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Biology

Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Aquí detallamos un método para obtener imágenes de células vivas de exocitosis regulada. Este método utiliza FITC-los dextranos, que se acumulan en orgánulos relacionados con los lisosomas, como reportero. Este sencillo método permite también distinguir entre los diferentes modos de exocitosis regulada en las células que son difíciles de manipular genéticamente.

Abstract

Regulada de la exocitosis es un proceso que carga, que se almacena en gránulos secretores (SGs), se libera en respuesta a un gatillo secretora. Regulada de la exocitosis es fundamental para la comunicación intercelular y es un mecanismo clave para la secreción de neurotransmisores, hormonas, mediadores inflamatorios y otros compuestos, por una variedad de células. Se conocen al menos tres mecanismos distintos para exocitosis regulada: exocitosis completo, donde un solo SG completamente se fusiona con la membrana plasmática, exocitosis de beso-y-run, donde un solo SG transitoriamente se fusiona con la membrana plasmática, y exocitosis compuesto, donde SGs varios fusionan, antes o después de la fusión de la SG con la membrana plasmática. El tipo de exocitosis regulada por una célula es dictado a menudo por el tipo de gatillo secretora. Sin embargo, en muchas células, un solo gatillo secretora puede activar varios modos de exocitosis regulada simultáneamente. A pesar de su abundancia e importancia a través de especies y tipos de la célula, los mecanismos que determinan los diferentes modos de secreción son en gran parte sin resolver. Uno de los principales retos en la investigación de los diferentes modos de exocitosis regulada, es la dificultad de distinguir entre ellos, así como exploración de por separado. Aquí describimos el uso de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como reportero de exocitosis y celular directo imágenes, para diferenciar entre las diferentes vías de exocitosis regulada, centrándose en la exocitosis compuesto, basado en la robustez y duración de los eventos exocíticas.

Introduction

Regulada de la exocitosis es el mecanismo primario por el cual carga fácilmente hecho es liberado de una célula secretora en respuesta a un disparador específico. La carga está preformada y secuestrada en vesículas secretoras, en la que se almacena hasta un relés la señal para la liberación del contenido de la SGs. Diferentes tipos de señales pueden resultar en diferentes modos de exocitosis regulada, o diferentes modos de exocitosis regulada pueden ocurrir simultáneamente. Se conocen tres modos principales de exocitosis regulada: exocitosis completo, que consiste en la fusión completa de un solo gránulo secretor con la membrana plasmática; exocitosis de beso-y-funcione, que consiste en la fusión transitoria del gránulo secretor con la membrana plasmática seguida por su reciclado; y exocitosis compuesta, que se caracterizaron por homotípicos fusión de varios SGs antes (es decir, multigranular exocitosis) o secuencial (es decir, exocitosis secuencial) a la fusión con la membrana plasmática1. Exocitosis compuesto se consideran el modo más extenso de carga release2, como permite la secreción rápida de la carga, la incluida del SGs que se encuentra distal de la membrana plasmática. Compuesto exocitosis se ha documentado en ambas células exocrinas y endocrinas3,4,5,6,7,8,9, así como en células inmunes. En las células inmunes, como los eosinófilos10,11,12 y neutrófilos13, exocitosis compuesto permite la liberación de mediadores que se requieren para matar a patógenos invasores tales como rápida y robusta bacterias o parásitos. Las células del mástil (MCs) desplegar compuesto exocitosis para la eficiente liberación de mediadores inflamatorios depositados durante la respuesta inmune innata, anafilaxia y otras reacciones alérgicas14,15,16 , 17. puesto que los diferentes modos de exocitosis pueden ocurrir simultáneamente18,19, se ha convertido en un reto para distinguir entre ellos en tiempo real o para identificar sus maquinarias de fusión respectivos, por lo tanto, la aclaración sus mecanismos subyacentes.

Aquí presentamos un método, basado en células vivas imágenes de celular cargado FITC-los dextranos, que permite el seguimiento en tiempo real de eventos exocíticas y distinguir entre sus diferentes modos. En particular, nuestro método permite el control exclusivo de exocitosis compuesto.

FITC-dextrano es un conjugado de fluoróforo sensible al pH FITC con el dextrano polisacárido de glucano. Fluorescencia de etiquetado dextranos han demostrado entrar en la célula micropinocytosis20,21 y macropinocitosis22,23. Como compartimentos endocíticos maduran hasta convertirse en lisosomas, se ha demostrado que FITC-los dextranos se acumulan en los lisosomas con sin degradación aparente. Sin embargo, desde FITC es un fluoróforo altamente sensibles al pH24, y el lumen del lisosoma es ácido, fluorescencia FITC-los dextranos apaga al llegar a la24del lisosoma. Por lo tanto, establecer dextranos como lisosoma dirigida la carga, junto con la sensibilidad del pH del FITC, han sentado las bases para el uso de FITC-los dextranos en estudios de lisosoma exocitosis25,26,27 , 28 , 29.

En varios tipos celulares, incluyendo MCs, neutrófilos, eosinófilos, células de T citotóxicas, melanosomas y otros, el SGs Mostrar características lisosomales y se clasifican como organelos relacionados con el lisosoma (LROs) o lisosomas secretores30,31 . Desde LROs tiene un pH ácido luminal, FITC-los dextranos pueden utilizarse para visualizar su exocitosis, como resultado de pH mayor asociado con la exteriorización de los LROs. De hecho, FITC-los dextranos se ha utilizado para monitorear la exocitosis en MCs18,32,33. En este método, FITC-los dextranos es agregado a la cultura de célula, tomado por las células por pinocitosis y clasificó en el SGs. Como es en los lisosomas, fluorescencia FITC se apaga en el SGs cuando están dentro de la célula. Sin embargo, en fusión con la membrana plasmática y la consecuente exposición al ambiente externo en SG, el FITC-los dextranos recupera su fluorescencia como el SG pH se levanta, permitiendo que el simple seguimiento de eventos exocíticas por microscopía de células vivas. Aquí, hemos ajustado este método para activar el seguimiento exclusivo de exocitosis compuesto.

Otros dos métodos se han utilizado previamente para seguimiento compuesto exocitosis. La microscopia electrónica fue el primer método para caracterizar estructuras exocíticas que sugirieron la ocurrencia de los diferentes modos de exocitosis. En particular, observaciones de "túneles secretoras" en las células acinares pancreáticas34 y MCs35,36,37 dieron lugar a la hipótesis de exocitosis compuesto. Sin embargo, mientras que la alta resolución de la microscopía electrónica tiene el poder de revelar las vesículas fusionadas, no puede seguir la dinámica de la fusión y por lo tanto no es posible definir si corresponden a la fusión de SG durante la exocitosis compuesto o la fusión de gránulos recapturados siguiendo su endocitosis. Este obstáculo es superado en otros métodos que pueden medir la exocitosis en las células vivas, tales como medidas de abrazadera de remiendo de la membrana plasmática capacitancia11,13,38,39 o Amperometría 40 de los medios de comunicación. Sin embargo, parche de sujeción requiere una instalación especial y puede no ser adecuado para todos los tipos de la célula. Amperometría medidas son capaces de rastrear exocitosis solamente si la carga se libera en las proximidades de los electrodos. Por lo tanto, usando proyección de imagen de células vivas ofrece una ventaja sobre estos métodos, permite no sólo para seguimiento en tiempo real de exocitosis, pero también permite la adquisición rápida y sencilla de los datos de la célula entera.

El seguimiento de FITC-los dextranos por microscopía de células vivas también ofrece algunas ventajas a otras células vivas métodos basados en la proyección de imagen. Por ejemplo, un método ampliamente usado es la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) de células cargado con una sonda fluorescente de SG o expresando un fluorescente etiquetado proteína SG carga o membrana proteína26,41, 42 , 43. la fuerza de este método radica en su capacidad para supervisar exclusivamente los sucesos que ocurren cerca de la membrana plasmática (en adelante como huella), por lo tanto eventos exocíticas. Sin embargo, esto es también el inconveniente de este método porque sólo la fracción celular que está al lado del cubreobjetos y cerca de la lente del microscopio puede ser había reflejada44. Si esas huellas representan de hecho la superficie de la membrana de la célula entera es todavía discutible45,46,47. En este sentido, utilizando un tinte pH-sensible como FITC-los dextranos y un microscopio estándar de fluorescencia o un microscopio confocal con un agujero de alfiler abierto permite la proyección de imagen de la célula entera, así capturar los eventos de total exocíticas que ocurren en ese celular.

Adicionales reporteros sensibles al pH que se utilizan para el estudio de exocitosis regulada por proyección de imagen de células enteras o TIRFM incluyen carga de SG o SG membrana proteína fusionada a phlourin, una variante de la GFP de pH-sensible. Los ejemplos incluyen NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin y synapto phluorin48,49,50,51,52. Mientras que la expresión de estas puntas de prueba puede representar más de cerca la composición endógena de las SGs, conlleva la transfección de las células y por lo tanto puede ser menos adecuado para las células que son difíciles de transfectar. Por lo tanto, cuando estudiando las células son difíciles de transfectar o bajo condiciones experimentales que requieren múltiples manipulaciones genómicas, es ventajoso el uso de un compuesto que puede ser suplido simplemente en el medio de cultivo celular, como FITC-los dextranos, . FITC-los dextranos también ofrece una ventaja sobre naranja de acridina (AO), otro tinte pH-sensible que ha sido utilizado para el rastreo de la exocitosis por celular vivo microscopia53,54,55,56 , 57 , 58. AO se ha demostrado para inducir la fotólisis de vesículas que dan lugar a destellos falsos, que no corresponden a la secreción real procesos de27. Por el contrario, FITC-los dextranos reflejan mejor eventos de secreción, probablemente debido a su baja producción foto-inducida del oxígeno reactivo27.

En particular, un enfoque alternativo para el estudio de exocitosis es mediante el seguimiento de la afluencia de un tinte, desde el medio exterior en la SG a través del poro de fusión que se abre durante este proceso. En este caso, el tinte se agrega al medio externo junto con el gatillo secretora. Entonces, cuando se abra el poro de fusión, el tinte se difunde en el SG59,60. Una clara ventaja de este método es que también ofrece la capacidad para estimar el tamaño del poro de fusión, mediante el uso de tintes de tamaño variable. Por ejemplo, dextranos de distinto peso molecular (MW), conjugado con diferentes fluoróforos, pueden utilizarse como colorantes extracelulares por el que el tamaño máximo de dextrano que puede penetrar la SG correspondería al tamaño del poro de fusión59, 61 , 62 , 63 , 64. Además, este enfoque no requiere el uso de una sonda de pH-sensibles. Sin embargo, una desventaja significativa es que la relación señal a ruido es muy baja, ya que una gran cantidad de colorante está presente en los medios de comunicación durante la adquisición de imágenes, resultando en la euforia.

En general, el uso de FITC-los dextranos como marcador para la exocitosis supera varios inconvenientes en métodos previamente divulgados, como señal a ruido ratio, toxicidad, seguimiento dinámico y complejidad.

Aquí describimos el uso de FITC-los dextranos supervisar exocitosis compuesta en la línea de la célula de mástil 3 RBL - 2H (en adelante como RBL, establecido principalmente por Eccleston et al. 65 y más clonados por Barsumian et al. 66), en respuesta a la inmunoglobulina E (IgE) / activación de antígeno (Ag).

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Protocol

1. preparaciones

  1. Preparación de medios de cultivo RBL
    1. Mezclar 500 mL de glucosa baja Dulbecco había modificado medio de águila (DMEM) con 56 mL de suero bovino fetal (FBS), 5,5 mL de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina, 5,5 mL de la solución de L-glutamina 200 mM. Esto da lugar a glucosa baja DMEM suplementado con 10% FBS, estreptomicina 100 μg/mL, 100 unidades/mL de penicilina, 12 nistatina unidades/mL y 2 mM L-glutamina.
    2. Filtro de los medios de comunicación mediante el uso de un filtro de alto vacío de 0,22 μm tamaño de poro y tienda a 4 ° C.
  2. Mantenimiento de las células RBL.
    1. Crecer las células RBL para una confluencia máxima del 90% en un plato de 10 cm. Si el cultivo celular es saludable, las células deben tener forma de huso con ocasionales protuberancias.
    2. Para la división de la célula, separar las células del plato aspirando los medios de comunicación y reemplazar con 2 mL de solución de tripsina/EDTA B. incubar de 5 a 10 minutos en un ambiente humidificado de 5% CO2 a 37 ° C.
    3. Una vez que han separado las células, neutralizar la tripsina por añadir 2 mL de medio de cultivo, utilizando una pipeta y dividir las celdas en un 1:2-1:10 de la relación.
  3. Preparación de 20 x buffer de Tyrode
    1. Preparar un stock 20 x 8 mM NaH2PO4 en agua bidestilada (DDW), solución de 54 mM KCl, 20 mM MgCl2y 2.74 M de NaCl. Mezclar bien y guardar a 4 ° C.

