Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Burada biz ayrıntılı olarak düzenlenmiş ekzositozu canlı hücre görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem lysosome ilgili organelleri içinde birikir, FITC-dextran muhabir olarak kullanır. Bu basit yöntem aynı zamanda genetik olarak işlemek zor olan hücrelerdeki düzenlenmiş ekzositozu farklı modları arasında ayrım sağlar.

Abstract

Düzenlenmiş ekzositozu tarafından salgı granül (SGs) depolanan, kargo, yanıt salgı tetikleyici olarak yayımlanan bir süreçtir. Düzenlenmiş ekzositozu hücreler arası iletişim için temel ve nörotransmitter, hormonlar, inflamatuar aracılar ve diğer bileşenleri, hücreler çeşitli tarafından salgılanmasını için önemli bir mekanizma. En az üç farklı mekanizmaları için düzenlenmiş ekzositozu bilinir: tam ekzositozu nerede tek bir SG tam olarak plazma zarı, nerede bir tek SG geçici plazma zarı ile sigortalar, öpücük ve çalıştırma ekzositozu ve bileşik ekzositozu, sigortalar, nerede birkaç SGs ile her diğer, önce veya sonra SG füzyon plazma zarı ile sigorta. Düzenlenmiş ekzositozu bir hücre tarafından üstlenilen tipi kez salgı tetikleyici türü tarafından belirlenir. Ancak, birçok hücrelerde, tek bir salgı tetikleyici düzenlenmiş ekzositozu birden çok modları aynı anda etkinleştirebilirsiniz. Bereket ve hücre tipleri ve türler arasında önem rağmen salgı farklı mod belirlemek mekanizmaları büyük ölçüde çözümlenmemiş. Düzenlenmiş ekzositozu, farklı mod soruşturma içinde ana sorunlardan biri onları ayrı ayrı keşfetmek gibi aralarında ayrım zorluk var. Burada floresein isothiocyanate (FITC) nasıl kullanılacağını açıklar-dextran bir ekzositozu gazeteci ve canlı hücre düzenlenmiş ekzositozu bileşik ekzositozu üzerinde odaklanarak, farklı yollar arasında ayırt etmek için Imaging olarak dayalı sağlamlık ve exocytic olaylar süresi.

Introduction

Düzenlenmiş ekzositozu tarafından kolayca yapılan kargo yanıt-e doğru belirli bir tetikleyicinin salgı bir hücrede bulunan serbest için birincil mekanizmasıdır. Kargo önceden oluşmuş ve salgı veziküller, tetikleyici SGs içerik sürümü için sinyal rölesi kadar bu depolandığı içine münzevi. Farklı tipteki sinyalleri düzenlenmiş ekzositozu farklı modlarda neden olabilir veya düzenlenmiş ekzositozu farklı mod aynı anda ortaya çıkabilir. Düzenlenmiş ekzositozu üç ana mod bilinmektedir: tam füzyonu ile plazma zarı; tek bir salgı granül içerir tam ekzositozu Onun geri dönüşüm tarafından takip plazma zarı ile geçici füzyon salgı granül içerir öpücük tarafından işletilen ekzositozu; ve birkaç SGs önceden (yani, multigranular ekzositozu) homotipik füzyon tarafından karakterize bileşik ekzositozu veya sıralı (yani, sıralı ekzositozu) Fusion plazma zarı1. Kargo yer alan SGs--dan da dahil olmak üzere, hızlı salgılanmasını sağlar gibi bileşik ekzositozu kargo release2, en geniş modunda plazma zarı distal kabul edilir. Bileşik ekzositozu hem ekzokrin ve endokrin hücreleri3,4,5,6,7,8,9, hem de belgelenmiş oldu bağışıklık hücreleri. Bağışıklık hücreleri, eozinofiller10,11,12 ve nötrofil13gibi bileşik ekzositozu arabulucu gibi işgal patojenleri öldürmek için gerekli olan hızlı ve sağlam sürümü sağlar bakteri ya da asalak. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, anafilaksi ve diğer alerjik reaksiyonlar14,15,16 sırasında önceden saklı inflamatuar aracılar verimli sürümü için bileşik ekzositozu mast hücreleri (MCs) dağıtma , 17. bu yana ekzositozu farklı mod18,19aynı anda ortaya çıkabilir, onları gerçek zamanlı olarak ayırt etmek için ya da bu nedenle elucidating onların anılan sıraya göre fusion makineleri belirlemek için bir meydan okuma olmuştur onların temel mekanizmaları.

Burada dayalı bir yöntem mevcut canlı hücre hücrenin görüntüleme exocytic olaylar gerçek zamanlı izleme ve onların farklı modları arasında ayrım sağlar FITC-dextran, yüklü. Özellikle, bizim Yöntem özel bileşik ekzositozu izleme sağlar.

FITC dextran glukan polisakkarit dextran ile pH duyarlı fluorophore FITC eşlenik var. Fluorescently etiketli dextrans hücre girmek için micropinocytosis20,21 ve macropinocytosis22,23tarafından gösterilmiştir. Endositik bölmeleri organellerin olgun olarak FITC dextran hiçbir belirgin bozulma ile lysosome içinde biriken gösterilmiştir. Ancak, beri FITC çok pH hassas fluorophore24ve lysosome lümen asittir, lysosome24ulaşan üzerine FITC dextran floresans quenches. Bu nedenle dextrans lysosome kurulması, FITC pH hassasiyeti ile birlikte alınan kargo, hedeflenen çalışmalar lysosome ekzositozu25,26,27 FITC dextran kullanımında temeli atılmıştır var , 28 , 29.

MCs, nötrofiller, eozinofiller, sitotoksik T hücreleri, melanosomes ve diğerleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin SGs lizozomal özellikleri görüntülemek ve organelleri (LROs) lysosome ile ilgili ya da salgı organellerin30,31 sınıflandırılır . LROs asidik bir luminal pH var, FITC dextran daha yüksek pH LROs exteriorization ile ilişkili bir sonucu olarak kendi ekzositozu görselleştirmek için kullanılabilir. Nitekim, FITC dextran ekzositozu MCs18,32,33içinde izlemek için kullanılır. Bu yöntemde, FITC dextran hücre kültürü için eklendi, hücreler tarafından pinocytosis tarafından alınan ve SGs sıralanmış. Organellerin içinde olduğu gibi hücre içinde oldukları zaman FITC floresans SGs söndürülür. Ancak, plazma zarı ve bunun sonucunda maruz kalma dış çevre ile SG fusion FITC dextran onun floresans SG pH yükselir olarak basit bir izleme exocytic olayları canlı cep mikroskobu tarafından izin kavuşur. Burada, bileşik ekzositozu benzersiz izlemeyi etkinleştirmek için bu yöntemi ayarlanır.

Diğer iki yöntem daha önce bileşik ekzositozu izlemek için kullanılmaktadır. Elektron mikroskobu ekzositozu farklı mod oluşumunu önerdi exocytic yapıları karakterize etmek için ilk yöntem oldu. Özellikle, "salgı tünellerde" pankreas acinar hücreleri34 ve MCs35,36,37 gözlemleri bileşik ekzositozu hipotez için doğuran. Ancak, elektron mikroskobu yüksek çözünürlüklü erimiş veziküller ortaya çıkarmak için güç olsa da, onların füzyon dinamikleri takip edemez ve bu nedenle onlar SG füzyon bileşik ekzositozu sırasında veya alınmış granül füzyonu karşılık tanımlayamazsınız onların endositoz takip. Plazma zarı kapasite11,13,38,39 veya amperometry düzeltme eki kelepçe ölçülerini gibi canlı hücrelerdeki ekzositozu ölçebilirsiniz diğer yöntemleri bu engeli aşmak 40 medya. Ancak, özel bir kurulum gerektirir yama sıkma ve tüm hücre türleri için uygun olmayabilir. Amperometry ölçümler elektrot birbirine çok yakın kargo yayımlanırsa ekzositozu takip edebiliyoruz. Bu nedenle, canlı hücre Imaging'i kullanma gibi sadece ekzositozu gerçek zamanlı izleme için sağlar, ama aynı zamanda tüm cep telefonu veri hızlı ve basit edinimi sağlar Bu yöntemler üzerinde bir avantaj sağlar.

FITC dextran izleme canlı cep mikroskobu tarafından bazı avantajları diğer canlı hücre için görüntüleme tabanlı yöntemleri sunuyor. Örneğin, yaygın olarak kullanılan bir yöntem bir floresan SG sonda ile yüklenen veya bir floresan protein öğesini SG kargo veya membran protein26,41, ifade hücrelerinin toplam iç yansıma floresans mikroskobu (TIRFM) olduğunu 42 , 43. sadece (burada ayak izi adlandırılır), plazma zarı yakın meydana gelen olayları izlemek için onun yetenek bu yöntemin gücü yatıyor dolayısıyla exocytic olaylar. Bu coverglass için bitişik ve mikroskop objektif yakın olabilir hücre Kesir44yansıma ancak, aynı zamanda bu yöntemin dezavantajı olmasıdır. Böyle ayak izleri gerçekten tüm hücre membran yüzey temsil olup olmadığını hala tartışmaya açık45,46,47yaşında. Bu bağlamda, bir pH duyarlı boya gibi FITC dextran ve Standart Floresan mikroskop ya da confocal mikroskop ile açık bir iğne deliği kullanarak böylece o hücrede oluşan toplam exocytic olayları yakalama tüm cep telefonu, görüntüleme sağlar.

Tüm cep telefonu görüntüleme veya TIRFM tarafından düzenlenir ekzositozu eğitim için kullanılan ek pH duyarlı gazetecilere SG kargo veya phlourin için bir pH duyarlı GFP değişken erimiş SG membran protein içerir. Örnek NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin ve synapto-phluorin48,49,50,51,52verilebilir. Bu sondalar ifade daha yakından SGs endojen bileşimi temsil ederken, transfection hücre gerektirir ve bu nedenle daha az transfect zor olan hücreler için uygun olabilir. Bu nedenle, ne zaman eğitim bu hücreleri transfect zor veya birden çok genomik manipülasyonlar gerektiren deneysel koşullar altında sadece FITC-dextran gibi hücre kültür ortamına içine desteklenebilir bir bileşik kullanımı avantajlıdır . FITC dextran akridin turuncu (AO), üzerinde bir avantaj sunduğu diğer ekzositozu izleme için canlı cep mikroskobu53,54,55,56 tarafından kullanılan başka bir pH duyarlı boya , 57 , 58. AO gerçek salgılanması için karşılık gelmeyen yanlış yanıp söner, sonucu27işler veziküller photolysis ikna etmek için gösterilen. Buna ek olarak, FITC dextran düşük fotoğraf kaynaklı üretim / reaktif oksijen27nedeniyle muhtemelen daha iyi salgı olayları yansıtır.

Özellikle, ekzositozu eğitim için alternatif bir boya, bu işlem sırasında açılır füzyon gözenek aracılığıyla SG içine dış ortamdan akını izleyerek yaklaşımıdır. Bu durumda, boya salgı tetik yanında dış ortama eklenir. O zaman, Füzyon gözenek açıldığında, boya SG59,60dağılır. Bu yöntemin açık bir avantaj bu da füzyon gözenek boyutu, değişken boyutu boyalar kullanılarak tahmin olanağı sunuyor olmasıdır. Örneğin, farklı molekül ağırlığı (MW), farklı fluorophores için Birleşik dextrans ekstrasellüler boyaları nereye SG nüfuz dextran en büyük boyutunu füzyon gözenek59, boyutuna karşılık olarak kullanılabilir 61 , 62 , 63 , 64. Buna ek olarak, bu yaklaşım bir pH duyarlı sonda kullanımı gerektirmez. Ancak, önemli bir dezavantaj boya büyük miktarda alım kaynaklanan yüksek arka planda görüntülerin sırasında medyada mevcut olduğu için sinyal gürültü oranı çok düşük olmasıdır.

Genel olarak, ekzositozu avans olarak FITC dextran kullanımı daha önce raporlanmış yöntemleri, sinyal gürültü oranı, toksisite, dinamik izleme ve karmaşıklık gibi çeşitli dezavantajları üstesinden gelir.

Burada FITC dextran (burada RBL, öncelikle Eccleston vd tarafından kurulan denir RBL - 2 H 3 mast hücresi doğrultusunda bileşik ekzositozu izlemek için nasıl kullanılacağını açıklar 65 ve daha da klonlanmış tarafından Barsumian vd. 66), yanıt immünglobulin E (IgE) / antijen (Ag) etkinleştirme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlıkları

  1. RBL Kültür medya hazırlanması
    1. Mix 500 mL düşük glikoz Dulbecco'nın 5.5 mL penisilin-streptomisin-nistatin çözeltisi, 5.5 mL L-glutamin 200 mM çözeltisi ile 56 mL fetal Sığır serum (FBS), kartal'ın orta (DMEM) değiştiren. Bu sonuçlarında düşük glikoz DMEM %10 FBS, 100 µg/mL streptomisin, 100 adet/mL penisilin, 12 adet/mL nistatin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir.
    2. Medya 4 ° C'de 0,22 µm gözenek boyutu ve mağaza bir üst-vakum filtre kullanarak filtre uygulama
  2. Bakım RBL hücre.
    1. RBL hücreleri maksimum confluency 10 cm tabak içinde % 90 için büyür. Hücre kültürü sağlıklı ise, hücreleri ara sıra çıkıntılar bir iğ şeklinde olmalı.
    2. Medya aspirating ve 5-10 dakika oksijen bir atmosferde % 5 CO2 37 ° C'de 2 mL trypsine/EDTA çözeltisi B. Incubate ile değiştirerek çanak hücreleri bölme hücre için ayırmak
    3. Hücreleri ayırdıktan sonra kültür ortamının bir pipet kullanarak 2 mL ekleyerek tripsin etkisiz hale getirmek ve bir 1:2-1'deki hücreleri bölme: 10 oranı.
  3. 20 x Tyrode'nın arabellek hazırlanması
    1. Bir hisse senedi 20 x 54 mM KCl çözeltisi, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl ve 8 mM NaH2PO4 kişilik distile su (DDW)'te hazırlayın. Mix iyi ve 4 ° C'de depolayın

2. canlı cep mikroskobu RBL hücre kültürü

  1. FITC dextran çözüm hazırlanması.
    1. FITC dextran tozu (150 K) 1 mg 1 mL (bkz. Adım 1.1.1) kültür ortamının karıştırın. Tam bir odacıklı coverglass için 3 mL hazırlayın.
    2. Selüloz asetat şırınga filtre ünitesi 0,22 µm gözenek boyutu ile kullanarak, çözünmüş FITC dextran filtre uygulama.
    3. Fare IgE 1 µg/mL konsantrasyonu için ekleyin.
  2. RBL hücreleri görüntüleme için tohum
    1. Görüntüleme, önceki gün kültür çanak medyadan Aspire edin ve 5-10 dakika 37 ° C'de % 5 CO2 oksijen bir ortamda 2 mL trypsine/EDTA çözeltisi B. Incubate ile değiştirin Hücreleri ayırdıktan sonra tripsin kültür ortamının 2 mL ekleyerek etkisiz hale getirin.
    2. Count RBL bir hemasitometre kullanarak hücreleri ve buna göre ses seviyesini kültür medyayla 7.5 x 105/mL bir hücre konsantrasyon.
    3. Hücre süspansiyon ile taze FITC dextran önceden doldurulmuş bir odacıklı coverglass için 10 µL Kültür (Bu 7.5 x 103 hücreleri bir odasında, tohum sonuçlanır) medya takıma ekleyin.
    4. Gecede bir atmosferde humified 37 ° C'de % 5 CO2 RBL hücrelerin büyümesine Hücreleri bir alt konfluent kademede hücreler ayrılır ve mikroskop altında tek tek her hücre tanımlamak için kolay emin olmak için kalmalıdır.
  3. RBL hücre - isteğe bağlı transfection.
    1. Exocytic olaylar fluorescently etiketli diğer proteinler ile birlikte görüntüleme için Azouz ve ark. hücrelerde RBL için transfection Protokolü Bkz: 67

3. canlı cep mikroskobu ekzositozu

  1. Çözümler hazırlanması:
    1. Bir son Tyrode'nın arabellek çözüm 1: 20'ddw hisse senedi çözümde sulandrarak hazırlamak seyreltme ve ek 20 mM Hepes pH 7, 1.8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA ve 5.6 mM glikoz ile.
    2. Taze bir 20 x salgılatıcı reaktif Tyrode'nın tampon hazırlamak [1 µg/mL dinitrophenyl Birleşik insan serum albumin (DNP-(Ag) vardır) bir 50 ng/mL 1 x konsantrasyon için bizim durumumuzda].
    3. 400 mM amonyum klorür çözüm toz Tyrode'nın tampon çözülerek hazırlayın.
  2. Hücreleri hazırlanması.
    1. Odacıklı coverglass odası ortamdan aspirating ve 37 ° C'ye prewarmed Tyrode'nın tamponunun 300 µL ile dolum tarafından 3 kez yıkamak Son olarak, odası 37 ° C'ye prewarmed Tyrode'nın tamponunun 300 µL ile doldurmak
    2. Odacıklı coverglass mikroskop'ın kuluçka odasında yerleştirin. Odası kararlı olduğundan emin olun.
  3. Mikroskop kurma
    1. İzlemek ilgi bir bölge seçmek için floresan ışık kaynağı (civa lamba geleneksel olarak) açın ve uygun floresan filtre seçin (yeşil fluorophores FITC dextran görüntülemek için filtre seçin). Bölgenin ilgi odak ve görüş alanı ortasında kez fotoğraf ağartma ve toksisite önlemek için ışık kaynağının açmak.
      Not: Bazı hücrelerde dahil FITC dextran floresans saklayabiliriz. Bunun nedeni FITC dextran da endosomes gibi sigara lizozomal bölmeleri için sıralanmış.
    2. Uygun aydınlatma FITC uyarma için açın. Lazer tabanlı bir mikroskop kullanarak, 488 nm lazer üzerinde açın. Emisyon çevresinde toplanan 500-550 nm (FITC emisyon tepeler, 510-520 nm).
    3. Confocal mikroskop kullanırken, iğne deliği ve sondaj maksimum açın. Bu beyazlatma önlemek için daha düşük lazer güç ve toksisite kullanarak sağlayacak ve hücrenin tüm uçaklar olaylardan ekzositozu yakalanması sağlayacaktır.
    4. Resim satın almalar arasındaki zaman aralığını ayarlama.
      1. Farklı hücrelere düzenlenmiş ekzositozu68onların kinetik içinde değişebilir. Bileşik ekzositozu belirli görüntüleme için bir zaman aralığı en az 5 saniye öneririz. Ancak, kural olarak, hızlı görüntüleme için izin vermek için tek bir kare alma zamanın hızlı olduğundan emin olun.
      2. Lazer tarama confocal mikroskop kullanırken, çift yönlü tarama yönünü ayarlamak, değil ortalama için izin ve ayarla çözünürlük 512 x 512 (önerilen; ikinci iki Hükümler Ayrıca ağartma ve toksisite en aza indirmek için yardımcı olur).
  4. Ekzositozu görüntüleme.
    1. Görüntü hücre hücre veya salgılatıcı türüne bağlı olarak istenilen süreler için. IgE/Ag ile tetiklenen RBL hücrelerde en exocytic olayları harekete geçirmek içinde 15-20 dk oluşur.
    2. Hücrelerin aktivasyonu için odasına salgılatıcı çözüm x 20 16 µL ekleyin.
  5. Hücreleri FITC dextran huzurunda teyit.
    1. Varlığı ve yerelleştirme FITC-dextran SGs için onaylamak için 16 µL amonyum klorür çözüm (dikkatli odası odak kaybetmek değil sırayla hareket olmak) odasına yavaşça ekleyin (bu-ecek yapmak son bir konsantrasyon 20 mm). Bu SGs alkalization ve saniye içinde gerçekleşir FITC floresan, dequenching neden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1a şematik nasıl FITC dextran muhabir olarak ekzositozu düzenlenmekte ve exocytic olayları farklı mod özetlemek için hareket edebilir temsil eder. İlk olarak, hücre hangi pinocytosis tarafından içselleştirilmiş ve SGs için sıralanmış FITC-dextran ile inkübe. MCs SGs LROs olduğundan, onların düşük pH FITC, burada gösterildiği gibi siyah granül floresans bozamıyor (A-C, ben). Hücreleri bir salgılatıcı ve plazma zarı ile SGs sigorta tarafından tetiklendiğinde, sızma proton ve SGs alkalization izin vererek bir füzyon gözenek oluşturulur. Sonuç olarak, FITC, floresan (bir, II) kavuşur. Tam ekzositozu kısa bir kendini tezahür (5'ten s) Floresan olay exteriorized SG'ın membran tam olarak plazma zarı ve FITC dextran çöker gibi dağılır uzakta kültür orta (bir, III). Bir öpücük ve çalıştırma exocytic olay sırasında SG'ın membran sadece geçici bir kısa ömürlü füzyon gözenek kaynaklanan plazma zarı ile sigortalar ve bu nedenle floresans SG olarak sadece kısa bir patlama hızla ayırır ve onun lümen hızla yeniden (B, acidifies III - IV). Son olarak, bileşik ekzositozu sırasında SGs bir dizi ardışık olarak sigorta (aşağıdaki SG füzyon) birbirleri ile yanı sıra bir açık füzyon gözenek bakım ile plazma zarı. Sonuç olarak, FITC dextran çok daha büyük bir kitle, sonda dış Orta (C, V) dağılır yükleyen bozunmaları bir büyük ve uzun ömürlü floresan patlaması (C, III-IV) sonuçlanan dequenched.

Biz bu modeli kullanılan ve kendi Öngörüler görüntüleme kontrol hücreleri ve homotipik SG-SG füzyon69 ve bileşik ekzositozu33için çok önemli olduğu gösterilmiştir Rab5, tükenmiş olan hücreler tarafından onaylandı. Satın alma zaman görüntüye her 15 ayarlayarak s, salgı, Yani, bileşik ekzositozu çoğunlukla sürekli olayları algılamak bekleniyor. Nitekim, Şekil 1B adımında gösterildiği gibi bu süre kontrol birçok büyük ve uzun ömürlü exocytic olay hücreleri bizim veri göstermek kaydedilmiş, yalnızca birkaç olaylar Rab5 devirme hücrelerde (shRab5) kaydedildi. Ayrıca, shRab5 hücrelerde kaydedildi olayları önemli ölçüde daha küçük kontrol hücreleri içinde kaydedilmiş olan olayları ile karşılaştırıldığında. Not, shRab5 hücreler salgı kapasitesi shRab5 bileşik ekzositozu inhibe ederken, salgı kaldırılması değil düşündüren aynı koşullar69altında tam olarak kalır. Bu nedenle, uzun aralıklarla görüntüleme FITC dextran floresans bileşik ekzositozu özel algılama için sağlar. Ayrıca, görüntüleme FITC dextran yayın bileşik ekzositozu sıralı doğası yakalama sağlar. Bir ışık, aşağıdaki Şekil 1b, oku gösterildiği gibi ilk bitişik zayıf flaş olarak ikinci bir flaş başlar. Bu bir SG plazma zarı (yani, sıralı ekzositozu) ile fusion sürecinde zaten bir SG ile füzyon olarak anlaşılmaktadır olabilir. Dolayısıyla, plazma zarı füzyon gözenek tarafından zaten bağlı ilk granül ile ikinci granül sigortalar ikinci granül pH de artar ve floresan ikinci bir patlama verimli FITC floresan dequenches. Böyle bir senaryo FITC dextran sürüm sırasında bitişik SGs sıralı füzyon Şekil 1 csunulur.

SGs sıralı füzyon bileşik ekzositozu sırasında başka bir örnek Şekil 2' de verilmiştir. RBL hücreleri Rab5a ve WT ek-23, koşullar altında hangi bileşik ekzositozu daha sağlam33olur yapısal etkin (CA) biçimi ile birlikte transfected. Görüntüleme CA Rab5a, SG-SG füzyon için gerekli olan ve büyük SGs33,69, birlikte FITC-dextran, kaplama, daha büyük bir CA-Rab5a dekore edilmiş granül ile daha küçük bir granül füzyonu daha iyi görselleştirme sağlar.

FITC dextran içinde SG saklandığında söndürülür beri FITC dextran SGs içinde gerçekten de yüklü olduğunu doğrulamak için bir tekniği uygulamak gereklidir. Bu salgı kaldırılması için beklenen koşullar altında bir deney preforming zaman daha da önemli hale gelir. Bu engeli aşmak için amonyum klorür 20 mM odası, her deneme sonuna eklenmiştir. Bu tedavi FITC floresan için izin veren SGs içinde pH yükseltir. Şekil 3' te, amonyum klorür medyaya ilavesi sonra gösterildiği FITC dextran görünür hale gelir ve mRFP öğesini peptit bir SG muhabir RBL hücreleri70' Y ile birlikte yerelleştirilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: bileşik ekzositozu belirli algılama. (a) nasıl düzenlenmiş ekzositozu farklı mod FITC dextran floresans değişiklikleri özetlemek açıklayan bir diyagram. (b) hücre FITC-dextran RBL hücrelerdeki görüntüleme ile NPY-mRFP ve ya pSilencer ya shRab5, transfected belirtildiği gibi yaşamak. Transfection yukarıda açıklanan67,70gerçekleştirildi. Kısaca, 1.5 x 107 RBL hücreleri transfection tampon (DMEM ile 20 mM K-borular pH 7, 10 µM Ca2 + asetat, 2 mM Mg2 + asetat, 128 mM potasyum glutamat takıma) resuspended 15 µg NPY-mRFP ve pSilencer ya da 30 µg içeren veya shRab5A 15 µg ve shRab5B/c Transfection 15 µg Elektroporasyon 300 V ve 20 msn pulse uzunluğu tarafından elde. Hücreleri hemen kültür 1 mg/mL FITC dextran içeren ortamda kaplanarak. 24 saat sonra hücreleri 1 µg/mL ile IgE duyarlı ve daha fazla 24 saat inkübe edildi. Hücreler daha sonra üç kez tam Tyrode'nın arabellekte yıkanmış ve 50 ng/mL tarafından DNP-HSA (Ag) aktif. Hücreleri tarafından hızlandırılmış floresans mikroskobu görüntülenir. PSilencer görüntülerde beyaz ok FITC floresan bir patlamaya yol gösterir ve beyaz dairenin taburcu SG işaretler. ShRab5A/B/C görüntülerde beyaz ok Rab5 nakavt hücrelerde, tam ekzositozu gösterge olması muhtemeldir oluşan dakika floresan olaylarını gösterir. Not, ShRab5 görüntü yoğunluğunu sinyal algılama izin için yükseltilmiştir. Görüntüleri ısıtmalı odası (37 ° C) ve CO2 denetleyicisi (% 4,8) ve açık iğne deliği ayarı altında bir C-Apochromat x63/1.2 W Corr amacı ile donatılmış confocal mikroskop tarafından elde. Full filmler için Klein ve ark. için başvurun 33 (c) (b) gösterilen homotipik SG füzyon süreci bir Şematik diyagramı. İlk SG ile plazma zarı Sigortalar ve füzyon gözenek kurar gibi ayrıntılı olarak bu FITC dextran içeriğini serbest bırakılırken alkalize başlar. Böylece, zamanla sıralı bir şekilde, ilk SG fades FITC dextran sürümü nedeniyle floresans birinci ile ikinci bir SG sigortalar. Ancak, ikinci SG alkalizes, hangi ilk SG bitişik görünen FITC flaş sonuçlanır. Bu rakam Klein ve ark. adapte oldu 33 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Çift görüntüleme FITC dextran ve mehmet-CA-Rab5. RBL hücreleri HA-wt-SNAP23 20 µg ve mehmet-CA Rab5A 10 µg ile birlikte transfected. Hücreleri FITC dextran ve IgE ile önceden inkübe ve Şekil 1' de açıklandığı gibi Ag ile tetiklenen. (a) çeliklerini SG (beyaz ok) ve bir SG arasında bir füzyon olay yakalama görüntüleri bir dizi bu zaten plazma zarı ile erimiş ve bu nedenle floresan. Çeliklerini SG 15.8. dakikada, onun komşu SG ile erimiş ve floresan kazanmaya başladı. Kutulu alanları her zaman noktası sol alt genişlemiş. Mehmet-CA Rab5A (kırmızılı) ve FITC-dextran gösterilen karşılık gelen zaman noktalarından (yeşil), (b) tanıtımı içinde (a), iki arasında füzyon gösteren SGs. görüntüleri bir Plan apochromat kullanarak confocal mikroskobu tarafından (açık iğne deliği) elde x63-NA 1,4 amaç. Bu rakam Klein ve ark. adapte oldu 33 full film için bkz: Klein ve ark. 33 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: SG alkalization NH4CL tarafından sırasında NPY-mRFP ve FITC dextran çift görüntüleme RBL hücreleri ile shRab5 transfected, önceden FITC dextran ve IgE ile inkübe ve Şekil 1' de açıklandığı gibi Ag ile tetiklenen. (a) hücreleri tarafından hızlandırılmış floresans mikroskobu görüntülenir. Kez görüntüleri belirlenmiş Ag ile tetikleme sonra dakika vardır. Görüntüleri bir planı-apochromat x63-NA 1.4 amacı istimal confocal mikroskobu tarafından elde. (b) kantitatif analiz gösterilen deneme içinde (a). Her çizgi grafiklerde FITC ilgi (ROI) bir bölge, ortalama floresans üzerinde tek bir hücredir. Ok NH4Cl (20 mM) ek saat için işaret eder. Barlar 5 mikron =. Bu rakam Klein ve ark. adapte oldu 33 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada nasıl izleme FITC dextran SGs yüklenen floresans özellikle bileşik ekzositozu olayları yakalamak için kullanılabilir açıklar. Bu her 15 saniyede bir görüntü elde etmek için mikroskop ayarlayarak, böylece yalnızca uzun ömürlü olaylar zaman içinde kaydedilecek sağlanması ve bu nedenle tam ekzositozu veya öpücük tarafından işletilen ekzositozu karşılık kısa etkinlikleri hariç sağlanır. Yöntem kurmak için RBL hücrelerde ifade edilir ve bileşik ekzositozu için hayati önem, genel salgısı hücre tarafından değil etkilenir FITC dextran açıklaması, olayları yakalama yeteneği ortadan kaldırır Rab5 izoformlarının bu nakavt gösterdi.

Yöntem en önemli dezavantajı sadece asidik SGs içeren hücrelere uygular olmasıdır. Bununla birlikte, yöntemin en önemli avantajı bu basit kuluçka FITC-dextran, içeren hücrelerin üzerinde transfection gerektirmeden dayanır. Düzenlenmiş ekzositozu çalışma ve SG kargo veya SG membran protein erimiş phlourin, (NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin ve synapto-phluorin48, gibi bir pH duyarlı GFP değişken için ilgili kullanılan diğer pH duyarlı gazeteciler 49,50,51,52), daha yakından SGs endojen bileşimi temsil edebilir. Ancak, bunların kullanımı transfection transfect zor olan hücreler için daha az uygun olabilir hücrelerin üzerine kuruludur. Bu nedenle, ne zaman eğitim bu hücreleri transfect zor veya birden çok genomik manipülasyonlar gerektiren deneysel koşullar altında hücre kültürü ortamında FITC-dextran gibi sadece desteklenebilir bir bileşik kullanımı avantajlıdır. Bizim iletişim kuralı ekzositozu farklı hücre türleri68kinetik farklılıkları barındırmak için hücre belirli ayarlar gerektirebilir. Bu nedenle, resim alma seçtiğiniz zaman aralığının optimize edilmelidir. RBL hücreler için biz 15 IgE/Ag RBL hücreleri tetiklediği saniyede, yeni bir görüntü yakalamak için mikroskop bize sadece uzun ömürlü olaylar, görselleştirmek izin set-up böylece bileşik ekzositozu olayların özel izleme izin var.

Dikkate alınması gereken bir diğer faktör kullanılmak üzere dextran türüdür. Onların moleküler ağırlıklar değişir dextrans çeşitli bulunmaktadır. Bu nedenle, farklı dextrans hücreleri üzerinde olabilir potansiyel etkileri dikkate alarak bir muhabir olarak uygun dextran seçmek önemlidir. Örneğin, düşük molekül ağırlıklı dextrans MCs etkinleştirmek ve salgı71,72,73,74ikna etmek için gösterilmiştir. Bu nedenle, düşük molekül ağırlıklı dextrans MC salgılanması için uygun gazetecilere olmaz. Hücre reaktivite dextrans doğru farklılıkları da farklı fare suşları75veya farklı co-stimulatory koşulları71,76,77,78altında kaydedilmiştir. Burada, bir 150 K FITC-daha önce RBL hücre hattında okudu ve salgı18,79inducing etkisiz olduğu gösterilmiştir dextran kullanmayı seçtiniz.

Seçilecek ışık kaynağı da iletişim kuralı için çok önemlidir. Confocal mikroskop, ışık kaynağı geleneksel lazer tabanlı kullanıldığında. Böylece, toksisite önlemek için düşük lazer güç seçmek zorunludur. İstenen lazer güç arasında mikroskoplar, Yaş lazer ve türünü bağlı olarak farklılık gösterir. Ayrıca, istenen lazer güç aynı zamanda kullanılan dedektörü türüne bağlıdır. Örneğin, bir photomultiplier tüp tabanlı dedektörü gibi ortak bir dedektör kullanırken, daha yüksek bir güç lazer daha modern hibrid dedektörü (örneğin bir photomultiplier tüp ve bir çığ fotoğraf diyotlar hibrid dedektörü) kullanırken gerekli olacaktır. Lazer güç yüzde 10'u geçmeyen ve olası en düşük lazer güç kullanarak öneririz.

Özetle, SG dequenching izleme FITC dextran sukut-mikroskobu dikkatle seçilmiş ayarları'nın altında bize için özel olarak yakalama bileşik ekzositozu RBL MCs, moleküler varlıkların büyük ölçüde kolaylaştıran kimlik içinde bu süreyi tarafından yüklenen Bu işlem düzenler. Bu yöntem daha da azaltılması ve dikkatle öpücük ve çalıştırma ile ilgili kısa süreli yanıp söner ayrım izin için görüntü Alım arasındaki zaman aralığını ayarlama tarafından tam öpücük tarafından işletilen ekzositozu ayırmak için ayarlanmış olabilir ekzositozu üzerinden tam ekzositozu eşlik bile daha kısa yanıp söner. Bu koşullar sinyal süresine göre o zaman ayırt bileşik ve öpücük tarafından işletilen ekzositozu yakalamak istiyorsunuz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip finansal faiz beyan

Acknowledgments

Dr. U. Ashery cDNA cömert bir hediye için teşekkür ederiz. Biz Drs. G. kütle, L. Mittleman, M. Shaharbani ve Y.Zilberstein Sackler hücresel ve moleküler görüntüleme Merkezi mikroskobu ile onların çok değerli yardım için teşekkür ederim. Bu eser Amerika Birleşik Devletleri-İsrail iki uluslu Bilim Vakfı (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, ı. Hammel ve S.J.Galli) tarafından desteklenen ve 933/15 Bilimler (için R.Sagi-Eisenberg İsrail Akademisi tarafından kurulan İsrail Bilim Vakfı Hibe ) ve NIH hibe U19 AI 104209 ve R01 AR067145 (için S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

Biyoloji sayı: 136 FITC-dextran düzenlenmiş ekzositozu bileşik ekzositozu canlı hücre görüntüleme lysosome ile ilgili organelleri pinocytosis
Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter