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Biology

成像 FITC-葡聚糖作为胞吐作用调节的记者

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

在这里, 我们详细介绍了一种带电细胞成像的调节胞吐作用方法。该方法利用 FITC-葡聚糖, 在溶酶体相关细胞器中积累, 作为记者。这一简单的方法也允许区分不同模式的调节胞吐作用在细胞难以操纵基因。

Abstract

被调控的胞吐作用是一个过程, 其中储存在分泌颗粒 (SGs) 的货物是针对分泌扳机释放的。调节胞吐作用是细胞间沟通的基础, 是神经递质、激素、炎症介质和其他化合物分泌的关键机制, 由多种细胞引起。至少有三种不同的机制是已知的调节胞吐作用: 全胞吐作用, 其中一个单一的 sg 完全融合与等离子膜, 亲吻和运行胞吐作用, 其中一个单一的 sg 瞬态保险丝与等离子膜, 和复合胞吐作用, 其中在 SG 与等离子膜融合之前或之后的几个 SGs 保险丝。细胞所进行的调节胞吐作用的类型通常由分泌触发器的类型决定。然而, 在许多细胞中, 单个分泌触发器可以同时激活多种模式的调节胞吐作用。尽管它们在细胞类型和种类上的丰富和重要, 但确定不同分泌方式的机制基本上没有解决。对胞吐作用的不同模式进行调查的主要挑战之一, 是区分两者之间的困难, 并分别进行探讨。在这里, 我们描述使用荧光素异硫氰酸酯 (FITC)-葡聚糖作为胞吐作用的记者, 和活细胞成像, 以区分不同的途径, 调节胞吐作用, 侧重于复合胞吐作用, 基于鲁棒性和exocytic 事件的持续时间。

Introduction

调节胞吐作用是一个主要的机制, 使货物从分泌细胞释放, 以响应特定的触发。这些货物是预先形成的, 并被封存成分泌性的囊泡, 在其中储存, 直到触发器中继的信号, 以释放 SGs 的内容。不同类型的信号可能导致不同的调节胞吐作用模式, 或不同的调节胞吐作用模式可能同时发生。三调节胞吐作用的主要模式为: 全胞吐作用, 包括与血浆膜完全融合单一分泌颗粒;胞吐作用, 它涉及分泌颗粒与血浆膜的瞬态融合, 其次是其循环再造;和复合胞吐作用, 其特点是着融合的几个 SGs 之前 (即, 多粒胞吐作用) 或顺序 (即, 顺序胞吐作用), 以融合与等离子膜1。复合胞吐作用被认为是最广泛的货物释放模式2, 因为它允许快速分泌的货物, 包括从 SGs 在远离等离子膜。复方胞吐作用已记录在外分泌和内分泌细胞3,4,5,6,7,8,9, 以及在免疫细胞。在免疫细胞中, 如嗜酸性粒10、11、12和中性白细胞13, 复方胞吐作用允许快速和强健地释放需要杀死入侵病原体的介质, 如细菌或寄生虫。肥大细胞 (MCs) 在先天免疫反应、过敏反应和其他过敏性应答14、15、16中, 部署复合胞吐作用, 有效释放预贮存的炎症介质;,17. 由于胞吐作用的不同模式可能同时发生18、19, 因此在实时区分它们或确定其各自的融合机制方面已成为一项挑战, 因此阐明其基本机制。

在这里, 我们提出了一个方法, 基于细胞加载 FITC 葡聚糖的活细胞成像, 使实时跟踪 exocytic 事件, 并区分其不同的模式。特别是, 我们的方法允许独家监测复合胞吐作用。

FITC 葡聚糖是 pH 敏感荧光 FITC 与葡聚糖多糖的共轭。荧光标记的 dextrans 已显示为进入细胞由 micropinocytosis20,21和 macropinocytosis22,23。随着吞室成熟为溶酶体, 已证明 FITC-葡聚糖在溶酶中积累, 没有明显的降解。然而, 由于 FITC 是一个高度 pH 敏感的荧光24, 溶酶腔是酸性的, FITC-葡聚糖荧光止渴到达溶酶体24。因此, 建立 dextrans 作为溶酶体靶向的货物, 连同 FITC 的 pH 敏感性, 为使用 FITC-葡聚糖在溶酶研究胞吐作用25,26,27奠定了基础,28,29。

在几种细胞类型中, 包括 MCs、中性粒细胞、嗜酸性细胞、细胞毒性 T 淋巴细胞、黑色素等, SGs 显示溶酶体特征, 被归类为溶酶体相关细胞器 (LROs) 或分泌溶体酶30,31.由于 LROs 具有酸性的腔内 pH 值, FITC-葡聚糖可以用来可视化他们的胞吐作用, 因为更高的 pH 值与 LROs exteriorization 相关。事实上, FITC-葡聚糖已被用于监测 MCs18,32,33的胞吐作用。在这种方法中, FITC 葡聚糖被添加到细胞培养, 由细胞吞饮, 并归类到 SGs。在溶酶体中, FITC 荧光在 SGs 细胞内被淬火。然而, 当 sg 与等离子膜融合并随之暴露于外部环境时, FITC-葡聚糖在 sg pH 升高时就恢复了荧光, 允许通过活细胞显微镜对 exocytic 事件进行简单的跟踪。在这里, 我们调整了这种方法, 以实现独特的跟踪复合胞吐作用。

以前有两种方法用于跟踪复合胞吐作用。电镜是描述 exocytic 结构的第一种方法, 它表明了胞吐作用不同模式的发生。特别是, 胰腺腺泡细胞34和 MCs35,36,37的 "分泌通道" 的观察导致了复方胞吐作用的假说。然而, 虽然电子显微镜的高分辨率具有揭示熔泡的能力, 但它无法跟踪其融合的动力学, 因此不能定义它们是否对应于复胞吐作用或重新捕获颗粒融合过程中的 SG 融合。跟随他们的吞。这种障碍是克服其他方法, 可以测量胞吐作用在活细胞, 如膜片钳测量的等离子膜电容11,13,38,39或探头40的媒体。然而, 补丁夹紧需要一个特殊的设置, 可能不适合所有的细胞类型。只有当货物在极接近电极的情况下释放时, 探头测量才能跟踪胞吐作用。因此, 使用活细胞成像比这些方法更有优势, 因为它不仅允许实时跟踪胞吐作用, 而且还允许快速简单地从整个单元中获取数据。

用活细胞显微镜对 FITC 葡聚糖的跟踪也为其他活细胞成像方法提供了一些优势。例如, 一个广泛使用的方法是全内反射荧光显微镜 (TIRFM) 的细胞加载与荧光 SG 探针或表达荧光蛋白标记的 SG 货物或膜蛋白26,41,42,43. 这种方法的优点在于它能够监测与等离子膜 (此处称为脚印) 相近的事件, 因此 exocytic 事件。然而, 这也是这一方法的缺点, 因为只有与 coverglass 相邻的细胞分数和接近显微镜透镜可以成像44。这些脚印是否确实代表了整个细胞膜表面仍然有争议的45,46,47。在这方面, 使用 pH 敏感的染料, 如 FITC 葡聚糖和标准荧光显微镜或共聚焦显微镜与开放针孔, 使整个细胞的成像, 从而捕获的总 exocytic 事件发生在该细胞。

其他 ph 敏感的记者, 用于研究受控胞吐作用的全细胞成像或 TIRFM 包括 sg 货物或 sg 膜蛋白融合到 phlourin, 一个 pH 敏感的 GFP 变种。例子包括 NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin 和 synapto-phluorin48,49,50,51,52。虽然这些探针的表达可能更紧密地代表 SGs 的内源成分, 但它需要转染细胞, 因此可能不太适合难以染的细胞。因此, 在研究难以染的细胞, 或在需要多重基因组操作的实验条件下, 使用一种可以简单补充到细胞培养基中的化合物, 如 FITC 葡聚糖, 是有利的。.FITC-葡聚糖也提供了优于吖啶橙 (AO), 另一种 pH 敏感染料, 已用于跟踪胞吐作用的活细胞显微镜53,54,55,56,57,58. AO 已被证明可以诱导对水泡的光解, 导致假闪光, 这不对应于实际分泌过程27。相反, FITC-葡聚糖反映了更好的分泌事件, 可能是由于其低光诱导生产活性氧27。

值得注意的是, 研究胞吐作用的另一种方法是通过在这个过程中打开的融合孔跟踪染料的流入, 从外部介质进入 SG。在这种情况下, 染料被添加到外部培养基旁边的分泌触发器。然后, 当融合孔打开, 染料扩散到 SG59,60。这种方法的一个明显的优点是, 它也提供的能力, 以估计的融合孔径大小, 使用的染料的可变大小。例如, 不同分子量 (兆瓦) 的 dextrans, 共轭到不同的显影, 可以作为胞外染料, 即能穿透 SG 的葡聚糖的最大尺寸对应于融合孔59的大小,61,62,63,64. 此外, 这种方法不需要使用 pH 敏感探针。然而, 一个很大的缺点是, 信噪比是非常低的, 因为在图像采集过程中存在大量的染料, 导致较高的背景。

总的来说, 使用 FITC 葡聚糖作为胞吐作用的标志, 克服了以往报告方法的一些缺点, 如信噪比, 毒性, 动态跟踪和复杂性。

在这里, 我们描述了使用 FITC 葡聚糖监测复合胞吐作用在 RBL-2H3 肥大细胞系 (这里称为 RBL, 主要建立埃克莱斯顿等。65和进一步克隆 Barsumian等。66), 对免疫球蛋白 E (IgE)/抗原 (Ag) 活化反应。

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Protocol

1. 筹备工作

  1. RBL 培养基的制备
    1. 混合500毫升低葡萄糖 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 与56毫升的胎牛血清 (血清), 5.5 毫升青霉素-链霉素-制霉菌素溶液, 5.5 毫升 l-谷氨酰胺200毫米溶液。这导致低葡萄糖 DMEM 补充10% 血清, 100 µg/毫升链霉素, 100 单位/毫升青霉素, 12 单位/毫升制霉菌素, 2 毫米 l-谷氨酰胺。
    2. 使用0.22 µm 孔径大小的顶部真空过滤器过滤介质, 并存储在4摄氏度。
  2. 对 RBL 细胞的维护。
    1. 在10厘米的盘子中, 将 RBL 细胞生长到最大融合90%。如果细胞培养是健康的, 细胞应该有一个纺锤形与偶尔突起。
    2. 对于细胞分裂, 从盘子中分离细胞, 通过吸媒体和取代2毫升的 trypsine/EDTA 溶液 b. 在 5% CO2的湿润气氛中孵育5-10 分钟, 37 摄氏度。
    3. 一旦细胞分离, 就可以通过添加2毫升培养基, 使用吸管来中和胰蛋白酶, 并将细胞分成 1:2-1:10 的比例。
  3. 20x Tyrode 缓冲器的研制
    1. 在双蒸馏水 (DDW) 中, 准备20x 溶液, 54 毫米氯化钾, 20 毫米氯化镁2, 2.74 米氯化钠, 8 毫米 NaH2PO4 。混合好, 并存储在4摄氏度。

2. 活细胞显微术中的 RBL 细胞培养

  1. FITC 葡聚糖溶液的制备。
    1. 混合1毫克的 FITC-葡聚糖粉 (150 K) 每1毫升培养基 (见步骤 1.1.1)。对于全腔 coverglass, 准备3毫升。
    2. 使用醋酸纤维素注射器过滤器单元, 0.22 µm 孔径, 过滤溶解 FITC-葡聚糖。
    3. 添加小鼠 IgE 到浓度为1µg/毫升。
  2. 为成像而播种 RBL 细胞
    1. 在成像前的前一天, 从培养基中吸取培养基, 用2毫升的 trypsine/EDTA 溶液代替, 在 5% CO2的湿润气氛中孵育 5-10 分钟, 37 摄氏度。细胞分离后, 加入2毫升培养基, 中和胰蛋白酶。
    2. 使用 hemocytometer 计数 RBL 单元格, 并相应地调整音量以培养培养基, 以获得 7.5 x 105/毫升的细胞浓度。
    3. 添加10µL 细胞悬浮液室 coverglass 预填充新鲜的 FITC 葡聚糖补充培养基 (这导致在室内播种 7.5 x 103细胞)。
    4. 在 5% CO2在37摄氏度的 humified 大气中, 一夜之间生长出 RBL 细胞。细胞应保持在一个亚汇合的水平, 以确保细胞分离, 并容易识别每个细胞在显微镜下单独。
  3. 对 RBL 细胞的转染-可选。
    1. 对于成像 exocytic 事件结合其他荧光标记的蛋白质, 请参阅转染协议的 RBL 细胞在阿祖兹·恩尼法尔等。67

3. 胞吐作用活细胞显微术

  1. 解决方案的准备:
    1. 准备一个最终 Tyrode 的缓冲解决方案, 稀释 DDW 中的库存溶液在1:20 稀释和补充与20毫米 Hepes pH 7, 1.8 毫米 CaCl2, 1 毫克/毫升 BSA, 5.6 毫米葡萄糖。
    2. 新鲜地准备一个 20x secretagogue 试剂在 Tyrode 的缓冲 [1 µg/毫升 dinitrophenyl 共轭人血清白蛋白 () 在我们的情况下, 为 50 ng/毫升1x 浓度]。
    3. 在 Tyrode 的缓冲液中溶解粉末, 制备400毫米氯化铵溶液。
  2. 细胞的制备。
    1. 清洗腔 coverglass 3 次, 通过从腔室中吸出介质, 并用300µL Tyrode 的缓冲器填充, prewarmed 到37摄氏度。最后, 补充300µL Tyrode 的缓冲室, prewarmed 到37摄氏度。
    2. 将腔内 coverglass 放在显微镜的孵化室中。确保房间稳定。
  3. 设置显微镜
    1. 要选择一个感兴趣的区域跟踪, 打开荧光光源 (传统的水银灯), 并选择适当的荧光过滤器 (选择绿色显影的过滤器, 以查看 FITC 葡聚糖)。一旦感兴趣的区域集中并处于视野的中间, 关闭光源以避免光漂白和毒性。
      注: 部分 FITC 葡聚糖在细胞中可能保留荧光。这是因为 FITC-葡聚糖也可能被归类为非溶酶室, 如内涵体。
    2. 打开适当的照明 FITC 励磁。如果使用激光显微镜, 打开488纳米激光。排放量应收集约 500-550 nm (FITC 发射峰在 510-520 nm)。
    3. 使用共焦显微镜时, 将针孔打开至最大值。这将允许使用较低的激光功率, 以避免漂白和毒性, 并将确保捕获的胞吐作用事件从所有平面的细胞。
    4. 校准图像购置之间的时间间隔。
      1. 不同的细胞在其调节胞吐作用68的动力学中可能有所不同。对于复合胞吐作用的特定成像, 我们建议至少5秒的时间间隔。但是, 作为一个经验法则, 要允许快速成像, 请确保单个帧的采集时间是快速的。
      2. 当使用激光扫描共焦显微镜时, 将扫描方向设置为双向, 不允许平均值, 并设置分辨率为 512 x 512 (推荐; 后两项规定也将有助于尽量减少漂白和毒性)。
  4. 胞吐作用的影像学。
    1. 所需工期的图像单元格, 具体取决于单元格或 secretagogue 的类型。在 IgE/Ag 引发的 RBL 细胞中, 大多数 exocytic 事件发生在 15-20 分钟的激活范围内。
    2. 为激活细胞, 添加16µL 从 20x secretagogue 解决方案的房间。
  5. 确认 FITC-葡聚糖在细胞中的存在。
    1. 为了确认 FITC 葡聚糖在 SGs 中的存在和定位, 添加16µL 氯化铵溶液 (小心不要移动房间, 以免失去焦点) 轻轻地 (这将使最终浓度为20毫米)。这将引起 FITC 荧光的 SGs 和 dequenching 的碱性, 这将在几秒钟内发生。

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Representative Results

图 1a代表了 FITC-葡聚糖如何作为胞吐作用的记者, 并概括了 exocytic 事件的不同模式。首先, 细胞与 FITC 葡聚糖一起孵化, 这是由吞饮内化, 并归类到 SGs。由于 MCs 的 SGs 是 LROs, 他们的低 pH 值抑制 FITC 的荧光, 这里显示为黑色颗粒 (A-C, I)。当细胞由 secretagogue 和与等离子膜的 SGs 保险丝触发时, 形成一个融合孔, 允许将质子和 sgs 的碱性流出。因此, FITC 恢复了它的荧光 (a, II)。完整的胞吐作用将在短 (少于5秒) 的荧光事件中表现出来, 因为形象化 SG 的膜完全折叠成等离子膜, FITC-葡聚糖扩散到培养基中 (a, III)。在一个接吻和运行的 exocytic 事件中, sg 的膜只瞬时与等离子膜融合, 导致短暂的融合毛孔, 因此只有当 SG 迅速分离和其流明迅速重新酸化 (B,III.)。最后, 在复合胞吐作用中, 一系列的 SGs 依次熔断 (继 SG 熔接) 以及与等离子膜, 保持一个开放的聚变孔。因此, 大量的 FITC-葡聚糖是 dequenched, 导致一个大而长寿命的荧光爆发 (c, III IV), 衰变时, 探针扩散到外部介质 (c, V)。

我们使用这个模型, 并确认其预测的影像控制细胞和细胞, 已耗尽的 Rab5, 我们已经证明是关键的着69和复合胞吐作用33。通过每十五年代将采集时间设定为图像, 我们预计会发现大部分连续的分泌物,即复合胞吐作用。事实上, 如图1B 所示, 我们的数据表明, 在控制单元中, 许多大而持久的 exocytic 事件可以被记录下来, 只有很少的事件记录在 Rab5 击倒细胞 (shRab5)。此外, 在 shRab5 细胞中记录的事件与控制细胞中记录的事件相比, 大小明显小。值得注意的是, shRab5 细胞的分泌能力在相同的条件下保持不变69, 这表明虽然 shRab5 抑制复合胞吐作用, 但它不废除分泌物。因此, 成像 FITC-葡聚糖荧光在长时间间隔允许特定的检测化合物胞吐作用。此外, 成像 FITC-葡聚糖释放允许捕获的顺序性质的复方胞吐作用。如图 1b中的箭头所示, 在光闪烁之后, 第二个闪光开始于与第一个相邻的微弱闪光。这可以推断为一个 sg 的融合与 sg, 已经在与等离子膜的融合过程 (即, 顺序胞吐作用)。因此, 当第二颗粒与第一粒已通过熔融孔连接到等离子体膜的粒子融合时, 第二颗粒的 pH 值也随之增加, FITC 荧光 dequenches, 产生第二次荧光。如图1c 所示, 在相邻 SGs 序列融合过程中, 这种 FITC-葡聚糖释放的情况。

在复合胞吐作用中, SGs 的顺序融合的另一个例子如图 2所示。RBL 细胞与组成性活性 (CA) 形式的 Rab5a 和 SNAP-23, 条件下复合胞吐作用变得更加健壮33。成像的 CA Rab5a, 这是必不可少的 sg-sg 融合和涂层大 SGs33,69, 连同 FITC-葡聚糖, 允许更好地可视化更小的颗粒与更大的 CA-Rab5a 装饰颗粒的融合。

由于 FITC 葡聚糖在 SG 内被淬火, 因此有必要实施一种验证 FITC-葡聚糖确实存在于 SGs 中的技术。当预在预期会废除分泌物的条件下进行实验时, 这种情况变得更加重要。为了克服这一障碍, 在每次试验结束时, 将20毫米氯化铵添加到腔室中。这种治疗提升了 SGs 内部的 pH 值, 允许 FITC 荧光。如图 3所示, 在将氯化铵添加到介质后, FITC 葡聚糖变得可见, 并与 mRFP 标记的神经肽 Y 进行协同定位, 后者是 RBL 细胞70中的 SG 记者。

Figure 1
图 1: 对复合胞吐作用的特定检测.(a)描述 FITC-葡聚糖荧光的变化如何重述不同的调节胞吐作用模式的示意图。(b) FITC-葡聚糖在 mRFP 和 pSilencer 或 shRab5 转染的 RBL 细胞中的活细胞成像。转染的执行情况如前所述67,70。简要地, 1.5 x 107 RBL 细胞被悬浮在转染缓冲器 (DMEM 补充与20毫米 K 管 pH 值 7, 10 µM 钙2 +乙酸, 2 毫米毫克2 +醋酸盐, 128 毫米谷氨酸钾) 包含15µg NPY mRFP 和30µg pSilencer 或15µg 的 shRab5A 和15µg 的 shRab5B/C. 转染是通过电穿孔300伏和20毫秒脉冲长度实现的。细胞被立即 replated 培养基中含有1毫克/毫升 FITC 葡聚糖。24小时后, 细胞被敏化1µg/毫升 IgE 和孵化进一步24小时。细胞被清洗三次在完全 Tyrode 的缓冲和激活由 50 ng/毫升的再组织蛋白 (Ag)。细胞通过时间失效荧光显微镜进行可视化。pSilencer 图像中的白色箭头指向 FITC 荧光的爆发, 白色圆圈标志着一个放电的 SG。shRab5A/B/C 图像中的白色箭头表示 Rab5-knockdown 细胞中发生的微小荧光事件, 可能预示着完全的胞吐作用。注意, ShRab5 图像的强度增加, 以允许检测信号。图像是由共聚焦显微镜获得的, 配备了加热室 (37 °c) 和 CO2控制器 (4.8%) 和一个 C 复消色差 x63/1.2 W 的确定目标, 在开放针孔设置。对于完整的电影, 请参阅克莱恩等。33( c) (b) 所示的着 SG 聚变过程示意图。详细地, 作为第一个 SG 与等离子膜融合, 并建立一个聚变孔, 它开始碱化, 同时释放其 FITC 葡聚糖的内容。因此, 当第二个 sg 以顺序方式与第一个保险丝融合时, 第一个 sg 的荧光就会因释放 FITC 葡聚糖而褪色。然而, 第二个 sg alkalizes, 它导致一个 FITC 闪光, 出现在第一个 sg 附近。这个数字是由克莱因等来改编的。33请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: mStr-CA-Rab5 和 FITC 葡聚糖的双重成像.RBL 细胞共转染20µg 的 HA-wt-SNAP23 和10µg mStr 钙 Rab5A。细胞是预先孵化的 FITC-葡聚糖和 IgE, 并触发与 Ag 如图 1所述。(a)一系列图像, 在淬火 sg (白色箭头) 和已与等离子膜融合的 sg 之间捕获融合事件, 因此是荧光的。15.8 分钟后, 淬火 sg 与邻近的 sg 融合, 开始获得荧光。盒装区域在每个时间点的左下角增大。(b)从 (a) 所示的相应时间点 mSTR Rab5A (红) 和 FITC 葡聚糖 (绿色), 表明两个 SGs 之间的融合. 图像是通过共聚焦显微镜 (开针孔) 获得的, 使用一个计划-复消色差x63-NA 1.4 目标。这个数字是由克莱因等来改编的。33为充分的影片, 看见克莱因等。33请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: NH-mRFP 和 FITC-葡聚糖在 SG4Cl. 中的双重成像RBL 细胞转染 shRab5, 预孵化与 FITC 葡聚糖和 IgE, 并触发与 Ag, 如图 1所述。(a)细胞通过时间推移荧光显微镜进行可视化。指定的时间在图片是分钟在触发与 Ag 之后。图像是通过共聚焦显微镜获得的, 使用一个计划-复消色差 x63-NA 1.4 目标。( b)对 (a) 所示实验进行定量分析。图中的每一行都是 FITC 在一个单元格上的一个感兴趣区域 (ROI) 的平均荧光。箭头指向 NH4Cl (20 毫米) 加法的时间。酒吧 = 5 µm。这个数字是由克莱因等来改编的。33请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

在这里, 我们描述如何追踪 FITC-葡聚糖的荧光加载到 SGs 可以用来专门捕捉化合物胞吐作用事件。这是通过设置显微镜, 每15秒获得一个图像, 从而确保只有长期的事件将记录一段时间, 因此不包括短事件, 将对应于完全胞吐作用或接吻和运行胞吐作用。为了建立这种方法, 我们表明, 在 RBL 细胞中表达的 Rab5 亚型的击倒, 是复合胞吐作用的关键, 消除了捕捉 FITC-葡聚糖释放事件的能力, 而细胞的整体分泌不受影响。

该方法最突出的缺点是它只适用于含有酸性 SGs 的细胞。然而, 该方法最突出的优点是, 它是基于简单的孵化细胞与 FITC 葡聚糖, 不需要转染。其他 ph 敏感的记者, 用于研究受管制的胞吐作用, 涉及 sg 的货物或 sg 膜蛋白融合到 phlourin, ph 敏感的 GFP 变种 (如 NPY-phlourin, β-hexoseaminidase phlourin, synapto-phluorin48, 49、50、51、52), 可更紧密地代表 SGs 的内生成分。然而, 它们的使用需要转染细胞, 这可能不太适合难以染的细胞。因此, 在研究难以染的细胞, 或在需要多种基因组操作的实验条件下, 使用一种可以简单补充的细胞培养基中的化合物, 如 FITC 葡聚糖, 是有利的。我们的协议可能需要进行细胞特定的调整, 以适应不同的细胞类型68的胞吐作用的动力学差异。因此, 应优化图像采集的选择时间间隔。对于 RBL 细胞, 我们已经建立了显微镜, 每15秒捕捉一个新的图像, 在 IgE/Ag 触发的 RBL 细胞允许我们只可视化持久的事件, 从而允许独家跟踪复合胞吐作用事件。

另一个需要考虑的因素是要使用的葡聚糖的类型。各种不同的 dextrans, 它们的分子量是可用的。因此, 选择合适的葡聚糖作为记者是很重要的, 考虑到不同 dextrans 可能对细胞产生的影响。例如, 低分子量 dextrans 已被证明激活 MCs 和诱发分泌物71,72,73,74。因此, 低分子量 dextrans 不会是适当的记者为 MC 分泌物。不同的大鼠菌株75, 或在不同的共同刺激条件下71,76,77,78, 也注意到细胞反应性对 dextrans 的差异。在这里, 我们选择使用一个 150K FITC 葡聚糖, 以前曾在 RBL 细胞系研究, 并证明是无效的诱导分泌物18,79。

要选择的光源对该议定书也是至关重要的。在使用共焦显微镜时, 光源传统上是基于激光的。因此, 为了避免毒性, 必须选择低激光功率。根据激光的类型和年龄, 所需的激光功率不同于显微镜。此外, 所需的激光功率也取决于所使用的探测器的类型。例如, 当使用一个通用探测器 (如光电倍增管探测器) 时, 需要比使用现代混合探测器 (如光电倍增管和雪崩光二极管混合探测器) 更高的功率激光器。我们建议使用尽可能低的激光功率, 不超过10% 的激光功率。

总之, 在精心选择的设置下, 通过时间推移显微镜监测 SG 负载的 FITC-葡聚糖的 dequenching, 使我们能够完全捕获 RBL MCs 中的复合胞吐作用, 极大地促进了分子实体的识别,调节这个过程。这一方法可以进一步调整, 以区分完全从接吻和运行胞吐作用通过减少和仔细校准的时间间隔的图像采集, 以允许短寿命闪烁的区别与接吻和运行胞吐作用从更短的闪光, 伴随着完整的胞吐作用。这些条件将捕获复合和接吻和运行胞吐作用, 然后可以根据信号的持续时间来区分。

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Disclosures

作者声明没有竞争的财政利益

Acknowledgments

我们感谢 u. 阿瑟瑞博士对 cDNA 的慷慨馈赠。我们感谢 Drs. g. 质量, l. Mittleman, m Shaharbani, 和 Zilberstein 从 Sackler 细胞 & 分子成像中心为他们的宝贵协助与显微术。这项工作得到了美国-以色列两国科学基金会 (赠款2013263至 r. Sagi-艾森伯格、i. Hammel 和 s.j. 加利) 的支持, 并由以色列科学院创立的以色列科学基金会授予 933/15 (以 r Sagi-艾森伯格) 和 NIH 赠款 U19 AI 104209 和 R01 AR067145 (S.J. 加利)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

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生物学 问题 136 FITC 葡聚糖 调节胞吐作用 复合胞吐作用 活细胞成像 溶酶体相关器 吞饮
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Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

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