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Biology

L’imagerie FITC-dextran comme Reporter pour l’exocytose régulée

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Ici nous détailler une méthode d’imagerie de cellules vivantes d’exocytose régulée. Cette méthode utilise la FITC-dextran, qui s’accumule dans les organites liés lysosome, comme journaliste. Cette méthode simple permet également de faire la distinction entre les différents modes d’exocytose régulée dans les cellules qui sont difficiles à manipuler génétiquement.

Abstract

Exocytose régulée est un processus par lequel cargo, qui est stocké dans des granules sécrétoires (SGs), est libéré en réponse à un déclencheur sécrétoire. Exocytose régulée est fondamentale pour la communication intercellulaire et est un mécanisme essentiel pour la sécrétion de neurotransmetteurs, hormones, médiateurs de l’inflammation et d’autres composés, par une variété de cellules. Au moins trois mécanismes distincts sont connus pour l’exocytose régulée : exocytose complet, où un seul SG entièrement fusionne avec la membrane plasmique, exocytose kiss-and-run, où un seul SG transitoirement fusionne avec la membrane plasmique, et composé exocytose, où plusieurs GV se fusible entre eux, avant ou après la fusion de SG avec la membrane plasmique. Le type d’exocytose régulée par une cellule est souvent dicté par le type de déclencheur sécrétoire. Toutefois, dans de nombreuses cellules, un seul déclencheur sécrétoire peut activer plusieurs modes d’exocytose régulée en même temps. Malgré leur abondance et leur importance à travers les espèces et les types de cellules, les mécanismes qui déterminent les différents modes de sécrétion sont en grande partie irrésolues. Un des défis principaux dans les enquêtes sur les différents modes d’exocytose régulée, est la difficulté de distinguer entre eux ainsi que d’explorer leur séparément. Nous décrivons ici l’utilisation de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran comme un reporter de l’exocytose et direct imagerie cellulaire, afin de différencier les différentes voies d’exocytose régulée, en se concentrant sur l’exocytose composé, basé sur la robustesse et durée des événements exocytiques.

Introduction

Exocytose régulée est le principal mécanisme par lequel facilement fait fret est libéré d’une cellule sécrétrice en réponse à un déclencheur spécifique. La cargaison est préformée et séquestrée dans des vésicules sécrétoires, dans lequel elle est stockée jusqu'à ce qu’un déclencheur relaie le signal pour la libération du contenu les cas suivants. Différents types de signaux peuvent entraîner dans des modes différents d’exocytose régulée ou modes d’exocytose régulée peuvent se produire simultanément. Trois modes principaux d’exocytose réglementé sont connus : exocytose complet, ce qui implique une fusion complète d’un seul granule sécrétoire avec la membrane plasmique ; Kiss-and-run exocytose, qui implique la fusion transitoire du granule sécrétion avec la membrane plasmique, suivie de ses activités de recyclage ; et exocytose composé, qui se caractérise par la fusion homotypique de plusieurs GV avant (c'est-à-dire, multigranulaire exocytose) ou séquentielle (c.-à-d., exocytose séquentielle) à la fusion avec la membrane plasmique1. Exocytose composé est considéré comme le plus vaste mode de fret release2, car elle permet la sécrétion rapide du fret, y compris celle de SGs qui situent trouvent distale de la membrane plasmique. Exocytose composé a été documenté dans les deux cellules exocrines et endocrines3,4,5,6,7,8,9, ainsi que dans cellules immunitaires. Dans les cellules immunitaires, telles que les éosinophiles10,11,12 et neutrophiles13, composé exocytose permet la libération rapide et robuste de médiateurs qui sont nécessaires pour tuer les pathogènes envahisseurs tels que bactéries ou parasites. Mastocytes (MCs) déployer l’exocytose composé la libération efficace de médiateurs inflammatoires pré-enregistrée au cours des réactions immunitaires innées, anaphylaxie et autres réactions allergiques14,15,16 , 17. étant donné que les différents modes d’exocytose peuvent se produire simultanément à18,19, il est devenu un défi pour distinguer entre eux en temps réel ou pour identifier leurs mécanismes de fusion respectifs, donc élucider leurs mécanismes sous-jacents.

Nous présentons ici une méthode basée sur des cellules vivantes imagerie de cellules chargées de FITC-dextran, qui permet le suivi en temps réel des événements de sécrétion et faire la distinction entre leurs différents modes. En particulier, notre méthode permet la surveillance exclusive d’exocytose composé.

FITC-dextran est un conjugé du fluorophore sensibles au pH FITC avec le dextran de polysaccharide glucan. Dextranes fluorescent étiquetés ont démontré d’entrer dans la cellule de micropinocytose20,21 et macropinocytose22,23. Compartiments endocytose à maturité dans les lysosomes, il a été démontré que la FITC-dextran s’accumule dans les lysosomes avec aucune dégradation apparente. Cependant, puisque FITC est un fluorophore hautement sensibles au pH24, et la lumière du lysosome est acide, fluorescence FITC-dextran étanche en arrivant le lysosome24. Ainsi, établissant des dextranes dans le lysosome ciblées de cargaison, conjugué à la sensibilité de pH du FITC, ont jeté les bases pour l’utilisation du FITC-dextran dans les études du lysosome exocytose25,26,27 , 28 , 29.

Dans plusieurs types de cellules, y compris les MCs, neutrophiles, les éosinophiles, les cellules T cytotoxiques, mélanosomes et autres, la SGs lysosomales caractéristiques d’affichage et sont qualifiée d’organites liés lysosome (BEI) ou sécrétoire lysosomes30,31 . Étant donné que la BEI ont un pH acide luminal, FITC-dextran peut servir à visualiser leur exocytose, suite à des pH plus élevés lié à l’extériorisation de la BEI. En effet, FITC-dextran a été utilisé pour surveiller l’exocytose dans MCs18,32,33. Dans cette méthode, FITC-dextran est ajoutée à la culture cellulaire, capté par les cellules par pinocytose et trié dans la SGs. Comme il est dans les lysosomes, fluorescence FITC est trempé dans la SGs quand ils sont dans la cellule. Toutefois, à la fusion de SG avec la membrane plasmique et l’exposition qui en résulte dans le milieu externe, le FITC-dextran regagne sa fluorescence SG pH montante, permettant le suivi simple des événements de sécrétion par microscopie des cellules vivantes. Ici, nous avons ajusté cette méthode pour activer le suivi unique d’exocytose composé.

Deux autres méthodes ont servi auparavant pour suivre l’exocytose composé. La microscopie électronique a été la première méthode pour caractériser les structures de sécrétion qui suggèrent la présence de différents modes d’exocytose. En particulier, observations de « tunnels sécrétoires » dans les cellules acineuses du pancréas34 et MCs35,36,37 a donné lieu à l’hypothèse d’exocytose composé. Cependant, alors que la haute résolution de la microscopie électronique a le pouvoir de révéler les vésicules fusionnées, il ne peut pas suivre la dynamique de leur fusion et par conséquent impossible de définir si elles correspondent à la fusion de SG au cours de l’exocytose composé ou fusion de granules récupérés suite à leur endocytose. Cet obstacle est surmonté dans d’autres méthodes permettant de mesurer l’exocytose dans les cellules vivantes, telles que les mesures de pince de patch de la membrane plasmique capacité11,13,,du3839 ou ampérométrie 40 des médias. Cependant, serrage patch requiert une configuration particulière et peut ne pas convenir pour tous les types de cellules. Ampérométrie mensurations sont en mesure de suivre l’exocytose uniquement si la cargaison est libérée à proximité de l’électrode. Par conséquent, à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes vous propose un avantage par rapport à ces méthodes, car il permet non seulement de suivi en temps réel d’exocytose, mais il permet également l’acquisition rapide et simple des données de la cellule entière.

Le suivi du FITC-dextran par microscopie des cellules vivantes offre également certains avantages aux autres cellules vivantes méthodes basées sur l’imagerie. Par exemple, une méthode largement utilisée est la microscopie de fluorescence de réflexion totale interne (TIRFM) des cellules chargées avec une sonde fluorescente de SG ou exprimant un fluorescent protéine-tag SG fret ou membrane protéines26,41, 42 , 43. la force de cette méthode réside dans sa capacité à surveiller uniquement les événements qui se produisent à proximité de la membrane plasmique (ci-après dénommée "empreinte"), d'où des événements de sécrétion. Cependant, c’est aussi l’inconvénient de cette méthode, car seule la fraction cellulaire qui est à côté de la lamelle et à proximité de la lentille du microscope peut être imagé44. Si ces empreintes représentent en effet la surface de la membrane de la cellule entière est encore discutable45,46,47. À cet égard, à l’aide d’un colorant sensibles au pH comme FITC-dextran et un microscope à fluorescence standard ou un microscope confocal avec un sténopé ouvert permet l’imagerie de la cellule entière, capturant ainsi les sécrétion total événements qui se produisent dans cette cellule.

Les journalistes sensibles au pH supplémentaires qui sont utilisés pour étudier l’exocytose régulée par imagerie de cellules entières ou TIRFM incluent fret SG ou protéine de membrane de SG Fondue à phlourin, une variante GFP sensibles au pH. Citons NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin et synapto-phluorin48,49,50,51,52. Alors que l’expression de ces sondes peut-être représenter de plus près la composition endogène de la SGs, il implique la transfection des cellules et donc peut être moins approprié pour les cellules qui sont difficiles à transfecter. Par conséquent, quand étudiant les cellules qui sont difficiles à transfecter ou dans des conditions expérimentales qui nécessitent plusieurs manipulations génomiques, l’utilisation d’un composé qui peut être simplement complété dans le milieu de culture cellulaire, comme FITC-dextran, est avantageuse . FITC-dextran offre également un avantage par rapport à l’acridine orange (AO), un autre colorant pH sensible qui a été utilisé pour le suivi de l’exocytose de cellules vivantes microscopie53,,du5455,56 , 57 , 58. AO a été montré pour induire la photolyse des vésicules que résultat en fausses flashs, qui ne correspondent pas à la sécrétion réelle des processus27. En revanche, FITC-dextran reflète mieux événements de sécrétion, probablement en raison de sa faible production photoinduit oxygénées27.

Une autre approche pour l’étude de l’exocytose est notamment par l’afflux d’un colorant, du milieu externe dans le SG par le pore de fusion qui s’ouvre au cours de ce processus de suivi. Dans ce cas, le colorant est ajouté au milieu externe aux côtés de la gâchette sécrétoire. Puis, lorsque le pore de fusion s’ouvre, le colorant diffuse dans le SG59,60. Un net avantage de cette méthode est qu’elle offre également la possibilité d’estimer la taille de pore de fusion, par l’utilisation de colorants, de taille variable. Par exemple, dextrans de différents poids moléculaires (MW), conjugué à des fluorophores différents, peuvent être utilisés comme colorants extracellulaires selon laquelle la taille maximale du dextran qui peut pénétrer la SG correspond à la taille des pores fusion59, 61 , 62 , 63 , 64. en outre, cette approche ne nécessite pas l’utilisation d’une sonde de pH-sensibles. Cependant, un inconvénient majeur est que le rapport signal sur bruit est très faible, puisqu’une grande quantité de colorant est présente dans les médias lors de l’acquisition d’images, ayant pour résultat de fond élevé.

Dans l’ensemble, l’utilisation du FITC-dextran comme marqueur pour l’exocytose surmonte plusieurs inconvénients des méthodes rapportées antérieurement, comme signal/bruit ratio, toxicité, suivi dynamique et complexité.

Nous décrivons ici l’utilisation de FITC-dextran pour surveiller l’exocytose composé dans la ligne de 3 cellules de mât RBL - 2H (ci-après dénommée RBL, principalement établie par Eccleston et al. 65 et encore cloné par Barsumian et al. ( 66), en réponse à immunoglobuline E (IgE) / activation de l’antigène (Ag).

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Protocol

1. les préparatifs

  1. Préparation des milieux de culture RBL
    1. Mélanger 500 mL de glucose bas Dulbecco aigle modifié (DMEM) avec 56 mL de sérum fœtal (SVF), 5,5 mL de solution de pénicilline-streptomycine-nystatine, 5,5 mL de solution de L-Glutamine 200 mM. Il en résulte une glycémie basse DMEM additionné de 10 % FBS, 100 µg/mL de streptomycine, 100 unités/mL de pénicilline, la nystatine 12 unités/mL et 2 mM de L-glutamine.
    2. Filtrer les médias en utilisant un filtre de haut-vide de 0,22 µm taille de pore et magasin à 4 ° C.
  2. Entretien des cellules de la RBL.
    1. La croissance de cellules RBL à une confluence maximale de 90 % dans un plat de 10 cm. Si la culture cellulaire est sain, les cellules doivent présenter une forme de broche avec saillies occasionnelles.
    2. Pour cellule de fractionnement, détacher les cellules du plat en aspirant les médias et en remplaçant avec 2 mL de solution de trypsine/EDTA B. Incuber pendant 5-10 minutes dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 à 37 ° C.
    3. Une fois que les cellules ont détaché, neutraliser la trypsine en ajoutant 2 mL de milieu de culture, à l’aide d’une pipette et fractionner les cellules dans un 1:2-1:10 ratio.
  3. Préparation de 20 x tampon Tyrode
    1. Préparation d’un stock de 20 x solution de KCl à 54 mM, 20 mM MgCl2, 2,74 M de NaCl et 8 mM NaH2PO4 dans l’eau bidistillée (DDW). Bien mélanger et conserver à 4 ° C.

2. culture de cellules RBL pour microscopie des cellules vivantes

  1. Préparation de la solution FITC-dextran.
    1. Mélanger 1 mg de poudre de FITC-dextran (150 K) pour 1 mL de milieu de culture (voir étape 1.1.1). Pour une pleine lamelle compartimentée, préparation de 3 mL.
    2. À l’aide d’une unité de filtre de seringue acétate de cellulose avec 0,22 µm taille de pore, filtrer le FITC-dextran dissous.
    3. Ajouter souris IgE à une concentration de 1 µg/mL.
  2. Ensemencement des cellules RBL pour l’imagerie
    1. La veille de l’imagerie, aspirer les médias de la boîte de Petri et remplacez par 2 mL de solution de trypsine/EDTA B. Incuber pendant 5-10 minutes dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 à 37 ° C. Une fois que les cellules ont détaché, neutraliser la trypsine en ajoutant 2 mL de milieu de culture.
    2. RBL Count cellules utilisant un hémocytomètre et régler le volume en conséquence avec des milieux de culture pour obtenir une concentration de cellules de 7,5 x 105/ml.
    3. Ajouter 10 µL de suspension cellulaire à une lamelle compartimentée pré-remplie avec frais FITC-dextran complétée des milieux de culture (il en résulte l’ensemencement de 7,5 x 103 cellules dans une chambre).
    4. La croissance de cellules RBL du jour au lendemain dans une ambiance humifiée de 5 % de CO2 à 37 ° C. Les cellules devraient rester à un niveau infra confluent afin de s’assurer que les cellules sont séparées et qu’il est facile d’identifier chaque cellule individuellement sous le microscope.
  3. Transfection des cellules RBL - facultatifs.
    1. Pour l’imagerie des événements de sécrétion en combinaison avec d’autres protéines fluorescent étiquetés, voir protocole de transfection pour les cellules RBL Azouz et al. 67

3. vivre la microscopie des cellules d’exocytose

  1. Préparation de solutions :
    1. Préparer la solution tampon une finale Tyrode par dilution de la solution mère dans DDW dans un 01:20 supplément avec 20 millimètres Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL de BSA et 5,6 mM de glucose et dilution.
    2. Fraîchement préparer un réactif de sécrétagogue 20 x dans un tampon de Tyrode [1 µg/mL dinitrophényl conjugué à l’albumine sérique humaine (DNP-a (Ag)) dans notre cas, pour une concentration de 1 x 50 ng/mL].
    3. Préparer une solution de chlorure d’ammonium de 400 mM en dissolvant la poudre dans un tampon de Tyrode.
  2. Préparation des cellules.
    1. Lavez la lamelle compartimentée 3 fois en aspirant les médias de la chambre et il recharge avec 300 µL de tampon de Tyrode, préchauffé à 37 ° C. Enfin, reconstituer la chambre avec 300 µL de tampon de Tyrode, préchauffé à 37 ° C.
    2. Placer la lamelle compartimentée en chambre incubateur du microscope. S’assurer que la chambre soit stable.
  3. Mise en place du microscope
    1. Pour choisir une région intéressante à suivre, allumez la source de lumière fluorescente (traditionnellement une lampe de mercure) et choisissez le filtre approprié de fluorescence (choisir le filtre pour les fluorophores vertes pour la visualisation FITC-dextran). Une fois que la zone concernée est mise au point et se trouve au milieu du champ de vision, éteignez la source de lumière afin d’éviter le blanchiment photo et la toxicité.
      Remarque : Certains de la FITC-dextran incorporé dans les cellules peuvent conserver la fluorescence. C’est parce que le FITC-dextran peut-être aussi être trié aux compartiments non-lysosomale telles qu’endosomes.
    2. Allumez l’éclairage approprié pour l’excitation de la FITC. Si vous utilisez un microscope utilisant le laser, allumer le laser à 488 nm. Des émissions doivent être réunis autour 500-550 nm (pics d’émission FITC à 510-520 nm).
    3. Lorsque vous utilisez un microscope confocal, ouvrir le trou d’épingle au maximum. Cela permettra à l’aide de toxicité et plus faible puissance du laser pour éviter la décoloration et assurera la capture des événements de l’exocytose de tous les avions de la cellule.
    4. Calibrer l’intervalle de temps entre l’acquisition de l’image.
      1. Différentes cellules peuvent varier dans leur cinétique d’exocytose régulée68. Pour l’imagerie spécifique d’exocytose composé, nous recommandons un intervalle d’au moins 5 secondes. Toutefois, en règle générale, pour permettre une imagerie rapide, assurez-vous que le temps d’acquisition d’une seule image est rapide.
      2. Lorsque vous utilisez un microscope confocal à balayage laser, affectez le sens de balayage bi-directionelle, ne pas permettre pour établir la moyenne et mis une résolution à 512 x 512 (recommandé ; ces dernières deux dispositions contribuera également à réduire au minimum le blanchissement et toxicité).
  4. Imagerie d’exocytose.
    1. Cellules d’image pour la durée désirée, selon le type de cellule ou sécrétagogue. Dans les cellules RBL déclenchées avec IgE/Ag, la plupart des événements de sécrétion se produisent dans 15-20 min d’activation.
    2. Pour l’activation des cellules, ajouter 16 µL du 20 x solution sécrétagogue à la chambre.
  5. Confirmant la présence de FITC-dextran dans les cellules.
    1. Pour confirmer la présence et la localisation du FITC-dextran de la SGs, ajouter 16 µL de solution de chlorure d’ammonium (prenez garde à déplacer la chambre pour ne pas perdre le focus) à la chambre doucement (cela rendra une concentration finale de 20 mM). Cela induira alcalinisation de la SGs et dequenching de fluorescence FITC, qui se dérouleront dans les secondes.

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Representative Results

Figure 1 a représente schématiquement comment FITC-dextran peut agir comme reporter pour régies exocytose et récapituler les différents modes d’événements exocytiques. Tout d’abord, les cellules sont incubées avec FITC-dextran, qui est internalisé par pinocytose et triée à la GV. Étant donné que le SGs de MCs sont LROs, leur faible pH amortit la fluorescence du FITC, présenté ici en noir granules (A-C, I). Lorsque les cellules sont déclenchés par un sécrétagogue et le fusible de SGs avec la membrane plasmique, un pore de fusion est formé, ce qui permet de l’efflux de protons et alcalinisation de la SGs. En conséquence, FITC regagne sa fluorescence (A, II). Exocytose complet se manifestera dans un court (moins de 5 s) fluorescent événement comme membrane de SG extériorisés s’effondre complètement dans la membrane plasmique et FITC-dextran se diffuse loin dans le milieu de culture (un, III). Lors d’un événement de kiss-and-run exocytiques, membrane de la SG seulement transitoirement fusionne avec la membrane plasmique, ayant pour résultat un pore de fusion éphémère et donc seulement une brève explosion de fluorescence comme le SG se détache rapidement et sa lumière rapidement re-acidifie (B, III - IV). Enfin, au cours de l’exocytose composé, une série de SGs fusible séquentiellement entre eux (suivant la fusion SG) ainsi qu’avec la membrane plasmique, avec maintien d’un pore de fusion ouvert. Ainsi, une masse beaucoup plus importante du FITC-dextran est dequenched, ce qui entraîne une explosion de grande et longue durée de vie de fluorescence (C, III-IV) qui se désintègre lorsque la sonde se diffuse dans le milieu externe (C, V).

Nous avons utilisé ce modèle et a confirmé ses prédictions par cellules de contrôle d’imagerie et les cellules sont vidés de Rab5, dont nous avons montré très importante pour homotypique de fusion SG-SG69 et exocytose composé de33. En définissant le temps d’acquisition d’une image toutes les 15 s, nous nous attendions à découvrir surtout continus événements de sécrétion, c'est-à-dire composé exocytose. En effet, comme le montre la figure 1 b, nos données montrent que tout en contrôle, cellules de nombreux événements de sécrétion importante et de longue durée pourrait être enregistré, seulement peu d’événements ont été enregistrés en défiant Rab5 cellules (shRab5). En outre, les événements qui ont été enregistrés dans les cellules shRab5 sont significativement plus petites en taille par rapport à des événements consignés dans les cellules du contrôle. À noter la capacité sécrétoire des cellules shRab5 reste inchangée sous les même conditions69, ce qui laisse supposer que shRab5 inhibe l’exocytose composé, il n’abolit pas la sécrétion. Par conséquent, d’imagerie par fluorescence de FITC-dextran à intervalles de temps longs permet une détection spécifique d’exocytose composé. En outre, d’imagerie FITC-dextran version permet capture la nature séquentielle d’exocytose composé. Comme il est indiqué par la flèche sur la Figure 1 b, suite à un éclair de lumière, un second flash commence comme un flash faible qui est adjacent à la première. Cela peut être déduit que la fusion d’une SG avec un SG qui est déjà dans le processus de fusion avec la membrane plasmique (c.-à-d., exocytose séquentiel). Par conséquent, comme le deuxième granule fusionne avec le premier granule qui est déjà connecté à la membrane plasmique par un pore de fusion, le pH du granule deuxième augmente aussi bien et fluorescence FITC dequenches, ce qui donne une deuxième rafale de fluorescence. Un tel scénario de libération FITC-dextran séquentielle fusion de SGs adjacents est présenté dans la Figure 1C.

Un autre exemple de fusion séquentielle du SGs au cours de l’exocytose composé est illustré à la Figure 2. Les cellules RBL sont conjointement transfectées avec une forme (CA) constitutivement active Rab5a et WT SNAP-23, les conditions en vertu de laquelle exocytose composé devient plus robuste33. Imagerie de la Rab5a de CA, ce qui est essentiel pour la fusion de SG-SG et enduit grand GV33,69, ainsi que de la FITC-dextran, permet la meilleure visualisation de la fusion d’un plus petit granule avec un plus grand granule de CA-Rab5a décorées.

Puisque FITC-dextran est éteint lorsqu’il est conservé à l’intérieur de la SG, il est nécessaire de mettre en œuvre une technique pour vérifier que le FITC-dextran est bien présente dans la SGs. Cela devient encore plus indispensable quand préformage une expérimentation dans des conditions qui devraient abolir la sécrétion. Pour surmonter cet obstacle, 20 mM de chlorure d’ammonium a été ajouté à la chambre à la fin de chaque expérience. Ce traitement augmente le pH à l’intérieur de la GV, permettant une fluorescence FITC. Comme le montre la Figure 3, après l’addition de chlorure d’ammonium dans les médias, dextran FITC devient visible et est localisée conjointement avec RDRF-tag neuropeptide Y, qui est journaliste de SG à RBL cellules70.

Figure 1
Figure 1 : détection spécifique des composés exocytose. (a) un diagramme décrivant comment les changements en fluorescence FITC-dextran récapitulent les différents modes d’exocytose régulée. (b) Live cell Qu'imaging de FITC-dextran dans les cellules RBL transfecté avec NPY-RDRF et pSilencer ou shRab5, comme il est indiqué. Transfection a été réalisée comme décrite précédemment67,70. En bref, 1,5 x 107 cellules RBL ont été resuspendu dans tampon transfection (DMEM additionné de 20 mM K-Pipes de pH 7, 10 µM Ca2 + acétate, 2 mM Mg2 + acétate, glutamate de potassium 128 mM) contenant 15 µg NPY-RDRF et soit 30 µg de pSilencer ou 15 µg de shRab5A et 15 µg de shRab5B/C. Transfection a été réalisée par électroporation à 300 V et d’une durée d’impulsion 20 mSec. Les cellules ont été replaquées immédiatement dans le milieu de culture contenant 1 mg/mL FITC-dextran. Après 24 h, les cellules étaient sensibilisés à 1 µg/mL d’IgE et incubés pendant plus de 24 h. Les cellules étaient ensuite lavés trois fois en mémoire tampon complète Tyrode et activées par 50 ng/mL de DNP-HSA (Ag). Les cellules ont été visualisées par microscopie de fluorescence Time-lapse. La flèche blanche dans les images pSilencer pointe vers un éclatement de la fluorescence de la FITC et le cercle blanc marque un SG déchargé. La flèche blanche dans les images de shRab5A/B/C indique les événements fluorescents minutes qui se produisent dans les cellules Rab5-knockdown, susceptibles d’être indicative d’exocytose complet. De note, l’intensité de l’image de ShRab5 a été augmentée pour permettre la détection du signal. Des images ont été acquises par un microscope confocal, équipé d’une chambre chauffée (37 ° C) et contrôleur de CO2 (4,8 %) et un objectif C-Apochromat x63/1.2 Corr W, réglage sténopé ouvert. Pour les films complets, voir Klein et al. 33 (c) un diagramme schématique du processus de fusion homotypique SG montré au point b. En détail, comme le premier SG fusionne avec la membrane plasmique et établit un pore de fusion, il commence à alcaliniser tout en libérant son contenu FITC-dextran. Ainsi, au moment où un deuxième SG fusionne avec la première de manière séquentielle, la fluorescence des premières fondus de SG en raison de la libération de FITC-dextran. Toutefois, le SG de la deuxième alkalizes, qui se traduit par un flash FITC qui apparaît adjacent à la première SG. Ce chiffre a été adapté de Klein et al. 33 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : imagerie double mStr-CA-Rab5 et FITC-dextran. Les cellules RBL sont conjointement transfectées avec 20 µg d’HA-wt-SNAP23 et 10 µg de mStr-CA Rab5A. Les cellules ont été préalablement incubées avec FITC-dextran et l’IgE et déclenchés avec Ag, tel que décrit à la Figure 1. (a) une série d’images capture d’un événement de fusion entre un SG trempé (flèche blanche) et un SG qui a déjà été fusionnée avec la membrane plasmique et est donc fluorescent. À 15,8 minutes, le SG trempé a fusionné avec ses voisine SG et commencé à gagner de fluorescence. Les zones en boîte sont agrandies en bas à gauche de chaque point dans le temps. (b) présentation de mSTR-CA Rab5A (en rouge) et FITC-dextran (en vert) depuis les points de temps correspondante indiquée à l’alinéa a, ce qui démontre la fusion entre les deux SGs. Images ont été acquises par microscopie confocale (trou d’épingle ouvert) à l’aide d’un Plan-apochromat x63-objectif 1.4 NA. Ce chiffre a été adapté de Klein et al. 33 pour le film complet, voir Klein et al. 33 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Imagerie double de NPY-RDRF et FITC-dextran au cours de l’alcalinisation du SG par NH4CL. RBL cellules ont été transfectées avec shRab5, préalablement incubées avec FITC-dextran et l’IgE et déclenchés avec Ag, tel que décrit à la Figure 1. (a) cellules ont été visualisées par microscopie de fluorescence Time-lapse. Désigné fois dans les images sont minutes après le déclenchement avec Ag. Des images ont été acquises par microscopie confocale à l’aide d’un Plan-apochromat x63-NA 1.4 objectif. (b) l’analyse Quantitative de l’expérience indiquée à l’alinéa a. Chaque ligne dans les graphiques est la fluorescence moyenne du FITC à une région d’intérêt (ROI) au cours d’une seule cellule. La flèche pointe vers le temps de NH4Cl (20 mM) addition. Barres = 5 µm. Ce chiffre a été adapté de Klein et al. 33 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ici, nous décrivons comment traçage la fluorescence du FITC-dextran chargé dans SGs peut être utilisée pour capturer spécifiquement les événements de l’exocytose composé. Ceci a été réalisé en affectant le microscope en vue d’acquérir une image toutes les 15 secondes, ce qui assure que seuls les événements de longue durée seront enregistrées au fil du temps et donc à l’exclusion de quelques événements qui correspondraient à l’exocytose complet ou l’exocytose kiss-and-run. Pour établir la méthode, nous avons montré cette précipitation des isoformes Rab5 qui sont exprimés dans les cellules RBL et jouent un rôle essentiel pour l’exocytose composé, élimine la possibilité de capturer les événements de la libération de FITC-dextran, tandis que la sécrétion globale par la cellule n’est pas affectée.

Le plus important inconvénient de la méthode est qu’elle s’applique uniquement aux cellules qui contiennent des acides SGs. Cependant, le plus important avantage de la méthode est qu’elle est fondée sur la simple incubation des cellules avec le FITC-dextran, sans nécessiter de transfection. Autres journalistes sensibles au pH qui servent à étudier l’exocytose régulée et impliquent la cargaison SG ou membrane SG protéine-fondue à phlourin, une variante GFP sensibles au pH (tels que NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin et synapto-phluorin48, 49,50,,du5152), peut-être plus étroitement représentent la composition endogène de la SGs. Cependant, leur usage entraîne la transfection des cellules, qui peut être moins approprié pour les cellules qui sont difficiles à transfecter. Par conséquent, quand étudiant les cellules qui sont difficiles à transfecter ou dans des conditions expérimentales qui nécessitent plusieurs manipulations génomiques, l’utilisation d’un composé qui peut être simplement complété dans le milieu de culture cellulaire, comme FITC-dextran, est avantageuse. Notre protocole peut nécessiter des ajustements spécifiques de cellules pour tenir compte des différences dans la cinétique de l’exocytose de cellules différents types68. Par conséquent, l’intervalle de temps choisi pour l’acquisition d’images doit être optimisé. Pour les cellules RBL, nous avons mise en place le microscope à capturer une nouvelle image toutes les 15 secondes, qui a déclenché les cellules RBL IgE/Ag nous a permis de visualiser uniquement les événements de longue durée, permettant ainsi le suivi exclusif des événements de l’exocytose composé.

Un autre facteur qui doit être pris en considération est le type de dextran à utiliser. Il existe une variété des dextrans qui varient dans leurs poids moléculaires. Par conséquent, il est important de choisir le dextran approprié comme reporter, en prenant en compte les effets potentiels de différents dextranes pourraient avoir sur les cellules. Par exemple, dextrans de faible poids moléculaire montrent pour activer MCs et induire la sécrétion71,72,,du7374. Par conséquent, dextrans de faible poids moléculaire ne serait pas appropriés reporters pour la sécrétion de MC. Différences de réactivité de la cellule vers dextranes ont également notées dans rat différentes souches75ou sous des conditions différentes de costimulation71,76,77,,78. Ici, nous avons choisi d’utiliser un 150 K FITC-dextran qui a précédemment été étudié dans la lignée de cellules RBL et avéré inefficace en induisant la sécrétion18,,79.

La source de lumière pour être sélectionné est également cruciale pour le protocole. Lorsque vous utilisez un microscope confocal, la source lumineuse est traditionnellement axée sur le laser. Ainsi, pour éviter une toxicité, il est impératif de choisir une laser faible puissance. La puissance du laser désiré diffère entre les microscopes, selon le type et l’âge du laser. En outre, la puissance du laser désirée est également dépendante du type de détecteur utilisé. Par exemple, lorsque vous utilisez un détecteur commun comme un détecteur d’en tube photomultiplicateur, un laser de puissance plus élevé est nécessaires que si vous utilisez un détecteur d’hybrides modernes (comme un tube photomultiplicateur et un détecteur d’hybride avalanche photo-diodes). Nous recommandons l’utilisation de la puissance du laser le plus bas possible et ne dépassant ne pas 10 % de la puissance du laser.

En résumé, suivi de la dequenching de SG chargé FITC-dextran par time que lapse-microscopie sous paramètres choisis avec soin nous a permis de capture exclusivement l’exocytose composé de RBL MCs, facilite grandement identification des entités moléculaires qui réguler ce processus. Cette méthode pourrait être plus ajustée pour distinguer plein d’exocytose kiss-and-run de réduire et soigneusement calibrer l’intervalle de temps entre l’acquisition d’image pour permettre la distinction des flashes de courte durée lié avec kiss-and-run exocytose de le clignote encore plus courte qui accompagnent l’exocytose complet. Ces conditions capturerait exocytose composé et kiss-and-run qui se distinguaient alors basée sur la durée du signal.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrente

Acknowledgments

Nous remercions le Dr U. Ashery pour le don généreux de cDNA. Nous remercions les Drs G. masse, L. Mittleman, M. Shaharbani et Y.Zilberstein de la Sackler Cellular & Molecular Imaging Center pour leur aide précieuse au microscope. Ce travail a été soutenu par la Fondation de sciences Binational États-Unis-Israël (subvention 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel et S.J.Galli) et accorde 933/15 de la Fondation Science Israël, fondé par l’Académie d’Israël pour les Sciences (pour R.Sagi-Eisenberg ) et subventions de NIH U19 AI 104209 et AR067145 R01 (à S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

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References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

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L’imagerie FITC-dextran comme Reporter pour l’exocytose régulée
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Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

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