Summary
Här detalj vi en metod för levande cell avbildning av reglerade exocytos. Denna metod använder FITC-dextran, som ackumuleras i lysosomen-relaterade organeller, som reporter. Den här enkla metoden kan också skilja mellan olika lägen av reglerade exocytos i celler som är svåra att manipulera genetiskt.
Abstract
Reglerade exocytos är en process genom vilken last, som lagras i sekretoriska granuler (SGs), släpps som svar på en sekretoriska utlösare. Reglerade exocytos är grundläggande för kommunikationen och är en viktig mekanism för utsöndringen av neurotransmittorer, hormoner, inflammatoriska mediatorer och andra föreningar, av en mängd olika celler. Minst tre olika mekanismer är kända för reglerade exocytos: full exocytos, där en enda SG fullt säkringar med plasmamembranet, kiss-och-kör exocytos, där en enda SG normalnivå säkringar med plasmamembranet, och sammansatta exocytos, där flera SGs säkring med varandra, före eller efter SG fusion med plasmamembranet. Typ av reglerade exocytos som genomförs av en cell är ofta styrs av vilken typ av sekretoriska trigger. Dock i många celler, kan en enda sekretoriska utlösare aktivera flera lägen av reglerade exocytos samtidigt. Trots deras överflöd och vikten över celltyper och arter är de mekanismer som bestämmer de olika transportsätten sekretion till stor del olösta. En av de viktigaste utmaningarna i att undersöka de olika transportsätten reglerade exocytos, är svårighet att skilja mellan dem samt att utforska dem separat. Här beskriver vi användningen av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran som exocytos reporter och levande cell imaging, för att skilja mellan de olika vägarna i reglerade exocytos, med fokus på sammansatta exocytos, baserat på robustheten och varaktighet av exocytic händelser.
Introduction
Reglerade exocytos är den primära mekanismen genom vilken lätt gjort Last släpps från en sekretoriska celler som svar på en specifik utlösare. Lasten är pre bildats och binds in sekretoriska vesikler, där det lagras tills en utlösare vidarebefordrar signalen för frisläppandet av SGs' innehåll. Olika typer av signaler kan resultera i olika lägen av reglerade exocytos, eller olika lägen av reglerade exocytos kan förekomma samtidigt. Tre huvudsakliga typer av reglerade exocytos är kända: full exocytos, som innebär full fusion av en inre sekretoriska granule med plasmamembranet; Kiss-och-kör exocytos, som involverar övergående fusion av det sekretoriska granulat med plasmamembranet följt av återvinning; och sammansatta exocytos, som kännetecknas av homotypic fusion av flera SGs före (dvs, multigranular exocytos) eller sekventiella (dvs, sekventiell exocytos) till fusion med plasmamembranet1. Sammansatta exocytos anses mest omfattande funktionsläget av Last release2, eftersom det ger snabb utsöndringen av last, till exempel som från SGs som ligger distalt från plasmamembranet. Sammansatta exocytos har dokumenterats i både exokrina och endokrina celler3,4,5,6,7,8,9, samt i immunceller. I immunceller, såsom eosinofiler10,11,12 och neutrofiler13, tillåter sammansatta exocytos snabb och robust frisläppandet av medlare som krävs för att döda invaderande patogener såsom bakterier eller parasiter. Mastceller (MCs) distribuera sammansatta exocytos för effektiv frisläppandet av förlagrade inflammatoriska mediatorer under medfödda immunsvar, anafylaxi och andra allergiska reaktioner14,15,16 , 17. eftersom de olika transportsätten exocytos kan förekomma samtidigt18,19, det har blivit en utmaning att särskilja dem i realtid eller för att identifiera deras respektive fusion maskinerier, därmed klarlägga deras bakomliggande mekanismer.
Här presenterar vi en metod, som bygger på levande cell avbildning av cell laddad FITC-dextran, som tillåter realtid spårning av exocytic händelser och skilja mellan sina olika lägen. Vår metod tillåter särskilt exklusiva övervakning av sammansatta exocytos.
FITC-dextran är ett konjugat av pH-känsliga fluorophore FITC med den glukan polysackarid dextran. Fluorescently märkta dextrans har visat sig in i cellen av micropinocytosis20,21 och macropinocytosis22,23. Som endocytic fack mogna i lysosomer, har det visats att FITC-dextran ackumuleras i lysosomen med någon uppenbar försämring. Men eftersom FITC är ett högt pH-känsliga fluorophore24, och Lysosomen lumen är surt, släcker FITC-dextran fluorescens när du når den Lysosomen24. Således att etablera dextrans som Lysosomen riktade Last, tillsammans med FITC pH känslighet, har lagt grunden för användning av FITC-dextran i studier av Lysosomen exocytos25,26,27 , 28 , 29.
I flera celltyper, inklusive MCs, neutrofiler, eosinofiler, cytotoxiska T-celler, melanosomer och andra, SGs lysosomala visningsfunktioner och klassificeras Lysosomen-relaterade organeller (LROs) eller sekretoriska lysosomer30,31 . Eftersom LROs har en sura luminala pH, kan FITC-dextran användas för att visualisera deras exocytos, till följd av högre pH är associerad med exteriorisering av LROs. FITC-dextran har faktiskt använts för att övervaka exocytos i MCs18,32,33. Den här metoden läggs till cellkulturen FITC-dextran, tas upp av cellerna av pinocytosis och sorterade i SGs. Som det är i lysosomer, är FITC fluorescens kylda i SGs när de är inom cellen. Dock vid SG fusion med plasmamembranet och åtföljande exponering för den yttre miljön återfår den FITC-dextran dess fluorescens som SG pH stiger, möjliggör enkel spårning av exocytic händelser av levande cell mikroskopi. Här, vi har anpassat denna metod om du vill aktivera unika spårning av sammansatta exocytos.
Två andra metoder har använts tidigare att spåra sammansatta exocytos. Elektronmikroskopi var den första metoden att karakterisera exocytic strukturer som föreslog förekomsten av olika lägen av exocytos. Särskilt gav yttrande av ”sekretoriska tunnlar” i bukspottskörteln acinar celler34 och MCs35,36,37 upphov till hypotesen om sammansatta exocytos. Men, medan den höga upplösningen av elektronmikroskopi har makt att avslöja smält blåsor, det kan inte spåra dynamiken i deras fusion och därmed kan inte definiera om de motsvarar SG fusion under förening exocytos eller fusion återerövrade granulat efter deras endocytos. Detta hinder övervinns i andra metoder som kan mäta exocytos i levande celler, såsom patch clamp mått plasmamembranet kapacitans11,13,38,39 eller amperometry 40 av media. Dock patch fastspänning kräver en speciell set-up och kanske inte lämpliga för alla celltyper. Amperometry mätningar kan spåra exocytos endast om lasten är släppt i mycket nära anslutning till elektroden. Därför, med hjälp av levande cell imaging erbjuder en fördel över dessa metoder, som inte bara gör det möjligt för realtid spårning av exocytos, men det ger också snabb och enkel insamling av data från hela cellen.
Spårning av FITC-dextran av levande cell mikroskopi erbjuder också några fördelar till andra levande cell imaging-baserade metoder. En allmänt använd metod är till exempel totalreflexion fluorescensmikroskopi (TIRFM) i cellerna laddad med en fluorescerande SG sond eller uttrycka en fluorescerande protein-taggade SG last eller membran protein26,41, 42 , 43. denna metod styrka ligger i dess förmåga att övervaka uteslutande händelser som inträffar nära plasmamembranet (hädanefter kallas fotavtryck), därav exocytic händelser. Detta är dock också nackdelen med denna metod, eftersom endast den cell-fraktionen som angränsar till täckglas och nära Mikroskop linsen kan vara avbildade44. Huruvida sådana fotavtryck verkligen representerar hela cellmembran ytan är fortfarande diskutabel45,46,47. I detta avseende, tillåter med ett pH-känsliga färgämne som FITC-dextran och standard fluorescens Mikroskop eller confocal Mikroskop med ett öppet hål imaging av hela cellen, därmed fånga de totala exocytic händelser som inträffar i cellen.
Ytterligare pH-känsliga reportrar som används för att studera reglerade exocytos av hela cellen imaging eller TIRFM inkluderar SG last eller SG membranprotein smält till phlourin, en pH-känsliga GFP variant. Exempel är NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin och synapto-phluorin48,49,50,51,52. Uttryck av dessa sonder kan representera närmare endogena sammansättningen av SGs, det innebär transfection celler medan kan därför vara mindre lämpligt för celler som är svåra att transfect. Därför, när studerar celler som är svåra att transfect eller under experimentella förhållanden som kräver flera genetiska manipulationer, är en förening som enkelt kan kompletteras i cell odlingsmediet, såsom FITC-dextran, fördelaktiga . FITC-dextran erbjuder också en fördel över akridin orange (AO), en annan pH-känsliga färgämne som har använts för spårning av exocytos av levande cell mikroskopi53,54,55,56 , 57 , 58. AO har visats inducera fotolys av blåsor att resultera i falskt blixtar, som inte motsvarar faktiska sekretion bearbetar27. I motsats därtill återspeglar FITC-dextran bättre utsöndring händelser, förmodligen på grund av dess låga foto-inducerad produktionen av reaktivt syre27.
Noterbart är en alternativ metod för att studera exocytos av spårning tillströmningen av ett färgämne, från externa mediet till SG genom fusion pore som öppnas under denna process. I det här fallet läggs färgen till externa medium tillsammans med sekretoriska utlösaren. Sedan, när fusion porerna öppnas färgämnet diffunderar in i SG59,60. En klar fördel med denna metod är att det också ger möjlighet att uppskatta fusion porstorlek, genom användning av färgämnen av varierande storlek. Exempelvis kan dextrans med olika molekylvikt (MW), konjugerat till olika fluorophores, användas som extracellulära färgämnen varvid den maximala storleken av dextran som kan penetrera SG skulle motsvara storleken på fusion pore59, 61 , 62 , 63 , 64. Dessutom denna metod kräver inte användning av en pH-känsliga sond. En betydande nackdel är dock att signal-brusförhållande är mycket låg, eftersom en stor mängd färgämne är närvarande i media under förvärv av bilder, vilket resulterar i hög bakgrund.
Övergripande, användning av FITC-dextran som en markör för exocytos övervinner flera nackdelar i tidigare rapporterade metoder, såsom signal till brus förhållande, toxicitet, dynamisk spårning och komplexitet.
Här beskriver vi användningen av FITC-dextran att övervaka sammansatta exocytos i RBL - 2H 3 mast cell linje (hädanefter kallas RBL, primärt fastställt Eccleston o.a. 65 och ytterligare klonade av Barsumian et al. ( 66), som svar på immunglobulin E (IgE) / antigen (Ag) aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelser
- Beredning av RBL kultur media
- Blanda 500 mL låg glukos Dulbecco's modified örnens medium (DMEM) med 56 mL fetalt bovint serum (FBS), 5,5 mL penicillin-streptomycin-nystatin lösning, 5,5 mL L-glutamin 200 mM lösning. Detta resulterar i låg glukos DMEM kompletteras med 10% FBS, 100 µg/mL streptomycin, 100 enheter/mL penicillin, 12 enheter/mL nystatin och 2 mM L-glutamin.
- Filtrera media med ett topp-vakuum filter 0,22 µm porstorlek och butik vid 4 ° C.
- Underhåll av RBL celler.
- Växa RBL celler till en maximal konfluens 90% i en 10 cm skål. Om cellkulturen är frisk, bör cellerna har en spindel form med enstaka utbuktningar.
- För cell delning, lossa cellerna från skålen genom aspirera media och ersätta med 2 mL trypsine/EDTA-lösning B. Inkubera i 5-10 minuter i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C.
- När cellerna har lossnat, neutralisera trypsin genom att tillsätta 2 mL odlingssubstrat, med pipett och dela celler i en 1:2-1:10 baserat.
- Beredning av 20 x Tyrodes buffert
- Förbereda ett lager 20 x lösning av 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl och 8 mM NaH2PO4 i dubbel destillerat vatten (DDW). Blanda väl och förvara vid 4 ° C.
2. kultur av RBL celler för levande Cell mikroskopi
- Beredning av FITC-dextran lösning.
- Blanda 1 mg av FITC-dextran pulver (150 K) per 1 mL odlingssubstrat (se steg 1.1.1). För en fullständig kamrar täckglas, förbereda 3 mL.
- Använder en cellulosaacetat spruta filterenhet med 0,22 µm porstorlek, filtrera den upplösta FITC-dextran.
- Lägg till mus IgE till en koncentration av 1 µg/mL.
- Seedning RBL celler för avbildning
- Dagen innan imaging, aspirera media från kultur skålen och ersätta med 2 mL trypsine/EDTA-lösning B. Inkubera i 5-10 minuter i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C. När cellerna har lossnat, neutralisera trypsin genom att tillsätta 2 mL odlingssubstrat.
- Räkna RBL celler med hjälp av en hemocytometer och justera volymen med kultur media för att få en cell koncentration av 7,5 x 105/ml.
- Lägg till 10 µL cellsuspension till ett kamrar täckglas förfylld med färska FITC-dextran kompletteras kultur media (Detta resulterar i sådd på 7,5 x 103 celler i en kammare).
- Växa RBL celler över natten i en humified atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C. Cellerna bör förbli i en sub konfluenta nivå för att se till att cellerna skiljs åt och att det är lätt att identifiera varje cell individuellt under mikroskopet.
- Transfection RBL celler - tillval.
- För imaging exocytic händelser i kombination med andra fluorescently märkta proteiner, se transfection protokoll för RBL celler i Azouz o.a. 67
3. levande Cell mikroskopi av exocytos
- Beredning av lösningar:
- Förbereda en sista Tyrode buffertlösning genom att späda ut stamlösning i DDW i en 1:20 tillägg med 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA och 5,6 mM glukos och utspädning.
- Nymalen förbereda ett 20 x insulinsekretagog reagens i Tyrodes buffert [1 µg/mL Dinitrophenylen konjugerat till humant serumalbumin (DNP-har (Ag)) i vårt fall, för en 50 ng/mL 1 x koncentration].
- Bered en 400 mM ammoniumklorid genom att lösa upp pulvret i Tyrodes buffert.
- Beredning av cellerna.
- Tvätta de kamrar täckglas 3 gånger genom att aspirera media från kammaren och påfyllningar det med 300 µL av Tyrodes buffert, föruppvärmd till 37 ° C. Slutligen, fylla kammaren med 300 µL av Tyrodes buffert, föruppvärmd till 37 ° C.
- Placera de kamrar täckglas i mikroskopets inkubator kammare. Se till att kammaren är stabil.
- Ställa in mikroskopet
- För att välja ett område av intresse att spåra, aktivera den fluorescerande ljuskällan (traditionellt en kvicksilverlampa) och välj lämplig fluorescens filtret (Välj filtret för gröna fluorophores för visning av FITC-dextran). När regionen av intresse är i fokus och är mitt i synfältet, inaktivera ljuskällan för att undvika foto-blekning och toxicitet.
Obs: Några av de FITC-dextran ingår i cellerna får behålla fluorescens. Detta beror på att FITC-dextran kan också sorteras till icke-lysosomala facken såsom endosomes. - Slå på lämplig belysning för FITC excitation. Om du använder en laser-baserad Mikroskop, slå på 488 nm laser. Utsläpp bör samlas runt 500-550 nm (FITC utsläpp toppar vid 510-520 nm).
- När du använder en confocal Mikroskop, öppna pinhole maximalt. Detta gör att använda lägre lasereffekt att undvika blekning och toxicitet och garanterar fångst av exocytos händelser från alla plan av cellen.
- Kalibrera tidsintervallet mellan bild förvärv.
- Olika celler kan variera i deras kinetik av reglerade exocytos68. För specifik avbildning av sammansatta exocytos rekommenderar vi ett tidsintervall på minst 5 sekunder. Men som en tumregel, för att möjliggöra snabb imaging, kontrollera att förvärvet av en bildruta är snabb.
- När du använder laserskanning confocal Mikroskop, ange scan riktning till dubbelriktad, inte tillåta genomsnitt och ställa in upplösning på 512 x 512 (rekommenderas, de två sistnämnda bestämmelserna bidrar också till att minimera blekning och toxicitet).
- För att välja ett område av intresse att spåra, aktivera den fluorescerande ljuskällan (traditionellt en kvicksilverlampa) och välj lämplig fluorescens filtret (Välj filtret för gröna fluorophores för visning av FITC-dextran). När regionen av intresse är i fokus och är mitt i synfältet, inaktivera ljuskällan för att undvika foto-blekning och toxicitet.
- Avbildning av exocytos.
- Bildceller för önskad varaktighet, beroende på vilken typ av cell eller insulinsekretagog. I RBL celler utlöses med IgE/Ag, inträffar de flesta exocytic händelser inom 15-20 min för aktivering.
- För aktivering av cellerna, lägga till 16 µL från 20 x insulinsekretagog lösning till kammaren.
- Bekräftar FITC-dextran närvaro i cellerna.
- För att bekräfta närvaro och lokalisering av FITC-dextran till SGs, tillsätt 16 µL ammoniumkloridlösning (vara noga med att inte flytta i kammaren för att inte förlora fokus) i kammaren försiktigt (detta kommer att göra en slutlig koncentration på 20 mM). Detta kommer att framkalla alkalization av SGs och dequenching av FITC fluorescens, som kommer att inträffa inom några sekunder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1a representerar schematiskt hur FITC-dextran kan fungera som en reporter för reglerad exocytos och sammanfatta de olika lägena av exocytic händelser. Först, cellerna inkuberas med FITC-dextran, som är internaliserad av pinocytosis och sorteras till SGs. Eftersom SGs av MCs är LROs, deras låga pH dämpar fluorescensen FITC visas här som svart granulat (A-C, jag). När celler utlöses av en insulinsekretagog och SGs säkringen med plasmamembranet, bildas en fusion por, så att utflödet av protoner och alkalization av SGs. Som en följd återfår FITC dess fluorescens (A, II). Full exocytos kommer att manifesteras i en kort (mindre än 5 s) fluorescerande händelse som exteriorized SGS membran kollapsar helt in i plasmamembranet och FITC-dextran diffunderar bort i odlingssubstratet (A, III). Under en kiss-och-kör exocytic händelse, SGS membran endast övergående säkringar med plasmamembranet, vilket resulterar i en kortlivad fusion por och därför endast en kort utbrott av fluorescens som SG snabbt lossnar och dess lumen snabbt åter försurar (B, III - IV). Slutligen under förening exocytos, en serie av SGs sekventiellt säkring med varandra (följande SG fusion) samt med plasmamembranet, med underhåll av en öppen fusion pore. Som ett resultat, är en mycket större massa FITC-dextran dequenched, vilket resulterar i en stor och långlivad fluorescens-burst (C, III-IV) som sönderfaller när sonden diffunderar in i externa mediet (C, V).
Vi har använt denna modell och bekräftade dess förutsägelser av imaging kontroll celler och celler som är utfiskade av Rab5, som vi har visat sig vara avgörande för homotypic SG-SG fusion69 och sammansatta exocytos33. Genom att ange förvärv tid en bild var 15 s, vi förväntas upptäcka mestadels kontinuerlig händelser av sekretion, dvs sammansatta exocytos. Indeed, som visas i figur 1B, våra data visar att medan kontroll celler många stora och långvariga exocytic händelser kunde registreras, endast några händelser registrerades i Rab5 knockdown celler (shRab5). Händelser som spelades i shRab5 celler var dessutom betydligt mindre i storlek jämfört med händelser som registreras i kontroll cellerna. Notera förblir den sekretoriska kapaciteten av shRab5 celler oförändrat under den samma villkor69, vilket tyder på att medan shRab5 hämmar sammansatta exocytos, det inte avskaffar sekretion. Därför tillåter imaging FITC-dextran fluorescens under långa tidsintervaller för specifik detektion av sammansatta exocytos. Dessutom tillåter imaging FITC-dextran release fånga sammansatta exocytos sekventiella karaktär. Som indikeras av pilen i figur 1b, efter en blixt av ljus, börjar en andra blixt som en svag blixt som angränsar till den första. Detta kan utläsas som fusion av en SG med en SG som redan håller på att fusion med plasmamembranet (dvs, sekventiell exocytos). Därmed, som det andra granulat säkringar med den första granule som redan är ansluten till plasmamembranet av en fusion por, pH-värdet i det andra granulat ökar också och FITC fluorescens dequenches, vilket ger en andra explosion av fluorescens. Ett sådant scenario av FITC-dextran release under sekventiell fusion av intilliggande SGs presenteras i figur 1 c.
Ett annat exempel av sekventiell sammansmältning av SGs under förening exocytos är visas i figur 2. RBL celler var samtidig transfekterade med en konstitutivt aktiv (CA) form av Rab5a och WT SNAPIN-23, villkor under vilka sammansatta exocytos blir mer robust33. Avbildning av de CA Rab5a, vilket är viktigt för SG-SG fusion och är beläggning stora SGs33,69, tillsammans med FITC-dextran, tillåter bättre visualisering av fusion av en mindre granule med en större CA-Rab5a inredda granule.
Eftersom FITC-dextran är släckas när lagras inuti SG, är det nödvändigt att genomföra en teknik för att verifiera att FITC-dextran är verkligen närvarande i SGs. Detta blir ännu viktigare när Förformning ett experiment under förhållanden som förväntas att avskaffa sekretion. För att övervinna detta hinder, har 20 mM ammoniumklorid lagts till i kammaren i slutet av varje experiment. Denna behandling höjer pH-värdet inuti SGs, möjliggör FITC fluorescens. Som visas i figur 3, efter tillägg av ammoniumklorid till media, FITC dextran blir synlig och co är lokaliserad med mRFP-taggade neuropeptid Y, som är en SG reporter i RBL celler70.
Figur 1: specifik detektion av sammansatta exocytos. (a) ett diagram som beskriver hur förändringar i FITC-dextran fluorescens sammanfatta de olika transportsätten reglerade exocytos. (b) Live cell avbildning av FITC-dextran i RBL celler transfekterade med NPY-mRFP och antingen pSilencer eller shRab5, som anges. Transfection utfördes som tidigare beskrivits67,70. Kort, 1,5 x 107 RBL celler var resuspended i transfection buffert (DMEM kompletteras med 20 mM K-Pipes pH 7, 10 µM Ca2 + acetat, 2 mM Mg2 + acetat, 128 mM kalium glutamat) som innehåller 15 µg NPY-mRFP och antingen 30 µg pSilencer eller 15 µg av shRab5A, och 15 µg shRab5B/C. Transfection uppnåddes genom elektroporation på 300 V och en 20 MS puls längd. Cellerna var omedelbart replated i odlingsmedium innehållande 1 mg/mL FITC-dextran. Efter 24 h, var celler sensibiliserats med 1 µg/mL av IgE och inkuberas i ytterligare 24 h. Cellerna var sedan tvättat tre gånger i full Tyrodes buffert och aktiveras av 50 ng/mL DNP-HSA (Ag). Cellerna var visualiserat av time-lapse fluorescensmikroskopi. Den vita pilen i pSilencer bilder till en explosion av FITC fluorescens och den vita cirkeln markerar ett urladdat SG. Den vita pilen i shRab5A/B/C bilder anger minuten fluorescerande händelser som inträffar i Rab5-knockdown celler, kan vara vägledande för full exocytos. Notera ökades intensiteten i den ShRab5 bilden för att möjliggöra upptäckt av signalen. Bilder förvärvades av confocal Mikroskop utrustat med en uppvärmd kammare (37 ° C) och CO2 -styrenhet (4,8%) och ett C-Apochromat x63/1.2 W Corr mål, under öppen pinhole inställning. För de fulla filmerna, se Klein et al. 33 (c) en schematisk bild av homotypic SG fusionsprocessen visas i (b). I detalj, som första SG säkringar med plasmamembranet och upprättar en fusion por, börjar det att alkalize medan släppa innehållet FITC-dextran. Således, när en andra SG säkringar med den första på ett sekventiellt sätt, fluorescensen av den första SG bleknar på grund av lanseringen av FITC-dextran. Dock Alkaliserar andra SG, vilket resulterar i en FITC-blixt som visas intill första SG. Denna siffra var anpassad från Klein et al. 33 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Dual imaging mStr-CA-Rab5 och FITC-dextran. RBL celler var samtidig transfekterade med 20 µg HA-wt-SNAP23 och 10 µg av mStr-CA Rab5A. Cellerna var pre inkuberas med FITC-dextran och IgE och utlöses med Ag som beskrivs i figur 1. (a) en serie bilder fånga en fusion händelse mellan ett seghärdat SG (vit pil) och en SG som redan har smält med plasmamembranet och därför är fluorescerande. På 15,8 minuter, har kylda SG smält med dess angränsande SG och börjat få fluorescens. Boxed områdena är förstorade längst ner till vänster i varje tidpunkt. (b) Presentation av både mSTR-CA Rab5A (i rött) och FITC-dextran (i grönt) från motsvarande punkter visas i a, visar fusion mellan de två SGs. bilder förvärvades av konfokalmikroskopi (öppna hål) med en Plan-apochromat x63-NA 1.4 mål. Denna siffra var anpassad från Klein et al. 33 för hela filmen, se Klein et al. 33 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dual imaging NPY-mRFP och FITC-dextran under alkalization i SG av NH4Cl. RBL celler var transfekterade med shRab5, pre inkuberas med FITC-dextran och IgE och utlöses med Ag, som beskrivs i figur 1. (a) celler var visualiserat av time-lapse fluorescensmikroskopi. Designerat gånger i bilderna är minuter efter utlösande med Ag. Bilder förvärvades av konfokalmikroskopi använder en Plan-apochromat x63-NA 1.4 mål. (b) kvantitativ analys av experimentet visas i a. Varje rad i diagrammen är den genomsnittliga fluorescensen av FITC på ett område av intresse (ROI) över en enda cell. Pilen pekar till tiden för NH4Cl (20 mM) tillägg. Barer = 5 µm. Denna siffra var anpassad från Klein et al. 33 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi hur spårning fluorescensen av FITC-dextran laddade i SGs kan användas för att specifikt fånga sammansatta exocytos händelser. Detta uppnåddes genom att ange mikroskopet till förvärva en bild var 15 sekunder, vilket säkerställer att endast långvarig händelser registreras över tid och därför exklusive kort händelser som skulle motsvara full exocytos eller kiss-och-kör exocytos. För att införa metoden, visade vi att Nedslagning av den Rab5-isoformer som uttrycks i RBL celler, och är avgörande för sammansatta exocytos, eliminerar möjligheten att fånga händelser av FITC-dextran release, medan totala utsöndringen av cellen inte påverkas.
Den mest framträdande nackdelen med metoden är att det endast gäller för celler som innehåller sura SGs. Den mest framträdande fördelen med metoden är dock att det är baserat på enkla inkubation av cellerna med FITC-dextran, utan att kräva transfection. Andra pH-känsliga reportrar som används för att studera reglerade exocytos och involvera SG last eller SG membran protein-smält till phlourin, en pH-känsliga GFP variant (till exempel NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin och synapto-phluorin48, 49,50,51,52), kan mer nära representera endogena sammansättningen av SGs. Deras användning medför dock transfection av cellerna, vilket kan vara mindre lämplig för celler som är svåra att transfect. Därför, när studerar celler som är svåra att transfect eller under experimentella förhållanden som kräver flera genetiska manipulationer, användningen av en förening som enkelt kan kompletteras i cellodlingsmedium, såsom FITC-dextran, är fördelaktiga. Våra protokoll kan kräva cell specifika justeringar för skillnader i kinetik av exocytos av annan cell typer68. Därför bör valt tidsintervall för bild förvärv optimeras. För RBL celler har vi set-up i Mikroskop för att fånga en ny bild varje 15 sekunder, vilket i IgE/Ag utlöste RBL celler tillät oss att visualisera endast långvarig händelser, vilket innebär att den exklusiva spårningen av sammansatta exocytos händelser.
En annan faktor som måste beaktas är typ av dextran används. Det finns en mängd dextrans som varierar i deras molekylvikter. Det är därför viktigt att välja den lämpliga dextran som reporter, med hänsyn till de potentiella effekterna som olika dextrans kan ha på celler. Låg molekylvikt dextrans har till exempel visat att aktivera MCs och framkalla utsöndring71,72,73,74. Därför, lågmolekylära dextrans inte skulle vara lämpligt reportrar för MC sekretion. Skillnader i cellsreaktivitet mot dextrans noterades också i olika råtta stammar75eller under olika co-stimulatory villkor71,76,77,78. Här har vi valt att använda en 150 K FITC-dextran som tidigare har studerats i RBL cell linje och visat sig vara ineffektivt för att framkalla utsöndring18,79.
Ljuskällan ska väljas är också avgörande för protokollet. När du använder en confocal Mikroskop, är ljuskällan traditionellt laser-baserad. Således, för att undvika toxicitet, det är absolut nödvändigt att välja en låg lasereffekt. Den önskade lasereffekten skiljer sig mellan Mikroskop, beroende på typ och ålder av laser. Dessutom är den önskade lasereffekten också beroende på vilken typ av detektor används. Till exempel när du använder en gemensam detektor som en fotomultiplikatorn röret-baserade detektor, kommer en högre makt laser att behövas än när du använder en modern hybrid detektor (såsom ett fotomultiplikatorn röret och en lavin foto-dioder hybrid detektor). Vi rekommenderar att den lägsta lasereffekten som möjligt och högst 10% av lasereffekten.
Sammanfattningsvis laddas övervakning av dequenching av SG FITC-dextran av time Lapse-mikroskopi under noga utvalda inställningar tillät oss att enbart fånga sammansatta exocytos i RBL MCs, kraftigt underlätta identifiering av de molekylära enheterna som reglera denna process. Denna metod kan justeras ytterligare för att skilja från kiss-och-kör exocytos genom att minska och noggrant kalibrera tidsintervallet mellan bild förvärv att tillåta skillnaden av den kortlivade blinkar är associerad med kiss-och-kör exocytos från den ännu kortare blinkar som åtföljer full exocytos. Sådana villkor skulle fånga både förening och kiss-och-kör exocytos som sedan kunde urskiljas baserat på varaktigheten av signalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen
Acknowledgments
Vi tackar Dr. U. Ashery för den generösa gåvan av cDNA. Vi tackar Drs. G. massa, L. Mittleman, M. Shaharbani och Y.Zilberstein från Sackler Cellular & Molecular Imaging Center för deras ovärderliga hjälp med mikroskopi. Detta arbete stöds av USA och Israel binationella Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel och S.J.Galli) och bevilja 933/15 från Israel Science Foundation, grundad av den Israel Academy for Sciences (till R.Sagi-Eisenberg ) och NIH grants U19 AI 104209 och R01 AR067145 (att S.J. Galli).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM low glucose | Biological Inductries | 01-050-1A | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12657 | |
| Pen-strep-nystatin solution | Biological Inductries | 03-032-1B | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Biological Inductries | 03-020-1A | |
| FITC dextran 150K | Sigma-Aldrich | 46946-500MG-F | |
| Trypsin/EDTA Solution B | Biological Inductries | 03-052-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size | Sartorius | 16534K | |
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-HSA (Ag) | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid direct light exposure |
| Hepes buffer 1M, pH 7.4 | Biological Inductries | 03-025-1B | |
| CaCl2 | MERK | 102382 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Ammonium chloride | MERK | 1145 | |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| NaH2PO4 | MERK | 6346 | |
| NaCl | MERK | 106404 | |
| MgCl2 | MERK | 105833 | |
| KCl | MERK | 104936 | |
| Electroporator | BTX | ECM830 | |
| Confocal microscope, Zeiss | Zeiss | LSM 5 Pascal, Axiovert 200M | Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator |
| Confocal microscope, Zeiss | Zeiss | LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 | Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator |
| Confocal microscope, Leica | Leica | SP5 | Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab) |
| RBL-2H3 cells | RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67 |
References
- Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
- Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
- Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
- Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
- Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
- Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
- Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
- Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
- Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
- Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
- Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
- Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
- Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
- Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
- Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
- Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
- Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
- Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
- Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
- Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
- Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
- Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
- Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
- Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
- Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
- Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
- Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
- Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
- Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
- Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
- Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
- Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
- Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
- Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
- Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
- Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
- Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
- Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
- Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
- Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
- Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
- Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
- Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
- Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
- Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
- Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
- Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
- Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
- Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
- Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
- Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
- Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
- Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
- Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
- Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
- Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
- Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
- Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
- Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
- Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).
