Summary
Proteasen zijn strak gereguleerde enzymen die betrokken zijn bij de fundamentele biologische processen en dysregulated protease-activiteit stations progressie van complexe ziekten zoals kanker. Doel van deze methode is het creëren van nanosensors die door het produceren van een decollete-signaal dat is aantoonbaar uit host urine en discrimineert ziekte protease activiteit in vivo meten.
Abstract
Proteasen zijn multifunctionele enzymen die zijn gespecialiseerd in de hydrolyse van peptide-obligaties en brede biologische processen, met inbegrip van homeostase en allostasis te controleren. Bovendien dysregulated protease-activiteit drijft pathogenese en is een functionele biomarker van ziekten zoals kanker; Daarom kan de mogelijkheid om te detecteren protease activiteit in vivo klinisch relevante informatie voor biomedische diagnostische gegevens bevatten. Het doel van dit protocol is het creëren van nanosensors die voor protease activiteit in vivo sonde door overlegging van een meetbare signaal in de urine. Deze protease-nanosensors bestaan uit twee onderdelen: een nanoparticle en substraat. De functies van de nanoparticle te verhogen omloop half-life en substraat levering naar doel ziekte sites. Het substraat is een opeenvolging van korte peptide (6-8 AA), die is ontworpen om specifiek voor een doelgroep protease of de protease-groep. Het substraat is geconjugeerd met het oppervlak van de nanoparticle en wordt beëindigd door een verslaggever, zoals een TL marker, voor de detectie. Zoals dysregulated proteasen het peptide substraat klieven, wordt de verslaggever gefilterd in de urine voor kwantificering als een biomarker van protease-activiteit. Hierin beschrijven we de bouw van een nanosensor voor matrix metalloproteinase 9 (MMP9), die geassocieerd met tumor progressie en metastase, voor de opsporing van colorectale kanker in een muismodel wordt.
Introduction
Proteasen zijn multifunctionele enzymen die zijn gespecialiseerd in de hydrolyse van peptide-obligaties en aanzienlijke controle hebben over vele biologische processen, met inbegrip van homeostase, allostasis en ziekte1. Een veranderde staat van protease-activiteit heeft zijn gecorreleerd aan een verscheidenheid van ziekten, waaronder kanker en hart-en vaatziekten, proteasen aantrekkelijke kandidaten voor ontwikkeling in klinische biomarkers2,3te maken. Protease-activiteit is bovendien functioneel gekoppeld aan verschillende pathogeneses, patiëntenoutcomes en prognose van de ziekte4. In het algemeen, biosensoren zijn ontwikkeld voor het detecteren van diverse biologische fenomenen en ziekten, zoals kanker, neurodegeneratieve ziekte en elektron overdracht verwerkt5,6,7,8 , 9. meer in het bijzonder, substraat-gebaseerde protease sensoren zijn ontwikkeld voor het opsporen van protease-activiteit, en omvatten fluorogenic sondes voor diagnostische imaging10 en ionenpaar met het label peptide substraten voor in vitro detectie door massaspectrometrie11. Bovendien, zijn activity based sondes ontwikkeld, waarin substraat-achtige gebieden die binden of wijzigen van de target protease12. Met deze methode wordt de doel-protease onherroepelijk geremd wanneer de actieve site wordt gewijzigd, en analyse vereist oogsten van weefsel, waardoor in vivo toepassingen wordt beperkt. Het is echter belangrijk te voelen protease activiteit in vivo, omdat de verordening van protease-activiteit is sterk afhankelijk van de context van andere biologische activiteiten zoals de aanwezigheid van endogene remmers.
Het doel van dit werk is voor het beschrijven van de formulering van activity based nanosensors die protease activiteit in vivo detecteren met het produceren van een meetbare signaal in de urine. Dit platform wordt gebruikt als een noninvasive diagnose te discrimineren complexe ziekten zoals kanker met behulp van dysregulated protease-activiteit als een functionele biomarker. Ons nanosensor platform bestaat uit ijzeroxide nanodeeltjes (IONP), geconjugeerd met protease substraten. Deze substraten worden beëindigd door een fluorescerende verslaggever die wordt vrijgegeven wanneer proteasen het substraat klieven. Deze IONPs circuleren in vivolokaliseren naar ziekte sites en substraten voor actieve ziekte-geassocieerde proteasen bloot. Na decollete, fluorescerende verslaggevers worden vrijgegeven en, als gevolg van hun geringe omvang, worden gefilterd in de urine, terwijl uncleaved substraten op de IONP in het lichaam blijven. Daarom zal een toename van protease activiteiten in vivo resulteren in hogere concentraties van verslaggever in urine (Figuur 1). Aangezien ons platform een urinetest is, geen imaging platform is vereist en diagnosesignalen zijn verrijkt met urine.
Dit platform kan worden ontworpen om te ontdekken een scala van ziekten zoals kanker, fibrose en trombose13,14. Hier beschrijven we het ontwerp van nanosensors te detecteren waterstand in de Matrix metallopeptidase 9 (MMP9) activiteit als een biomarker van colorectal kanker. Darmkanker is de tweede belangrijke doodsoorzaak kanker in de Verenigde Staten, met een geschatte 136,800 nieuwe gevallen en sterfgevallen van de 50,300 in 2014 alleen al15. Colorectale tumorcellen produceren MMP9, die heeft aangetoond dat de schijf kwaadaardige progressie, aantasting van de matrix, evenals metastase16. Bovendien, we geïdentificeerd een geschikt peptide substraat (PLGVRGK) voor MMP9 van de literatuur17. Dit platform kan worden gebruikt voor de vroegtijdige opsporing van kanker en goedkope point-of-care diagnostiek13,14,18,19,20,21.
Figuur 1: schematische van Nanosensor activiteit In vivo. Nanosensors door het lichaam circuleren en lokaliseren naar sites van ziekte. Vervolgens, klieven proteasen ziekte-gerelateerde peptide substraten gepresenteerd door IONPs. De grootte van gekloofd fragmenten voorziet in renal clearance, waardoor ze te lokaliseren in de urine. Nadat het dier plast, kunnen deze peptide fragmenten worden geanalyseerd door hun verslaggever molecule. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionele goedkeuring van institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) bij van de onderzoeker instelling is nodig voor het uitvoeren van de volgende dierproeven. Bovendien zijn standaard dierenverzorgers voorzieningen (bijvoorbeeld huisvesting chambers, steriele dierlijke kappen, isofluorane kamers voor afstomping en CO2 kamers voor ethische eindpunt euthanization) naar behoren uit te voeren die nodig experimenten. Speciale opleiding en bijstand met deze faciliteiten kunnen worden verstrekt door de fysiologische onderzoek laboratorium (PRL) bij iemands instelling. Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door IACUC in Georgia Tech (protocol: A14100).
1. ijzeroxide Nanoparticle (IONP) synthese
Opmerking: Veiligheid: de hele ijzeroxide Nanoparticle synthese moet worden uitgevoerd met behulp van persoonlijke beschermingsmiddelen en rook onder een chemische stof kap.
- Chill in een conische tube van 15 mL, 1 mL van 30% ammoniumhydroxide in een ijsemmer voor 30 min.
- Wassen van een 250 mL-kolf met gedeïoniseerd water en voeg 10 mL dubbele gedestilleerd water (ddH2van O). De buitenkant van de kolf in een ijsbad rusten op een bord roer/warmte dompelen. Gebruik een plastic pipet aan stroom N2 gas in de ddH2O in de kolf. Zeepbel gedurende 15 minuten met N2 deoxygenate.
- Weeg 224 µmol (4,5 gram) van dextran (molecuulgewicht (MW) = 20 kDa) in een conische buis van 50 mL. Voeg H2O zodanig zijn dat het uiteindelijke volume van het mengsel, met inbegrip van de dextran, 20 mL. Vortex krachtig te ontbinden de dextran.
- Weeg 290 µmol (78,5 gram) van ijzer chloride-hexahydraat, toevoegen aan dextran oplossing en vortex te ontbinden.
- Filtreer de oplossing door een 0,2 µm filter.
- Pipetteer 1 mL gekoeld ammoniumhydroxide in 9 mL van het gedeoxygeneerd water. Terug naar de 4 ° C.
- Weeg 367 µmol (73,0 gram) van ijzer(II) chloride tetrahydraat, Los dit op in 1 mL van zuurstofvrije ddH2O en filtreer door een 0,2 µm filter.
- Breng de dextran-iron(III) oplossing in de conische kolf van 250 mL en deoxygenate met N2 gedurende 15 minuten op het ijs. Meng met een magnetische roer bar spinnen van 1600 toeren per minuut.
- Als u wilt maken een homogene stikstof atmosfeer, cap de kolf of fles met een rubber tussenschot. Lekke band het septum met een 18 gauge naald aan stroom N2 in de kolf. Een aparte 18 gauge naald invoegen als een stroom-outlet.
- Voeg 467 µL van de ijzer(II) oplossing aan de dextran-iron(III) oplossing met een spuit van 1 mL, roeren met een magnetische roer bar van 1600 toeren per minuut. Deze ratio van ijzer(II) tot reductie resulteert in een evenwichtige reactie die magnetiet of Fe3O4 produceren zal.
- Voeg dat de gekoelde verdunde ammoniak hydroxide ontkleuring in de ijzer (II) - ijzer (III) - dextran oplossing tot de nucleatie proces21. Zorg ervoor dat elke druppel mengt goed voordat neer te zetten in een andere. Afwerking van de reactie na de toevoeging van 1-2 mL van de ammonia.
- De stroom van N2 stoppen en verwijder de rubber tussenschot. Het ijsbad verwijderen en vervangen door een bad van warm water, terwijl steeds roer de oplossing. Zorg ervoor dat de temperatuur van de oplossing 75 ° C bereikt en incubeer gedurende 75 minuten.
- Verwijder de kolf uit de roer/hete plaat en dubbel Filtreer de oplossing door 0,2 µm dan 0.1 µm filters om grove deeltjes te verwijderen.
- Buffer uitwisseling de deeltjes in ddH2O, met behulp van 100 kDa molecuulgewicht (m.w.c.o.) concentrators verwijderen overtollige dextran uit de oplossing die zeer viskeuze worden moet afgesneden. Vervang filters indien de stroom door donker zelfs na 2-3 draaiingen, waarmee wordt aangegeven blijft dat het filter kan hebben gebroken.
- Buffer van uitwisseling met spin filters, centrifugeer bij 4 ° C bij 4800 X g gedurende 15 minuten, negeren de doorstroming en toevoegen van nieuwe buffer aan de oplossing van IONP. 3 - 5 keer herhalen.
- Bepaal de concentratie van het gebruik van een spectrofotometer/afleesapparaat nanodeeltjes. Neem extinctie metingen bij 400 nm en gebruik de molaire absorptivity van IONP bij deze golflengte (ε = 2.07 x 106 cm-1 M-1) om te bepalen van de concentratie van IO deeltjes.
- Resuspendeer de IONPs tot 10 mg/mL in ddH2O (totaalvolume is meestal ~ 3 mL) en maak gebruik van polypropyleen-buizen voor deze stap voor de chemische mengbaarheid. 1.6 volumes van 5 M NaOH toevoegen, voeg dan 0,65 volumes van epichloorhydrine. Strikt meng op een plaat shaker bij kamertemperatuur gedurende 12 uur dwarslijn dextran.
- Gebruik een 20 mL spuit met de naald van een 18-gauge overbrengen van de oplossing van de IONP naar het 50 kDa m.w.c.o. dialyse membraan. Plaats het membraan dialyse in 4 L ddH2O en vervangen H2O een paar keer (elke 2-3 uur). Na een nacht bebroeden.
- Meten van de concentratie en IONPs brengen met 5 mg/mL (zie stap 1.15). Ammoniumhydroxide om te bereiken van 20% (v/v) en schudden bij kamertemperatuur > 12 uren aminate het oppervlak van de IONPs toevoegen. Buffer uitwisseling met 30 kDa m.w.c.o. filters (zie 1.14).
- Stel het volume tot 2.5-3.5 mL vóór definitieve zuivering door snel eiwit vloeistofchromatografie (FPLC; Zie Tabel van materialen voor gel filtratie kolom).
- Gebruik dynamische lichtverstrooiing (DLS) om te bepalen van de hydrodynamische straal van IONPs (verwachte bereik 10-100 nm, gemiddelde grootte 40-50 nm). Dit doen door aliquoting 1 mL 100 X verdunde IONP monster in een cuvet, plaats in de machine en gebruik van software van de fabrikant om de meting.
Opmerking: De totale bevolking van IONPs zullen tussen 10 en 100 nm door DLS metingen, maar de meerderheid van de bevolking is ongeveer de gemiddelde diameter, die van 40-50 nm varieert. Als men wil beperken de groottewaaier, kan men verder gebruiken grootte uitsluiting chromatografie te isoleren van breuken met verschillende diameters. IONPs moeten worden bewaard bij 4 ° C.
2. peptide Design, vervoeging IONP en In Vitro validatie
- Een peptide substraat (bijvoorbeeld door een kern-faciliteit of commercieel) voor een doel protease synthetiseren met een N-terminal fluorescerende verslaggever zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en een C terminal cysteine residu dat thiol-gemedieerde koppeling.
Opmerking: In het geval van deze studie voor MMP9, de peptide gebruikt Poncela FITC-PLGVRGK-C, kkat/Km ~ 2.0 x 105 M-1s-1. - Aliquot 0.5 mg IONP (bij 1 mg/mL) en de uitwisseling van de buffer in de buffer koppeling (50 mM natriumboraat met 1 mM EDTA, pH = 8,5) met behulp van een 10 kDa m.w.c.o. spin filteren (zie stap 1.14).
- Los Succinimidyl iodoacetate (SIA) in dimethylformamide (DMF) tot een concentratie van ~ 30 mg/mL, en op een molverhouding van 500 SIA:IONP SIA toevoegen aan IONP.
Opmerking: SIA is een heterobifunctional cross linker die koppeling van aminen op IONPs aan de sulfaatzuurstof groepen op het substraat peptide bemiddelt. - Incubeer gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur in het donker. Als 's nachts verlaten, Incubeer bij 4 ° C.
- Buffer exchange via een 10 kDa m.w.c.o. spin filter in buffer koppeling verwijderen spoorverontreiniging SIA (zie stap 1.14).
- Breng de oplossing van het eindproduct aan 1 mg/mL (0,5 mL oplossing). Meng de peptide van belang bij een molaire verhouding van 90:1 (peptide: IONP) met 20 kDa thiol-beëindigd polyethyleenglycol (PEG) bij een molaire verhouding van 20:1 (PEG: IONP). Meng dit peptide-PEG-oplossing met IONP.
- Na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur op een plaat shaker op de hoogste snelheid, die betrekking hebben op buizen in folie ter voorkoming van photobleaching van fluorescerende moleculen.
- L-cysteïne toevoegen bij een molaire verhouding van 500: 1 (C:IONP) te neutraliseren elke spoorverontreiniging SIA-moleculen. Incubeer gedurende 1 uur bij 25 ° C op een shaker met hoogste snelheid bij kamertemperatuur.
- Zuiveren via FPLC (zie 1.1.19). Gebruik een spectrofotometer meet de extinctie van de monsteroplossing en de verhouding van de Peptide: IONP volgens het volgende berekenen. Na zuivering, product bij 1 mg/mL bij 4 ° C worden opgeslagen in PBS.
- Een spectrofotometer gebruiken voor het meten van de extinctie van de monsteroplossing bij 400 nm (eenmonster, 400) en de golflengte van de maximale extinctie voor de fluorophore gebruikt, die 488 is nm voor FITC (eenmonster, 488). Meet de extinctie van een voorraad amine IONP oplossing bij dezelfde twee golflengten (400 nm en 488 nm), die respectievelijk worden weergegeven als eenNP, 400 en eenNP, 488.
- Vergelijkingen 1 en 2 voor het berekenen van de genormaliseerde A400 en een488 waarden gebruiken.
Vergelijking 1
Vergelijking 2 - Een400 en een488 vertegenwoordigen de genormaliseerde waarden van het monster. Deze waarden gebruiken voor de berekening van de verhouding van Peptide: IONP met vergelijking 3.
Vergelijking 3 - Waar
en 
zijn de molaire absorptivities van de IONP en de fluorophore, respectievelijk. Voor deze deeltjes 2.06 x 106 M-1cm-1 en voor de FITC = = 72.000 M-1cm-1, dus de waarde van 
28.75 moet worden. Typische Peptide: IONP ratio's moeten in het bereik van 20:1 tot 50: 1.
- Functionaliteit van de sondes valideren door het uitvoeren van een decollete in vitro assay.
- Met PBS (1% BSA), maken een 18 µL nanoparticle oplossing met een 200 nM concentratie van peptide. Meng met 2 µL van protease van belang (MMP9; 0,1 - 1 mg/mL).
- Incubeer in een afleesapparaat bij 37 ° C gedurende 1 uur, fluorescentie metingen (met behulp van de juiste excitatie en emissie golflengten, die zijn 485 nm en 528 nm voor FITC, respectievelijk) elke 1-2 minuten te controleren decollete.
Vergelijking 1
Vergelijking 2
Vergelijking 3
en 
zijn de molaire absorptivities van de IONP en de fluorophore, respectievelijk. Voor deze deeltjes 
28.75 moet worden. Typische Peptide: IONP ratio's moeten in het bereik van 20:1 tot 50: 1.3. beheer van Nanosensors en Urine opsporing van kanker
Opmerking: Voor meer informatie over het model voorbeeld, zie onze eerdere verslag13.
- Maak een metabole kooi voor urine collectie door het veiligstellen van een cilindrische mouw naar de top van een 96 goed plaat. Bij urine verzamelen, plaats een muis in de mouw- en bedek met een dekking van de petrischaal te voorkomen ontsnappen van het dier.
- Bereid een injectie-oplossing (200 µL maximumvolume) met nanosensors met een concentratie van 3000 mg/kg (~ 50 µmol) door peptide in een steriele zoutoplossing.
- In naakt, vrouwelijke, 8 - weken oude muizen die xenograft LS174T colorectal tumoren op een last van ~ 100-300 mm3, die moeten worden uitgevoerd op ongeveer dag 10, beheren nanosensor oplossing via staart veneuze injectie. Onmiddellijk na de injectie, muizen in metabole kooien plaatsen en Let op de tijd van injectie voor elke muis.
- Bij 60-90 minuten na de injectie, cilindrische mouw uit 96-wells-plaat te verwijderen. Beperken van muis en lichte druk uitoefenen op de blaas voor het opwekken van muizen om eventuele resterende urine op de plaat ongeldig. Verzamel alle urine (200-500 µL).
- Urine monsters analyseren door immunoprecipitation FITC zuiveren van de urine te verhogen van de gevoeligheid. Magnetische kralen gebruik in combinatie met anti-FITC antilichamen.
- Eerst wassen 25 mg van de magnetische parels 3 keer met coating buffer, en breng het eindvolume aan 225 µL.
Opmerking: Het is belangrijk dat de coating buffer (0,1 M natriumboraat, pH 9,5), blokkeerbuffer (PBS, 0,5% BSA 0,05% Tween-20, pH 7.4) en wassen buffer (PBS, 0,1% BSA 0,05% Tween-20, pH 7.4) verse dat elke keer, en ongeveer 20 mL van elk is nodig. - Voeg 200 µL van anti-FITC (5 mg/mL) en 200 µL van ammoniumsulfaat (3 M). Incubeer gedurende 16-24 uur bij 37 C op een rotator.
- De oplossing aan een magnetische scheidingsteken toevoegen, de bovendrijvende vloeistof verwijderen, vervangen door 625
Λ blokkeren buffer, en na een nacht bebroeden bij 37 C. Daarna 3 keer wassen met wash buffer en bewaar op 1,25 mL was buffer. - Incubeer 2 µL van urine met 5 µL van magnetische kralen (20 mg/mL) en breng aan een totaal volume naar 50 µL met PBS (0,01% tween-20). Incubeer gedurende 60 min.
- Wassen tweemaal met 50 µL PBS (0,01% Tween 20) met behulp van een magnetische scheidingsteken voor het verzamelen van magnetische kralen na elke wasbeurt.
- Elueer tweemaal met 32.5 µL van 5% ijsazijn. Neutraliseer gepoolde elutie (70 µL) met 35 µL van 2 M Tris te bereiken van een definitieve pH van ~ 7.
- Lezen op een afleesapparaat (Zie Tabel van materialen) in de juiste excitatie en emissie golflengten te kwantificeren urine fluorescentie. Bereken de concentratie van fluorescerende verslaggever tegen een ladder van de bekende concentraties van vrije fluorophore.
- Eerst wassen 25 mg van de magnetische parels 3 keer met coating buffer, en breng het eindvolume aan 225 µL.
Λ blokkeren buffer, en na een nacht bebroeden bij 37 C. Daarna 3 keer wassen met wash buffer en bewaar op 1,25 mL was buffer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De meerderheid van de bevolking van de IONPs is rond de gemiddelde diameter, die van 40-50 nm varieert. Na pegylation, deze groottewaaier een omloop halveringstijd heeft van ongeveer 6 uur13 in vivo (Zie Figuur 2a). Als men wil selecteren voor het bereik van een bepaalde grootte, kunt een grootte uitsluiting chromatografie te isoleren IONP breuken met verschillende diameters. De nanodeeltjes door TEM verschijnt als individuele sferische ijzeroxide nanodeeltjes kruisverwijzende samen door een buitenlaag van dextran. 13 Een oplossing van IONPs verschijnt doorschijnend met geen overhaaste en licht bruin van kleur. Na succesvolle peptide conjugatie, zal extinctie van de spectrale analyse onthullen een afzonderlijke extinctie piek bij de golflengte van de maximale excitatie van de fluorescerende verslaggever. In het geval van FITC, dit zal worden gecentreerd rond 488 nm (Zie Figuur 2b). Een typische peptide vervoeging reactie zal resulteren in een peptide IONP molaire/verhouding van 20-50 na zuivering van de FPLC. Om te testen op het vermogen van de sonde te zin protease-activiteit, kan een aliquoot gedeelte van het nanosensors worden geïncubeerd met recombinant proteasen en gecontroleerd door fluorimetrie. Decolleté activiteit zal resulteren in de release van fluorescerende verslaggevers - die anders homoquenched op het oppervlak van de nanoparticle - in-oplossing en verhogen monster fluorescentie. Het is typisch voor het observeren van substraat decollete snelheden die Michaelis-Menten kinetica volgen (Zie Figuur 2 c).
Figuur 2: Valideren van de structuur en functie van de Nanosensors In vitro. (a) A DLS grafiek vertegenwoordigen de grootteverdeling van een IONP bevolking na synthese. (b) de extinctie spectrum van IONPs na conjugatie met FITC-geëtiketteerden MMP-9 substraten. (c) de in vitro decollete bepaling waaruit blijkt dat de MMP9 gestaag cleaves de peptide gepresenteerd door de nanosensor in de loop van een uur. Een protease-concentratie van 0,5 mg/mL werd gebruikt in PBS (1% BSA) buffer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Voor de toepassing van dit platform in muismodellen van kanker, is het typisch om te gebruiken nanosensors bedekt met een fluorescerende verslaggever van nabij-infrarood zodat visualisatie van farmacokinetiek door geheel-dier TL imaging (Figuur 3a). In muizen die LS174T colorectal tumoren, zal een fluorescent signaal lokaliseren in de urine binnen 60-90 minuten na intraveneuze toediening van nanosensors als gevolg van de MMP9 splitsing van peptide substraten op de nanosensors. Daarentegen zal er lagere fluorescerende signalen in de blaas van controle groep muizen (Zie Figuur 3a). Opgemerkt moet worden dat het signaal waargenomen in de lever ontstaat doordat de deeltjes zijn uiteindelijk opruiming door monocyten en macrofagen in het systeem van de reticuloendotheliaal, die gewoonlijk worden aangetroffen in de lever, de milt en de lymfeklieren. Daarom is het signaal vanuit de lever in Figuur 3a als gevolg van de goedkeuring van de nanodeeltjes. 13 wanneer kwantificeren urine fluorescentie door immunoprecipitation, een aanzienlijk verhoogde signaal zal worden waargenomen in muizen die LS174T tumoren in vergelijking met gezonde controles (Zie Figuur 3b).
Figuur 3: opsporen van Colorectal kanker in een muismodel. (a) In vivo afbeeldingen van de tumor en controle groep muizen, observatie van de lokalisatie van de IONP naar sites van ziekte, evenals urine lokalisatie als gevolg van progressie van de tumor. (b) de kwantificering van de fluorescentie van het Urine van tumor in controle muizen in het model van de tumor LS174T. Foutbalken worden uitgezet als standaardafwijking (*p < 0.05 door twee-staart gepaarde t-test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode beschrijft de ontwikkeling van activity based nanosensors bestaande uit protease substraten geconjugeerd met een kern van nanoparticle. De gebeurtenis van Proteolytische decolleté is dubbed the "farmacokinetische switch", omdat gekloofd peptide producten kleiner dan de maximale filtratie renale grootte van 5 nm23 en filter in de urine zijn te produceren een noninvasive signaal. Daarom is het belangrijk om te gebruiken van nanodeeltjes of dragers met een hydrodynamische straal die groter is dan 5 nm, als iets kleiner wordt snel gewist door de nieren en urine signalen beschamen. We gebruiken gepegyleerde IONPs omdat ze FDA goedgekeurd, goed verdragen zijn, en een circulerend halveringstijd van 3-5 uur hebben. 13 een andere belangrijke overweging bij het formuleren van nanosensors is de PEG peptide substraat molaire verhouding. 24 , 25 verhogen de verhouding zal aspecifieke decollete verminderen door uit-target proteasen via sterische afscherming van peptiden26, maar potentieel verminderen op doelsoort zijn activiteit als goed. Omgekeerd, een lagere PEG peptide verhouding zal toenemen protease toegankelijkheid en splitsing van peptides, die detecteren signalen zal versterken, maar ook achtergrondgeluiden kan verhogen. In vivo, kan een lagere oppervlakte concentratie van PEG ook nanosensor opname te verhogen door het reticuloendotheliaal systeem (RES) en omloop tijd inkorten.
Voor de toepassing van deze technologie om te diagnosticeren van andere ziekten, moeten proteasen die upregulated in een ziekte-staat worden vastgesteld van de literatuur17. Ontdekking inspanningen moeten richten op de extracellulaire proteasen, omdat deze nanosensors niet ontworpen zijn om cellen te zin intracellulaire activiteit doordringen. Deze nanosensors zijn ook ontworpen om zin endoproteases dat in het midden van de peptide, waarin vele kandidaat-ziekten klieven te richten. Door zich te richten van extracellulaire endoproteases alleen hebben wij diagnostiek voor leverfibrose, meerdere soorten kanker en trombose13,19,20,21ontwikkeld. Dit platform kan verder worden ontworpen om sonde voor exoprotease activiteit na endoprotease decollete in het kader van ziekte26,27. Het is ook belangrijk voor het ontwerpen van een peptide-substraat dat specifiek is voor de protease van belang. Dit kan worden bereikt door de screening van de kandidaat-peptide reeksen met de in vitro decollete assay (stappen 2.10-2.11). Potentiële aspecifieke protease decolleté moet ook worden getest tijdens de peptide ontwerp. In het geval van MMP9, bijvoorbeeld we substraat specificiteit met trombine, een coagulatie protease gevonden bij hoge concentraties in het bloed getest. Activiteit nanosensors in vivowilt gebruiken, moet de optimale urine afhaaltijd worden bepaald door de kinetiek van signaal productie controle door imaging of discrete bemonstering van de urine na toediening van nanosensors. Muizen kunnen ook worden doordrenkt met steriele zoutoplossing overhydrate dieren en verhoging van de productie van urine. Praktisch, kan deze technologie worden uitgebreid tot een ziekte met upregulated of werden extracellulaire protease-activiteit. Een sterkte van dit platform is dat het voorziet in de versterking van doel protease signaal, dus zelfs als slechts een fractie van de ziekte-site protease bevolking is onderzocht, een aanzienlijke uitlezing kan worden gemeten. Het huidige platform is ontworpen om de extracellulaire endoproteases gevoel. Bij de toepassing van dit platform voor andere ziekten, moet men identificeren de protease-biologie van deze ziekte, zodanig dat dit platform kan worden afgestemd op gevoel proteasen van belang.
Deze core-technologie kan verder worden ontworpen met decollete verslaggevers die kunnen worden opgespoord met verschillende analytische platformen om het aantal toepassingen te verhogen. Bijvoorbeeld, kunnen decollete verslaggevers die liganden voor antilichaam binding bevatten worden gedetecteerd door papier tests voor low-cost point-of-care diagnostiek19. Bovendien, kunt labelen van substraten met massale verslaggevers meerdere proteasen worden gelijktijdig uit urine gedetecteerd door massaspectrometrie13. Kortom, beschrijft deze methode formuleren activity based nanosensors om zin protease activiteit in vivo als een noninvasive urine biomarker van ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Kwong is mede-oprichter en fungeert als consultant aan Glympse Bio, dat is het ontwikkelen van producten in verband met de in dit artikel wordt beschreven. Deze studie kan zijn persoonlijke financiële toestand beïnvloeden. De bepalingen van deze overeenkomst zijn herzien en goedgekeurd door het Georgia Tech overeenkomstig haar beleid belangenconflicten
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door van de directeur van een NIH New Innovator Award (Award nr. DP2HD091793). Q.D.M. wordt ondersteund door de NSF Graduate Research Fellowships Program (Grant nr. DGE-1650044). B.A.H wordt ondersteund door de nationale instituten van gezondheid GT BioMAT Training subsidie onder Award nummer 5T32EB006343, evenals de Georgia Tech President's Fellowship. G.A.K. houdt een Career Award aan de wetenschappelijke Interface uit de Burroughs Welcome Fonds. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filters | VWR | 4652 | |
| 18G needle | VWR | 89134-024 | |
| 15 mL conicals | VWR | 89039-670 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89000-362 | |
| Stir bar | VWR | 58949-006 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 97064-482 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Thermo Fisher | A13100 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma | 236489 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 44939 | |
| Epichlorohydrin | Sigma | 45340-500ML-F | |
| DMF | Sigma | D4551 | |
| Ammonium Hydroxide | Sigma | 320145-500ML | |
| Sodium Hydroxide pellets | Sigma | 221465-500G | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Sodium Borate | Sigma | B9876 | |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-100G | |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| Dextran | Pharmacosmos | 5510 0020 9006 | |
| Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk | Millipore | UFC901024 | |
| Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk | Millipore | UFC910024 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | NanoZS | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | LifeTech | 66130 | |
| Dynabeads MyOne Tosylactivated | LifeTech | 65501 | |
| SIA | Life Tech | 22349 | |
| PEG 20k | Laysan Bio | MPEG-SH-20K-1g | |
| Fluorescein Antibody [2A3] | GeneTex | GTX10257 | |
| Hiload 16/600 superdex 200 | GE Healthcare | 45-002-490 | |
| Plate Reader | Fisher | BTCYT5M | |
| BD Insulin Syringes | Fisher | NC0872854 |
References
- Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
- Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology, molecular mechanisms and clinical applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (2), 195-208 (2015).
- Koblinski, J. E., Ahram, M., Sloane, B. F. Unraveling the role of proteases in cancer. Clinica Chimica Acta. 291 (2), 113-135 (2000).
- Lilja, H., Vickers, A., Scardino, P. Measurements of proteases or protease system components in blood to enhance prediction of disease risk or outcome in possible cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (4), 347-348 (2007).
- Jin, H., et al. Flexible surface acoustic wave resonators built on disposable plastic film for electronics and lab-on-a-chip applications. Scientific Reports. 3, 2140 (2013).
- Ma, W., Liu, H. -T., Long, Y. -T. Monitoring dopamine quinone-induced dopaminergic neurotoxicity using dopamine functionalized quantum dots. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (26), 14352-14358 (2015).
- Zhang, W. -H., Ma, W., Long, Y. -T. Redox-mediated indirect fluorescence immunoassay for the detection of disease biomarkers using dopamine-functionalized quantum dots. Analytical Chemistry. 88 (10), 5131-5136 (2016).
- Ma, W., et al. Investigating electron-transfer processes using a biomimetic hybrid bilayer membrane system. Nature Protocols. 8 (3), 439-450 (2013).
- Holt, B. A., et al. Fc microparticles can modulate the physical extent and magnitude of complement activity. Biomaterials science . 5, 463-474 (2017).
- Edgington, L. E., Verdoes, M., Bogyo, M. Functional imaging of proteases: Recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (6), 798-805 (2011).
- Kleifeld, O., et al. Identifying and quantifying proteolytic events and the natural N terminome by terminal amine isotopic labeling of substrates. Nature Protocols. 6 (10), 1578-1611 (2011).
- Sanman, L. E., Bogyo, M. Activity-based profiling of proteases. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 249-273 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nature Biotechnology. 31 (1), 63-70 (2013).
- Dudani, J. S., Buss, C. G., Akana, R. T. K., Kwong, G. A., Bhatia, S. N. Sustained-release synthetic biomarkers for monitoring thrombosis and inflammation using point-of-care compatible readouts. Advanced Functional Materials. 26 (17), 2919-2928 (2016).
- Meester, R. G. S., et al. Public health impact of achieving 80% colorectal cancer screening rates in the United States by 2018. Cancer. 121 (13), 2281-2285 (2015).
- Mehner, C., et al. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer. Oncotarget. 5 (9), 2736-2749 (2014).
- Bremer, C., Tung, C. H., Weissleder, R. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition. Nature Medicine. 7 (6), 743-748 (2001).
- Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13709-13714 (2014).
- Warren, A. D., Kwong, G. A., Wood, D. K., Lin, K. Y., Bhatia, S. N. Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3671-3676 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mathematical framework for activity-based cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12627-12632 (2015).
- Dudani, J. S., Jain, P. K., Kwong, G. A., Stevens, K. R., Bhatia, S. N. Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity. ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).
- Palmacci, S., Josephson, L. AMAG Pharmaceuticals Inc. Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids. US patent. , 5,262,176 (1991).
- Choi, H. S., et al. Renal clearance of nanoparticles. Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).
- Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly. Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).
- Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
- Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).
- Villanueva, J., et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns. The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).
