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Biology

FITC-Destrano di imaging come Reporter per esocitosi regolata

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936

Summary

Qui abbiamo dettaglio un metodo per l'imaging di cellule vive di esocitosi regolata. Questo metodo utilizza FITC-Destrano, che si accumula in organelli lisosoma-correlati, come reporter. Questo semplice metodo permette anche di distinguere tra diverse modalità di esocitosi regolata in cellule che sono difficili da manipolare geneticamente.

Abstract

Esocitosi regolamentato è un processo mediante il quale carico, che è memorizzato nei granuli secretori (SGs), viene rilasciato in risposta a un trigger secretivo. Esocitosi regolata è fondamentale per la comunicazione intercellulare ed è un meccanismo chiave per la secrezione di neurotrasmettitori, ormoni, mediatori infiammatori e altri composti, da una varietà di cellule. Almeno tre meccanismi distinti sono noti per esocitosi regolata: esocitosi completo, dove un singolo SG si fonde completamente con la membrana plasmatica, bacio-e-faccia funzionare l'esocitosi, dove un singolo SG transitoriamente si fonde con la membrana plasmatica, e composto esocitosi, dove diversi SGs fusibile con a vicenda, prima o dopo la fusione di SG con la membrana plasmatica. Il tipo di esocitosi regolata intrapresa da una cella è dettato spesso dal tipo di trigger secretiva. Tuttavia, in molte cellule, un singolo trigger secretivo può attivare contemporaneamente più modalità di esocitosi regolata. Nonostante la loro abbondanza e importanza attraverso specie e tipi di cellule, i meccanismi che determinano i diversi modi di secrezione sono in gran parte irrisolti. Una delle sfide principali nell'investigare le diverse modalità di esocitosi regolata, è la difficoltà di distinguere tra di loro così come esplorare loro separatamente. Qui descriviamo l'uso di isotiocianato di fluorescina (FITC)-destrano come un reporter di esocitosi e live cell imaging, per distinguere tra le diverse vie di esocitosi regolata, concentrandosi su composto esocitosi, basata sulla solidità e durata degli eventi esocitica.

Introduction

Regolamentato l'esocitosi è il meccanismo principale da cui prontamente fatta carico viene rilasciato da una cellula secretiva in risposta a un trigger specifico. Il carico è pre-formato e sequestrato in vescicole secretorie, in cui è memorizzato fino a quando un trigger inoltra il segnale per il rilascio di contenuti la SGs. Diversi tipi di segnali possono derivare in diverse modalità di esocitosi regolata, o diverse modalità di esocitosi regolata può verificarsi contemporaneamente. Sono noti tre modalità principali di esocitosi regolata: esocitosi completo, che prevede la fusione completa di un singolo granello secretivo con la membrana plasmatica; bacio-and-run esocitosi, che comporta la fusione transitoria del granulo secretivo con la membrana plasmatica seguita da suo riciclaggio; ed esocitosi composto, che è caratterizzata dalla fusione di homotypic di diversi prima di SGs (cioè, granularità esocitosi) o sequenziale (cioè, esocitosi sequenza) alla fusione con la membrana plasmatica1. Esocitosi composto è considerata la più ampia modalità di carico release2, poiché permette la rapida secrezione di carico, comprese quelle provenienti da SGs che si trovano distale dalla membrana del plasma. Esocitosi composto è stato documentato in sia cellule esocrine ed endocrine3,4,5,6,7,8,9, così come in cellule del sistema immunitario. In cellule immuni, come gli eosinofilo10,11,12 e neutrofili13, esocitosi composto permette il rilascio veloce e robusto di mediatori che sono necessari per uccidere gli agenti patogeni d'invasione come batteri o parassiti. Mastociti (MCs) distribuire esocitosi composto per l'efficiente rilascio dei mediatori infiammatori pre-memorizzati durante la risposta immune innata, anafilassi e altre reazioni allergiche14,15,16 , 17. Poiché le diverse modalità di esocitosi può accadere simultaneamente18,19, è diventato una sfida per distinguere tra loro in tempo reale o per identificare i loro macchinari rispettivi fusione, quindi delucidamento i meccanismi di fondo.

Qui presentiamo un metodo, basato su cellule vive imaging della cella caricato FITC-Destrano, che permette l'inseguimento in tempo reale degli eventi di esocitica e la distinzione fra loro diverse modalità. In particolare, il nostro metodo consente il monitoraggio esclusivo composto esocitosi.

FITC-Destrano è un coniugato del fluoroforo pH sensibili FITC con il destrano del polisaccaride di glucano. Destrani fluorescente identificati sono stati indicati per entrare nella cellula di micropinocytosis20,21 e Macropinocitosi22,23. Come scomparti endocitico maturo lisosomi, è stato dimostrato che FITC-Destrano si accumula nel lisosoma senza apparente degrado. Tuttavia, poiché FITC è un fluoroforo altamente sensibili al pH24, e il lume del lisosoma è acido, fluorescenza FITC-Destrano disseta dopo aver raggiunto il lisosoma24. Così, che istituisce i destrani come lisosoma mirati carico, insieme con la sensibilità di pH del FITC, hanno posto le basi per l'utilizzo di FITC-Destrano negli studi del lisosoma esocitosi25,26,27 , 28 , 29.

In diversi tipi cellulari, MCs, neutrofili, eosinofili, cellule di T citotossiche, melanosomi e altri, la SGs lisosomiali caratteristiche dell'esposizione e sono classificati come organelli lisosoma-correlati (LROs) o secretiva lisosomi30,31 . Poiché LROs hanno un pH acido luminal, FITC-Destrano può essere utilizzato per visualizzare loro esocitosi, come risultato più alto pH connesso con l'esteriorizzazione della LROs. Infatti, FITC-Destrano è stato usato per monitorare esocitosi in MCs18,32,33. In questo metodo, FITC-Destrano è aggiunto alla coltura delle cellule, preso dalle cellule di pinocitosi e ordinato in SGs. Come è nei lisosomi, fluorescenza FITC è spenta in SGs quando sono all'interno della cellula. Tuttavia, sulla fusione di SG con la membrana plasmatica e la conseguente esposizione all'ambiente esterno, il FITC-Destrano riacquista relativa fluorescenza come gli aumenti di pH di SG, permettendo che il semplice rilevamento di eventi esocitica da microscopia di cellule vive. Qui, abbiamo regolato questo metodo per abilitare il rilevamento univoco composto esocitosi.

Due altri metodi sono stati utilizzati in precedenza per tenere traccia di esocitosi composto. La microscopia elettronica è stato il primo metodo per la caratterizzazione di strutture di esocitica che ha suggerito l'avvenimento di diverse modalità di esocitosi. In particolare, le osservazioni di "tunnel secretiva" in cellule acinose pancreatiche34 e MCs35,36,37 ha dato luogo all'ipotesi di esocitosi composto. Tuttavia, mentre l'alta risoluzione di microscopia elettronica ha il potere di rivelare le vescicole fuse, non può tenere traccia le dinamiche della loro fusione e quindi non è possibile definire se essi corrispondono a fusione SG durante esocitosi composto o fusione di granuli riconquistate seguendo il loro endocitosi. Questo ostacolo è stato superato in altri metodi che possono misurare esocitosi in cellule viventi, quali misure del morsetto di toppa della membrana plasmatica capacitanza11,13,38,39 o amperometria 40 di media. Tuttavia, patch di bloccaggio richiede una speciale messa a punto e potrebbe non essere adatto per tutti i tipi di cellule. Amperometria misurazioni sono in grado di monitorare l'esocitosi solo se il carico viene rilasciato nella prossimità molto vicina all'elettrodo. Pertanto, facendo uso di live cell imaging offre un vantaggio rispetto a questi metodi, permette non solo di inseguimento in tempo reale di esocitosi, ma permette anche di semplice e rapida acquisizione di dati da tutta la cella.

Il tracking di FITC-Destrano da microscopia diretta cella offre anche alcuni vantaggi per altre cellule vive metodi basati su formazione immagine. Ad esempio, un metodo ampiamente utilizzato è la microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM) di cellule caricate con una sonda fluorescente di SG o esprimendo una fluorescente proteina-etichetta SG cargo o membrana proteina26,41, 42 , 43. la forza di questo metodo risiede nella sua capacità di monitorare esclusivamente gli eventi che si verificano vicino alla membrana plasmatica (in appresso come ingombro), quindi esocitica eventi. Tuttavia, questo è anche lo svantaggio di questo metodo, perché solo la frazione di cella che è adiacente il coprioggetto e vicino alla lente del microscopio può essere imaged44. Se tali impronte rappresentano infatti la superficie intera membrana delle cellule è ancora discutibile45,46,47. A questo proposito, utilizzando un colorante pH sensibili quali FITC-Destrano e un microscopio a fluorescenza standard o un microscopio confocale con un foro stenopeico aperto permette la formazione immagine della cella intera, catturando così il parete totale eventi che si verificano in quella cella.

Ulteriori reporter di pH sensibili che vengono utilizzati per studiare esocitosi regolata da formazione immagine intera cellula o TIRFM includono carico SG o proteina di membrana di SG fusa a phlourin, una variante GFP sensibili al pH. Gli esempi includono NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin e synapto-phluorin48,49,50,51,52. Mentre l'espressione di queste sonde può rappresentare più da vicino la composizione endogena di SGs, esso comporta la transfezione delle cellule e può quindi essere meno adatto per le celle che sono difficili a transfect. Pertanto, durante lo studio delle celle che sono difficili a transfect o in condizioni sperimentali che richiedono più manipolazioni genomiche, l'uso di un composto che può essere semplicemente integrato nel terreno di coltura cellulare, ad esempio FITC-Destrano, è vantaggioso . FITC-Destrano offre anche un vantaggio sopra arancio di acridina (AO), un altro colorante di pH sensibili che è stato utilizzato per il rilevamento di esocitosi di cellule vive microscopia53,54,55,56 , 57 , 58. AO è stato indicato per indurre la fotolisi di vescicole che risultato in lampi di falsi, che non corrispondono alla secrezione effettiva processi di27. Al contrario, FITC-Destrano riflette meglio eventi di secrezione, probabilmente a causa della sua bassa produzione foto-indotta di ossigeno reattive27.

In particolare, un approccio alternativo per lo studio di esocitosi è monitorando l'afflusso di un colorante, dal supporto esterno in SG attraverso il poro di fusione che si apre durante questo processo. In questo caso, il colorante viene aggiunto al mezzo esterno a fianco il grilletto secretivo. Poi, quando si apre il poro di fusione, la tintura si diffonde in SG59,60. Un chiaro vantaggio di questo metodo è che esso offre anche la possibilità di stimare la dimensione dei pori di fusione, mediante l'uso di coloranti di dimensioni variabili. Ad esempio, destrani di diverso peso molecolare (MW), coniugati a fluorofori diversi, possono essere utilizzati come coloranti extracellulare, per cui la dimensione massima di destrano che possa penetrare la SG corrisponderebbe alla dimensione del poro fusione59, 61 , 62 , 63 , 64. Inoltre, questo approccio non richiede l'uso di una sonda di pH sensibili. Tuttavia, uno svantaggio significativo è che il rapporto segnale-rumore è molto basso, poiché una grande quantità di colorante è presente nei mezzi di comunicazione durante l'acquisizione delle immagini, con conseguente elevato background.

Nel complesso, l'uso di FITC-Destrano come indicatore per esocitosi supera diversi inconvenienti nei metodi precedentemente segnalati, come segnale/rumore rapporto, tossicità, tracciabilità dinamica e complessità.

Qui descriviamo l'uso di FITC-Destrano per monitorare composto esocitosi nella linea RBL - 2H 3 delle cellule di albero (di seguito definita come RBL, principalmente fondata da Eccleston et al. 65 e ulteriormente clonato da Barsumian et al. 66), in risposta all'immunoglobulina E (IgE) / attivazione dell'antigene (Ag).

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Protocol

1. preparati

  1. Preparazione di terreni di coltura RBL
    1. Mix da 500 mL di glucosio basso Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) con 56 mL di siero bovino fetale (FBS), 5,5 mL di soluzione di penicillina-streptomicina-nistatina, 5,5 mL di soluzione di L-glutamina 200 mM. Ciò si traduce in glucosio basso DMEM completati con 10% FBS, 100 µ g/mL di streptomicina, 100 unità/mL di penicillina, 12 unità/mL nistatina e 2 mM L-glutammina.
    2. Filtrare i media utilizzando un filtro alto-vuoto di 0,22 µm diametro dei pori e negozio a 4 ° C.
  2. Manutenzione delle cellule RBL.
    1. Crescere le cellule RBL a un confluency di massima del 90% in un piatto di 10 cm. Se la coltura delle cellule è sana, le cellule dovrebbero avere una forma di mandrino con sporgenze occasionale.
    2. Per cella spaccare, staccare le cellule dal piatto aspirando i media e sostituendo con 2 mL di soluzione di EDTA/antitripsina B. Incubare per 5-10 minuti in atmosfera umidificata di 5% CO2 a 37 ° C.
    3. Una volta che le cellule hanno staccato, neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 mL di terreni di coltura, utilizzando una pipetta e dividere le celle in un 1:2-1:10 ratio.
  3. Preparazione del tampone di Tyrode 20x
    1. Preparare un brodo 20 soluzione di 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl e 8mm NaH2PO4 in doppia acqua distillata (DDW). Mescolare bene e conservare a 4 ° C.

2. coltura di cellule RBL per microscopia di cellule vive

  1. Preparazione della soluzione di FITC-Destrano.
    1. Mescolare 1 mg di polvere di FITC-Destrano (150K) per 1 mL di terreno di coltura (Vedi punto 1.1.1). Per un completo coprioggetto chambered, preparare 3 mL.
    2. Utilizzando un'unità di filtro siringa di acetato di cellulosa con porosità di 0,22 µm, filtrare il disciolto FITC-Destrano.
    3. Aggiungere mouse IgE a una concentrazione di 1 µ g/mL.
  2. Semina di cellule RBL per l'imaging
    1. Il giorno prima di formazione immagine, aspirare i media dalla piastra di coltura e sostituire con 2 mL di soluzione di EDTA/antitripsina B. Incubare per 5-10 minuti in atmosfera umidificata di 5% CO2 a 37 ° C. Una volta che le cellule hanno staccato, neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 mL di terreno di coltura.
    2. RBL conteggio celle utilizzando un emocitometro e regolare di conseguenza il volume con terreni di coltura per ottenere una concentrazione di cellule di 7,5 x 105/ml.
    3. Aggiungere 10 µ l di sospensione cellulare per un coprioggetto chambered pre-riempita con fresco FITC-Destrano completati terreni di coltura (in questo modo semina di 7,5 x 103 celle in una camera).
    4. Crescere le cellule RBL durante la notte in un'atmosfera umificata di 5% CO2 a 37 ° C. Le cellule dovrebbero rimanere a un livello sub-confluente al fine di assicurarsi che le cellule sono separate e che è facile da identificare ogni cella singolarmente sotto il microscopio.
  3. Transfezione di cellule RBL - facoltative.
    1. Per esocitica eventi in combinazione con altre proteine fluorescente contrassegnati di imaging, vedere protocollo di transfezione di cellule RBL in Azouz et al. 67

3. tensione delle cellule microscopia di esocitosi

  1. Preparazione delle soluzioni:
    1. Preparare la soluzione tampone di un finale Tyrode diluendo la soluzione di riserva in DDW in un 01:20 supplemento con 20 mM Hepes a pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA e 5,6 mM glucosio e diluizione.
    2. Appena preparare un reagente secretagogo 20x nel buffer di Tyrode [1 µ g/mL dinitrophenyl coniugata all'albumina sierica umana (DNP-ha (Ag)) nel nostro caso, per una concentrazione di 1 x di 50 ng/mL].
    3. Preparare una soluzione di cloruro di ammonio di 400 mM dalla dissoluzione della polvere nel buffer di Tyrode.
  2. Preparazione delle cellule.
    1. Lavare il coprioggetto chambered 3 volte, aspirando i media dalla camera e riempirlo con 300 µ l di tampone di Tyrode, preriscaldata a 37 ° C. Infine, riempire la camera con 300 µ l di tampone di Tyrode, preriscaldata a 37 ° C.
    2. Porre il coprioggetto chambered nella camera di incubatore del microscopio. Assicurarsi che la camera sia stabile.
  3. Impostazione del microscopio
    1. Per scegliere una regione di interesse per tenere traccia, accendere la sorgente luminosa fluorescente (tradizionalmente una lampada a mercurio) e scegliere il filtro appropriato fluorescenza (scegliere il filtro per fluorofori verde per la visualizzazione di FITC-Destrano). Una volta che la regione di interesse è a fuoco e si trova al centro del campo visivo, spegnere la sorgente di luce per evitare foto-candeggio e tossicità.
      Nota: Alcuni del FITC-Destrano incorporato nelle cellule possono mantenere fluorescenza. Questo è perché FITC-Destrano può anche essere ordinato ai compartimenti non lisosomiali quali gli endosomi.
    2. Accendere l'illuminazione appropriata per l'eccitazione del FITC. Se si usa un microscopio basate su laser, accendere il laser 488 nm. Emissione dovrebbe essere raccolti intorno a 500-550 nm (FITC picchi di emissione a 510-520 nm).
    3. Quando si utilizza un microscopio confocale, aprire il foro stenopeico al massimo. Questo consentirà utilizzando tossicità e bassa potenza del laser per evitare lo sbiancamento e garantirà la cattura di eventi di esocitosi da tutti i piani della cella.
    4. Calibrare l'intervallo di tempo tra acquisizioni di immagine.
      1. Cellule differenti possono variare nella loro cinetica di esocitosi regolata68. Per l'imaging specifiche di esocitosi composto, si consiglia un intervallo di tempo di almeno 5 secondi. Tuttavia, come regola generale, per consentire la formazione immagine veloce, assicurarsi che che il tempo di acquisizione di un singolo fotogramma è veloce.
      2. Quando si utilizza un microscopio confocale a scansione laser, impostare la direzione di scansione di bi-direzionale, non consentono una media e impostato la risoluzione a 512 x 512 (consigliata; queste ultime due disposizioni contribuirà inoltre a ridurre al minimo lo sbiancamento e tossicità).
  4. Formazione immagine di esocitosi.
    1. Celle di immagine per durate desiderate, a seconda del tipo di cellula o secretagogo. In cellule RBL innescate con IgE/Ag, la maggior parte esocitica eventi si verificano entro 15-20 min di attivazione.
    2. Per l'attivazione delle cellule, aggiungere 16 µ l dalla soluzione di secretagogo 20x alla camera.
  5. Confermando la presenza di FITC-Destrano nelle cellule.
    1. Per confermare la presenza e localizzazione di FITC-Destrano a SGs, aggiungere 16 µ l di soluzione di cloruro di ammonio (fare attenzione a non spostare la camera per non perdere la messa a fuoco) alla camera delicatamente (questo farà una concentrazione finale di 20 mM). Questo indurrà alcalinizzazione del SGs e dequenching della fluorescenza di FITC, che avverrà in pochi secondi.

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Representative Results

Figura 1a rappresenta schematicamente come FITC-Destrano può agire come un reporter per regolato esocitosi e ricapitolare le diverse modalità di esocitica eventi. In primo luogo, le cellule vengono incubate con FITC-Destrano, che è interiorizzato dal pinocitosi e ordinato per la SGs. Poiché il SGs di MCs sono LROs, loro basso pH smorza la fluorescenza del FITC, mostrato qui granuli di colore nero (A-C, I). Quando le cellule sono innescate da un secretagogo e il fusibile di SGs con la membrana plasmatica, un poro di fusione è formato, consentendo di efflusso di protoni e alcalinizzazione di SGs. Di conseguenza, FITC riacquista la sua fluorescenza (A, II). Esocitosi completo si manifesterà in un breve (meno di 5 s) evento fluorescente come membrana di SG esteriorizzato collassa completamente nella membrana plasmatica e FITC-Destrano diffonde via nel terreno di coltura (una, III). Durante un evento di bacio-and-run esocitica, membrana di SG solo transitoriamente fonde con la membrana plasmatica, risultante in un poro di fusione di breve durata e pertanto solo una breve esplosione di fluorescenza come la SG si stacca rapidamente e relativo lumen rapidamente ri-acidifica (B, III - IV). Infine, durante composto esocitosi, una serie di SGs fusibile in sequenza con a vicenda (fusione seguente SG) nonché con la membrana plasmatica, con mantenimento di un poro aperto fusion. Di conseguenza, una massa molto più grande di FITC-Destrano è dequenched, risultante in una raffica di fluorescenza grande e longevo (C, III-IV) che decade quando la sonda si diffonde nell'ambiente esterno (C, V).

Abbiamo utilizzato questo modello e ha confermato le sue previsioni di imaging controllo celle e celle che sono vuotate di Rab5, che abbiamo indicato per essere cruciale per homotypic SG-SG fusione69 ed esocitosi composto33. Impostando il tempo di acquisizione di un'immagine ogni 15 s, ci aspettavamo di rilevare principalmente continui eventi della secrezione, cioè, composto esocitosi. Infatti, come mostrato in Figura 1B, nostri dati mostrano che, mentre nel controllo delle cellule di molti eventi di parete di grandi dimensioni e di lunga durata potrebbe essere registrata, solo alcuni eventi sono stati registrati in celle di colpo Rab5 (shRab5). Inoltre, gli eventi che sono stati registrati in shRab5 cellule erano significativamente più piccoli dimensioni rispetto ad eventi registrati in cellule di controllo. Della nota, la capacità secretiva delle cellule shRab5 rimane inalterata sotto le stesse condizioni69, suggerendo che mentre shRab5 inibisce l'esocitosi composto, non abolire la secrezione. Pertanto, in intervalli di tempo di imaging fluorescenza di FITC-Destrano consente il rilevamento specifico di esocitosi composto. Inoltre, imaging FITC-Destrano rilascio permette l'acquisizione della natura sequenza di esocitosi composto. Come indicato dalla freccia nella Figura 1b, seguendo un lampo di luce, un secondo flash inizia come un flash debole che è adiacente al primo. Questo si può dedurre come la fusione di una SG con una SG che è già in procinto di fusione con la membrana plasmatica (cioè, esocitosi sequenza). Quindi, come il granello secondo si fonde con il primo granello che è già connesso alla membrana del plasma da un poro di fusione, il pH del granulo secondo aumenta pure e fluorescenza FITC dequenches, producendo un secondo scoppio di fluorescenza. Tale scenario di rilascio FITC-Destrano durante sequenziale fusione di SGs adiacente è presentato in Figura 1C.

Un altro esempio di fusione sequenziale di SGs durante esocitosi composto è illustrato nella Figura 2. Le cellule RBL vengono co-trasfettate con una forma costitutivamente attiva (CA) di Rab5a e WT SNAP-23, le condizioni sotto cui esocitosi composto diventa più robusto33. Formazione immagine di Rab5a la CA, che è essenziale per la fusione di SG-SG ed è il rivestimento grande33,SGs69, insieme con FITC-Destrano, permette una migliore visualizzazione della fusione di un granulo più piccolo con un granello di CA-Rab5a decorato più grande.

Poiché FITC-Destrano è spenta quando memorizzati all'interno della SG, è necessario implementare una tecnica per verificare che la FITC-Destrano è infatti presente in SGs. Questo diventa ancora più essenziale quando un esperimento in condizioni che sono attesi per sopprimere la secrezione di preformatura. Per superare questo ostacolo, 20 mM di cloruro di ammonio è stato aggiunto alla camera alla fine di ogni esperimento. Questo trattamento eleva il pH all'interno di SGs, permettendo per fluorescenza FITC. Come illustrato nella Figura 3, dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio ai media, FITC Destrano diventa visibile ed è co-localizzato con etichetta mRFP neuropeptide Y, che è un reporter di SG in RBL cellule70.

Figure 1
Figura 1: rilevazione specifica di esocitosi composto. (a) un diagramma che descrive come cambiamenti nella fluorescenza FITC-Destrano ricapitolano le diverse modalità di esocitosi regolata. (b) Live cell che Imaging di FITC-Destrano in cellule RBL transfected con NPY-mRFP e pSilencer o shRab5, come indicato. Transfezione è stata effettuata come descritto in precedenza67,70. Brevemente, 1.5 x 10 cellule RBL7 sono stati risospesi in tampone di transfezione (DMEM completate con 20 mM tubi K a pH 7, acetato2 + 10 µM Ca, 2 mM Mg2 + acetato, 128mm potassio glutammato) contenente 15 µ g NPY-mRFP e o 30 µ g di pSilencer o 15 µ g di shRab5A e 15 µ g di shRab5B/C. transfezione è stato realizzato mediante elettroporazione a 300 V e una lunghezza di impulso 20 mSec. Le cellule sono state immediatamente replated in terreno di coltura contenente 1 mg/mL FITC-Destrano. Dopo 24 h, cellule erano sensibilizzate con 1 µ g/mL di IgE ed incubate per altre 24 h. Le cellule erano quindi lavate tre volte in tampone di Tyrode completo ed attivate da 50 ng/mL di DNP-HSA (Ag). Le cellule sono state visualizzate da microscopia di fluorescenza time-lapse. La freccia bianca nelle immagini pSilencer punta a una raffica di fluorescenza FITC e il cerchio bianco segna un SG scariche. La freccia bianca nelle immagini shRab5A/B/C indica minuti fluorescenti eventi che si verificano nelle cellule Rab5-atterramento, probabile che sia indicativo di esocitosi completo. Di nota, l'intensità dell'immagine ShRab5 è stato aumentato per consentire il rilevamento del segnale. Immagini sono state acquisite da un microscopio confocale, dotato di una camera riscaldata (37 ° C) e controller di CO2 (4,8%) e un obiettivo C-Apochromat x63/1.2 W Corr, sotto impostazione aperta pinhole. Per il film completo, fare riferimento a Klein et al. 33 (c) un diagramma schematico del processo di fusione homotypic SG illustrato in (b). In dettaglio, come il primo SG si fonde con la membrana plasmatica e stabilisce un poro di fusione, comincia a alcalinizzare mentre si rilascia il suo contenuto di FITC-Destrano. Così, per il momento una seconda SG si fonde con quello primo in modo sequenziale, la fluorescenza del primo SG svanisce a causa del rilascio di FITC-Destrano. Tuttavia, la seconda SG alcalinizza, che si traduce in un flash FITC che appare adiacente il primo SG. Questa figura è stata adattata da Klein et al. 33 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dual imaging di mStr-CA-Rab5 e FITC-Destrano. Le cellule RBL vengono co-trasfettate con 20 µ g di HA-wt-SNAP23 e 10 µ g di Rab5A mStr-CA. Cellule sono state pre-incubate con FITC-Destrano e IgE e innescate con Ag come descritto nella Figura 1. (a) una serie di immagini l'acquisizione di un evento di fusione tra un estiguuto SG (freccia bianca) e una SG che già ha fuso con la membrana plasmatica e pertanto è fluorescente. A 15,8 minuti, la SG estiguuto ha fuso con la sua vicina SG e cominciato a fluorescenza di guadagno. Le aree "in box" sono allargate in basso a sinistra di ciascun punto di tempo. (b) presentazione di Rab5A mSTR-CA (in rosso) e di FITC-Destrano (in verde) dai punti corrispondenti di tempo indicato (a), dimostrando la fusione tra i due SGs. le immagini sono state acquisite mediante microscopia confocale (aperto pinhole) utilizzando un piano-apochromat X63-NA 1.4 obiettivo. Questa figura è stata adattata da Klein et al. 33 per il film completo, vedere Klein et al. 33 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Formazione immagine Dual di NPY-mRFP e FITC-Destrano durante alcalinizzazione di SG di NH4cl. Le cellule RBL erano transfected con shRab5, pre-incubate con FITC-Destrano e IgE e innescate con Ag, come descritto nella Figura 1. (a) le cellule sono state visualizzate da microscopia di fluorescenza time-lapse. Designato volte nelle immagini sono minuti dopo l'attivazione con Ag. Immagini sono state acquisite mediante microscopia confocale utilizzando un piano-apochromat x63-NA 1.4 obiettivo. (b) analisi quantitativa dell'esperimento mostrato in (a). Ogni riga nei grafici è la fluorescenza media di FITC in una regione di interesse (ROI) nel corso di una singola cella. La freccia indica l'ora di NH4aggiunta di Cl (20 mM). Bar = 5 µm. Questa figura è stata adattata da Klein et al. 33 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui descriviamo come tracciatura la fluorescenza di FITC-Destrano caricato in SGs può essere utilizzata in particolare acquisire eventi composto esocitosi. Questo è stato ottenuto impostando il microscopio per acquisire un'immagine ogni 15 secondi, garantendo così che verranno registrati solo gli eventi di lunga durata nel tempo, e pertanto escluse brevi eventi che corrisponderebbero a esocitosi completo o bacio-and-run esocitosi. Per stabilire il metodo, abbiamo mostrato che atterramento delle isoforme Rab5 che sono espressi nelle cellule RBL e sono di fondamentale importanza per esocitosi composto, Elimina la possibilità di acquisire gli eventi di rilascio di FITC-Destrano, mentre la secrezione complessiva dalla cella non è interessata.

Lo svantaggio più importante del metodo è che si applica solo alle celle che contengono acidi SGs. Tuttavia, il vantaggio più importante del metodo è che si basa sulla semplice incubazione delle cellule con FITC-Destrano, senza la necessità di transfezione. Altri reporter di pH sensibili che vengono utilizzati per studiare regolamentato esocitosi e coinvolgere carico SG o SG membrana proteina-fuso a phlourin, una variante GFP pH-sensibile (come NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin e synapto-phluorin48, 49,50,51,52), può più strettamente rappresentano la composizione endogena di SGs. Tuttavia, il loro uso comporta transfezione delle cellule, che potrebbe essere meno adatto per le celle che sono difficili a transfect. Pertanto, durante lo studio delle celle che sono difficili a transfect o in condizioni sperimentali che richiedono più manipolazioni genomiche, l'uso di un composto che può essere semplicemente integrato in medium della coltura cellulare, ad esempio FITC-Destrano, è vantaggioso. Il nostro protocollo può richiedere adattamenti specifici delle cellule ospitare differenze nella cinetica di esocitosi di cellulari diversi tipi68. Quindi, l'intervallo di tempo scelto per acquisizione di immagini deve essere ottimizzato. Per le cellule RBL, abbiamo set-up il microscopio per acquisire una nuova immagine ogni 15 secondi, che a IgE/Ag ha innescato le cellule RBL ci ha permesso di visualizzare solo gli eventi di lunga durata, consentendo in tal modo il rilevamento esclusivo di eventi di esocitosi composto.

Un altro fattore che deve essere considerato è il tipo di destrano per essere utilizzato. Una varietà di destrani che variano nella loro pesi molecolari sono disponibili. Pertanto, è importante scegliere il destrano appropriato come reporter, prendendo in considerazione i potenziali effetti che destrani diversi potrebbero avere sulle cellule. Ad esempio, destrani a basso peso molecolare sono stati indicati per attivare MCs e indurre la secrezione71,72,73,74. Di conseguenza, destrani a basso peso molecolare non sarebbe appropriato reporter per la secrezione di MC. Le differenze di reattività delle cellule verso destrani inoltre sono state notate nel ratto diversi ceppi75, o sotto diverse condizioni di costimolazione71,76,77,78. Qui, abbiamo scelto di utilizzare un 150 K FITC-Destrano che precedentemente è stato studiato nella linea cellulare RBL e dimostrato di essere inefficace nell'indurre la secrezione18,79.

La fonte di luce per essere selezionato è anche cruciale per il protocollo. Quando si utilizza un microscopio confocale, la sorgente luminosa è tradizionalmente basate su laser. Così, per evitare la tossicità, è imperativo per scegliere un laser a bassa potenza. La potenza del laser desiderato differisce tra microscopi, a seconda del tipo e l'età del laser. Inoltre, la potenza del laser desiderato dipende anche dal tipo di rivelatore utilizzato. Ad esempio, quando si utilizza un rivelatore di comune come un rivelatore di basati su tubo di fotomoltiplicatore, un laser di potenza superiore sarà necessari rispetto a quando si utilizza un rivelatore di moderni ibridi (ad esempio un tubo di fotomoltiplicatore e un rivelatore di ibrido di fotodiodi valanga). Si consiglia di utilizzando la potenza del laser più bassa possibile e non superiore al 10% della potenza del laser.

In sintesi, monitoraggio dequenching di SG caricato FITC-Destrano di time che lapse-microscopia sotto impostazioni attentamente scelte ci ha permesso di cattura esclusivamente l'esocitosi di composto in RBL MCs, notevolmente facilitare identificazione delle entità molecolari che regolano questo processo. Questo metodo potrebbe essere ulteriormente corretto per distinguere full da esocitosi di bacio-e-faccia funzionare riducendo e calibrare attentamente l'intervallo di tempo tra acquisizioni di immagine per permettere la distinzione dei lampi di breve durata connesso con bacio-e-faccia funzionare esocitosi dall'ancora più brevi flash che accompagnano l'esocitosi completo. Tali condizioni sarebbero catturare esocitosi sia composto e bacio-e-run che poi potrebbero essere distinti basato sulla durata del segnale.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrenti

Acknowledgments

Ringraziamo il dottor U. Ashery per il generoso dono di cDNA. Ringraziamo d. ssa G. massa, L. Mittleman, M. Shaharbani e Y.Zilberstein dal centro di Imaging molecolare e Sackler cellulare per la loro preziosa assistenza con microscopia. Quest'opera è stata sostenuta da Stati Uniti d'America-Israele binazionale Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel e S.J.Galli) e concedere 933/15 della Israel Science Foundation, fondata dall'Accademia Israele per le scienze (a R.Sagi-Eisenberg ) e sovvenzioni NIH U19 AI 104209 e AR067145 R01 (a S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

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References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

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