2. cultivo de células RBL para microscopía de células vivas

  1. Preparación de solución de FITC-los dextranos.
    1. Mezcle 1 mg de polvo de FITC-los dextranos (150 K) por 1 mL de medio de cultivo (véase el paso 1.1.1). Para un completo cámara cubreobjetos, preparar 3 mL.
    2. Usando una unidad de filtro de jeringa de acetato de celulosa con tamaño de poro de 0,22 μm, filtro de la FITC-dextrano disuelto.
    3. Añadir mouse IgE a una concentración de 1 μg/mL.
  2. Siembra de las células RBL para la proyección de imagen
    1. El día antes de la proyección de imagen, los medios de comunicación desde la placa de cultivo de aspirar y reemplazar con 2 mL de solución de tripsina/EDTA B. incubar de 5 a 10 minutos en un ambiente humidificado de 5% CO2 a 37 ° C. Una vez que han separado las células, neutralizar la tripsina por añadir 2 mL de medio de cultivo.
    2. RBL cuenta las células usando un hemocitómetro y ajustar en consecuencia el volumen con medios de cultivo para obtener una concentración celular de 7.5 x 105/ml.
    3. Añadir 10 μl de la suspensión celular a un cubreobjetos cámara, Prellenado con FITC-los dextranos fresco complementa los medios de cultivo (esto resulta en siembra de 7.5 x 103 células en una cámara).
    4. Cultivar células RBL durante la noche en un ambiente humified de 5% CO2 a 37 ° C. Las células deben permanecer en un nivel del confluente para cerciorarse de que las células se separan y que es fácil de identificar cada celda individualmente bajo el microscopio.
  3. Transfección de células RBL - opcionales.
    1. Para exocíticas eventos en combinación con otras proteínas de la fluorescencia de etiquetado de imágenes, ver protocolo de la transfección de las células RBL en Azouz et al. 67

3. vivir la microscopía celular de exocitosis

  1. Preparación de soluciones:
    1. Preparar solución de tampón de un Tyrode final diluyendo la solución madre en DDW en una 1:20 dilución y suplemento con 20 mM de Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA y 5,6 mM de glucosa.
    2. Recién preparar un reactivo de secretagogue 20 x en buffer de Tyrode [1 μg/mL dinitrophenyl conjugada con albúmina sérica humana (DNP-tiene (Ag)) en nuestro caso, para una concentración de 1 x 50 ng/mL].
    3. Preparar una solución de cloruro de amonio 400 mM disolviendo el polvo en buffer de Tyrode.
  2. Preparación de las células.
    1. Lavar las cámaras cubreobjetos 3 veces por los medios de comunicación de la cámara de aspiración y rellenar con 300 μL de tampón de Tyrode, precalentada a 37 ° C. Finalmente, llenar la cámara con 300 μL de tampón de Tyrode, precalentada a 37 ° C.
    2. Colocar el cubreobjetos cámaras en cámara de la incubadora del microscopio. Asegúrese de que la cámara sea estable.
  3. Configuración del microscopio
    1. Para seleccionar una región de interés para realizar el seguimiento, encienda la fuente de luz fluorescente (tradicionalmente una lámpara de mercurio) y seleccione el filtro apropiado de la fluorescencia (elegir el filtro verde fluoróforos para ver FITC-los dextranos). Una vez que la región de interés está en foco y está en el centro del campo de visión, apague la fuente de luz para evitar blanqueo de foto y toxicidad.
      Nota: Algunos de la FITC-dextran incorporado en las células pueden retener de la fluorescencia. Esto es porque FITC-los dextranos también pueden ordenarse a compartimentos no lisosomal como endosomas.
    2. Encender la iluminación adecuada para la excitación de FITC. Si utilizando un microscopio láser, activar el láser de 488 nm. Emisión debe recogerse alrededor de 500-550 nm (FITC picos de emisión a 510-520 nm).
    3. Cuando se utiliza un microscopio confocal, abrir el poro al máximo. Esto permitirá utilizar toxicidad y baja energía de láser para evitar el blanqueo y asegurará la captura de eventos de la exocitosis de los planos de la célula.
    4. Calibrar el intervalo de tiempo entre adquisición de imagen.
      1. Distintas células pueden variar en su cinética de exocitosis regulada68. Para la proyección de imagen específica de exocitosis compuesta, se recomienda un intervalo de tiempo de al menos 5 segundos. Sin embargo, como regla general, para permitir la proyección de imagen rápida, asegúrese de que el tiempo de la adquisición de un solo cuadro es rápido.
      2. Cuando se utiliza un microscopio confocal de escaneo láser, establezca la dirección de exploración en bidireccional, no permite para calcular el promedio y establece la resolución a 512 x 512 (recomendado; las últimas dos disposiciones también ayudará a minimizar el blanqueo y toxicidad).
  4. Proyección de imagen de exocitosis.
    1. Imagen de células para la duración deseada, dependiendo del tipo de célula o secretagogos. En las células RBL accionadas con IgE/Ag, se producen más eventos de exocíticas en 15-20 min de activación.
    2. Para la activación de las células, agregar 16 μl de 20 x solución de secretagogue a la cámara.
  5. Confirmar presencia de FITC-los dextranos en las células.
    1. Para confirmar la presencia y localización de FITC-los dextranos a las SGs, añadir 16 μl de solución de cloruro de amonio (tenga cuidado de no mover la cámara para no perder el enfoque) a la cámara suavemente (esto hará que una concentración final de 20 mM). Esto inducirá la alcalización de las SGs y dequenching de fluorescencia FITC, que tendrá lugar dentro de los segundos.

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Representative Results

Figura 1a se representa esquemáticamente cómo FITC-los dextranos pueden actuar como reportero para regulada de la exocitosis y recapitular los diferentes modos de eventos exocíticas. En primer lugar, las células se incuban con FITC-los dextranos, que es internalizado por pinocitosis y ordenados para el SGs. Puesto que el SGs de MCs LROs, su bajo pH amortigua la fluorescencia del FITC, se muestra gránulos negros (A-C, I). Cuando las células se activan por un secretagogo y el SGs se funden con la membrana plasmática, se forma un poro de fusión, permitiendo el flujo de protones y alcalinización de las SGs. Como consecuencia, FITC recupera su fluorescencia (A, II). Completo exocitosis se manifestarán en un corto (menos de 5 s) evento fluorescente como membrana de SG exteriorizada se derrumba completamente en la membrana plasmática y FITC-los dextranos se difunde en el medio de cultivo (A, III). Durante un evento de beso-y-funcione exocíticas, membrana de SG sólo transitoriamente se fusiona con la membrana plasmática, dando lugar a un poro de fusión de breve duración y por lo tanto, sólo un breve estallido de fluorescencia como el SG se separa rápidamente y su lumen rápidamente volver a acidifica (B, III - IV). Finalmente, durante la exocitosis compuesta, de una serie de SGs fusible secuencialmente con otro (fusión de SG siguiente) así como con la membrana plasmática, con el mantenimiento de un poro de fusión abierto. Como resultado, una masa mucho más grande de FITC-los dextranos se dequenched, dando por resultado una explosión grande y duradero de la fluorescencia (C, III-IV) que se descompone cuando la sonda se difunde en el medio exterior (C, V).

Hemos utilizado este modelo y confirmó sus predicciones por proyección de imagen de las células control y las células que están agotadas de Rab5, que hemos demostrado ser crucial para homotípicos SG SG fusión69 y exocitosis compuesto33. Por ajuste de tiempo de la adquisición a una imagen cada 15 s, se esperaba detectar principalmente continuos eventos de secreción, es decir, compuesto exocitosis. De hecho, como se muestra en la figura 1B, nuestro datos muestran que mientras en el control de eventos exocíticas grande y duradera de las células pudo ser grabado, sólo algunos acontecimientos fueron registrados en las células Rab5 precipitación (shRab5). Por otra parte, acontecimientos que se registraron en las células de shRab5 fueron significativamente más pequeños en tamaño en comparación con los eventos registrados en las células del control. A destacar la capacidad secretora de las células shRab5 permanece inalterada bajo las misma condiciones69, sugiriendo que mientras que la shRab5 inhibe la exocitosis compuesto, no abolir la secreción. Por lo tanto, la fluorescencia FITC-los dextranos imágenes en intervalos de tiempo permite la detección específica de exocitosis compuesto. Además, liberación de FITC-los dextranos imagen permite capturar de la naturaleza secuencial de exocitosis compuesto. Según lo indicado por la flecha en la Figura 1b, después de un destello de luz, un flash segunda comienza como un débil rayo que es adyacente al primero. Esto se puede deducir como la fusión de una SG con una SG que ya está en el proceso de fusión con la membrana del plasma (es decir, exocitosis secuencial). Por lo tanto, como el segundo gránulo se fusiona con el gránulo de primera que ya está conectado a la membrana por un poro de fusión, el pH del gránulo segunda también aumenta y fluorescencia FITC dequenches, produciendo una segunda explosión de fluorescencia. Tal escenario de lanzamiento de FITC-los dextranos en la fusión secuencial de SGs adyacentes se presenta en la figura 1C.

Otro ejemplo de fusión secuencial de SGs durante la exocitosis compuesta se muestra en la figura 2. Las células RBL se co transfected con una forma constitutivamente activa de (CA) de Rab5a y WT SNAP-23, las condiciones bajo que exocitosis compuesto se convierte en más sólida33. Proyección de imagen de la Rab5a CA, que es esencial para la fusión de SG SG y es capa grande SGs33,69, junto con FITC-los dextranos, permite mejor visualización de la fusión de un granulado más pequeño con un gránulo de CA-Rab5a decorado más grande.

Desde FITC-los dextranos se apaga cuando se almacena dentro de la SG, es necesario implementar una técnica para verificar que FITC-los dextranos son de hecho presente en el SGs. Esto se hace aún más esencial cuando preformado un experimento bajo condiciones que se pretende abolir la secreción. Para superar este obstáculo, 20 mM de cloruro de amonio fue agregado a la cámara al final de cada experimento. Este tratamiento eleva el pH en el SGs, para fluorescencia FITC. Como se muestra en la figura 3, después de la adición de cloruro de amonio a los medios de comunicación, FITC dextrano se hace visible y se localiza junto con etiquetado mRFP neuropéptido Y, que es un reportero de la SG en las células RBL70.

Figure 1
Figura 1: detección específica de compuestos exocitosis. (a) un diagrama que describe cómo los cambios en la fluorescencia FITC-los dextranos recapitulan los diferentes modos de exocitosis regulada. (b) viven celular que imágenes de FITC-los dextranos en las células RBL transfected con NPY-mRFP y pSilencer o shRab5, como se indica. La transfección se realizó como se describió anteriormente67,70. Brevemente, 1,5 x 107 células RBL se resuspendió en buffer de transfección (DMEM suplementado con 20 mM K-pipas de pH 7, 10 μm Ca2 + acetato, acetato de magnesio2 + , glutamato de potasio 128 mM de 2 mM) que contiene 15 μg de NPY-mRFP y o 30 μg de pSilencer o 15 μg de shRab5A y 15 μg de shRab5B/C. transfección fue alcanzada por electroporación en 300 V y una longitud del pulso 20 ms. Las células fueron inmediatamente replated en medio de cultivo con 1 mg/mL FITC-los dextranos. Después de 24 h, las células se sensibilizado con 1 μg/mL de IgE y se incubaron durante más de 24 h. Las células se lavaron tres veces en buffer de Tyrode completo y activadas por 50 ng/mL de DNP-HSA (Ag). Las células fueron visualizadas por microscopia de fluorescencia Time-lapse. La flecha blanca en las imágenes de pSilencer apunta a una explosión de fluorescencia FITC y el círculo blanco marca una SG descargada. La flecha blanca en las imágenes de shRab5A/B/C indica minuto eventos fluorescentes que se producen en células Rab5 caída parece ser indicativo de exocitosis completo. De la nota, la intensidad de la imagen ShRab5 fue aumentada para permitir la detección de la señal. Imágenes fueron adquiridas por un microscopio confocal equipado con una cámara caliente (37 ° C) y controlador de CO2 (4,8%) y un objetivo de C-Apochromat x63/1.2 W Corr, configuración abierta agujero de alfiler. Para el cine completo, consulte Klein et al. 33 (c) un diagrama esquemático del proceso de fusión homotípicos SG que se muestra en (b). En detalle, como el primer SG se funde con la membrana plasmática y establece un poro de fusión, comienza a alcalinizar mientras suelta su contenido de FITC-los dextranos. Así, por el momento una segunda SG se fusiona con el primero de ellos de una manera secuencial, la fluorescencia de la primer SG se desvanece debido a la liberación de FITC-los dextranos. Sin embargo, la segunda SG alcaliza, que resulta en un flash FITC que aparece junto a la primera SG. Esta figura fue adaptada de Klein et al. 33 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: doble proyección de imagen de maestro-CA-Rab5 y FITC-los dextranos. Las células RBL se co transfected con 20 μg de HA-wt-SNAP23 y 10 μg de Rab5A maestro-CA. Las células fueron previamente incubadas con FITC-los dextranos e IgE y activadas con Ag como se describe en la figura 1. (a) una serie de imágenes que captura un evento de fusión entre una SG apagado (flecha blanca) y una SG ha fusionado ya con la membrana plasmática y por lo tanto es fluorescente. A 15,8 minutos, SG apagado ha fusionado con su vecina SG y comenzado a ganar la fluorescencia. Las áreas en caja están agrandadas en la parte inferior izquierda de cada punto del tiempo. (b) presentación de Rab5A maestro-CA (en rojo) y FITC-los dextranos (en verde) de los puntos de tiempo correspondiente se muestra en (a), que demuestra la fusión entre los dos SGs. imágenes fueron adquiridas por microscopía confocal (agujero abierto) con un Plan-apochromat x63-NA 1.4 objetivo. Esta figura fue adaptada de Klein et al. 33 para la película completa, ver Klein et al. 33 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Doble proyección de imagen de NPY-mRFP y FITC-los dextranos durante la alcalinización de SG por NH4cl. Células RBL fueron transfectadas con shRab5 previamente incubadas con FITC-los dextranos e IgE y activadas con Ag, como se describe en la figura 1. (a) las células fueron visualizadas por microscopia de fluorescencia Time-lapse. Designado a veces en las imágenes son minutos después de la activación con Ag. Imágenes fueron adquiridas por microscopía confocal con un Plan-apochromat x63-NA 1.4 objetivo. (b) análisis cuantitativo del experimento se muestra en (a). Cada línea de los gráficos es la fluorescencia media del FITC en una región de interés (ROI) en una sola celda. La flecha señala el momento de NH4Cl (20 mM) además. Barras = 5 μm. Esta figura fue adaptada de Klein et al. 33 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí describimos cómo traza la fluorescencia de FITC-los dextranos en SGs puede utilizarse para capturar específicamente compuesto exocitosis eventos. Esto se logró mediante el ajuste del microscopio para adquirir una imagen cada 15 segundos, asegurando que se registrarán sólo eventos de larga duración en el tiempo y por lo tanto excluyendo eventos cortos que corresponderían a la exocitosis completo o exocitosis de beso-y-funcione. Para establecer el método, nos demostró caída de las Rab5 isoformas que se expresan en las células RBL y son fundamentales para la exocitosis compuesto, elimina la capacidad de capturar eventos de lanzamiento de FITC-los dextranos, mientras que no se ve afectada la secreción total de la célula.

La desventaja más importante del método es que sólo se aplica a las células que contienen ácidos SGs. Sin embargo, la ventaja más importante del método es que se basa en simple incubación de las células con FITC-los dextranos, sin necesidad de transfección. Otros reporteros sensibles al pH que se utilizan para estudiar la exocitosis regulada e implican carga de SG o SG membrana proteína fusionada a phlourin, una variante de la GFP de pH-sensible (como el NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin y synapto phluorin48, 49,50,51,52), pueden representar más de cerca la composición endógena de las SGs. Sin embargo, su uso conlleva la transfección de las células, que puede ser menos adecuado para las células que son difíciles de transfectar. Por lo tanto, cuando estudiando las células son difíciles de transfectar o bajo condiciones experimentales que requieren múltiples manipulaciones genómicas, el uso de un compuesto que puede ser suplido simplemente en el medio de cultivo celular, como FITC-los dextranos, es ventajoso. Nuestro protocolo puede requerir ajustes específicos de la célula para dar cabida a las diferencias en la cinética de la exocitosis de células diferentes tipos68. Por lo tanto, debe optimizarse el intervalo de tiempo elegido para la adquisición de la imagen. Para las células RBL, tenemos puesta a punto del microscopio para capturar una nueva imagen cada 15 segundos, que en IgE/Ag activa las células RBL nos permitió visualizar sólo eventos de larga duración, permitiendo así el seguimiento exclusivo de eventos compuesto exocitosis.

Otro factor que debe considerarse es el tipo de dextrano para ser utilizado. Hay una variedad de dextranos que varían en sus pesos moleculares. Por lo tanto, es importante elegir el dextrano apropiado como reportero, teniendo en cuenta los posibles efectos que podrían tener diferentes dextranos en las células. Por ejemplo, dextranos de bajo peso molecular han demostrado para activar MCs e inducir secreción71,72,73,74. Por lo tanto, dextranos de bajo peso molecular no sería apropiados reporteros para la secreción de MC. También se observaron diferencias en la reactividad de la célula hacia dextranos en rata diferentes cepas75, o bajo diferentes condiciones coestimuladoras71,76,77,78. Aquí, hemos optado por utilizar un 150 K FITC-los dextranos que previamente ha sido estudiado en la línea celular RBL y demostrado ser ineficaz en la inducción de secreción18,79.

La fuente de luz que se seleccionarán también es crucial para el protocolo. Cuando se utiliza un microscopio confocal, la fuente de luz está tradicionalmente basada en láser. Así, para evitar la toxicidad, es imprescindible escoger un láser de baja potencia. La potencia del láser deseado diferencia entre microscopios, dependiendo del tipo y edad del láser. Por otra parte, la potencia del láser deseado es también depende del tipo de detector utilizado. Por ejemplo, cuando se utiliza un detector común como un detector basado en el tubo fotomultiplicador, un láser de potencia más alta se necesitará que cuando se utiliza un detector híbrido moderno (como un tubo fotomultiplicador y un detector de híbrido de fotodiodos de avalancha). Se recomienda utilizar la energía del laser más bajo posible y hasta un 10% de la energía del laser.

En Resumen, seguimiento dequenching de SG cargado FITC-los dextranos por tiempo que lapso-microscopía en cuidada configuración permitió exclusivamente captura de exocitosis compuesto en RBL MCs, enormemente facilitar identificación de las entidades moleculares regulan este proceso. Este método podría ajustarse más para distinguir completo de exocitosis de beso-y-funcionan al reducir y calibrar cuidadosamente el intervalo de tiempo entre adquisición de imagen para permitir la distinción de los flashes de breve duración asociados con beso-y-funcione exocitosis de los destellos incluso más cortos que acompañan a exocitosis completo. Tales condiciones serían capturar compuesto y beso-y-funcione exocitosis que podían distinguirse entonces basado en la duración de la señal.

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Disclosures

Los autores no declaran competencia interés financiero

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. U. Ashery el regalo generoso de cDNA. Agradecemos a los Drs. G. Mass, L. Mittleman, M. Shaharbani y Y.Zilberstein de Sackler celular & Molecular Imaging Center por su inestimable asistencia con microscopía. Este trabajo fue apoyado por la binacional Estados Unidos-Israel Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel y S.J.Galli) y conceder 933/15 de la Israel Science Foundation, fundada por la Academia de Israel de Ciencias (R.Sagi-Eisenberg ) y las subvenciones de NIH U19 AI 104209 y AR067145 R01 (a S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

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References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

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