Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging FITC-dextran som Reporter for regulerede exocytose

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Her detalje vi en metode for levende celle billeddannelse af regulerede exocytose. Denne metode udnytter FITC-dextran, der ophobes i lysosomet-relaterede organeller, som reporter. Denne simple metode giver også mulighed for at skelne mellem forskellige former for regulerede exocytose i celler, der er vanskelige at manipulere genetisk.

Abstract

Regulerede exocytose er en proces som last, som er gemt i sekretorisk granulat (SGs), er udgivet som reaktion på en sekretoriske udløser. Regulerede exocytose er grundlæggende for intercellulær kommunikation og er en vigtig mekanisme for udskillelsen af neurotransmittere, hormoner, inflammatoriske mediatorer og andre forbindelser, af en række celler. Mindst tre forskellige mekanismer er kendt for regulerede exocytose: fuld exocytose, hvor en enkelt SG fuldt sikringer med plasma membran, kys og Kør exocytose, hvor en enkelt SG forbigående sikringer med plasma membranen, og sammensatte exocytose, hvor flere SGs fuse med hinanden, før eller efter SG fusion med plasmamembran. Typen af regulerede exocytose foretaget af en celle er ofte dikteret af sekretoriske udløser type. Men i mange celler, en enkelt sekretoriske udløser kan aktivere flere former for lovreguleret exocytose samtidigt. Trods deres overflod og deres betydning på tværs af celletyper og arter er de mekanismer, der bestemmer de forskellige transportformer sekretion i vid udstrækning uløste. En af de vigtigste udfordringer i at undersøge de forskellige transportformer regulerede exocytose, er er vanskeligheden at skelne mellem dem samt udforskning af dem separat. Her beskriver vi brugen af fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran som exocytose reporter og levende celle imaging for at differentiere mellem de forskellige veje af regulerede exocytose, med fokus på sammensatte exocytose, baseret på robustheden og varigheden af exocytic begivenheder.

Introduction

Regulerede exocytose er den primære mekanisme, som let lavet last er frigivet fra en sekretoriske celle som svar på en bestemt udløser. Lasten er pre dannet og afsondret i sekretoriske vesikler, hvor det opbevares indtil en udløser relæer signal til frigivelse af SGs' indhold. Forskellige typer af signaler kan resultere i forskellige tilstande af regulerede exocytose, eller forskellige former for regulerede exocytose kan forekomme samtidig. Tre vigtigste transportformer regulerede exocytose er kendt: fuld exocytose, der indebærer fuld fusion af en enkelt sekretorisk granulat med plasma membran; kys og Kør exocytose, der indebærer forbigående fusion af granulet sekretoriske med plasma membran efterfulgt af sin genanvendelse; og sammensatte exocytose, som er karakteriseret ved Homotypiske fusion af flere SGs forudgående (dvs, multigranular exocytose) eller sekventiel (dvs., sekventiel exocytose) til fusion med plasma membran1. Sammensatte exocytose anses for den mest omfattende tilstand af lasten release2, da det giver mulighed for hurtig udskillelsen af lasten, herunder fra SGs, der er placeret distale fra plasmamembran. Sammensatte exocytose er blevet dokumenteret i både eksokrine og endokrine celler3,4,5,6,7,8,9, samt i immunceller. I immunceller, såsom eosinofile10,11,12 og neutrofile13, sammensatte exocytose giver mulighed for en hurtig og robust frigivelse af mæglere, der er forpligtet til at dræbe invaderende patogener som bakterier eller parasitter. Mast celler (MCs) installere sammensatte exocytose for effektiv frigivelse af allerede gemte inflammatoriske mediatorer under medfødte immunrespons, anafylaksi og andre allergiske reaktioner14,15,16 , 17. da de forskellige transportformer exocytose kan forekomme samtidigt18,19, det er blevet en udfordring at skelne mellem dem i realtid eller til at identificere deres respektive fusion machineries, dermed belyse deres underliggende mekanismer.

Her præsenterer vi en metode, baseret på levende celle billeddannelse af celle indlæst FITC-dextran, der giver mulighed for tidstro sporing af exocytic arrangementer og skelne mellem deres forskellige tilstande. Især vores metode giver mulighed for eksklusive overvågning af sammensatte exocytose.

FITC-dextran er en konjugation af pH-følsom fluorophore FITC med glucan polysaccharid dextran. Fluorescently mærket dextrans har vist sig at komme ind i cellen af micropinocytosis20,21 og macropinocytosis22,23. Som endocytic rum modnes til lysosomer, har det vist sig at FITC-dextran ophobes i lysosomet med ingen tilsyneladende forringelse. Men da FITC er en meget pH-følsom fluorophore24, og lysosomet lumen er sure, FITC-dextran fluorescens slukker ved ankomsten til lysosomet24. Således etablere dextrans som lysosomet målrettet cargo, sammen med pH følsomheden af FITC, har lagt grundlaget for anvendelse af FITC-dextran i undersøgelser af lysosomet exocytose25,26,27 , 28 , 29.

I flere celletyper, herunder MCs, neutrofile, eosinofile, cytotoksiske T-celler, melanosomer, og andre, SGs vise lysosomale funktioner og er kategoriseret som lysosomet-relaterede organeller (LROs) eller sekretoriske lysosomer30,31 . Da LROs har en syrlig luminale pH, kan FITC-dextran bruges til at visualisere deres exocytose, som følge af højere pH forbundet med eksteriorisering af LROs. Faktisk er FITC-dextran blevet brugt til at overvåge exocytose i MCs18,32,33. I denne metode, FITC-dextran føjes til cellekultur, taget af celler af pinocytosis og sorteret i SGs. Som det er i lysosomer, bratkølet FITC fluorescens i SGs, når de er inden for cellen. Dog ved SG fusion med plasma membran og deraf følgende eksponering til det eksterne miljø genvinder FITC-dextran sin fluorescens da SG pH stiger, giver mulighed for enkel sporingen af exocytic arrangementer af levende celle mikroskopi. Her, justeret vi denne metode for at aktivere unikke tracking af sammensatte exocytose.

To andre metoder har været anvendt tidligere til at spore sammensatte exocytose. Elektronmikroskopi var den første metode til at karakterisere exocytic strukturer, der foreslog, at forekomsten af forskellige transportformer exocytose. Navnlig gav bemærkningerne "sekretoriske tunneller" i pancreas acinar celler34 og MCs35,36,37 anledning til hypotesen om sammensatte exocytose. Men mens den høj opløsning af elektronmikroskopi har beføjelse til at afsløre sammenvoksede vesikler, det kan ikke spore dynamikken i deres fusion og dermed ikke kan definere, om de svarer til SG fusion under sammensatte exocytose eller fusion af genfangede granulat efter deres endocytose. Denne hindring er overvundet i andre metoder, der kan måle exocytose i levende celler, såsom patch klemme målinger af plasma membran kapacitans11,13,38,39 eller amperometry 40 af medierne. Dog patch fastspænding kræver et specielt set-up og kan ikke være egnet til alle celletyper. Amperometry målinger er i stand til at spore exocytose kun hvis lasten er udgivet i meget tæt nærhed af elektroden. Derfor, ved hjælp af levende celle imaging giver en fordel i forhold til disse metoder, så det ikke kun giver mulighed for tidstro sporing af exocytose, men det giver også mulighed for hurtig og enkel erhvervelse af data fra hele cellen.

Sporing af FITC-dextran af levende celle mikroskopi tilbyder også nogle fordele ved at andre levende celle imaging-baserede metoder. For eksempel, er en meget udbredt metode total interne reflection Fluorescens mikroskopi (TIRFM) af celler fyldt med en fluorescerende SG sonde eller udtrykker en fluorescerende proteiner-tagged SG last eller membran protein26,41, 42 , 43. denne metode styrke ligger i dens evne til at overvåge udelukkende hændelser, som forekommer tæt på plasma membran (herefter kaldet fodaftryk), derfor exocytic begivenheder. Dette er dog også Ulempen ved denne metode fordi kun den celle fraktion, der støder op til daekglas og tæt på mikroskop linse kan være afbildet44. Om sådanne fodspor faktisk repræsenterer hele cellemembranen overflade er stadig tvivlsomt45,46,47. I denne forbindelse tillader ved hjælp af et pH-følsom farvestof som FITC-dextran og en standard fluorescens mikroskop eller en Konfokal mikroskop med en åben hul billeddannelse af hele cellen, således indfange de samlede exocytic hændelser, der indtræffer i cellen.

Yderligere pH-følsom journalister, der bruges til at studere regulerede exocytose af hele cellen imaging eller TIRFM omfatter SG last eller SG membran protein sammenvokset til phlourin, en pH-følsom normal god landbrugspraksis variant. Eksempler kan nævnes NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, og synapto-phluorin48,49,50,51,52. Mens udtryk for disse sonder kan repræsentere tættere endogene sammensætningen af SGs, det indebærer Transfektion af cellerne, og kan derfor være mindre egnet til celler, der er vanskelige at transfect. Derfor, hvornår studerer celler der er vanskeligt at transfect eller under eksperimentelle betingelser, der kræver flere genomisk manipulationer, brug af et stof, der blot kan suppleres i cellekulturmedium, såsom FITC-dextran, er fordelagtigt . FITC-dextran tilbyder også en fordel over acridin orange (AO), en anden pH-følsom farvestof, der er blevet brugt til at spore exocytose levende celle mikroskopi53,54,55,,56 , 57 , 58. AO har vist sig at fremkalde fotolyse af vesikler, resultere i falske blinker, som ikke svarer til faktiske sekretion processer27. Derimod afspejler FITC-dextran bedre sekretion begivenheder, formentlig på grund af sin lave foto-induceret produktion af reaktive oxygen27.

Især er en alternativ tilgang til at studere exocytose ved at spore tilstrømningen af et farvestof, fra den eksterne medium i SG gennem fusion pore, der åbner i løbet af denne proces. I dette tilfælde er farvestoffet føjet til den eksterne medium sammen med den sekretoriske udløser. Derefter, når fusion pore åbner, farvestoffet trænger ind SG59,60. En klar fordel ved denne metode er, at det også giver mulighed for at estimere porestørrelse fusion ved hjælp af farvestoffer af variabel størrelse. For eksempel, kan dextrans af forskellige molekylvægt (MW), konjugeret med forskellige fluorophores, bruges som ekstracellulære farvestoffer, hvorved den maksimale størrelse af dextran, der kan trænge SG ville svare til størrelsen af fusion pore59, 61 , 62 , 63 , 64. Derudover denne metode kræver ikke brug af et pH-følsom sonde. En væsentlig ulempe er imidlertid, at signalet / støjforhold er meget lav, da en stor mængde farvestof er til stede i medierne i løbet af erhvervelse af billeder, hvilket resulterer i høje baggrund.

Samlet set overvinder anvendelse af FITC-dextran som markør for exocytose flere ulemper i tidligere rapporterede metoder, såsom signal-støj-forholdet, toksicitet, dynamisk sporing og kompleksitet.

Her beskriver vi anvendelse af FITC-dextran at overvåge sammensatte exocytose i linjen RBL - 2H 3 mast celle (herefter omtalt som RBL, primært etableret af Eccleston et al. 65 og yderligere klonet af Barsumian et al. 66), som svar på immunglobulin E (IgE) / antigen (Ag) aktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. præparater

  1. Forberedelse af RBL kultur medier
    1. Mix 500 mL af lav glucose Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM) med 56 mL føtalt bovint serum (FBS), 5,5 mL af penicillin-streptomycin-nystatin løsning, 5,5 mL L-glutamin 200 mM løsning. Dette resulterer i lav glucose DMEM suppleret med 10% FBS, 100 µg/mL streptomycin, 100 enheder/mL penicillin, 12 enheder/mL nystatin og 2 mM L-glutamin.
    2. Filtrere medierne ved hjælp af en top-vakuum filter med 0,22 µm porestørrelse og butik ved 4 ° C.
  2. Vedligeholdelse af RBL celler.
    1. Vokse RBL celler til en maksimal confluency på 90% i en 10 cm parabol. Hvis cellekultur er sundt, skal cellerne har en spindel figur med lejlighedsvise fremspring.
    2. For celle opdeling, frigør celler fra fadet ved sugning medierne og erstatte med 2 mL trypsine/EDTA-oploesning B. Incubate for 5-10 minutter i en fugtig atmosfære i 5% CO2 ved 37 ° C.
    3. Når cellerne er skilt, neutralisere trypsin ved tilsætning 2 mL af kultur medier, ved hjælp af en pipette, og Opdel celler i en 1:2-1:10-forholdet.
  3. Forberedelse af 20 x Tyrode's buffer
    1. Forberede en bestand 20 x løsning af 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl og 8 mM NaH2PO4 i dobbelt destilleret vand (DDW). Bland godt og opbevares ved 4 ° C.

2. kultur af RBL celler til levende celle mikroskopi

  1. Fremstilling af FITC-dextran løsning.
    1. Bland 1 mg af FITC-dextran pulver (150 K) per 1 mL af Kulturmedier (Se trin 1.1.1). For en fuld chambered daekglas, forberede 3 mL.
    2. Ved hjælp af en celluloseacetat sprøjte filterenhed med 0,22 µm porestørrelse, filtrere den opløste FITC-dextran.
    3. Tilføj mus IgE til en koncentration på 1 µg/mL.
  2. Såning RBL celler til billedbehandling
    1. Dagen før imaging, Aspirér medier fra kultur parabol og erstatte med 2 mL trypsine/EDTA-oploesning B. Incubate for 5-10 minutter i en fugtig atmosfære i 5% CO2 ved 37 ° C. Når cellerne er skilt, neutralisere trypsin ved tilsætning 2 mL af Kulturmedier.
    2. Grev RBL celler ved hjælp af en hemocytometer og justere lydstyrken i overensstemmelse hermed med kultur medier til at få en celle koncentration af 7,5 x 105/mL.
    3. Tilsæt 10 µL af cellesuspension til en chambered daekglas fyldt med frisk FITC-dextran suppleret kultur medier (Dette resulterer i såning af 7,5 x 103 celler i et kammer).
    4. Vokse RBL celler natten over i en humified atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. Cellerne skal forblive i en sub sammenflydende niveau for at sikre at cellerne separeres og at det er let at identificere hver enkelt celle individuelt under mikroskop.
  3. Transfektion af RBL celler - valgfri.
    1. Imaging exocytic begivenheder i kombination med andre fluorescently tagged proteiner, finder Transfektion protokol for RBL celler i Azouz et al. 67

3. levende celle mikroskopi af exocytose

  1. Forberedelse af løsninger:
    1. Forberede en afsluttende Tyrode bufferopløsning ved fortynding af stamopløsningen i DDW i en 1:20 fortynding og supplere med 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA og 5,6 mM glukose.
    2. Frisk forberede en 20 x secretagogue reagens i Tyrode's buffer [1 µg/mL dinitrophenyl konjugeret med human serum albumin (DNP-har (Ag)) i vores tilfælde, for en 50 ng/mL 1 x koncentration].
    3. Forberede en 400 mM ammoniumklorid løsning ved at opløse pulveret i Tyrode's buffer.
  2. Forberedelse af celler.
    1. Vask det chambered daekglas 3 gange af sugning medier fra salen og opfyldning det med 300 µL af Tyrode's buffer, forvarmet til 37 ° C. Endelig, fylde salen med 300 µL af Tyrode's buffer, forvarmet til 37 ° C.
    2. Placer den chambered daekglas i mikroskops inkubator kammer. Sørg for, at mødesalen er stabil.
  3. Opsætning af mikroskopet
    1. Du vælger en region af interesse at spore, tænde den fluorescerende lyskilde (traditionelt en kviksølv lampe) og vælge filteret passende fluorescens (Vælg filteret til grøn fluorophores til visning af FITC-dextran). Når det pågældende område er i fokus og er i midten af synsfeltet, sluk lyskilden for at undgå foto-blegning og giftighed.
      Bemærk: Nogle af FITC-dextran indarbejdet i cellerne kan bevare fluorescens. Dette er fordi FITC-dextran kan også sorteres til ikke-lysosomale rum såsom endosomes.
    2. Tænd den passende belysning for FITC excitation. Hvis bruger en laser-baseret mikroskop, drej på 488 nm laser. Emissioner bør være samledes omkring 500-550 nm (FITC emission toppe ved 510-520 nm).
    3. Når du bruger en Konfokal mikroskop, åbne pinhole til maksimalt. Dette vil give mulighed for ved hjælp af lavere laser power at undgå blegning og giftighed og vil sikre erobringen af exocytose begivenheder fra alle fly af cellen.
    4. Kalibrere tidsintervallet mellem billede erhvervelser.
      1. Forskellige celler kan variere i deres kinetik af regulerede exocytose68. For specifikke billeddannelse af sammensatte exocytose anbefaler vi et tidsinterval på mindst 5 sekunder. Men som en tommelfingerregel, for at muliggøre hurtig billedbehandling, sikre at erhvervelse tid af et enkelt billede er hurtig.
      2. Når du bruger en laser-scanning Konfokal mikroskop, angive retningen scan til bi-directional, ikke giver mulighed for i gennemsnit, og Indstil opløsningen på 512 x 512 (anbefales, de sidstnævnte to bestemmelser vil også bidrage til at minimere blegning og giftighed).
  4. Billeddannelse af exocytose.
    1. Billede celler ønskede varighed, afhængigt af typen celle eller secretagogue. I RBL celler udløses med IgE/Ag, opstår de fleste exocytic hændelser i 15-20 min af aktivering.
    2. For aktivering af cellerne, tilføje 16 µL fra 20 x secretagogue løsning til salen.
  5. Bekræfter FITC-dextran tilstedeværelse i cellerne.
    1. For at bekræfte tilstedeværelsen og lokalisering af FITC-dextran til SGs, tilføje 16 µL af ammoniumklorid løsning (Vær omhyggelig med ikke at bevæge sig i salen for ikke at miste fokus) til salen forsigtigt (dette vil gøre en endelig koncentration på 20 mM). Dette vil fremkalde alkalization af SGs og dequenching af FITC fluorescens, der vil forekomme inden for sekunder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1a repræsenterer skematisk hvordan FITC-dextran kan fungere som en reporter for reguleret exocytose og sammenfatte de forskellige former for exocytic begivenheder. Først, cellerne inkuberes med FITC-dextran, som er internaliseret af pinocytosis og sorteret til SGs. Da SGs MCs er LROs, deres lav pH dæmper fluorescens af FITC, vises her som sort granulat (A-C, jeg). Når celler er udløst af en secretagogue og SGs fuse med plasma membran, dannes en fusion pore, giver mulighed for efflux af protoner og alkalization af SGs. Som følge heraf genvinder FITC sin fluorescens (A, II). Fuld exocytose vil manifestere sig i en kort (mindre end 5 s) fluorescerende begivenhed som den exteriorized SG membran helt kollapser i plasma membran og FITC-dextran diffunderer væk dyrkningsmedium (A, III). Under hændelsen kys og Kør exocytic SGS membran kun forbigående sikringer med plasma membran, som resulterer i en kortvarig fusion pore og derfor kun en kort udbrud af fluorescens som SG hurtigt løsner og dens lumen hurtigt igen forsurer (B, III - IV). Endelig, under sammensatte exocytose, en serie af SGs sekventielt fuse med hinanden (følgende SG fusion) og plasma membran, med vedligeholdelse af en åben fusion pore. Som et resultat, er en meget større masse af FITC-dextran dequenched, hvilket resulterer i en stor og langlivede fluorescens burst (C, III-IV), der henfalder når sonden diffunderer ind i den eksterne medium (C, V).

Vi har brugt denne model og bekræftet sine forudsigelser af billeddiagnostiske kontrol celler og celler, der er forarmet af Rab5, som vi har vist sig for at være afgørende for Homotypiske SG-SG fusion69 og sammensatte exocytose33. Ved at indstille erhvervelse tid til et billede hver 15 s, vi forventes at opdage det meste løbende arrangementer af sekretion, dvs, sammensatte exocytose. Ja, som vist i figur 1B, vores data viser, at mens kontrollen celler mange store og langvarige exocytic begivenheder kunne registreres, kun få arrangementer blev registreret i Rab5 knockdown celler (shRab5). Desuden var begivenheder, der blev optaget i shRab5 celler væsentligt mindre i størrelse i forhold til hændelser registreres i kontrol celler. Af note forbliver sekretorisk kapaciteten af shRab5 celler uændret under de samme betingelser69, tyder på, at mens shRab5 hæmmer sammensatte exocytose, ikke det afskaffe sekretion. Derfor, imaging FITC-dextran fluorescens i lang tid mellemrum giver mulighed for specifikke påvisning af sammensatte exocytose. Derudover tillader imaging FITC-dextran release erobring af den sekventielle karakter af sammensatte exocytose. Som angivet af pilen i figur 1b, efter et lysglimt, begynder en anden flash som en svag flash, der støder op til den første. Dette kan udledes som en sammensmeltning af en SG med en SG, der allerede er i færd med at fusion med plasma membran (dvs., sekventiel exocytose). Derfor, som det andet granul sikringer med den første granula, der er allerede tilsluttet plasma-membran via en fusion pore, pH i granulet andet øger såvel og FITC fluorescens dequenches, giver en anden eksplosion af fluorescens. Sådant et scenarium af FITC-dextran frigivelse under sekventiel fusion af tilstødende SGs er præsenteret i figur 1 c.

Et andet eksempel på sekventiel fusion af SGs under sammensatte exocytose er vist i figur 2. RBL celler var Co transfected med en constitutively aktiv (CA) form af Rab5a og WT SNAP-23, betingelser under hvilke sammensatte exocytose bliver mere robust33. Billeddannelse af CA-Rab5a, som er afgørende for SG-SG fusion og er belægning store SGs33,69, sammen med FITC-dextran, giver bedre visualisering af sammensmeltning af en mindre granula med en større CA-Rab5a dekoreret granula.

Da FITC-dextran er slukket når gemt inde i SG, er det nødvendigt at gennemføre en teknik til at kontrollere, at FITC-dextran er faktisk til stede i SGs. Dette bliver endnu mere vigtigt, når du udfører et eksperiment på betingelser, som forventes at afskaffe sekretion. For at overvinde denne hindring, blev 20 mM ammoniumchlorid føjet til kammer for enden af hvert forsøg. Denne behandling hæver pH ind SGs, giver mulighed for FITC fluorescens. Som vist i figur 3, efter tilsætning af ammoniumklorid til medierne, FITC dextran bliver synlig og Co er lokaliseret med mRFP-tagged neuropeptid Y, som er en SG reporter i RBL celler70.

Figure 1
Figur 1: specifik påvisning af sammensatte exocytose. (a) et diagram, der beskriver, hvordan ændringer i FITC-dextran fluorescens sammenfatte de forskellige transportformer regulerede exocytose. (b) levende celle billeddannelse af FITC-dextran i RBL celler transfekteret med NPY-mRFP og enten pSilencer eller shRab5, som angivet. Transfektion blev udført som tidligere beskrevet67,70. Kort, 1.5 x 107 RBL celler blev genopslemmes i Transfektion buffer (DMEM suppleret med 20 mM K-rør pH 7, 10 µM Ca2 + acetat, 2 mM Mg2 + acetat, 128 mM kalium glutamat) indeholdende 15 µg NPY-mRFP og enten 30 µg for pSilencer eller 15 µg for shRab5A og 15 µg for shRab5B/C. Transfektion blev opnået ved elektroporation på 300 V og en 20 msek puls længden. Celler blev straks replated dyrkningsmedium indeholdende 1 mg/mL FITC-dextran. Efter 24 timer, blev celler sensibiliseret med 1 µg/mL af IgE og inkuberes i yderligere 24 timer. Cellerne blev derefter vaskes tre gange i fuld Tyrode buffer og aktiveres af 50 ng/mL af DNP-HSA (Ag). Celler blev visualiseret ved time-lapse Fluorescens mikroskopi. Den hvide pil i pSilencer billeder peger på en byge af FITC fluorescens og den hvide cirkel markerer et afladet SG. Den hvide pil i shRab5A/B/C billeder angiver minut fluorescerende hændelser, der opstår i Rab5-knockdown celler, sandsynligvis vil være vejledende for fuld exocytose. Af note, blev intensiteten af ShRab5 billedet øget til at tillade registrering af signalet. Billeder blev erhvervet af en Konfokal mikroskop udstyret med en opvarmet kammer (37 ° C) og CO2 controlleren (4,8%) og en C-Apochromat x63/1.2 W Corr mål, under Åbn pinhole indstilling. For de fulde film, henvise til Klein et al. 33 (c) et skematisk diagram over Homotypiske SG fusion processen vist i (b). I detaljer, som den første SG sikringer med plasma membran og etablerer en fusion pore, begynder det at alkalize under frigivelse af FITC-dextran indholdet. Således, på tidspunktet en anden SG sikringer med den første sekventielt, fluorescens af de første SG svinder på grund af frigivelsen af FITC-dextran. Men den anden SG alkalizes, hvilket resulterer i et FITC-flash, der vises ved siden af den første SG. Dette tal blev tilpasset fra Klein et al. 33 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dual imaging mStr-CA-Rab5 og FITC-dextran. RBL celler var Co transfected med 20 µg af HA-wt-SNAP23 og 10 µg for mStr-CA Rab5A. Celler var forud inkuberet med FITC-dextran og IgE og udløses med Ag, som beskrevet i figur 1. (a) en serie af billeder, opfange hændelsen fusion mellem en quenched SG (hvid pil) og en SG, har allerede smeltet med plasma membran og er derfor fluorescerende. 15,8 minutter, har quenched SG sammensmeltet med dens nærliggende SG og begyndt at få fluorescens. De boxed områder er udvidet på nederst til venstre på hvert tidspunkt. (b) præsentation af både mSTR-CA Rab5A (med rødt) og FITC-dextran (i grønt) fra de tilsvarende tid point vist i litra a viser fusion mellem de to SGs. billeder blev erhvervet af Konfokal mikroskopi (åben pinhole) ved hjælp af en Plan-apochromat x63-NA 1,4 mål. Dette tal blev tilpasset fra Klein et al. 33 den fulde film finder Klein et al. 33 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Dual imaging NPY-mRFP og FITC-dextran under alkalization af SG af NH4Cl. RBL celler blev transfekteret med shRab5, pre inkuberes med FITC-dextran og IgE og udløses med Ag, som beskrevet i figur 1. (a) celler blev visualiseret ved time-lapse Fluorescens mikroskopi. Udpeget gange i billederne er minutter efter udløsning med Ag. Billeder blev erhvervet af Konfokal mikroskopi ved hjælp af en Plan-apochromat x63-NA 1,4 mål. (b) kvantitativ analyse af forsøget vist i litra a. Hver linje i graferne er den gennemsnitlige fluorescens af FITC på en region af interesse (ROI) i en enkelt celle. Pilen peger på tidspunktet for NH4Cl (20 mM) tilføjelse. Barer = 5 µm. Dette tal blev tilpasset fra Klein et al. 33 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi, hvordan opsporing fluorescens af FITC-dextran indlæst ind SGs kan bruges til at specifikt fange sammensatte exocytose begivenheder. Dette blev opnået ved at indstille mikroskop til at erhverve et billede hvert 15 sekund, hvilket sikrer at kun langvarige begivenheder vil blive registreret over tid og derfor undtagen kort begivenheder, der ville svare til fuld exocytose eller kys og Kør exocytose. For at fastlægge metoden, viste vi at knockdown af Rab5 isoformer, der udtrykkes i RBL celler, og er afgørende for sammensatte exocytose, eliminerer muligheden for at fange begivenheder af FITC-dextran frigivelse, mens den overordnede sekretionen af cellen ikke er påvirket.

Den mest fremtrædende Ulempen ved metoden er, at det kun gælder for celler, der indeholder sure SGs. Dog er mest fremtrædende fordelen ved metoden, at det er baseret på enkle inkubation af celler med FITC-dextran, uden at kræve Transfektion. Andre pH-følsom journalister, der bruges til at studere regulerede exocytose og inddrage SG last eller SG membran protein-sammenvokset til phlourin, en pH-følsom normal god landbrugspraksis variant (f.eks NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, og synapto-phluorin48, 49,50,51,52), kan mere nøje repræsenterer SGs endogene sammensætning. Dog, deres anvendelse medfører Transfektion af celler, som kan være mindre egnet til celler, der er vanskelige at transfect. Derfor, hvornår studerer celler der er vanskeligt at transfect eller under eksperimentelle betingelser, der kræver flere genomisk manipulationer, brug af et stof, der blot kan suppleres i cellekulturmedium, såsom FITC-dextran, er fordelagtigt. Vores protokol kan kræve celle specifikke justeringer til at rumme forskelle i kinetik af exocytose af forskellige typer68. Derfor bør valgte tidsintervallet for image erhvervelse optimeres. For RBL celler har vi set-up mikroskop til at fange et nyt billede hver 15 sekunder, hvilket i IgE/Ag udløst RBL celler tillod os at visualisere kun langvarige begivenheder, hvorved den eksklusive sporing af sammensatte exocytose begivenheder.

En anden faktor, der skal overvejes er typen af dextran skal anvendes. En række dextrans, der varierer i deres Molekylær vægt er tilgængelige. Det er derfor vigtigt at vælge den passende dextran som reporter, under hensyntagen til de potentielle virkninger, som forskellige dextrans kan have på celler. For eksempel har lavmolekylære dextrans vist sig at aktivere MCs og fremkalde sekretion71,72,73,74. Lavmolekylære dextrans ville derfor ikke være passende journalister for MC sekretion. Forskelle i celle reaktivitet mod dextrans blev også bemærket i forskellige rotte stammer75eller under forskellige co-stimulatory betingelser71,76,77,78. Her, har vi valgt at bruge en 150 K FITC-dextran, der tidligere har været studeret i RBL cellelinie og vist sig at være ineffektive i inducerende sekretion18,79.

Lyskilden skal være markeret, er også afgørende for protokollen. Når ved hjælp af en Konfokal mikroskop, er lyskilden traditionelt laser-baseret. For at undgå toksicitet, er det således nødvendigt at vælge en lav laser power. Ønskede laser power varierer mellem mikroskoper, afhængigt af den type og alder af laser. Desuden er ønskede laser power også afhængig af typen af detektoren anvendes. For eksempel, når du bruger en fælles detektor som en photomultiplier tube-baserede detektor, en højere magt laser vil være behov for end når du bruger en moderne hybrid detektor (f.eks. en photomultiplier tube og en lavine foto-dioder hybrid detector). Vi anbefaler at bruge den laveste laser power muligt og højst 10% af laser power.

I Resumé indlæst overvågning, dequenching af SG FITC-dextran af tid bortfalder-mikroskopi under omhyggeligt valgte indstillinger tillod os at udelukkende capture sammensatte exocytose i RBL MCs, høj grad at lette identifikationen af de molekylære enheder regulere denne proces. Denne metode kunne reguleres yderligere for at skelne fuld fra kys og Kør exocytose ved at reducere og omhyggeligt kalibrere tidsintervallet mellem billede erhvervelser til at gøre det muligt at skelne mellem de kortvarige blinker forbundet med kys og Kør exocytose fra de endnu kortere blinker, der ledsager fuld exocytose. Sådanne forhold ville fange både sammensatte og kys og Kør exocytose der kunne derefter adskilles baseret på varigheden af signalet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen konkurrerende økonomisk interesse

Acknowledgments

Vi takker Dr. U. Ashery for den generøse gave af cDNA. Vi takker Drs. G. masse, L. Mittleman, M. Shaharbani og Y.Zilberstein fra Sackler cellulær & Molekylær Imaging Center for deres uvurderlige assistance med mikroskopi. Dette arbejde blev støttet af USA og Israel binationale Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel og S.J.Galli) og give 933/15 fra Israel Science Foundation, grundlagt af Israel akademi for Videnskaber (til R.Sagi-Eisenberg ) og NIH tilskud U19 AI 104209 og R01 AR067145 (til S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

Biologi sag 136 FITC-dextran regulerede exocytose sammensatte exocytose levende celle imaging lysosomet-relaterede organeller pinocytosis
Imaging FITC-dextran som Reporter for regulerede exocytose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter