FITC-декстран также могут быть отсортированы не лизосомальных отсеков, например endosomes.
    2. Включите соответствующий освещения для возбуждения FITC. При использовании лазерных микроскопов, включите 488 нм лазер. Выбросов должна собираться вокруг 500-550 Нм (FITC пики выбросов на 510-520 Нм).
    3. При использовании конфокального микроскопа, откройте отверстие до максимума. Это позволит использовать меньше мощность лазера во избежание обесцвечивания и токсичности и обеспечит захват экзоцитоз событий из всех самолетов ячейки.
    4. Настройте интервал времени между изображения приобретений.
      1. Различные клетки может варьироваться в их кинетики регулируемых экзоцитоз68. Для конкретных изображений составных экзоцитоз, мы рекомендуем интервал времени, по крайней мере 5 секунд. Однако как правило, чтобы для быстрой обработки изображений, убедитесь, что приобретение время одного кадра быстро.
      2. При использовании сканирование лазерного конфокального микроскопа, задать направление сканирования для двунаправленной, не позволяют для усреднения и установите разрешение на 512 x 512 (рекомендуется, последние два положения также поможет свести к минимуму обесцвечивания и токсичности).
  4. Визуализационная диагностика экзоцитоз.
    1. Изображение клетки для требуемой длительности, в зависимости от типа ячейки или secretagogue. В клетках RBL, срабатывает с IgE/Ag большинство exocytic события происходят в течение 15-20 мин активации.
    2. Для активации клеток мкл 16 из 20 x secretagogue решение в палату.
  5. Подтверждая наличие FITC-декстрана в клетках.
    1. Для подтверждения наличия и локализации FITC-декстрана в SGs, добавить 16 мкл раствора хлорида аммония (будьте осторожны, чтобы не перемещать камеру, чтобы не потерять фокус) в камеру осторожно (это будет сделать окончательный концентрации 20 мм). Это будет стимулировать защелачивание SGs и dequenching FITC флуоресценции, который будет происходить в течение нескольких секунд.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1a представляет схематично как FITC-декстран могут выступать в качестве репортера регулируется экзоцитоз, и охарактеризовать различные режимы exocytic событий. Во-первых клетки инкубируют с FITC-декстрана, который интернализации, Пиноцитоз и сортируются в SGs. Так как SGs MCs LROs, их низкий рН гасит флуоресценции FITC, показанный здесь как Черный гранул (A-C, я). Когда клетки вызваны secretagogue и SGs предохранитель с плазматической мембраны, формируется фьюжн поры, позволяя измеряем протонов и защелачивание SGs. Как следствие FITC восстанавливает его флуоресценции (, II). Полное экзоцитоз будет проявляться в короткие (менее 5 s) флуоресцентных событие как экстериоризируется SG мембраны полностью разрушается в плазматической мембраны и FITC-декстран рассеивает прочь в питательной среды (, III). Во время события поцелуй и ран exocytic, SG мембраны только временно предохранители с плазматической мембраны, что приводит к кратковременным фьюжн поры и поэтому только краткий всплеск флуоресценции как SG быстро отсоединяется и его просвете быстро повторно подкисляет (B, III - IV). Наконец во время соединения экзоцитоз, серия SGs последовательно сливаются друг с другом (следующие SG фьюжн), а также с плазматической мембраны, с содержанием поры open fusion. В результате dequenched намного больше массы FITC-декстрана, что приводит к большой и долгоживущих флуоресценции взрыв (C, III-IV), который разлагается при зонд диффундирует в внешнем носителе (C, V).

Мы использовали эту модель и подтвердил свои прогнозы по визуализации управления клетки и клетки, которые истощаются из Rab5, который мы показали, чтобы иметь решающее значение для homotypic SG-SG фьюжн69 и составные экзоцитоз33. Устанавливая время аэросъёмки для изображения каждые 15 s, мы ожидали обнаружить основном непрерывной события секреции, т.е., составные экзоцитоз. Действительно, как показано на рисунке 1B наши данные показывают, что во время управления клеток многих крупных и long-lasting exocytic события могут регистрироваться, только несколько события были записаны в Rab5 нокдаун клеток (shRab5). Кроме того события, которые были записаны в shRab5 клетках были значительно меньше по размеру по сравнению с события, записанные в ячейках элемента управления. Следует отметить секреторные потенциала клеток shRab5 остается неизменным под же условия69, предполагая, что в то время как shRab5 подавляет составные экзоцитоз, она не упразднить секрецию. Таким образом изображений FITC-декстран флуоресценции в долгое время интервалов позволяет для конкретного выявления составных экзоцитоз. Кроме того изображения FITC-декстран релиз позволяет захвата последовательный характер составных экзоцитоз. Как указано стрелкой в рисунок 1b, после вспышки света, как слабая вспышка, которая примыкает к первому начинается вторая вспышка. Это может быть выведено как fusion SG с SG, который уже находится в процессе сплавливание с плазматической мембраны (то есть, последовательные экзоцитоз). Таким образом, как второй блок предохранителей с первый блок, который уже подключен к плазматической мембране, фьюжн поры а также увеличивает pH второй блок и FITC флуоресценции dequenches, уступая второй взрыв флуоресценции. Такой сценарий FITC-декстран выпуска во время последовательного слияние смежных SGs представлен на рисунке 1 c.

Еще одним примером последовательной синтеза SGs во время соединения экзоцитоз показан на рисунке 2. RBL клетки были совместно transfected с конститутивно активных (CA) форма Rab5a и WT SNAP-23, условия, при которых составные экзоцитоз становится более надежной33. Изображения Rab5a CA, который необходим для SG-SG фьюжн и покрытия больших SGs33,69, вместе с FITC-декстрана, позволяет лучше визуализация слияние мелких гранул с крупных гранул CA-Rab5a стиле.

Так как FITC-декстран закалка при хранении внутри SG, необходимо реализовать метод для проверки, что FITC-декстран действительно присутствует в SGs. Это становится еще более важным, когда брикетирования эксперимент в условиях, которые, как ожидается, отменить выделение. Чтобы преодолеть это препятствие, 20 мм хлорида аммония был добавлен в палату в конце каждого эксперимента. Эта процедура повышает рН внутри SGs, позволяющие FITC флуоресценции. Как показано на рисунке 3, после добавления хлорида аммония в СМИ, FITC декстрана становится видимым и локализуется совместно с mRFP тегами нейропептида Y, который является журналистом SG в RBL клетки70.

Figure 1
Рисунок 1: конкретные Обнаружение составных экзоцитоз. () диаграмма, описывая, как изменения в флуоресцировании FITC-декстран пилки различных режимов регулируемых экзоцитоз. (b) живой клетки, что transfected изображений FITC-декстрана в RBL клетки с NPY-mRFP и pSilencer или shRab5, как указано. Transfection была выполнена как описано67,70. Вкратце, 1,5 x 107 руб клетки были высокомобильна в трансфекции буфера (DMEM дополнены 20 мм K-трубы рН 7, 10 мкм Ca2 + ацетат, 2 мм Mg2 + ацетат, 128 мм калия глутамата) содержащий 15 мкг NPY-mRFP и либо 30 мкг pSilencer или 15 мкг shRab5A и 15 мкг shRab5B/C. Transfection была достигнута путем электропорации в 300 V и длиной импульса 20 мс. Клетки были немедленно replated в культурной среде, содержащей 1 мг/мл FITC-декстрана. После 24 часов клетки были ознакомлены с 1 мкг/мл МГЭ и инкубированы для дальнейшего 24 h. Клетки были затем промывают три раза в полном Tyrode буфера и активированную 50 нг/мл DNP-HSA (Ag). Клетки были визуализированное покадровой флуоресцентной микроскопии. Белая стрелка в pSilencer изображений к всплеск FITC флуоресценции и белый круг знаменует разряженные SG. Белая стрелка в образах shRab5A/B/C указывает минуты флуоресцентные события, которые происходят в клетках Rab5-нокдаун, вероятно, свидетельствует о полной экзоцитоз. Следует отметить чтобы разрешить обнаружение сигнала было увеличено интенсивность ShRab5 изображения. Изображения были приобретены Конфокальный микроскоп оснащены подогревом палата (37 ° C) и CO2 контроллера (4,8%) и C-Апохромат x63/1.2 W Corr цели, под открытым обскуры параметр. Для полнометражных фильмов обратитесь к Klein et al. 33 (c) принципиальная схема процесса синтеза homotypic SG, показано в пункте (b). В деталях как первый SG предохранители с плазматической мембраны и устанавливает фьюжн поры, он начинает подщелачивать при освобождении его содержание FITC-декстрана. Таким образом ко времени второй SG предохранители с первым в последовательном порядке, флуоресценции первый SG исчезает из-за выпуска FITC-декстрана. Однако второй SG Подщелачивает, что приводит в FITC flash, которая появляется рядом с первым SG. Эта цифра была адаптирована из Klein et al. 33 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: двойной изображений mStr-CA-Rab5 и FITC-декстрана. RBL клетки были совместно transfected с 20 мкг ха wt-SNAP23 и 10 мкг mStr-CA Rab5A. Клетки были предварительно инкубировали с FITC-декстран и IgE и срабатывает с Ag, как описано в рисунке 1. серию изображений захвата событий сплавливание между закаленном SG (белая стрелка) и SG, уже сливается с плазматической мембраны и поэтому флуоресцентные. На 15,8 минут закаленных SG сливается с его соседних SG и завоевывать флуоресценции. В штучной упаковке области увеличены в нижней левой части каждой точке времени. (b) презентация mSTR-CA Rab5A (в красном) и FITC-декстрана (в зеленом) из соответствующих точек времени показан в (а), демонстрируя сплавливание между двумя SGs. изображения были приобретены confocal микроскопии (открытые обскуры) с помощью плана Апохромат x63-NA 1.4 цель. Эта цифра была адаптирована из Klein et al. Полный фильм, 33 см Klein et al. 33 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Двойная изображений NPY-mRFP и FITC-декстран во время защелачивание SG NH4Cl. RBL клетки были transfected с shRab5, предварительно инкубировали с FITC-декстран и IgE и срабатывает с Ag, как описано в рисунке 1. (a) клетки были визуализированное покадровой флуоресцентной микроскопии. Установленное время в изображениях минут после срабатывания с Ag. Изображения были приобретены confocal микроскопии, используя план Апохромат x63-NA 1.4 цель. (b) количественный анализ эксперимента показано в (a). Каждая строка в графах является средняя флуоресценции FITC региона интерес (ROI) за одну ячейку. Стрелка указывает на время NH4сложения Cl (20 мм). Бары = 5 мкм. Эта цифра была адаптирована из Klein et al. 33 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем, как трассировка флуоресценции FITC-декстран загружается в SGs может использоваться для специально захвата составные экзоцитоз событий. Это было достигнуто, установив Микроскоп, чтобы получить изображение каждые 15 секунд, обеспечивая тем самым, что со временем будет записано только долгосрочные мероприятия, и таким образом исключая короткие события, которые будут соответствовать полное экзоцитоз или поцелуй и побегите экзоцитоз. Чтобы установить метод, мы показали, что нокдаун изоформ Rab5, которые выражаются в RBL клеток и стержневые для составных экзоцитоз, устраняет возможность захвата событий FITC-декстран-релиз, в то время как общий секреторной клеткой не влияет.

Наиболее известных недостатком метода является, что она применяется только к ячейки, содержащие кислой SGs. Однако наиболее известных преимуществом метода является, что он основан на простой инкубации клеток с FITC-декстрана, не требуя transfection. Другие репортеры pH фактора, которые используются для изучения регулируемых экзоцитоз и привлекать SG груза или SG мембранных белков сливается с phlourin, pH фактора GFP вариант (например, NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin и synapto-phluorin48, 49,50,,51-52), могут более тесно представляют эндогенные состав SGs. Однако их использование предполагает transfection клетки, которые могут быть менее пригодны для клеток, которые трудно transfect. Поэтому, когда изучение клеток, трудно transfect или в экспериментальных условиях, которые требуют нескольких геномной манипуляции, использование соединения, которые могут быть лишь дополнены в среде культуры клеток, таких как FITC-декстрана, выгодно. Наш протокол может потребоваться конкретные изменения ячейки для размещения различия в кинетика экзоцитоз различных клеточных типов68. Следовательно выбранный временной интервал для захвата изображений должны быть оптимизированы. Для RBL клеток у нас есть настройки, Микроскоп, чтобы захватить новое изображение каждые 15 секунд, которые в МГЭ/Ag срабатывает RBL клеток позволило нам визуализировать только долгосрочных мероприятий, таким образом позволяя эксклюзивные отслеживания составных экзоцитоз событий.

Еще одним фактором, который необходимо рассматривать это тип декстрана использоваться. Доступны разнообразные декстраны, которые различаются по их молекулярным весом. Таким образом важно выбрать соответствующие декстрана как репортер, принимая во внимание возможные последствия, которые могут иметь различные декстраны на клетки. Например низкомолекулярные декстраны было показано, чтобы активировать MCs и стимулировать секрецию-71,-72,-73,-74. Таким образом низкомолекулярные декстраны не будет соответствующей репортеров для MC секрецию. Различия в реакционной способности клеток к декстраны были также отмечены в различных крыса штаммов75или под различные условия co-stimulatory71,76,,7778. Здесь мы решили использовать 150 K FITC-декстрана, ранее учился в строке ячейки RBL и показано, чтобы быть неэффективным в стимулировании секрецию18,79.

Источник света должен выбираться также имеет решающее значение для протокола. При использовании конфокального микроскопа, источник света, традиционно на основе лазера. Таким образом чтобы избежать токсичности, важно выбрать мощность низкий лазера. Мощность лазера желаемого отличается между Микроскопы, в зависимости от типа и возраста лазера. Кроме того желаемый лазерного луча также зависит от типа детектора используется. Например при использовании общей детектор например фотоэлектронный умножитель детектор на основе трубки, выше мощность лазера будет необходимо чем при использовании Современные гибридные детектор (например трубу фотоэлектронный умножитель и лавинные фотодиоды гибрид детектор). Мы рекомендуем использовать низкие мощность лазера можно и не превышает 10% мощности лазера.

В резюме мониторинг dequenching SG загружен FITC-декстрана, время промежуток микроскопия в тщательно выбранных параметров позволило нам исключительно захват соединения экзоцитоз в RBL МКН, в значительной степени содействия идентификации молекулярных структур регулировать этот процесс. Этот метод может корректироваться далее отличить полный от поцелуй и побегите экзоцитоз путем сокращения и тщательно калибровки временной интервал между изображения приобретений разрешить различие недолго вспышек, связанных с kiss и ран экзоцитоз от даже короткие вспышки, которые сопровождают полный экзоцитоз. Такие условия будут захватить как комплекса, так и поцелуй и побегите экзоцитоз, затем можно выделить зависимости длительности сигнала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующие финансового интереса

Acknowledgments

Мы благодарим д-р U. Ashery за щедрый дар cDNA. Мы благодарим Drs. G. массовые, L. Mittleman, м. Shaharbani и Y.Zilberstein от Sackler сотовых и молекулярной визуализации Центр за их неоценимую помощь с помощью микроскопии. Эта работа была поддержана двусторонней научного фонда США Израиль (Грант 2013263 R. саги-Айзенберг, I. Хаммел и S.J.Galli) и предоставить 933/15 от Израиля научный фонд, созданная Израилем академия наук (для R.Sagi-Айзенберг ) и низ грантов U19 Ай 104209 и R01 AR067145 (чтобы S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

Биология выпуск 136 FITC-декстрана регулируемых экзоцитоз составные экзоцитоз живых клеток связанных с Лизосома органеллы Пиноцитоз
Imaging FITC-декстран репортером для регулируемых экзоцитоз
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter