Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Hier zeigen wir eine Methode für das live Cell Imaging von regulierten Exozytose. Diese Methode nutzt FITC-Dextran, die reichert sich in Lysosomen-bezogene Organellen, als Reporter. Diese einfache Methode ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen verschiedenen Modi der regulierten Exozytose in Zellen, die schwer zu genetisch zu manipulieren sind.

Abstract

Regulierten Exozytose ist ein Prozess, der durch den Ladung, die in sekretorischen Granulat (SGs) gespeichert ist, als Reaktion auf einen sekretorischen Auslöser freigegeben wird. Regulierten Exozytose ist von grundlegender Bedeutung für die interzelluläre Kommunikation und ist ein wichtiges Instrument für die Sekretion von Neurotransmitter, Hormone, Entzündungsmediatoren und andere Verbindungen, durch eine Vielzahl von Zellen. Mindestens drei verschiedene Mechanismen sind bekannt für regulierte Exozytose: volle Exozytose, wo ein einziges SG voll mit der Plasmamembran, Kiss-and-Run Exozytose verschmilzt, wo ein einziges SG vorübergehend mit der Plasmamembran verschmilzt, und zusammengesetzte Exozytose, wo mehreren SGs verschmelzen miteinander, vor oder nach SG-Fusion mit der Plasmamembran. Die Art der regulierten Exozytose durchgeführt von einer Zelle wird häufig durch die Art der sekretorischen Trigger vorgeschrieben. Jedoch kann in vielen Zellen, sekretorische einabzug mehrere Modi der regulierten Exozytose gleichzeitig aktivieren. Trotz ihrer Fülle und Bedeutung über Zelle Arten und Arten sind die Mechanismen, die die verschiedenen Modi der Sekretion bestimmen weitgehend ungelöst. Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung der verschiedenen Verkehrsträger regulierten Exozytose ist die Schwierigkeit bei der Unterscheidung zwischen ihnen, als auch separat zu erkunden. Hier beschreiben wir die Verwendung von Fluorescein erfolgt (FITC)-Dextran als Exozytose Reporter und live Cell imaging, um zu unterscheiden, die verschiedene Wege der regulierten Exozytose, mit Schwerpunkt auf zusammengesetzte Exozytose, basierend auf die Robustheit und Dauer der Exocytic Ereignisse.

Introduction

Regulierten Exozytose ist der primäre Mechanismus durch die leicht gemachte Cargo von sekretorischen Zellen als Reaktion auf einen bestimmten Auslöser freigegeben wird. Die Ladung ist vorgeformt und abgesondert in sekretorischen Vesikel, in denen es gespeichert wird, bis ein Auslöser das Signal für die Veröffentlichung von Inhalten der SGs überträgt. Verschiedene Arten von Signalen können in verschiedenen Modi der regulierten Exozytose, oder verschiedene Modi der regulierten Exozytose können gleichzeitig auftreten. Drei Hauptmodi des regulierten Exozytose sind bekannt: volle Exozytose, einhergehende vollständige Verschmelzung von einem einzigen sekretorischen Granulat mit der Plasmamembran; Kiss-and-Run Exozytose, die vorübergehende Verschmelzung von sekretorischen Granulat mit der Plasmamembran, gefolgt von seiner Wiederverwertung beinhaltet; und zusammengesetzte Exozytose, charakterisiert durch homotypische Verschmelzung von mehreren SGs vor (d.h. multigranular Exozytose) oder sequenziell (d.h., sequentielle Exozytose) zur Fusion mit der Plasmamembran1. Zusammengesetzte Exozytose den umfangreichsten Modus der Fracht Release2, gilt als es die schnelle Sekretion von Fracht ermöglicht, einschließlich von SGs, die sich distal von der Plasmamembran. Zusammengesetzte Exozytose ist dokumentiert worden, in beiden exokrinen und endokrinen Zellen3,4,5,6,7,8,9, sowie in Immunzellen. In Immunzellen, wie eosinophile10,11,12 und neutrophile13ermöglicht zusammengesetzte Exozytose die schnelle und robuste Freisetzung von Mediatoren, die eindringende Krankheitserreger wie töten müssen Bakterien oder Parasiten. Mastzellen (MCs) bereitstellen zusammengesetzte Exozytose für die effiziente Freisetzung von Entzündungsmediatoren vorgespeicherten während der angeborenen Immunantwort, Anaphylaxie und andere allergische Reaktionen14,15,16 , 17. da die verschiedenen Modi der Exozytose18,19gleichzeitig auftreten können, ist es eine Herausforderung unterschieden in Echtzeit oder zu identifizieren, ihre jeweiligen Fusion Maschinen, daher verdeutlichend geworden die zugrunde liegenden Mechanismen.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, basierend auf live Cell Imaging Zelle geladen FITC-Dextran, das Echtzeit-Tracking der Exocytic Ereignisse und die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Modi erlaubt. Unsere Methode ermöglicht insbesondere, exklusive Überwachung der zusammengesetzten Exozytose.

FITC-Dextran ist ein Konjugat pH-Sensitive Fluorophor FITC mit Glucan Polysaccharid Dextran. Eindringmittel beschrifteten Dextrans nachweislich in die Zelle eindringen von Micropinocytosis20,21 und Macropinocytosis22,23. Als endocytic Fächer in Lysosomen Reifen, hat sich gezeigt, dass FITC-Dextran sammelt sich in den Lysosomen mit keine offensichtliche Verschlechterung. Jedoch da FITC ein hochsensibler pH Fluorophor-24 istund das Lysosomen Lumen sauer ist, stillt FITC-Dextran Fluoreszenz bei Erreichen der Lysosomen-24. So gezielt Fracht, zusammen mit der pH-Empfindlichkeit der FITC Dextrans als Lysosomen zu etablieren, haben den Grundstein für die Nutzung der FITC-Dextran in Studien der Lysosomen Exozytose25,26,27 , 28 , 29.

In mehreren Zelltypen, einschließlich MCs, neutrophile, eosinophile, zytotoxischen T-Zellen, Melanosomen und andere die SGs lysosomale Anzeigefunktionen und gelten als Lysosomen-bezogene Organellen (LROs) oder sekretorische Lysosomen30,31 . Da LROs einen sauren luminalen pH haben, kann FITC-Dextran verwendet werden, ihre Exozytose, als Folge der höheren pH-Wert, verbunden mit der Auslagerung der LROs zu visualisieren. In der Tat, FITC-Dextran wurde zur Exozytose MCs18,32,33zu überwachen. Bei dieser Methode ist FITC-Dextran hinzugefügt, um die Zellkultur, durch Pinocytose von den Zellen aufgenommen und in die SGs sortiert. Wie es in Lysosomen, wird FITC Fluoreszenz in der SGs abgeschreckt, wenn sie innerhalb der Zelle sind. Allerdings gewinnt bei SG Fusion mit der Plasmamembran und konsequente Exposition gegenüber dem äußeren Milieu, FITC-Dextran seine Fluoreszenz steigendem pH-Wert SG ermöglicht die einfache Verfolgung von Exocytic Veranstaltungen live Zelle Mikroskopie. Hier haben wir diese Methode, um einzigartige Tracking von zusammengesetzten Exozytose ermöglichen angepasst.

Zwei andere Methoden haben zuvor verwendet worden, um zusammengesetzte Exozytose zu verfolgen. Elektronenmikroskopie war die erste Methode zur Charakterisierung von Exocytic Strukturen, die das Auftreten von verschiedenen Modi der Exozytose vorgeschlagen. Insbesondere führte zu der Hypothese des zusammengesetzten Exozytose Beobachtungen "sekretorischen Tunnel" in pankreatischen acinar Zellen34 und MCs35,36,37 . Jedoch während die hochauflösende Elektronenmikroskopie verschmolzenen Vesikel offenbaren kann, kann nicht verfolgen die Dynamik ihrer Fusion und daher kann nicht festlegen, ob sie SG Fusion bei zusammengesetzten Exozytose oder Verschmelzung von zurückeroberten Granulat entsprechen nach ihrer Endozytose. Dieses Hindernis ist in anderen Methoden überwinden, die Exozytose in lebenden Zellen, wie z. B. Patch Clamp-Messungen der Plasmamembran Kapazität11,13,38,39 oder strommesstechnik messen können 40 der Medien. Allerdings spannen Patch erfordert eine spezielle Set-up und möglicherweise nicht geeignet für alle Zelltypen. Strommesstechnik Messungen sind in der Lage, Exozytose zu verfolgen, nur dann, wenn die Ladung in unmittelbarer Nähe an der Elektrode freigegeben wird. Mit live Cell Imaging bietet daher einen Vorteil gegenüber diesen Methoden, da es nicht nur Echtzeit-Tracking der Exozytose ermöglicht, sondern es auch schnelle und einfache Erfassung von Daten aus der gesamten Zelle erlaubt.

Das Tracking der FITC-Dextran live Zelle Mikroskopie bietet auch einige Vorteile zu anderen live Cell Imaging-basierte Methoden. Zum Beispiel ist eine weit verbreitete Methode Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) der Zellen geladen mit einer fluoreszierenden SG-Sonde oder mit dem Ausdruck eine fluoreszierende Protein markiert SG Fracht oder Membran Protein26,41, 42 , 43. die Stärke dieser Methode liegt in seiner Fähigkeit, ausschließlich Ereignisse zu überwachen, die auftreten, in der Nähe der Plasmamembran (hier "Fußabdruck" bezeichnet), daher Exocytic Veranstaltungen. Dies ist jedoch auch der Nachteil dieser Methode, da nur die Zelle Teil, die grenzt an das Deckglas und nah an den Mikroskop-Objektiv kann44abgebildet. Ob solche Fußabdrücke in der Tat die gesamte Zelle Membranoberfläche darstellen ist noch fraglich45,46,47. In dieser Hinsicht ermöglicht die Verwendung eines pH-sensitiven Farbstoffs wie FITC-Dextran und ein standard Fluoreszenzmikroskop oder ein confocal Mikroskop mit einer offenen Lochkamera Bildgebung der ganzen Zelle, so erfassen die totale Exocytic Ereignisse, die in dieser Zelle auftreten.

Weitere pH-Sensitive-Reporter, die verwendet werden, um regulierte Exozytose studieren durch ganze Zelle Bildgebung oder TIRFM gehören SG Fracht oder SG Membranprotein verschmolzen, Phlourin, eine pH-Sensitive-GFP-Variante. Beispiele sind NPY - Phlourin-, β-Hexoseaminidase-Phlourin und Synapto-Phluorin48,49,50,51,52. Während Ausdruck dieser Sonden die endogene Zusammensetzung des SGs genauer darstellen kann, es beinhaltet Transfektion von Zellen, und kann daher für die Zellen, die schwer zu transfizieren sind weniger geeignet. Daher, wenn Studium Zellen sind schwer zu transfizieren oder unter experimentellen Bedingungen, die mehrere genomische Manipulationen erfordern die Verwendung einer Verbindung, die einfach in das Zellkulturmedium wie FITC-Dextran, ergänzt werden kann ist vorteilhaft . FITC-Dextran bietet auch einen Vorteil gegenüber Acridin orange (AO), ein anderer pH-Sensitive-Farbstoff, der für die Verfolgung von Exozytose von live Zelle Mikroskopie53,54,55,56 verwendet wurde , 57 , 58. AO hat gezeigt, dass die Photolyse von Vesikeln zu induzieren, dass führen zu falschen Blitze, die nicht zum eigentlichen Sekretion entsprechen27verarbeitet. Im Gegensatz dazu reflektiert FITC-Dextran bessere Sekretion Veranstaltungen, wahrscheinlich aufgrund seiner geringen Foto-induzierte Produktion von reaktiven Sauerstoff-27.

Bemerkenswert ist ein alternativer Ansatz für das Studium Exozytose durch die Verfolgung des Zustroms von ein Farbstoff aus dem externen Medium in der SG durch die Fusion Pore, die während dieses Prozesses wird geöffnet. In diesem Fall wird der Farbstoff auf das externe Medium neben der sekretorischen Trigger hinzugefügt. Dann, wenn die Fusion Pore geöffnet wird, diffundiert der Farbstoff in der SG59,60. Ein klarer Vorteil dieser Methode ist, dass es auch die Möglichkeit bietet, die Fusion Porengröße, durch den Einsatz von Farbstoffen von variabler Größe zu schätzen. Beispielsweise können Dextrans von unterschiedlichem Molekulargewicht (MW), konjugiert zu verschiedenen Fluorophore, als extrazelluläre Farbstoffe verwendet werden wobei die maximale Größe der Dextran, die die SG durchdringen kann die Größe der Fusion Pore59, entsprechen würde 61 , 62 , 63 , 64. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht erfordern den Einsatz einer pH-Sensitive-Sonde. Ein wesentlicher Nachteil ist jedoch, dass das Signal-Rausch-Verhältnis sehr gering ist, da eine große Menge an Farbstoff während der Aufnahme von Bildern, was zu hohen Hintergrund in den Medien präsent ist.

Die Verwendung von FITC-Dextran als ein Marker für die Exozytose überwindet insgesamt mehrere Nachteile in zuvor gemeldeten Methoden wie Signal-Rausch-Verhältnis, Toxizität, dynamische Tracking und Komplexität.

Hier beschreiben wir die Verwendung von FITC-Dextran, zusammengesetzte Exozytose in der RBL - 2 H-3 Mast Zell-Linie (hier bezeichnet als RBL, in erster Linie festgelegten Eccleston Et Al. zu überwachen 65 und weitere geklont von Barsumian Et Al. ( 66), als Reaktion auf Immunglobulin E (IgE) / Antigen (Ag) Aktivierung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vorbereitungen

  1. Vorbereitung der RBL Nährmedien
    1. Mix 500 mL niedrige Glukose Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 56 mL fetalen bovine Serum (FBS), 5,5 mL Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung, 5,5 mL L-Glutamin 200 mM Lösung. Dies führt zu niedrigen Blutzucker DMEM mit 10 % FBS, 100 µg/mL Streptomycin, 100 Einheiten/mL Penicillin, 12 Einheiten/mL Nystatin und 2 mM L-Glutamin ergänzt.
    2. Filtermedien Sie die mit einem Top-Vakuum-Filter von 0,22 µm Porengröße und Store bei 4 ° c
  2. Wartung von RBL-Zellen.
    1. Wachsen Sie RBL-Zellen auf eine maximale Konfluenz von 90 % in einer 10 cm Petrischale. Wenn die Zellkultur gesund ist, sollten die Zellen eine Spindel Form mit gelegentlichen Vorsprünge aufweisen.
    2. Lösen Sie für Zelle aufteilen die Zellen aus der Schale durch Absaugen der Medien und ersetzt mit 2 mL Trypsine/EDTA Lösung B. Incubate für 5-10 Minuten in eine feuchte Atmosphäre 5 % CO2 bei 37 ° C.
    3. Sobald die Zellen getrennt haben, neutralisieren die Trypsin durch Zugabe von 2 mL von Nährmedien, mit einer Pipette und Teilen von Zellen in einer 1:2-1:10-Verhältnis.
  3. Vorbereitung von 20 x Tyrode Puffer
    1. Bereiten Sie ein Lager 20 x 54 mM KCl-Lösung, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl und 8 mM NaH2PO4 in doppelt destilliertem Wasser (DDW). Gut mischen und bei 4 ° c Lagern

(2) Kultur der RBL-Zellen für Live Cell Mikroskopie

  1. Vorbereitung der FITC-Dextran-Lösung.
    1. Mischen Sie 1 mg FITC-Dextran-Pulver (150 K) pro 1 mL der Nährmedien (siehe Schritt 1.1.1). Bereiten Sie eine volle gekammerten Deckglas 3 mL.
    2. Mit einer Cellulose-Acetat-Spritze-Filtereinheit mit 0,22 µm Porengröße, Filtern Sie die gelösten FITC-Dextran.
    3. Eine Konzentration von 1 µg/mL Maus IgE hinzufügen.
  2. Aussaat von RBL-Zellen für die Bildgebung
    1. Am Vortag Bildgebung, Aspirieren Sie die Medien aus der Kulturschale und ersetzen mit 2 mL Trypsine/EDTA Lösung B. Incubate für 5-10 Minuten in eine feuchte Atmosphäre 5 % CO2 bei 37 ° C. Sobald die Zellen getrennt haben, neutralisieren Sie die Trypsin durch Zugabe von 2 mL Nährmedien.
    2. Graf RBL Zellen mit einem Hemocytometer und stellen Sie die Lautstärke entsprechend mit Nährmedien Zellkonzentration von 7,5 x 105/mL erhalten.
    3. Fügen Sie 10 µL Zellsuspension auf einer gekammerten Deckglas vorausgefüllt mit frischen FITC-Dextran Nährmedien ergänzt (Dies führt Aussaat von 7,5 x 103 Zellen in einer Kammer).
    4. Zellen Sie RBL über Nacht in einer humifizierten Atmosphäre des 5 % CO2 bei 37 ° C. Die Zellen sollte in einer Sub-konfluierende Ebene bleiben, um sicherzustellen, dass die Zellen voneinander getrennt sind und dass es einfach ist, jede Zelle einzeln unter dem Mikroskop zu erkennen.
  3. Transfektion von Zellen RBL - optional.
    1. Exocytic Veranstaltungen in Kombination mit anderen eindringmittel tagged Proteinen imaging, finden Sie unter Transfektion Protokoll für RBL Zellen in Azouz Et al. 67

3. live Cell Mikroskopie der Exozytose

  1. Vorbereitung der Lösungen:
    1. Bereiten Sie eine endgültige Tyrode-Pufferlösung durch Verdünnung der Stammlösung in DDW in einem 01:20 Verdünnung und Ergänzung mit 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA und 5,6 mM Glukose.
    2. Frisch zubereiten ein 20 X sekretagog Reagenz in Tyrode Puffer [1 µg/mL Dinitrophenyl konjugiert, menschliches Serumalbumin (DNP-hat (Ag)) in unserem Fall für eine 50 ng/mL 1 X Konzentration].
    3. Bereiten Sie eine 400 mM-Ammoniumchlorid-Lösung durch Auflösen von Pulver in Tyrode Puffer.
  2. Vorbereitung der Zellen.
    1. Waschen Sie die gekammerten Deckglas 3 Mal durch Absaugen der Medien aus der Kammer und Befüllen es mit 300 µL Tyrode Puffer, auf 37 ° c vorgewärmt Schließlich ergänzen Sie die Kammer mit 300 µL Tyrode Puffer, auf 37 ° c vorgewärmt
    2. Legen Sie die gekammerten Deckglas in das Mikroskop Inkubator Kammer. Stellen Sie sicher, dass die Kammer stabil ist.
  3. Aufbau des Mikroskops
    1. Wählen Sie eine Region von Interesse zu verfolgen, schalten Sie die fluoreszierenden Lichtquelle (traditionell einer Quecksilber-Lampe) und wählen Sie den entsprechenden Fluoreszenz-Filter (Wählen Sie den Filter für grüne Fluorophore für die Anzeige von FITC-Dextran). Die Region von Interesse steht im Mittelpunkt und ist in der Mitte das Sichtfeld, Ausschalten der Lichtquelle um Foto-Bleichen und Toxizität zu vermeiden.
      Hinweis: Einige der FITC-Dextran, integriert in den Zellen kann Fluoreszenz behalten. Und zwar deshalb, weil FITC-Dextran auch auf nicht-lysosomale Fächer wie Endosomen sortiert werden kann.
    2. Aktivieren Sie die entsprechende Beleuchtung für FITC Erregung. Wenn ein Laser-basierten Mikroskop verwenden, schalten Sie den 488 nm-Laser. Emission sollte gesammelt werden, um 500-550 nm (FITC Emission Peaks bei 510-520 nm).
    3. Wenn ein confocal Mikroskop verwenden, öffnen Sie das Loch bis zum Maximum. Dadurch kann mit geringer Laserleistung, Bleichen zu vermeiden und Toxizität und sorgt für die Erfassung von Exozytose Ereignisse aus allen Ebenen der Zelle.
    4. Kalibrieren Sie das Zeitintervall zwischen Bild übernahmen.
      1. Verschiedene Zellen variieren in ihrer Kinetik der regulierten Exozytose68. Für spezielle Aufnahmen von zusammengesetzten Exozytose empfehlen wir einen zeitlichen Abstand von mindestens 5 Sekunden. Jedoch als eine Faustregel, um schnelle Bildgebung zu ermöglichen, stellen Sie sicher, dass die Übernahme eines einzelnen Frames schnell ist.
      2. Bei der Verwendung von konfokale Laserscanning-Mikroskop legen Sie die Scan-Richtung auf Bi-direktionale, nicht erlauben für die Mittelung und 512 x 512 Auflösung festgesetzt (empfohlen, die letzteren beiden Bestimmungen hilft auch, um Bleichen und Toxizität zu minimieren).
  4. Bildgebung der Exozytose.
    1. Zellen für die gewünschte Dauer, je nach der Art der Zelle oder sekretagogum. Im RBL Zellen mit IgE/Ag ausgelöst treten die meisten Exocytic Ereignisse innerhalb von 15-20 min der Aktivierung.
    2. Für die Aktivierung der Zellen hinzufügen der Kammers 16 µL aus den 20 x sekretagog Lösung.
  5. FITC-Dextran-Präsenz in den Zellen zu bestätigen.
    1. Um das Vorhandensein und die Lokalisierung der FITC-Dextran, die SGs zu bestätigen, hinzufügen 16 µL Ammoniumchlorid-Lösung (darauf achten, nicht zu die Kammer um nicht den Fokus verlieren zu bewegen) an die Kammer vorsichtig (damit wird eine Endkonzentration von 20 mM). Dies wird induzieren Alkalisierung des SGs und dequenching der FITC Fluoreszenz, die innerhalb von Sekunden auftreten wird.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Abbildung 1a stellt schematisch wie FITC-Dextran als Reporter tätig werden kann für die Exozytose reguliert und die verschiedenen Modi der Exocytic Ereignisse zu rekapitulieren. Erstens sind Zellen mit FITC-Dextran, inkubiert, die durch Pinocytose verinnerlicht und sortiert die SGs. Da die SGs MCs LROs sind, ihre niedrige pH-Wert dämpft die Fluoreszenz der FITC, hier gezeigten Schwarz Granulat (A-C, ich). Wenn Zellen durch eine sekretagog und SGs verschmelzen mit der Plasmamembran ausgelöst werden, entsteht eine Fusion Pore, so dass Efflux von Protonen und Alkalisierung des SGs. Folglich gewinnt FITC seine Fluoreszenz (A, II). Volle Exozytose manifestiert sich in einem kurzen (weniger als 5 s) fluoreszierende Ereignis der exteriorized SG Membran vollständig in die Plasmamembran und FITC-Dextran zusammenbricht diffundiert Weg in das Kulturmedium (A, III). Während ein Kiss-and-Run Exocytic-Veranstaltung der SG Membran nur vorübergehend verschmilzt mit der Plasmamembran, was zu einer kurzlebigen Fusion Pore und daher nur eine kurze Ausbruch von Fluoreszenz als die SG schnell löst und seine Lumen säuert schnell wieder (B, III - IV). Schließlich, während zusammengesetzte Exozytose, eine Reihe von SGs nacheinander verschmelzen (folgende SG Fusion) untereinander sowie mit der Plasmamembran mit Wartung eine offene Fusion Pore. Dadurch ist eine viel größere Masse der FITC-Dextran dequenched, was zu einer großen und langlebigen Fluoreszenz platzen (C, III-IV), die zerfällt, wenn die Sonde in das externe Medium (C, V) diffundiert.

Wir haben dieses Modell verwendet und bestätigt seine Vorhersagen durch bildgebende Kontrollzellen und Zellen, die von Rab5, erschöpft sind, die wir gezeigt haben, für homotypische SG-SG Fusion69 und zusammengesetzte Exozytose33von entscheidender Bedeutung sein. Indem Erfassungszeit auf einem Bild alle 15 s, wir erwartet hatten, vor allem andauernde Ereignisse der Sekretion, d. h. zusammengesetzte Exozytose zu erkennen. In der Tat, wie in Abbildung 1 b, unsere Daten zeigen, dass während der Kontrolle viele große und lang anhaltende Exocytic Veranstaltungen Zellen aufgenommen werden konnten, nur wenige Ereignisse in Rab5 Knockdown Zellen (shRab5) aufgenommen wurden. Darüber hinaus waren Ereignisse, die in den shRab5 Zellen aufgezeichnet waren deutlich kleiner im Vergleich zu Veranstaltungen in der Kontrollzellen aufgezeichnet. Der Hinweis bleibt der sekretorische Kapazität der shRab5 Zellen unter den gleichen Bedingungen69, was darauf hindeutet, dass während shRab5 zusammengesetzte Exozytose hemmt, es nicht, Sekretion abschaffen unverändert. Daher ermöglicht bildgebende FITC-Dextran-Fluoreszenz in langen Zeitabständen zum spezifischen Nachweis von zusammengesetzten Exozytose. Darüber hinaus ermöglicht bildgebende FITC-Dextran-Version der sequentiellen Natur des zusammengesetzten Exozytose erfassen. Wie durch den Pfeil in Abbildung 1 b, Anschluss an einen Lichtblitz, beginnt ein zweiter Blitz als eine schwache Blitz, der neben das erste man ist. Dies kann als die Verschmelzung von einer SG mit einem SG abgeleitet werden, die bereits im Zuge der Fusion mit der Plasmamembran (d.h., sequentielle Exozytose) geht. Daher, wie das zweite Untermodul "mit dem ersten Modul Sicherungen, die bereits durch eine Pore Fusion mit der Plasmamembran verbunden ist der pH-Wert des zweiten Granulat erhöht sowie und FITC Fluoreszenz dequenches, mit einem zweiten Ausbruch von Fluoreszenz. Ein solches Szenario der FITC-Dextran-Version bei der sequenziellen Fusion der angrenzenden SGs ist in Abbildung 1 cvorgestellt.

Ein weiteres Beispiel für sequentielle Verschmelzung von SGs bei zusammengesetzten Exozytose ist in Abbildung 2dargestellt. RBL-Zellen wurden mit einer konstitutiv aktiv (CA) Form von Rab5a und WT SNAP-23, Bedingungen, unter denen zusammengesetzte Exozytose robuster33wird, Co transfizierten. Bildgebung der CA Rab5a, das ist wichtig für die SG-SG-Fusion und große SGs33,69, zusammen mit FITC-Dextran, Beschichtung ist erlaubt bessere Visualisierung der Verschmelzung eine kleinere Körnchen mit eine größere Körnung CA-Rab5a dekoriert.

Da FITC-Dextran gestillt wird, wenn innerhalb der SG gespeichert, ist es notwendig, eine Technik zur Überprüfung, ob FITC-Dextran in der SGs in der Tat vorhanden ist. Dies wird sogar noch wichtiger, wenn ein Experiment unter Bedingungen Vorformen die Sekretion abschaffen sollen. Um dieses Hindernis zu überwinden, wurde der Kammer am Ende jedes Experiments 20 mM von Ammoniumchlorid hinzugefügt. Diese Behandlung erhöht den pH-Wert im Inneren der SGs, zulassend FITC Fluoreszenz. Wie in Abbildung 3dargestellt, nach Zugabe von Ammoniumchlorid zu den Medien, FITC-Dextran sichtbar und wird gemeinsam mit mRFP getaggt NEUROPEPTID Y, die ein SG-Reporter im RBL Zellen70ist lokalisiert.

Figure 1
Abbildung 1: spezifische Erkennung des zusammengesetzten Exozytose. (a) ein Diagramm beschreibt, wie Änderungen in FITC-Dextran Fluoreszenz die verschiedenen Modi der regulierten Exozytose rekapitulieren. (b) Leben Zelle, die Darstellung der FITC-Dextran in RBL Zellen NPY-mRFP und entweder mit pSilencer oder shRab5 transfiziert, wie angegeben. Transfektion erfolgte wie zuvor beschrieben67,70. Kurz, 1,5 x 107 RBL Zellen wurden in Transfektion Puffer (DMEM ergänzt mit 20 mM K-Rohre pH 7, 10 µM Ca2 + Acetat, 2 mM Mg2 + Acetat, 128 mM Kalium Glutamat) Nukleinsäuretablette mit 15 µg NPY-mRFP und entweder 30 µg von pSilencer oder 15 µg shRab5A und 15 µg shRab5B/C. Transfektion wurde durch Elektroporation bei 300 V und eine 20 mSec Impulslänge erreicht. Zellen wurden sofort in Kulturmedium mit 1 mg/mL FITC-Dextran formulierte. Nach 24 Stunden waren Zellen mit 1 µg/mL IgE sensibilisiert und für weitere 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal in voller Tyrode-Puffer gewaschen und von 50 ng/mL der DNP-HSA (Ag) aktiviert. Zellen wurden durch Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Der weiße Pfeil in den pSilencer Bildern verweist auf ein Platzen der FITC Fluoreszenz und der weiße Kreis markiert eine entladene SG. Der weiße Pfeil in den shRab5A/B/C-Bildern zeigt Minute fluoreszierende Ereignisse in Rab5-Zuschlag Zellen, voraussichtlich voll Exozytose hindeuten. Der Hinweis wurde die Intensität des ShRab5 Bildes erhöht, um die Erkennung des Signals zu ermöglichen. Bilder wurden von einem confocal Mikroskop, ausgestattet mit einer beheizten Kammer (37 ° C) und CO-2 -Controller (4,8 %) und eine C-Apochromat X63/1.2 W Corr Ziel, unter offenen Lochkamera Einstellung übernommen. Für die vollständige Filme beziehen sich auf Klein Et al. 33 (c) eine schematische Darstellung des Fusionsprozesses homotypische SG in (b) gezeigt. Im Detail wie die ersten SG mit der Plasmamembran verschmilzt und eine Fusion Pore legt fängt an, während die Freigabe inhaltlich FITC-Dextran alkalisieren. So verschmilzt mit der Zeit eine zweite SG mit dem ersten in einer sequenziellen Weise, die Fluoreszenz der ersten SG-verblasst durch die Freisetzung von FITC-Dextran. Jedoch alkalizes die zweite SG, woraus sich ein FITC-Blitz, der neben der ersten SG angezeigt wird. Diese Zahl wurde von Klein Et al. 33 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Dual Bildgebung mStr-CA-Rab5 und FITC-Dextran. RBL-Zellen wurden mit 20 µg von HA-wt-SNAP23 und 10 µg mStr-CA Rab5A Co transfizierten. Zellen wurden vorab mit FITC-Dextran und IgE inkubiert und ausgelöst mit der Ag, wie in Abbildung 1beschrieben. (a) eine Reihe von Bildern erfassen eine Fusion Event zwischen einem abgeschreckt SG (weißer Pfeil) und eine SG, die hat bereits mit der Plasmamembran fusioniert und deshalb fluoreszierend. 15,8 Minuten hat die abgeschreckt SG verschmolzen mit seinen benachbarten SG und damit begonnen, Fluoreszenz zu gewinnen. Die geschachtelte Bereiche werden am linken unteren Rand jeden Zeitpunkt vergrößert. (b) Präsentation des mSTR-CA Rab5A (in rot) und FITC-Dextran (in grün) aus den entsprechenden Zeitpunkten angezeigt (a), demonstrieren die Fusion zwischen den beiden SGs. Bilder von konfokalen Mikroskopie (offene Pinhole) mit einer Plan-Apochromat erworben wurden X63-NA 1.4 Ziel. Diese Zahl wurde von Klein Et al. Sehen Sie 33 für den ganzen Film Klein Et al. 33 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Dual Bildgebung von NPY-mRFP und FITC-Dextran während Alkalisierung des SG von NH4KL. RBL-Zellen wurden mit shRab5 transfiziert, vorab mit FITC-Dextran und IgE inkubiert und ausgelöst mit der Ag, wie in Abbildung 1beschrieben. (a) Zellen wurden durch Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Bestimmten Zeiten in den Bildern sind wenige Minuten nach dem Auslösen mit Ag. Bilder von konfokalen Mikroskopie mit einer Plan-Apochromat X63-NA 1.4 Ziel erworben. (b) Quantitative Analyse des Experiments gezeigt (a). Jede Zeile in den Diagrammen ist die durchschnittliche Fluoreszenz der FITC in einer Region of Interest (ROI) über eine einzelne Zelle. Der Pfeil zeigt auf die Zeit des NH4Cl (20 mM) Ergänzung. Balken = 5 µm. Diese Zahl wurde von Klein Et al. 33 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschreiben wir wie Tracing die Fluoreszenz der FITC-Dextran in SGs geladen verwendet werden kann um speziell zusammengesetzte Exozytose Ereignisse zu erfassen. Dies wurde erreicht durch das Mikroskop, alle 15 Sekunden ein Bild zu erwerben, damit nur lang andauernde Ereignisse im Laufe der Zeit aufgezeichnet werden und daher ohne kurze Ereignisse, die volle Exozytose oder Kiss-and-Run Exozytose entsprechen würde. Um die Methode zu etablieren, haben wir gezeigt, dass Knockdown von Rab5-Isoformen, die sind in RBL Zellen exprimiert und sind entscheidend für zusammengesetzte Exozytose, beseitigt die Fähigkeit, Ereignisse der FITC-Dextran-Version, zu erfassen, während die gesamte Sekretion von der Zelle nicht beeinträchtigt wird.

Der bekannteste Nachteil der Methode ist, dass es gilt nur für Zellen mit sauren SGs. Der prominenteste Vorteil der Methode ist jedoch, dass es ohne Transfektion auf einfache Inkubation der Zellen mit FITC-Dextran, basiert. Andere pH-Sensitive-Reporter, die verwendet werden, zu studieren regulierten Exozytose und beinhalten SG Fracht oder SG-Membran-Protein verschmolzen, Phlourin, eine pH-Sensitive-GFP-Variante (z. B. NPY - Phlourin-, β-Hexoseaminidase-Phlourin und Synapto-Phluorin48, 49,50,51,52), kann mehr eng die endogene Zusammensetzung des SGs vertreten. Allerdings bringt ihren Einsatz Transfektion von Zellen, die möglicherweise weniger geeignet für Zellen, die schwer zu transfizieren. Daher, wenn studieren, die Zellen sind schwer zu transfizieren oder unter experimentellen Bedingungen, die mehrere genomische Manipulationen erfordern die Verwendung einer Verbindung, die einfach im Zellkulturmedium wie FITC-Dextran, ergänzt werden kann ist vorteilhaft. Unser Protokoll erfordern Zelle spezifische Anpassungen, Unterschiede in der Kinetik der Exozytose von verschiedenen Zelle Arten68unterzubringen. Daher sollte der gewählten Zeitintervall für die Bildaufnahme optimiert werden. Für RBL Zellen haben wir Setup das Mikroskop, um ein neues Bild alle 15 Sekunden erfassen die in IgE/Ag RBL Zellen ausgelöst erlaubt uns nur lang andauernde Ereignisse visualisieren wodurch die exklusive Verfolgung von zusammengesetzten Exozytose Veranstaltungen.

Ein weiterer Faktor, der berücksichtigt werden muss ist die Art von Dextran verwendet werden. Gibt es eine Vielzahl von Dextrans, die in ihrer Molekulargewichte variieren. Daher ist es wichtig, wählen die entsprechende Dextran als Reporter, unter Berücksichtigung der möglichen Auswirkungen, die verschiedenen Dextrans auf Zellen haben könnte. Zum Beispiel wurden niedermolekularen Dextrans aktivieren MCs und induzieren Sekretion71,72,73,74gezeigt. Niedermolekularen Dextrans wäre daher nicht angemessen Reporter für MC-Sekretion. Unterschiede in der Zelle Reaktivität gegenüber Dextrans wurden auch in verschiedenen Ratte Stämme75oder unter verschiedenen co-stimulatory Bedingungen71,76,77,78festgestellt. Hier haben wir eine 150 K FITC-Dextran verwenden, die zuvor studierte in der RBL-Zell-Linie und bei der Induktion der Sekretion18,79unwirksam erwiesen wurde.

Entscheidend für das Protokoll ist auch die Lichtquelle ausgewählt werden. Wenn Sie ein confocal Mikroskop verwenden, ist die Lichtquelle traditionell Laser-basierte. So, um die Toxizität zu vermeiden, ist es unerlässlich, eine niedrige Laserleistung wählen. Die gewünschte Laserleistung unterscheidet sich zwischen Mikroskope, je nach Typ und Alter des Lasers. Darüber hinaus ist auch die gewünschte Laserleistung abhängig vom Typ des Detektors eingesetzt. Beispielsweise werden bei der Verwendung von eines gemeinsamen Detektors wie einen Photomultiplier Tube-basierten Detektor ein höhere Power-Laser als benötigt, wenn einen moderne Hybrid-Detektor (z. B. ein Photomultiplier Röhre und eine Lawine Fotodioden Hybrid Detektor) verwenden. Wir empfehlen mit der niedrigsten Laserleistung möglich und nicht mehr als 10 % der Laserleistung.

Zusammenfassend lässt sich sagen Überwachung der dequenching der SG FITC-Dextran durch geladen Frist verfallen-Mikroskopie unter sorgfältig ausgewählten Einstellungen uns, ausschließlich Erfassung zusammengesetzte Exozytose im RBL MCs, erheblich erleichtert Identifizierung der molekularen Einheiten, die Dieser Prozess zu regulieren. Diese Methode könnte weiter angepasst werden, um voll von Kiss-and-Run Exozytose zu unterscheiden, durch die Reduzierung und sorgfältig kalibriert das Zeitintervall zwischen Bild Akquisitionen ermöglichen die Unterscheidung der kurzlebigen blinkt Kiss-and-Run zugeordnet Exozytose aus der noch kürzere Blitze, die volle Exozytose begleiten. Solche Bedingungen erfassen würde, zusammengesetzte und Kiss-and-Run Exozytose, die dann unterschieden werden konnte aufgrund der Dauer des Signals.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen

Acknowledgments

Wir danken Dr. U. Ashery für das großzügige Geschenk von cDNA. Wir danken Dr. G. Masse, L. Mittleman, M. Shaharbani und Y.Zilberstein vom Sackler Cellular & Molecular Imaging Center für ihre unschätzbare Hilfe für Mikroskopie. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Vereinigten Staaten und Israel binationale Wissenschaftsstiftung (Grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel und S.J.Galli) und 933/15 zu gewähren, die Israel Science Foundation, gegründet von der Israel-Akademie für Wissenschaften (zu R.Sagi-Eisenberg ) und NIH-Stipendien U19 AI 104209 und R01 AR067145 (, S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

Biologie Ausgabe 136 FITC-Dextran regulierten Exozytose compound Exozytose live Cell Imaging Lysosomen-bezogene Organellen Pinozytose
Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter